CN109996543A - 抗体药物复合体 - Google Patents

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Abstract

一种抗体药物复合体(antibody‑drug conjugate,ADC)，包括如式(I)所示之结构或其药学上可接受之盐类：其中，Ab为不具醣基之抗体(即为抗体的蛋白质部分)；G1及G2可为相同或不同之醣单元；Cn1及Cn2可为相同或不同之复合单元；L1和L2可为相同或不同之链接单元；D1和D2可为相同或不同的药物单元；以及在x+y≠0的前提下，x和y系独立为0至8之整数。

Description

抗体药物复合体
发明背景
技术领域
本发明系关于一种抗体药物复合体(antibody-drug conjugate,ADC)，尤指一种透过醣基使药物单元专一性连接至抗体接点的抗体药物复合体。
先前技术
抗体药物复合体(antibody-drug conjugat,ADCs)可提供治疗多种疾病或症状的标靶治疗，例如提供癌症的标靶治疗。抗体药物复合体是一种复合分子，其包括连结至生物活性药物(例如细胞毒杀性药剂或药物)的抗体。藉由组合特定抗体目标以及药物疗效，抗体药物复合体可以辨别正常细胞与癌细胞，进而减少副作用。
抗体药物复合体一般包括一可辨识特殊标记(例如肿瘤标记)之抗体以及藉由偶联结至抗体之抗癌药物(例如细胞毒素)。在身体内，抗体追踪这些蛋白质标记，并使自己与癌细胞
表面接触。抗体与目标蛋白(抗原)之间的生化反应会引发肿瘤细胞内的讯号传递，而后使抗体药物复合体内化；待抗体药物复合体内化以后，细胞毒性药物被释放出来并且杀死癌细胞。由于此标靶过程，药物具有较低的副作用。
在抗体药物复合体中，抗体与细胞毒性药物(例如抗癌药物)之间的稳定连结相当重要。连结基(linkers)可为裂解性或非裂解性。在使用非裂解性连结基的情况下，抗体、连结基及细胞毒性药物(抗癌药物)全部皆进入目标癌细胞中，抗体可在癌细胞内被分解，而细胞毒性药物可在细胞内被释放出来。另一方面，在使用裂解性连结基的情况下，细胞毒性药物可能会在目标细胞外就被释放出来，可能引发针对邻近癌细胞的「旁观者杀伤效应」(bystander killing)。
在抗体药物复合体早期的发展中，已经研究出部分的共轭化学性。在非选择性的模式中，药物基团通常会接触抗体的离胺酸或半胱胺酸侧链，因此，非选择性的共轭方式使抗体药物复合体一般包含具有不同药物抗体比(drug-antibody ratio,DAR)的分子混合物，因此产生不同的药物动力学性质。
近年来，生物科技已发展出接点专一性的共轭方式，能够固定连结基和承载的细胞毒杀药物的数量与准确的链接位置。举例来说，此类方法包括经由硫基修饰的抗体、或其他修饰后具有结合区的相似抗体。
提供接点专一性接触的另一种方法为：使承载物接触抗体的醣基。即使该方法可提供接点专一性的接触，但因抗体上醣基的异质性(heterogeneity)，该方法可能无法制造出同质的抗体药物复合体。
典型的IgG包含位于Fc区域Asn297位置的N-醣基。N-醣基一般为具有相当结构异质性的双分支(biantennary)复合型，其中核心五聚醣可以不同的核心海藻糖(Fuc)、等分N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、末端半乳糖(Gal)、及末端唾液酸(Sia)修饰。N-醣基的组成可影响Fc区域的构形，因而调节抗体性质，例如稳定性、免疫原性、效用功能(effectorfunctions)、抗体介导的发炎反应、以及补体活化作用。
具有接点专一性的抗体药物复合体系以异质性醣基为基础，造成高度变异性的药物抗体比(DAR)以及药物动力学特性。因此，目前亟需发展一种较佳的接点专一性抗体药物复合体之制备方法，以使组合物内具有实质相同的抗体药物复合体。
发明内容
本发明之实施方式系关于抗体药物复合体，其利用醣基团与承载物接触。抗体的醣基可以被修饰为实质相同物，此类醣基修饰可利用醣苷内切酶进行。例如，在天然抗体上的醣基可被醣苷内切酶切割分解成一种或多种醣基残基。然后，具有特定结构的醣基可以与剩下的醣基残基结合，以产生具有实质相同醣基结构的抗体。接着，这些抗体可用于制备抗体药物复合体(antibody-drug conjugate,ADC)。
本发明之抗体药物复合体皆为实质均相化，它们在制造、质量控管、及体内药物动力学特性上可具有较佳的性质，尤其是针对给药系统的设计与监测的体内药物动力学特性。
由于特殊的制程，本发明之实施方式可具有相对高的平均药物抗体比。根据本发明之实施方式，具有两个双分支醣基的抗体，其平均药物抗体比为3.0以上。相反地，一般来说，在本技术领域中已知抗体的平均药物抗体比为2.0以下。具有两个单分支醣基的抗体，其平均药物抗体比为1.5至2.0。较高的平均药物抗体比表示各抗体分子可以携带较多的承载体，且由本发明说明书中记载的实验证明：本发明的抗体药物复合体作为疗效药物可具有更大的功效。此外，因本发明的抗体药物复合体仅需少量即可达到相同的承载体吞吐量，故成本较低；由于抗体价钱昂贵，此项优点可让病患省下不少的治疗费用。
根据本发明的实施方式，具有特定结构的醣单元可以先和链接基-药物单元(linker-drug moiety)结合，再与被切割的抗体复合。或者，具有特定结构的醣单元可以先与被切割的抗体复合，再和链接基-药物单元结合。
根据本发明部分实施方式，「连结基-药物」
(linker-drug)单元可以不用在与醣单元复合之前形成。换言之，连结基可以先和醣基链接，然后药物单元再与产物单元接触。
根据本发明的实施方式，一种抗体药物复合体(ADC)可具有如式(I)所示之结构或其药学上可接受之盐类：
其中，
Ab为不具醣基之抗体(即为抗体的蛋白质部分)；
G1及G2可为相同或不同之醣单元；
Cn1及Cn2可为相同或不同之复合单元；
L1和L2可为相同或不同之链接单元；
D1和D2可为相同或不同的药物单元；以及
在x+y≠0的前提下，x和y系各自为从0至8之整数。
根据本发明部分实施方式，抗体药物复合体中的抗体结合至一目标，该目标系选自由：分化群19(Cluster of differentiation19,CD19)、分化群22(CD22)、分化群27(CD27)、分化群30(CD30)、分化群33(CD33)、分化群37(CD37)、分化群56(CD56)、分化群70(CD70)、分化群74(CD74)、分化群79b(CD79b)、分化群138(CD138)、分化群142(CD142)、碳酸酐酶6(Carbonic anhydrase 6,CA6)、钙黏素(p-Cadherin)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5,CEACAM5)、LY6/PLAUR结构域蛋白3(LY6/PLAUR Domain Containing 3,C4.4a)、Delta样配体3(Delta-like3,DLL3)、上皮生长因子受器(epidermal growth factor receptor,EGFR)、上皮生长因子受器VIII(epidermal growth factor receptor variant III,EGFRVIII)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterasefamily member 3,ENPP3)、肝配蛋白A型受体2(ephrin type-A receptor 2,EphA2)、肝配蛋白A(EphrinA)、叶酸受体蛋白1(Folate Receptor 1,FLOR1)、纤维母细胞生长因子受体2(Fibroblast growth factor receptor,FGFR2)、鸟苷酸环化酶C(Guanylate cyclase,GCC)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、受体酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase,cKIT)、雌激素调节蛋白1(Estrogen-Regulated Protein LIV1)、间皮素(Mesothelin,MSLN)、黏蛋白16(Mucin 16,MUC16)、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2b(Sodium-dependent phosphate transport protein 2B,NaPi2b)、连接蛋白4(Nectin4)、跨膜醣蛋白神经介素蛋白B(Transmembrane glycoproteinneuromedin B,gpNMB)、前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)、SLIT及NTRK相似蛋白6(SLIT and NTRK-like protein 6,SLITRK6)、前列腺六跨膜上皮抗原1(six transmembrane epithelial antigen of the prostate,STEAP1)、滋养层细胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen,TROP2)、滋养层醣蛋白(Trophoblast glycoprotein,5T4)、阶段特异性胚胎抗原4(stage-specific embryonicantigen 4,SSEA4)、Globohexaosylceramide,(GloboH)、五分子前趋醣脂质(Gb5)、(Sialyl-Tn,STn)、及Tn所组成之群组。
根据本发明部分实施方式，醣基可选自由：双醣、三醣、四醣、五醣、六醣、七醣、八醣、九醣、十醣及十一醣所组成之群组。
根据本发明之较佳实施方式，该醣单元可具有如式(II-1a)或式(II-2a)所示之结构：
其中，
RN1a、RN1b、RN2a、及RN2b各自独立选自由氢、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6酰基、及氮保护基团所组成之群组；其中氮保护基团可为本技术领域中所熟知的合适氮保护基团，例如异丁基氧基羰基(isotertbutyloxycarboxy group,t-BOC)、9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl group,Fmoc)、芐基(benzyl group,Bn)、芐氧羰基(benzyloxycarbonyl group,Cbz)、烯丙氧羰基(allyloxycarbonyl group,Aloc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl group,Teoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl,Troc)、二苯甲基(diphenylmethyl group,Dpm)、三苯甲基(trityl group,Tr)、9-苯芴基(9-phenylfluorenyl group,PhFI)、及对甲氧基苄基(p-methoxybenzyl group,PMB)；[Ab]表示抗体的接点；以及
[Cn]表示复合单元的接点。
根据本发明之较佳实施方式，该醣单元可具有如式(II-1b)或式(II-2b)所示之结构：
其中[Ab]表示抗体的接点；[Cn]表示复合单元的接点。
根据本发明之部分实施方式，该复合单元可选自由：式(III-1)、式(III-2a)、式(III-2b)、式(III-2c)、式(III-2d)、式(III-3)、式(III-4a)、式(III-4b)、式(III-4c)、及式(III-4d)之结构所组成的群组；
其中，
Q系Y1+Y2连接基团(spacer group)，其中Y1和Y2系独立选自由：直接键结、—(CH2)n—、—O—、—NH—、—C(O)—、—C(O)NH—、—NHC(O)—、—(CH2)nO—、—O(CH2)n—、—(CH2)n—C(O)—、—C(O)(CH2)n—、—(CH2)n—NH—、—NH—(CH2)n—、—(CH2)n—NHC(O)—、—C(O)(CH2)n—NHC(O)—、(CH2)nSCH2C(O)—、及—(CH2CH2O)m所组成之群组；
R3a系选自由：氢、卤素、C1-C6烷基所组成之群组；
R3b系独立选自由：氢、卤素、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基、选择性被取代之C1-C24环烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3c系独立选自由：氢、卤素、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3d系独立选自由：氢、卤素、OH、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基所组成之群组；
n为1至8的整数，亦包括1及8；
m为1至4的整数，亦包括1及4；
[G]表示醣单元的接点；以及
[L]表示链接单元的接点。
根据本发明之部分实施方式，「链接单元」(linker moeity)可为一直接键结。换言之，药物系直接链接到复合单元而不需中间链接基。根据本发明之部分实施方式，链接单元可为裂解性或非裂解性。裂解性的链接单元，例如：可包含化学键(如酯或酰胺)，其可水解/降解或可在体内被酵素切割。根据本发明之部分实施方式，链接单元可为水溶性或非水溶性。
根据本发明之较佳实施方式，链接单元可选自由：式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、及式(IV-5)结构所组成之群组；
其中，
[Cn]表示复合单元的接点；
[D]表示药物单元的接点；
并且m和n各自为0至6的整数，亦包括0及6。
根据本发明之部分实施方式，该药物单元(承载物)可选自由：单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E,MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F,MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(Monomethyl auristatin D,MMAD)、美登素DM1/DM4(Mertansine,Maytansinoid DM1/DM4)、紫杉醇(Paclitaxel)、多西他赛(Docetaxel)、埃博霉素B(Epothilone B)、埃博霉素A(Epothilone A)、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸盐(Auristatintyramine phosphate)、澳瑞他汀氨基喹啉(Auristatin aminoquinoline)、Halocombstatins、刺孢霉素θ(Calicheamicin theta)、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin(SN-38))、吡咯苯并二氮杂卓(Pyrrolobenzodiazepine,PBD)、水鬼蕉碱(Pancratistatin)、环磷酸酯(Cyclophosphate)、Cribrostatin-6、Kitastatin、涡轮他汀1-4(Turbostatin1-4)、海洛因他汀(Halocombstatins)、Silstatins、前微管菌素D(Pretubulysin D)、及微管菌素(Tubulysins)(微管菌素A、B、C、D、E、F、G、H、I、U、V、及Z)所组成之群组。
本发明另一目的系提供一种使用上述抗体药物复合体做为用以治疗癌症之医药组合物的方法。根据本发明之部分实施方式，该癌症可为脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌或前列腺癌。
由下列叙述和依附之申请专利范围，可明显推知本发明之其他特征和优点。
附图说明
第1图为本发明实施例之TRZ(天然贺癌平(Herceptin))、TRZ-N(F)(切醣后的贺癌平)、以及TRZ-NAS/TRZ-NKS(经具有两个修饰过的双分支醣基醣基化修饰的贺癌平)的SDS-PAGE实验结果。第1道：标准品，第2道：TRZ，第3道：TRZ-N(F)，第4道：TRZ-NAS/TRZ-NKS。
第2图为本发明实施例之TRZ-N、TRZ-NG及TRZ-NGKS(经醣基化修饰的贺癌平，具有两个修饰过的单分支醣基)的质谱图。顶图：TRZ-N，中图：TRZ-NG，底图：TRZ-NGKS。
第3图为本发明实施例之TRZ(A图)、TRZ-NKS(B图)及TRZ-NAS(C图)的醣基分析图(glycan mapping)。各醣基波峰系利用在线MS分析连接至具荧光检测的HPLC所判定。A图右边的表格列举出甘露糖-5(Man-5)醣基的含量，其系按照多寡排列。
第4图为本发明实施例之接点专一性抗体药物复合体(ADCs)的SDS-PAGE实验结果。第1道：标准品，第2道：TRZ-NKS，第3道：TRZ-A22。
第5图为本发明实施例之接点专一性抗体药物复合体(ADCs)的SDS-PAGE实验结果。第1道：标准品，第2道：TRZ-NGKS，第3道：TRZ-A11-D2。
第6图为本发明实施例之接点专一性抗体药物复合体(ADCs)与时间相关的SDS-PAGE实验结果。第1道：标准品，第2道：TRZ-NKS，第3道：TRZ-A09(反应时间：15分钟)，第4道：TRZ-A09(反应时间：30分钟)，第5道：TRZ-A09(反应时间：60分钟)，第6道：TRZ-A09(反应时间：120分钟)。
第7图为本发明实施例之TRZ-A22及TRZ-NKS的质谱图。顶图：TRZ-A22，底图：TRZ-NKS。
第8图为本发明实施例之TRZ-A01对HER2的结合亲和力评估(比较组：Roche-TRZ)。
第9图为本发明实施例之TRZ-A01(具有抗体或毒素)于HER2正表现细胞株BT474的细胞毒杀性实验结果。
第10图为本发明实施例之ADC A01于NCI-N87异种移植模式中的抗肿瘤活性实验结果。以5mg/kg TRZ-A01Q7D x 4处理能够抑制NCI-N87的肿瘤生长。数据系以平均值±标准偏差表示之。「**」表示与载体控制组比较下P<0.01。
实施方式
本发明之实施方式系关于利用醣基与承载物接触的抗体药物复合体。抗体的醣基可以被修饰为实质相同。在本发明中，「实质相同」表示80％以上、较佳为85％以上、更佳为90％以上、再更佳为95％以上的同构型(homogeneity)。此类醣基修饰可利用醣苷内切酶进行。例如，在天然抗体上的醣基可被醣苷内切酶切割分解成一种或多种醣基的残基。然后，具有特定结构的醣基可以与剩下的醣基残基结合，以产生具有实质相同醣基结构的抗体。接着，这些经醣基化修饰的抗体可用于制备抗体药物复合体。另一种可能是，具有特定结构的醣基可与连结基或带有药物基团的连结基结合，接着再与经醣苷内切酶切割后的抗体结合。
根据本发明之实施方式，醣基化修饰可包含使用源自酿脓链球菌(StreptococcusPyogenes)之醣苷内切酶S2
(endoglycosidase S2,EndoS2)或其突变体，可提高转醣化活性以及降低水解活性，使合成的抗体携带大量具有明确定义的N-醣基。这些带有明确定义的N-醣基可接续用于制备抗体药物复合体。
由于特殊的制程，本发明之实施方式可具有相对高的平均药物抗体比。根据本发明之实施例，具有两个双分支(biantennary)醣基的抗体的平均药物抗体比为3.0以上。相反地，一般而言在本技术领域中已知抗体的平均药物抗体比为2.0以下。具有两个单分支醣基的抗体，其平均药物抗体比为1.5至2.0。较高的平均药物抗体比表示：各抗体分子可以携带较多的承载体，且由本发明说明书中记载的实验证明：本发明的抗体药物复合体作为疗效药物可具有更大的功效。此外，因本发明的抗体药物复合体仅需少量即可达到相同的承载体吞吐量，故成本较低；由于抗体价钱昂贵，此项优点可让病患省下不少的治疗费用。
根据本发明之实施方式，抗体药物复合体中的药物单元(承载物)可以使用连结基与醣基接触、或不使用连结基直接与醣基接触。
根据本发明的实施方式，一种抗体药物复合体可具有如式(I)所示之结构或其药学上可接受之盐类：
其中，
Ab为不具醣基之抗体(即为抗体的蛋白质部分)；
G1及G2可为相同或不同之醣单元；
Cn1及Cn2可为相同或不同之复合单元；
L1和L2可为相同或不同之链接单元；
D1和D2可为相同或不同的药物单元；以及
在x+y≠0的前提下，x和y系独立为0至8之整数。
根据本发明部分实施方式，抗体药物复合体中的该抗体可自主结合至一目标，例如：分化群19(CD19)、分化群22(CD22)、分化群27(CD27)、分化群30(CD30)、分化群33(CD33)、分化群37(CD37)、分化群70(CD70)、分化群74(CD74)、分化群79b(CD79b)、分化群138(CD138)、分化群142(CD142)、碳酸酐酶6(CA6)、钙黏素(p-Cadherin)、癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)、LY6/PLAUR结构域蛋白3(C4.4a)、Delta样配体3(DLL3)、上皮生长因子受器(EGFR)、上皮生长因子受器VIII(EGFRVIII)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(ENPP3)、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、肝配蛋白A(EphrinA)、叶酸受体蛋白1(FLOR1)、纤维母细胞生长因子受体2(FGFR2)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、受体酪胺酸激酶(cKIT)、雌激素调节蛋白1(LIV1)、间皮素(MSLN)、黏蛋白16(MUC16)、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2b(NaPi2b)、连接蛋白4(Nectin4)、跨膜醣蛋白神经介素蛋白B(gpNMB)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、SLIT及NTRK相似蛋白6(SLITRK6)、前列腺六跨膜上皮抗原1(STEAP1)、滋养层细胞表面抗原2(TROP2)、滋养层醣蛋白(5T4)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)、Globohexaosylceramide(GloboH)、五分子前趋醣脂质(Gb5)、(Sialyl-Tn,STn)及Tn所组成之群组。
根据本发明部分实施方式，醣基可选自由：双醣、三醣、四醣、五醣、六醣、七醣、八醣、九醣、十醣及十一醣所组成之群组。根据本发明之较佳实施方式，该醣单元可具有如式(II-1a)或式(II-2a)所示之结构：
其中，RN1a、RN1b、RN2a、及RN2b系独立选自由氢、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6酰基、及氮保护基团所组成之群组；其中氮保护基可为本技术领域中所熟知的氮保护基团，例如异丁基氧基羰基(t-BOC)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、芐基(Bn)、芐氧羰基(Cbz)、烯丙氧羰基(Aloc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(Teoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)、二苯甲基(Dpm)、三苯甲基(Tr)、9-苯芴基(PhFI)、及对甲氧基苄基(PMB)；[Ab]表示抗体的接点；以及[Cn]表示复合单元的接点。
根据本发明之较佳实施方式，该醣单元可具有如式(II-1b)或式(II-2b)所示之结构：
其中[Ab]表示抗体的接点；以及[Cn]表示复合单元的接点。
根据本发明之部分实施方式，该复合单元可选自由：式(III-1)、式(III-2a)、式(III-2b)、式(III-2c)、式(III-2d)、式(III-3)、式(III-4a)、式(III-4b)、式(III-4c)、及式(III-4d)结构所组成之群组；
其中，
Q系Y1+Y2连接基团(spacer group)，其中Y1和Y2系独立选自由：直接键结、—(CH2)n—、—O—、—NH—、—C(O)—、—C(O)NH—、—NHC(O)—、—(CH2)nO—、—O(CH2)n—、—(CH2)n—C(O)—、—C(O)(CH2)n—、—(CH2)n—NH—、—NH—(CH2)n—、—(CH2)n—NHC(O)—、—C(O)(CH2)n—NHC(O)—、(CH2)nSCH2C(O)—、及—(CH2CH2O)m所组成之群组；
R3a系选自由：氢、卤素、C1-C6烷基所组成之群组；
R3b系独立选自由：氢、卤素、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基、选择性被取代之C1-C24环烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3c系独立选自由：氢、卤素、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3d系独立选自由：氢、卤素、OH、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基所组成之群组；
n为1至8的整数，包含1及8；
m为1至4的整数，包含1及4；
[G]表示醣单元的接点；以及
[L]表示链接单元的接点。
根据本发明之较佳实施方式，链接单元可选自由：式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、及式(IV-5)结构所组成之群组；
其中，
[Cn]表示复合单元的接点；以及
[D]表示药物单元的接点；
并且m和n系独立为0至6的整数，包含0及6。
根据本发明之部分实施方式，该药物(承载物)可选自由：单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素DM1/DM4(MaytansinoidDM1/DM4)、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B、埃博霉素A、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸盐、澳瑞他汀氨基喹啉、Halocombstatins、刺孢霉素θ、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)、吡咯苯并二氮杂卓(PBD)、水鬼蕉碱、环磷酸酯、Cribrostatin-6、Kitastatin、涡轮他汀1-4、海洛因他汀、Silstatins、前微管菌素D(Pretubulysin D)、及微管菌素(Tubulysins，A、B、C、D、E、F、G、H、I、U、V、及Z)所组成之群组。
根据本发明之实施方式，药物单元可以先和链接基结合(在有使用连结基之情况下)，然后再与醣基结合(例如：透过上述复合单元与醣基结合)。若没有使用链接基，药物单元可直接与醣基结合。
连结基和药物之间的结合可以透过本技术领域中任一合适方法所完成。本技术领域中具有通常知识者将依据链接基和药物的性质进而选用特定方法，且本技术领域中具有通常知识者不需过度实验即能够完成此结合。在稍后的段落中将描述部分实施例。一旦制备出药物-链接单元，即可与醣单元结合。
别种可行方式是，连结基可先和醣单元结合，然后再使药物单元与链接基接触。再次说明，这些方法为习知技术，本技术领域中具有通常知识者不需过度实验即能够进行这些反应。
可透过本技术领域中已知的多种利用温和反应条件的方法以结合生物分子。例如：键击化学(click chemistry)属于一种生物兼容性反应，其可用于结合标志和生物分子(可参考H.C.Kolb；M.G.Finn；K.B.Sharpless(2001),"Click Chemistry:DiverseChemical Function from a Few Good Reactions,"Angewandte Chemie,Int’l Ed.,40(11):2004–2021)。一种特别有效的键击化学法系利用无铜、加压的迭氮-炔基环加成法，将迭氮基添加至紧绷式炔基(例如环辛炔)，以形成新颖的五员环(five-membered ring)。此类键击反应的一实例系于下列反应式中说明：
根据本发明部分实施方式，可以利用键击化学法合成用于抗体药物复合体的醣基-链接基单元。例如：醣基单元可包含一迭氮基，且连结基可包含环辛炔基(或相似的炔基)；以此类推。
除了键击化学法以外，其他常用的耦合化学法也可用于本发明之实施方式。这些其他方法，例如可包括：透过加成或取代反应在酮/醛和胺之间形成希夫碱(Schiff base，或肟(oxime))、或形成共价键等。
本发明之实施方式系由以下的实施例加以说明，本技术领域中具有通常知识者可了解这些实施例仅用于举例说明，在不偏离本发明范围的其他修改或变化亦可为之。此外，本技术领域中具有通常知识者可知晓以下实施例中的具体条件或数量。然而，这些具体条件或数量仅用于举例说明而非用于限制本发明之范围。
实施例
实施例1：经醣基化修饰抗体的制备与定性
反应式1：自CT(复合型)醣基制备NKS或NAS醣基
1.1制备NKS/NAS醣基
将CT(复合型)醣基进行唾液酸化以制备NKS/NAS醣基。将SCT(唾液酸化复合型)醣基(50.5mg,25μmol溶于50mM Tris-HCl缓冲液，pH值7.4)于37℃下以唾液酸酶(sialidase)(75单位)处理24小时以获得CT醣基，并使用薄层色层分析仪(Thin LayerChromatography,TLC)监测获得的CT醣基。然后将该溶液于80℃下加热30分钟，利用过滤移除失活的酵素，并将该溶液于真空中浓缩，接着透过G-20胶体层析(洗脱液，90％)纯化出CT醣基粗萃物。
将CT醣基进行酵素法以制备NKS/NAS醣基。简言之，将降钙素(calcitonin,CT)(32.8mg,18μmol)、三磷胞苷酸(cytidine triphosphate,CTP)(5μmol)、ManNAcN3/ManNAcLev(40μmol)、丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)(81μmol)、磷酸烯醇丙酮酸盐(Phosphoenolpyruvate,PEP)(55μmol)、及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)(5μmol)溶于50mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride,Tris-HCl)缓冲液(pH8.0)中。将α-(2,6)-唾液酸转移酶(20单位)、唾液酸醛醇酶(20单位)、CMK(10单位)、丙酮酸激酶I(pyruvatekinase I,Pykf)(10单位)、多聚磷酸(polyphosphoric acid,PPA)(10单位)、及Pmcss(10单位)添加至该溶液中，且使该反应液于37℃下作用8小时，并使用薄层色层分析仪(TLC)监测该反应。待反应终止后，于100℃下加热5分钟使酵素失活。然后，以G25、二乙基氨基乙基(Diethylaminoethyl,DEAE)、及G25管柱纯化所需之NKS/NAS(产率：29.1mg,80％)。ESI-TOF m/z:2130.8349([M-H-]-of NKS),2100.7804([M--H]-of NAS)。
反应式2：NKS-恶唑林(oxazoline)或NAS-恶唑林之合成
1.2形成NKS/NAS-恶唑林的一般流程
将NKS/NAS醣基(13.6mg)及Na2CO3(78.75mg)溶于H2O(1.16mL)中，冷却至4℃，接着添加2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓氯化物(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride,CDMBI)(48mg)并将该反应液于4℃下以1000rpm震荡2小时。该初萃液于3000rpm下离心2分钟，然后收集上清液待进一步纯化。使用尺寸排除管柱(G25)，以0.01％的三乙醇胺/水(TEA(trithanolamine)/H2O)接续100％的H2O进行洗脱，收集产物然后冻干，以得到白色粉末的NKS-恶唑林(NKS-ox)或NAS-恶唑林(NAS-ox)。
NAS-ox：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.09(d,J＝7.2Hz,1H),5.12(s,1H),4.96(s,1H),4.8(d,J＝1.2Hz,1H),4.74(s,1H),4.65-4.57(m,2H),4.44(d,J＝7.6Hz,1H),4.38(t,J＝2.8Hz,1H),4.23-4.13(m,4H),4.06(s,4H),4.25-3.46(61H),3.45-3.38(m,1H),2.67(dd,J＝4Hz,12.8Hz,1H),2.08-2.04(m,9H),1.72(t,J＝12.4Hz,1H)。
NKS-ox：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.05(d,J＝7.2Hz,1H),6.05(s,1H),4.92(s,1H),4.65-4.55(m,2H),4.43-4.34(m,3H),4.2-4.1(m,5H),4.0-3.34(m,72H),2.93-2.75(m,4H),2.63(dd,J＝3.6Hz,12.4Hz,2H),2.58-2.4(m,5H),2.19(s,7H),2.07-1.96(m,11H),1.68(t,J＝12.0Hz,1H)。
反应式3：抗体(1)的醣基化修饰
1.3以单一容器化学酵素合成法的一般流程合成经醣基化修饰的贺癌平，其具有两个修饰过的双分支醣基(TRZ-NKS及TRZ-NAS)
取10mg的贺癌平(Herceptin)溶于100mM的TES缓冲液(pH值7.0)中，再添加1至5μg的EndoS2(或EndoS2的衍生物或突变体)，使最终抗体浓度为10mg/mL。将该溶液于室温下(30℃或37℃)反应1至4小时。然后，另取10-15μg的EndoS2(或EndoS2的衍生物或突变体)添加至得到的贺癌平-N(F)(包含或不包含海藻糖的单GlcNAc；N为GlcNAc且F为海藻糖)，冷却至30℃，然后添加NKS/NAS-ox(6-8mg)，使最终抗体浓度为8mg/mL，再反应1至1.5小时。待反应完成后，经转醣化的贺癌平通过吸附管柱(Protein A)及阴离子交换管柱Capto S(GEHealthcare)纯化。利用SDS-PAGE分析纯化后的醣基化贺癌平(TRZ-NKS及TRZ-NAS)，并将缓冲液置换成磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffered saline,PBS)(pH值7.4)待后续使用。
反应式4：抗体(2)的醣基化修饰
1.4经醣基化修饰的贺癌平后具有两个修饰过的单触角醣基(TRZ-
NGKS)的一般制程
取50mg的TRZ-N溶于Tris缓冲液(pH 7.0)，使最终浓度为10mM的MnCl2，混合1mg的β-1,4-半乳糖转移酶，然后再添加5mg的尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDP-Gal)，将该混合物于37℃下作用8小时，以生成TRZ-NG。接着合成TRZ-NGKS，在MgCl2(10mM)溶于Tris-HCl(100mM)缓冲液(pH值8.0)中，将TRZ-NG与5mmol的N-乙烯神经胺酸(Neu5Ac)、0.05mmol的ATP、0.5mmol的CTP、10mmol的PEP混合，再加入50U的胞嘧啶核苷单磷酸激酶(CMK)、120U的CMP-唾液酸合成酶(CSS)、100U的丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)、100U的PPA及150U的α-2,6-唾液酸转移酶。将烧瓶置于25℃下作用至反应完成。利用质谱仪完善监控反应原料和产物(第2图)。
1.5醣基性质分析
利用GlycoWorks RapiFluor-MS N-醣基套组分析TRZ-NKS和TRZ-NAS的醣基特性。根据操作手册，从抗体水解出醣基并标志上醣苷胺。标志步骤后，利用HILIC SPE微洗脱板(μElution plate)纯化样品。纯化后的醣基利用Xevo G2-XS QToF结合Waters H-classUHPLC进行分析。利用ACQUITY UPLC醣基BEH酰胺管柱(2.1mm X 150mm,1.7μm,WatersCorp,Milford,MA)以50分钟梯度于0.4mL/min流速下分离出醣基样品。移动相A由50mM的甲酸铵(溶于ddH2O)所组成，以及移动相B由乙腈所组成。醣基分析是透过操作Xevo G2XSQToF质谱仪在FastDDA模式下收集数据。
第3图显示TRZ、TRZ-NKS及TRZ-NAS的醣基特性比较结果。TRZ呈现出4.2％水平以上的高甘露糖型的N-醣基特性。相反地，TRZ-NKS及TRZ-NAS不具高甘露糖型的N-醣基。大多数从TRZ-NKS及TRZ-NAS释放出来的醣基为经修饰的唾液酸化(Neu5AcN3及Neu5AcLev)双分支复合型醣基。
实施例2：承载物(A01-A24)的制备和特性
表1：经设计的承载物
2.1化合物9(A11)之合成与特性
制备化合物2
在化合物1(500.0mg,1.03mmol)溶于20ml EtOAc之溶液中添加NaBH(OAc)3(500.0mg,1.54mmol)，并于室温下搅拌反应20小时。将该反应混合物用EtOAc稀释并以1N的HCl、饱和NaHCO3水溶液及卤水清洗。该有机萃取层使用MgSO4进行干燥后浓缩以得到用于下一步骤的黄色固体化合物(485.0mg)。将上述所得的化合物(450.0mg,0.93mmol)、咪唑(69.4mg,1.02mmol)及4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)(11.4mg,0.093mmol)溶于30ml的CH2Cl2溶液中，再添加重量为154.0mg、浓度为1.02mmol的叔丁基二甲基氯硅烷(tert-ButyldiMethylsilyl chloride,TBDMSCl)，将该反应液于室温下搅拌15小时。将该反应混合物以CH2Cl2稀释，并以1N之HCl、饱和NaHCO3水溶液及卤水清洗。该有机萃取层使用MgSO4进行干燥后浓缩以得到黄色固体的化合物2(490.0mg)。88％1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(t,J＝1.6Hz,1H),8.08(dd,J＝2.8,9.2Hz,1H),7.00(d,J＝9.2Hz,1H),5.33(m,3H),5.23(d,J＝6.8Hz,1H),4.70(d,J＝15.6Hz,1H),4.56(d,J＝15.6Hz,1H),4.23(d,J＝8.8Hz,1H),3.69(s,3H),2.03(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),0.94(s,9H),0.10(s 3H),0.10(s,3H)。
制备化合物3
将Pd(OH)2添加至溶有化合物2(1.0g,1.67mmol)的20ml之EtOAc/MeOH(9:1)溶液中。此反应系统经抽真空后以H2填充三次，利用球型瓶使该反应系统保持在H2环境下，并于室温下搅拌1小时。待反应完成后，过滤移除Pd(OH)2。蒸发该滤出物以得到用于下一步骤的化合物2-1(930.0mg)。在溶有化合物2-1(930.0mg,1.63mmol)及琥珀酸酐(180.0mg,1.80mmol)的20ml CH2Cl2溶液中添加TEA(272uL)。将该反应液于室温下搅拌15小时后，利用管柱抽真空并纯化以得到黄色油状的化合物3(2.78g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.09(s,1H),7.59(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.39(d,J＝2.4Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.27(m,3H),5.01(d,J＝6.8Hz,1H),4.69(d,J＝14.8Hz,1H),4.58(d,J＝14.8Hz,1H),4.09(d,J＝8.4Hz,1H),3.70(s3H),2.88(q,J＝7.2Hz,8H),2.59(bs,4H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.17(t,J＝7.2Hz,9H),0.92(s,9H),0.08(s,6H)。
制备化合物5
在溶有化合物3(289.0mg,0.432mmol)、化合物4(200mg,0.648mmol)、及羟基苯并三唑(Hydroxybenzotriazole,HOBT)(100.0mg,0.648mmol)之CH2Cl2溶液中添加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDCI)(100.0mg,0.648mmol)。将该反应液于室温下搅拌14小时后，将该溶液抽真空。利用管柱纯化该粗萃物，以得到黄色油状之化合物5(340.0mg,0.35mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.78(s,1H),8.10(s,1H),7.53(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.41(d,J＝2.4Hz,1H),6.85(d,J＝8.8Hz,1H),6.75(bs,1H),5.30(m,3H),5.01(d,J＝7.2Hz,1H),4.68(d,J＝15.2Hz,1H),4.59(d,J＝15.2Hz,1H),4.10(m,1H),3.95(m,2H),3.70(s,3H),3.70-3.15(m,12H),3.40(m,2H),2.60(m,4H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.43(s,9H),0.92(s,9H),0.07(s,6H)。
制备化合物6
在溶有化合物5(300.0mg,0.312mmol)的四氢呋喃(THF)溶液(25mL)中添加375uL的四丁基氟化铵(Tetrabutylammonium fluoride,TBAF)，于室温下搅拌15小时。将该溶液抽真空后，利用管柱纯化该粗产物，以得到黄色油状之化合物6(235.0mg,0.28mmol)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.27(s,1H),7.51(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.40(d,J＝2.4Hz,1H),7.15(bs,1H),6.9(d,J＝8.8Hz,1H),5.30(m,3H),5.02(d,J＝7.6Hz,1H),4.68(d,J＝15.2Hz,1H),4.40(d,J＝15.2Hz,1H),4.12(m,1H),3.98(m,2H),3.67(s,3H),3.66-3.50(m,12H),3.40(m,2H),2.60(m,4H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.42(s,9H)。
制备化合物7
将化合物6(100.0mg,0.12mmol)溶于5mL之CH2Cl2并冷却至0℃。将TEA(24.0mg,0.24mmol)、DMAP(14.7mg,0.12mmol)、对硝基苯氯甲酸酯(PNP Chloroformate)(47.7mg,0.24mmol)添加至该混合物中，于室温下搅拌3小时。将该反应混合物以CH2Cl2稀释，并以1N之HCl、饱和NaHCO3水溶液及卤水清洗。该有机萃取层使用MgSO4进行干燥后浓缩，利用管柱纯化该粗萃物以得到用于下一步骤的化合物A01-6。在溶有A01-6(95.0mg,0.094mmol)及MMAE(67.5mg,0.094mmol)的THF之溶液(4mL)中，加入TEA(19.0mg,0.188mmol)进行处理。将该反液混合物于室温下搅拌48小时，待反应完成后，将35mL的乙酸乙酯(EA)及20mL的HCl(0.5N)添加至该溶液中。该有机萃取层使用MgSO4进行干燥后浓缩，利用管柱纯化该粗萃物以得到黄色油状的化合物7(98.0mg,0.06mmol)。(ESI-TOF m/z:1587.8759[M-H]-)。
制备化合物8
将化合物7(20.0mg,0.013mmol)溶于2.5mL之甲醇与水混合溶液(MeOH：H2O＝4：1)中，于0℃加入Na2CO3处理，将该反应混合物于室温下搅拌3小时。待反应完成后，在减压环境下移除该有机层。该剩余物利用C18管柱纯化后得到化合物8(15.2mg,0.010mmol,77.0％)。ESI-TOF m/z:1471.7639[M+Na+]。
制备化合物9
将化合物8(10mg,2.99mmol)溶于2ml的CH2Cl2，再添加0.25ml TFA，于室温下搅拌1小时。浓缩该溶液并利用C18管柱纯化该剩余物，得到化合物9(6.5mg,77％)。ESI-TOF m/z:1347.7178[M-H]-。
2.2化合物15(A02)之合成与特性
制备化合物11
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸3(109mg,0.16mmol)及炔基-PEG4-胺10(60mg,0.16)溶于CH2Cl2(5mL)，再于该溶液中添加EDCI(46.4mg,0.244mmol)、HOBt(2.5mg,0.015mmol)及DMAP(6.2mg,0.05mmol)。4小时后，移除溶剂，接着透过硅胶柱层析法(silica gel chromatography)(依序以20％EA/己烷、50％EA/己烷洗脱)纯化该反应混合物，藉以得到103mg(73％)的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(化合物11)。然后，将化合物11(95mg,0.108mmol)溶于砒啶(9mL)及醋酸(3mL)的溶液中，再添加TBAF(0.5mL,1M溶于THF)。12小时后，移除溶剂，接着透过依序以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2洗脱的硅胶柱层析法纯化该反应混合物，藉此以得到66.4mg(80％)的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OH-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB-succinate-alkynyl-PEG4)(化合物12)。将得到的化合物12悬浮于无水CH2Cl2(2.6mL)中，添加砒啶(122μL,0.88mmol)和4-硝基氯化苯甲酰(74mg,0.36mmol)。2小时后，移除溶剂并利用硅胶柱层析法纯化(依序以CH2Cl2(100％)、及5％的MeOH/CH2Cl2洗脱)，藉此以得到46.6mg(58％)的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OpNP-PAB-succinate-alkynyl-PEG4)(化合物13)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.12(s,1H),8.24(d,J＝2.04Hz,2H),7.57(d,J＝2.44Hz,1H),7.5(d,J＝8.88Hz,1H),7.39(d,J＝7.12Hz,1H),6.98(d,J＝8.88Hz,1H),6.76(t,J＝2.74Hz,1H),5.37-5.28(m,3H),5.24(dd,J＝11.92Hz,24.04Hz,2H),5.1(d,J＝14.32Hz,1H),4.16(d,J＝9.08Hz,1H),4.13(d,J＝2.4Hz,2H),3.69(s,3H),3.67-3.6(m,8H),3.59-3.56(m,4H),3.5(t,J＝4.8Hz,1H),3.41(t,J＝4.8Hz,1H),2.62(ddd,J＝4.6Hz,7.76Hz,16.12Hz,4H),2.41(t,J＝2.36Hz,1H),2.35(s,1H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.0(s,3H)。
制备化合物14
将MMAE(30mg,0.043mmol)溶于THF(2.0mL)和砒啶(0.5mL)之混合液中，再添加N,N-二异丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine,DIPEA)(80μL)、HOBt(1.5mg,0.01mmol)及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(化合物13)(40mg,0.043mmol)。48小时后，移除溶剂并利用硅胶柱层析法纯化(依序以CH2Cl2(100％)及7.5％MeOH/CH2Cl2洗脱)，以得到38.4mg(59％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基l-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(2,3,4-tri-Ac-6-methy l-Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-alkynyl-PEG4)(化合物14)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.0(m,1H),7.67-7.25(m.6H),7.24-6.9(m,3H),6.81(s,1H),6.7-6.45(m,2H),5.42-5.29(m,4H),5.29-4.88(m,4H),4.8-4.55(m,2H),4.22(bs,1H),4.15(s,3H),4.12-4.0(m,3H),3.85-3.23(m,33H),3.1-2.75(m,6H),2.73-2.5(m,5H),2.42(d,J＝2.0Hz,1H),2.4-2.3(m,4H),2.3-2.16(m,2H),2.15-2.07(m,5H),2.06(s,9H),1.8-1.0(m,33H).ESI-TOF m/z:1408.7366[M+Na]+。
制备化合物15
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(化合物14)(30mg,0.02mmol)溶于MeOH(1.0mL)，再于该溶液中添加Na2CO3(7mg,0.063mmol)。1小时后，将H2O(40μL)加入反应混合物中，并且于室温下再搅拌1小时。利用IR-120中和该反应液，经过滤后将该粗萃物抽真空，并以C18管柱纯化(依序以100％H2O及50％的乙腈/H2O洗脱)，接着得到12.3mg(44.5％)的6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-alkynyl-
PEG4)(化合物15)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(m,1H),7.68(d,J＝7.9Hz,1H),7.5-6.8(m,8H),5.38(d,J＝6.7Hz,1H),5.37-5.15(m,1H),5.0(d,J＝6.7Hz,1H),4.9(s,1H),4.85-4.52(m,3H),4.35-4.16(bs,2H),4.15(d,J＝2.36Hz,3H),4.1-3.2(m,32H),3.14-2.97(m,2H),2.86-2.75(m,3H),2.68-2.54(m,4H),2.43(t,J＝2.36Hz,1H),2.4-1.5(m,13H),1.4-1.23(m,1H),1.22(s,2H),1.2(s,1H),1.12-1.0(m,1H),0.98-0.45(m,20H).ESI-TOF m/z:1408.7366[M+Na]+。
2.3化合物23(A03)之合成与特性
制备化合物17
将p-甲苯磺酰氯(30g,157mmole)溶于CH2Cl2(100mL)之溶液，逐滴加入含有四乙二醇(60g,308mmole)及三乙基胺(47mL,337mmole)之二氯甲烷溶液(100mL)中，于室温下搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，并以CH2Cl2清洗。该滤液于真空浓缩后，使用快速管柱层析进行纯化(使用硅胶体，含有10-20％之乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油状中间物(40g,115mmole)。然后，将上述得到的化合物(40g,115mmole)加入含迭氮化钠(20g,307mmole)之N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于80℃搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，并以CH2Cl2清洗。该滤液于真空浓缩后，使用快速管柱层析进行纯化(使使用硅胶体，含有50至70％之乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油状产物(化合物17)(24g,109.5mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)3.67(t,J＝4.0Hz,2H),3.62-3.61(m,10H),3.57-3.55(m,2H),3.34(t,J＝2.4Hz,2H),2.66(s,1H)。
制备化合物18
将p-甲苯磺酰氯(26g,136.8mmole)溶于CH2Cl2(40mL)之溶液，逐滴加入含有化合物17(24g,109.5mmole)及三乙基胺(19mL,136.8mmole)之二氯甲烷溶液(40mL)，于室温下搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，并以CH2Cl2清洗。该滤液于真空浓缩后，使用快速管柱层析进行纯化(使用硅胶体，含有25-30％乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油状的甲苯磺酰化产物(34.7g,93mmole)。然后，将上述得到的甲苯磺酰化产物(10g,26.78mmole)加入N-Boc-羟胺(5.35g,40mmole)之二氯乙烷(30mL)溶液中，再添加DBU(8.07mL,54mmole)后，于室温下搅拌72小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，该溶液已被浓缩。使用快速管柱层析进行纯化该粗萃物(使用硅胶体，含有35-30％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到油状产物(化合物18)(5.37g，产率60％)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C13H26N4O6Na，计算值：357.1745，实测值：357.1736。
制备化合物20
将化合物18(1.4g,4.2mmole)及三苯基膦(2.89g,11mmole)加入二氯甲烷(20mL)溶液中，于室温下搅拌隔夜，该滤液于真空浓缩后，剩余物使用快速管柱层析(硅胶体，含有90％乙酸乙酯的己烷溶液)进行纯化，以得到油状产物(1.09g,3.53mmole)。然后，将化合物19(1.46g,5.52mmol,1.0eq)及上述所得之中间化合物(1.09g,3.53mmole)加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(90mL)溶液中，再添加EDCI-HCl(1.06g,6.83mmol)及HOBt(0.34g,2.52mmol)。使用快速管柱层析(硅胶体，含有2％之MeOH的乙酸乙酯溶液)对该粗产物进行纯化，以得到油状产物(化合物20)(1.38g,2.49mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.78(s,1H),7.35-7.26(m,5H),6.26(s,1H),5.07(s,2H),3.99-3.97(m,2H),3.70-3.68(m,2H),3.67-3.58(m,8H),3.53(t,J＝4.8Hz,2H),3.42-3.39(m,2H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),2.12(t,J＝7.2Hz,2H),1.64-1.54(m,4H),1.44(s,9H),1.30-1.27(m,4H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C28H46N2O9Na，计算值：577.3096，实测值：577.3080。
制备化合物21
将化合物20(1.38g,2.49mmole)和Pd/C(0.4g)溶于甲醇(10mL)溶液，于氢气环境下搅拌之。待搅拌14小时隔夜后，使用硅藻土片过滤出Pd/C，并以甲醇清洗。该溶液于真空中浓缩后，使用快速管柱层析(硅胶体，含有2％之MeOH的CH2Cl2溶液)对该剩余物进行纯化，以得到油状产物(化合物21)(0.5146g,1.1mmole)。H NMR(400MHz,CDCl3)7.98(s,1H),6.45(s,1H),4.00-3.98(m,2H),3.70-3.68(m,2H),3.64-3.61(m,8H),3.54(t,J＝4.4Hz,2H),3.43-3.41(m,2H),2.30(t,J＝6.8z,2H),2.16(t,J＝7.6Hz,2H),1.64-1.54(m,4H),1.45(s,9H),1.32-1.31(m,4H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C21H40N2O9Na，以得计算值：487.2626，实测值：487.2625。
制备化合物22
将化合物21(30mg,0.0646mmol)和MMAE(35.5mg,0.0494mmol)溶于DMF(2mL)中，于0℃下依序添加焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC)(0.31g,0.181mmole)及DIPEA(0.03mL,0.181mmol)，该混合物于0℃至室温环境下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，使用快速管柱层析(硅胶体，含有6-10％之MeOH的CH2Cl2溶液)对该剩余物进行纯化，以得到油状产物22(52.6mg,0.0452mmole)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C21H40N2O9Na，以得计算值：1186.7561，实测值：1186.7567。
制备化合物23
将化合物22溶于二氯甲烷(DCM)(0.7mL)之溶液中，于0℃下缓慢添加TFA(0.3mL)，于室温下搅拌该反应混合物2小时。经浓缩后，使用快速管柱层析(硅胶体，含有6-10％MeOH之CH2Cl2溶液)对该粗产物进行纯化，以得到油状产物(化合物23)(33.6mg,0.032mmol)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C13H26N4O6Na，以得计算值：1086.7037，实测值：1086.7113。
2.4化合物25(A04)之合成与特性
制备化合物24
将四乙二醇16(40g,207mmole)及氢化钠(4.8g,120mmole)加入四氢呋喃(250mL)溶液中，于0℃下再添加溴丙炔(7.4mL,69mmole)，并于室温下搅拌该反应混合物16小时。当薄层色层分析仪(TLC)显示起始原料被完全消耗时，表示已浓缩该溶液。利用二氯甲烷(CH2Cl2)(4x 30mL)和水(H2O)对剩余物进行萃取，将有机层集中后使用硫酸镁(MgSO4)干燥，干燥后过滤。于真空中浓缩该滤出物后，使用快速管柱层析(硅胶体，含有15％乙酸乙酯的己烷溶液)对剩余物进行纯化，得到油状产物24(14g,60.3mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.17-4.16(m,2H),3.70-3.62(m,14H),3.59-3.56(m,2H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C11H20O5Na，计算值：255.1203，实测值：255.1202。
制备化合物25
将化合物24(920mg,3.96mmol)溶于70mL二氯甲烷之溶液，并添加戴斯-马丁过碘烷(Dess-Martin Periodinane；2.25g,5.30mmol)于该溶液中。在环境温度下隔夜搅拌该反应混合物。利用溶于60mL的饱和碳酸氢钠之亚硫酸氢钠终止反应。将该混合物分离，以饱和碳酸氢钠、卤水洗涤有机层，并以硫酸钠进行干燥，过滤后于真空中浓缩。利用快速管柱层析法纯化该剩余物以得化合物(0.54g,2.345mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)9.69(s,1H),4.16-4.13(m,2H),3.71-3.62(m,14H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H)。将上述得到的化合物(12.8mg,0.0556mmol)及16μL醋酸添加至溶有MMAE(10mg,0.0139mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)之溶液(0.286mL)中，接着添加2mg之氰基硼氢化物。将该反应混合物于室温下搅拌2小时，该反应混合物经浓缩并以快速管柱层析法纯化，藉此得到化合物25(10mg,0.0107mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C50H85N5O11Na，计算值：954.6138，实际值：954.6303。
2.5化合物31(A05)之合成和特性
制备化合物27
将Boc-Val-Cit-PAB-OH(化合物26)(100mg,0.2mmol)悬浮于无水CH2Cl2(1.8mL)溶液中，并添加TFA(0.45mL)。于0℃下搅拌该反应液10分钟，然后回温至室温后再搅拌30分钟。将该反应混合物蒸馏至干燥(以甲苯共沸3次)后，不需进一步纯化便可得到Val-Cit-PAB-OH(化合物27)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.3-6.99(m,5H),4.47(m,1H),4.44(s,1H),3.86(s,3H),3.05(m,2H),2.11(m,1H),1.7(m,1H),1.58(m,1H),1.5(m,2H),0.95(q,6H)。
制备化合物29
将得到的化合物27及炔基-PEG4-COOH(化合物28)(58mg,0.2mmol)悬浮于无水CH2Cl2(2.0mL)中，再添加HOBt(2.7mg,0.02mmol)及EDCI(57mg,0.3mmol)。12小时后，移除溶剂并透过硅胶柱层析纯化(以CH2Cl2(100％)接着10％的MeOH/CH2Cl2进行洗脱)，以得到80.8mg(62％)之炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OH(化合物29)。将化合物29(80mg,0.12mmol)悬浮于无水DMF(2mL)，然后再添加砒啶(58μL,0.72mmol)及硝基苯甲酰氯(66.8mg,0.36mmol)。2小时后，移除溶剂并以硅胶柱层析纯化(依序以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2进行洗脱)，以得到63.7mg(65％)的炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP(化合物30)。接着，将MMAE(33.4mg,0.047mmol)溶于DMF(1.5mL)和砒啶(0.5mL)之混合溶液中，再添加DIPEA(72μL)、HOBt(2mg,0.014mmol)及炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP(alkynyl-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP，化合物30)(38mg,0.047mmol)。48小时后，移除溶剂并以硅胶柱层析纯化(依序以CH2Cl2(100％)及15％MeOH/CH2Cl2进行洗脱)该反应混合物，以得到30mg(45％)之炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(alkynyl-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物31)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.48(d,J＝7.88Hz,2H),7.3-7.05(m,7H),5.14-4.9(m,2H),4.6-4.37(m,3H),4.19(dd,J＝2.76Hz,7.12Hz,1H),4.15-4.09(m,2H),4.07(d,J＝2.36Hz,2H),3.78(s,2H),3.64-3.57(m,5H),3.56-3.53(m,8H),3.51(s,4H),3.3(t,J＝10.8Hz,1H),2.45(d,J＝3.32Hz,1H),3.17(s,1H),3.15-2.95(m,3H),2.85-2.8(m,3H),2.75(t,J＝2.36Hz,1H),2.45-2.35(m,2H),2.15-1.57(m,11H),1.45(m,4H),1.35-1.13(m,9H),1.07(q,3H),1.03(t,J＝7.08Hz,3H),1.0-0.55(m,25H).ESI-TOF m/z:1417.8368[M+Na]+。
2.6化合物35(A06)之合成与特性
制备化合物32
将含有氰化钠(1.93g,48.25mmole)及1-迭氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷(1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecane,5g,22.80mmole)之四氢呋喃(200mL)溶液，于0℃下将溴丙炔(6mL,69.6mmole)添加至该溶液中并于室温下搅拌16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，即表示该溶液已被浓缩，利用CH2Cl2(4×30mL)和H2O对剩余物进行萃取，将有机层集中后使用MgSO4干燥，干燥后过滤。该滤出物于真空中浓缩后，使用快速管柱层析进行纯化(使用硅胶体，含有35％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到油状产物(化合物32)(5.4g,20.9mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.17(d,J＝2.4Hz,2H),3.67-3.64(m,14H),3.36(t,J＝5.2Hz,2H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C11H19N3O4Na，计算值：280.1268实测值：280.1270。
制备化合物33
将三苯基膦(3.68g,14mmole)和化合物32(2.9g,11.3mmole)加入四氢呋喃(40mL)溶液中并搅拌之。于室温下搅拌隔夜后，于真空中浓缩该溶液，且利用快速管柱层析(硅胶体，含有80％MeOH的CH2Cl2溶液)对剩余物进行纯化以得到油状产物33(2.4g,10.376mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.17-4.16(m,2H),3.65-3.57(m,14H),2.83(t,J＝4.8Hz,2H),2.40(t,J＝2.0Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C11H21NO4Na，计算值：232.1543，实测值：232.1615。
制备化合物34
将化合物33(0.34g,1.47mmole)和琥珀酸酐(0.18g,1.79mmole)溶于四氢呋喃(12mL)中，再添加三乙基胺(0.35mL,2.51mmole)并于室温下搅拌2小时。该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，含有5-6％MeOH的CH2Cl2溶液)纯化该剩余物以得到油状产物34(2.4g,10.376mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)6.79(s,1H),4.16(d,J＝2.4Hz,1H),3.68-3.58(m,12H),3.52(t,J＝4.8Hz,2H),3.43-3.39(m,2H),2.64(t,J＝6Hz,2H),2.51(t,J＝7.2Hz,2H),2.42(t,J＝2.4Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C15H25NO7Na，计算值：354.1523，实测值：354.1548。
制备化合物35
于0℃下依序将DEPC(0.014g,0.0863mmole)和DIPEA(0.021mL,0.127mmol)添加至含有化合物34(24.5mg,0.0739mmol)及MMAE(30mg,0.0418mmol)溶于DMF(2.75mL)之溶液中，并于0℃下搅拌该混合物16小时。该反应混合物接着于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，含有4-7％MeOH之CH2Cl2溶液)纯化该剩余物，以得到油状产物35(25.9mg,0.0251mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C54H90N6O13Na，计算值：1053.6458，实测值：1053.6604。
2.7化合物38(A07)之合成与特性
制备化合物36
将化合物24(1.14g,4.908mmole)及氢化钠(0.245g,6.125mmole)溶于四氢呋喃(24mL)溶液中，再于0℃下逐滴加入溴乙酸甲酯(0.67mL,6.865mmole)，并于室温下搅拌该混合物16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，利用MeOH终止反应，使用硅藻土片过滤，并以MeOH清洗。集中过滤物和清洗物，于减压下浓缩，使用快速管柱层析对该剩余物进行纯化(硅胶体，含有70％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到油状产物(化合物36)(1.18g,3.877mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.10(d,J＝2.4Hz,1H),4.07(s,2H),3.65(s,3H),3.64-3.56(m,16H),2.36(t,J＝2.4Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MH+)计算C14H25O7，以得计算值：305.1595，实测值：305.1599。
制备化合物37
将化合物36(1.18g,3.877mmole)、水(6mL)、及LiOH(0.188g,7.85mmole)溶于四氢呋喃(10mL)之溶液，于室温下搅拌2小时，加入1N的HCl(10mL)终止反应，再利用乙酸乙酯和卤水进行分离。收集有机层以使用乙酸乙酯(50mL×4)萃取水相层。集中的有机层经浓缩后利用快速管柱层析法(硅胶体，10-15％MeOH溶于CH2Cl2溶液)对剩余物进行纯化以得到油状产物(化合物37)(0.6g,2.07mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.01(d,J＝2.4Hz,1H),3.99(s,2H),3.56-3.48(m,16H),2.35(t,J＝2.0Hz,1H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C13H22O7Na，计算值：313.1258，实测值：313.1261。
制备化合物38
将化合物37(38.8mg,0.1337mmol)及MMAE(51mg,0.071mmol)溶于DMF(4mL)，于0℃下依序添加DEPC(0.0334g,0.206mmole)及DIPEA(0.034mL,0.206mmol)溶液中，且该混合物于0℃至室温下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，4-6％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，以得到油状产物(化合物38)(49.2mg,0.0497mmole)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C52H87N5O13Na，以得计算值：1012.6193，实测值：1012.6186。
2.8化合物44(A08)之合成和特性
制备化合物40
取2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OTBS-PAB-胺(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB-amine，化合物2-1，44mg,0.077mmol)及DBCO-PEG4-酸(DBCO-PEG4-acid，化合物39)(45mg,0.077)溶于CH2Cl2(4mL)中，再添加EDCI(22.5mg,0.117mmol)、HOBt(1.2mg,0.008mmol)及DMAP(3mg,0.025mmol)。6小时后，移除溶剂，且利用硅胶体层析法对反应混合物进行纯化(依序以20％EA/己烷及75％EA/己烷进行洗脱)，得到56.7mg(64.8％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-PEG4-DBCO(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB-PEG4-DBCO，化合物40)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65-7.59(m,1H),7.58-7.55(m,1H),7.46(t,J＝2.52Hz,2H),7.4-7.26(m,5H),7.23-7.18(m,1H),6.87(dd,J＝1.04Hz,8.8Hz,1H),5.35-5.21(m,4H),5.1(dd,J＝1.36Hz,13.84Hz,1H),5.04(dd,J＝4.4Hz,7.12Hz,1H),4.64(dd,J＝14..84Hz,44.64Hz,1H),4.12(dd,J＝3.25Hz,9.08Hz,1H),3.84-3.68(m,5H),3.68-3.49(m,12H),3.43(t,J＝5.28Hz,2H),3.31(t,J＝2.36Hz,2H),2.47(q,J＝6.36Hz,1H),2.37-2.13(m,2H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.0(s,3H),1.97-1.91(m,2H),2.91-1.8(m,1H),1.48-1.17(m,6H),0.91(s,9H),0.07(s,6H)。
制备化合物41
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-PEG4-DBCO(化合物40)(56mg,0.05mmol)溶于含砒啶(0.63mL)及醋酸(0.42mL)之混合物中，然后再添加TBAF(72μL,1M in THF)。12小时后，移除溶剂，且利用硅胶柱层析法(以20％EA/己烷及85％EA/己烷进行洗脱)纯化该反应混合物，以得到50.2mg(98.6％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OH-PAB-PEG4-DBCO(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB-PEG4-DBCO，化合物41)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),7.64(dd,J＝5.7Hz,9.9Hz,2H),7.45-7.28(m,6H),6.89(dd,J＝1.07Hz,7.9Hz,1H),5.37-5.29(m,1H),5.24(d,J＝8.16Hz,2H),5.18(d,J＝12.2Hz,2H),5.06(t,J＝4.36Hz,1H),4.65(d,J＝13.2Hz,1H),4.38(dd,J＝1.07Hz,8.9Hz,1H),4.0(dd,J＝8.07Hz,8.9Hz,1H),3.73(t,J＝5.68Hz,1H),3.67(s,3H),3.65-3.46(m,13H),3.42(t,J＝5.12Hz,2H),3.28(d,J＝4.6Hz,2H),2.53(t,J＝5.65Hz,1H),2.22-2.12(m,1H),2.05(s,3H),2.02(s,2H),2.01(s,3H),2.0(s,3H),1.93-1.89(q,J＝4.1Hz,2H),1.87-1.69(m,2H),1.45-1.15(m,8H)。
制备化合物42
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OH-PAB-PEG4-DBCO(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB-PEG4-DBCO，化合物41)(50mg,0.049mmol)悬浮于无水CH2Cl2(1mL)中，再添加砒啶(40μL,0.49mmol)及4-硝苯甲酰氯(41.4mg,0.197mmol)。2小时后，移除溶剂，且利用硅胶柱层析法对该反应混合物进行纯化(依序以20％EA/己烷及60％EA/己烷进行洗脱)以得到36.3mg(62.2％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB-PEG4-DBCO(化合物42)。将MMAE(25.3mg,0.035mmol)溶于THF(1.6mL)及砒啶(0.4mL)之混合液中，再添加DIPEA(48μL)、HOBt(2mg,0.014mmol)、及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB-PEG4-DBCO(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OpNP-PAB-PEG4-DBCO，化合物42)(36mg,0.03mmol)于该溶液中。48小时后，移除溶剂，并利用硅胶柱层析法(以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2进行洗脱)纯化该反应混合物，以得到29mg(55％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-PEG4-DBCO(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB-PEG4-DBCO，化合物43)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.8(m,1H),7.7-7.18(m,14H),7.17-6.87(m,1H),6.66-6.3(m,2H),5.5-5.2(m,4H),5.5-4.88(m,2H),4.87-4.59(m,2H),4.35-3.95(m,6H),3.85(d,J＝9.2Hz,1H),3.79-3.68(m,7H),3.68-3.47(m,16H),3.44(t,J＝5.16Hz,2H),3.37(s,3H),3.36-3.3(m,2H),3.27(s,3H),2.98(s,2H),2.88(s,2H),2.67-2.02(m,18H),2.01(s,9H),1.92(bs,2H),1.81(bs,2H),1.77-1.59(m,3H),1.5-1.15(m,11H),1.14-0.76(m,20H),0.65(d,J＝3.34Hz,1H).ESI-TOFm/z:1784.8878[M+Na]+。
制备化合物44
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-PEG4-DBCO(化合物43)(10mg,0.005mmol)溶于MeOH(0.5mL)中，再将Na2CO3(1.62mg,0.015mmol)加至该溶液中。1小时后，对该反应液添加H2O(48μL)并室温下再搅拌1小时。以IR-120中和该反应液，经过滤后蒸馏粗萃物，并透过C18管柱(依序以100％的H2O(纯水)及30％乙腈/H2O洗脱)纯化该粗翠物，以得到5mg(62％)之葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-PEG4-DBCO(Glucuranate-2’-MMAE-PAB-PEG4-DBCO)5的化合物44。ESI-TOF m/z:1619.8361[M-H]-。
2.9化合物50(A09)之合成及特性
制备化合物46
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸(化合物3)(136mg,0.2mmol)及BCN-PEG4-胺(化合物45)(74.4mg,0.2mmol)溶于CH2Cl2(7.8mL)中，再添加EDCI(58mg,0.305mmol)、HOBt(3.1mg,0.019mmol)及DMAP(7.8mg,0.063mmol)于该溶液中。4小时后，移除溶剂，并利用硅胶柱层析法对反应混合物进行纯化(依序以20％EA/己烷及60％EA/己烷进行洗脱)，以得到135mg(65％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB-succinate-PEG4-BCN,，化合物46)。将上述得到的化合物溶于砒啶(9mL)及醋酸(3mL)之混合物中，再添加TBAF(0.5mL,1M溶于THF)。12小时后，将溶剂移除，并利用硅胶柱层析法(依序以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2进行洗脱)纯化该反应混合物，以得到100mg(85％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物47)。ESI-TOF m/z:928.3738[M+Na]+。
制备化合物48
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(化合物47)(100mg,0.11mmol)悬浮于无水CH2Cl2(3.24mL)中，再添加砒啶(89.6μL,1.1mmol)及4-硝基苯甲酰氯(92.7mg,0.45mmol)。2小时后，移除溶剂，利用硅胶柱层析法依序CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2洗脱以纯化该反应混合物，得到82.3mg(69.8％)之2,3,4-tri-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OpNP-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物48)。然后，取MMAE(63.3mg,0.088mmol)溶于THF(4.0mL)及砒啶(1.0mL)之混合物中，再添加DIPEA(120μL)、HOBt(3mg,0.021mmol)及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN 48(82.3mg,0.0768mmol)。48小时后，将溶剂移除并利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及7.5％MeOH/CH2Cl2进行洗脱以纯化该反应混合物，得到50mg(34.4％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物49)。将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(化合物49)(50mg,0.03mmol)溶于MeOH(1.2mL)中，再添加Na2CO3(10mg,0.095mmol)。1小时后，添加H2O(60μL)至该反应混合物并再搅拌1小时。利用IR-120中和反应，经过滤后蒸馏粗萃物，并透过以C18管柱依序以100％H2O及35％乙腈/H2O洗脱)以纯化该粗萃物，以得到14.2mg(31.4％)之葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN(Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物50)。1HNMR(400MHz,D2O)δ7.62-7.17(m,8H),5.26(s,2H),5.01(s,1H),4.75-4.42(m,2H),4.4-4.17(m,2H),4.01(bs,3H),3.83(bs,1H),3.73-3.51(m,18H),3.5-3.26(m,12H),3.15(s,2H),3.05(d,J＝6.44Hz,2H),3.01-2.9(m,3H),2.84-2.42(m,6H),2.21(s,3H),2.16(bs,6H),1.92-1.77(m,2H),1.72-1.56(m,1H),1.54-1.39(m,3H),1.39-1.23(m,4H),1.22-1.12(m,3H),1.08(d,J＝6.48Hz,2H),0.98(d,J＝6.55Hz,2H),0.95-0.6(m,19H).ESI-TOF m/z:1507.8027[M-H]-。
2.10化合物54(A10)之合成与特性
制备化合物51
经氰化钠(0.42g,10.50mmole)及四乙二醇(化合物16)(6g,30.89mmole)加入四氢呋喃(120mL)之溶液，再于0℃下逐滴加入溴乙酸甲酯(1.25mL,10.5mmole)，于室温下搅拌该混合物16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，以MeOH终止反应，使用硅藻土片过滤，并以MeOH清洗。将过滤物和清洗物集中并于减压下浓缩，使用快速管柱层析(硅胶体，4-6％MeOH溶于CH2Cl2)纯化该剩余物，以得到油状产物(1.843g,6.92mmole)。
将上述所得之化合物(0.49g,1.84mmole)及三乙基胺(0.7mL,5.02mmole)加入二氯甲烷(10mL)溶液，再添加溶于CH2Cl2(20mL)之P-甲苯磺酰氯(0.56g,2.937mmole)，于室温下搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，再以CH2Cl2清洗。过滤物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，75-85％乙酸乙酯溶于己烷)纯化剩余物，以得到油状产物(0.367g,0.872mmole)。
取N-Boc-羟胺(0.1762g,1.323mmole)及上述所得化合物(0.367g,0.873mmole)溶于四氢呋喃(4mL)之溶液，添加DBU(0.26mL,1.74mmole)并于室温下搅拌72小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，即表示该溶液已被浓缩。使用管柱层析法(使用硅胶体，乙酸乙酯)纯化该粗萃物以得到油状产物51(0.14g,0.367mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)4.14(s,2H),4.00-3.98(m,1H),3.72(s,3H),3.70-3.61(m,15H),1.45(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C16H31NO9Na，计算值：404.1891，实测值：404.1901。
制备化合物52
取化合物51(68.4mg,0.179mmole)、H2O(0.05mL)、及LiOH(7.7mg,0.183mmole)加入四氢呋喃(1.00mL)溶液并搅拌之。于室温下搅拌2小时后，使用1N HCl(10mL)终止反应，利用乙酸乙酯和卤水加以分离。集中有机层，以乙酸乙酯(50mL×4)萃取水相层，集中的有机层经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，12-20％之MeOH溶于CH2Cl2)纯化剩余物，以得到油状产物(化合物52)(34.5mg,0.0939mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)9.29(s,1H),3.98(s,2H),3.86(s,2H),3.65-3.61(m,14H),1.45(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C15H29NO9Na，计算值：390.1735，实测值：390.1742。
制备化合物53
取化合物52(44.8mg,0.1219mmol)及MMAE(46.5mg,0.065mmol)溶于DMF(2.7mL)之溶液，于0℃下依序添加DEPC(30.6mg,0.189mmole)及DIPEA(0.030mL,0.182mmol)，并于0℃至室温下搅拌该混合物16小时。该反应混合物于真空中浓缩，利用快速管柱层析法(硅胶体，3-6％之MeOH溶于CH2Cl2)纯化剩余物，以得到油状产物53(48.6mg,0.0455mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C54H94N6O15Na，计算值：1089.6669，实测值：1089.6660。
制备化合物54
于0℃下缓慢将TFA(0.35mL)加入溶有化合物53(52.6mg,0.0493mmol)之DCM(0.65mL)溶液中，并于室温下搅拌该反应混合物2小时，再浓缩。利用管柱层析法(硅胶体，6-10％MeOH溶于CH2Cl2)纯化该粗产物，以得到油状产物54(29mg,0.030mmol)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C49H86N6O13Na，计算值：967.6326，实测值：967.6353。
2.11化合物59(A11)之合成与特性
制备化合物55
将Boc-Val-Cit-PAB-OH(化合物26)(100mg,0.2mmol)悬浮于无水DMF(1mL)、THF(2mL)及CH2Cl2(1mL)之混合液中，再添加砒啶(97μL,1.2mmol)及4-硝基苯甲酰氯(115mg,0.62mmol)。2小时后移除溶剂，并利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)5％MeOH/CH2Cl2洗脱以纯化，藉此得到89mg(69％)之Boc-Val-Cit-PAB-OpNP(化合物55)。然后，将MMAE(88.6mg,0.123mmol)溶于THF(2.8mL)及砒啶(0.7mL)之混合液中，再添加DIPEA(212μL)、HOBt(5.6mg,0.039mmol)及Boc-Val-Cit-PAB-OpNP(化合物55)(89mg,0.138mmol)。48小时后，移除溶剂，该利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及15％MeOH/CH2Cl2洗脱以纯化该反应混合物，藉此得到30mg(45％)之Boc-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物56)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(t,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.08(m,11H),5.13-4.94(m,2H),4.69-4.4(m,5H),4.2-4.05(m,4H),4.97(bs,1H),3.81(dd,J＝2.5Hz,6.56Hz,1H),3.77(dt,J＝9.2Hz,1.8Hz,1H),3.63-3.55(m,2H),3.44(m,1H),3.35-3.15(m,20H),3.14-3.04(m,2H),3..5-2.95(m,3H),2.9-2.75(m,4H),2.41-2.34(m,3H),2.45(s,1H),2.21(s,1H),2.16-1.55(m,16H),1.54-1.39(m,4H),1.34(s,9H),1.3(bs,2H),1.11-0.95(m,11H),0.9-0.6(m,42H)。
制备Boc-羟胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物58)
将Boc-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物56)(66mg,0.054mmol)悬浮于无水CH2Cl2(4.0mL)中，再添加TFA(1.0mL)，将该反应液于0℃下搅拌10分钟，然后加热至室温后再搅拌30分钟。将该反应混合物蒸馏至干燥(以甲苯共沸3次)后，无需进一步纯化即可得到Val-Cit-PAB-MMAE(化合物57)。将所得化合物29溶于无水DMF(1.5mL)中，再添加EA(75μL)、DMAP(0.66mg)、HOBt(0.73mg)及Boc-羟胺-PEG4-COOH(化合物51)(20mg,0.054mmol)。16小时后，移除溶剂并利用硅胶柱层析法，依序以1％MeOH/CH2Cl2及10％MeOH/CH2Cl2洗脱，藉此纯化以得到32.6mg(41％)之Boc-羟胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(Boc-hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物58)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89-7.05(m,10H),5.11-4.95(m,2H),4.6-4.38(m,3H),4.21(dd,J＝2.76Hz,7.0Hz,1H),4.18-4.04(m,2H),3.98(s,2H),3.82(dd,J＝3.36Hz,5.72Hz,2H),3.63-3.4(m,16H),3.35-3.15(m,15H),3.0(s,2H),2.83(dd,J＝2.66Hz,11.1Hz,3H),2.43-1.4(m,13H),1.07(t,J＝5.92Hz,3H),1.03(t,J＝7.08Hz,3H),0.95-0.6(m,26H).ESI-TOF m/z:1494.8684[M+Na]+。
制备羟胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物59)
将Boc-羟胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(Boc-hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物58)(32mg,0.021mmol)悬浮于无水CH2Cl2(2.0mL)中，添加TFA(0.5mL)。将该反应液于0℃下搅拌10分钟，然后加热至室温后再搅拌30分钟。该反应混合物蒸馏至干燥后，通过C18管柱依序以100％H2O及40％乙腈/H2O洗脱，藉此得到18mg(65％)之羟胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物59)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.9-6.9(m,11H),5.25-4.95(m,2H),4.65-4.37(m,2H),4.21-3.9(m,6H),3.73(bs,1H),3.65-3.48(m,12H),3.42-3.15(m,6H),3.01(s,2H),2.82(d,J＝10.5Hz,2H),2.45-1.25(m,11H),1.1-0.5(m,32H).ESI-TOF m/z:1394.8241[M+Na]+。
2.12化合物60(A12)之合成与特性
制备化合物60
取化合物24(46.4mg,0.150mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(150mg,0.744mmole)、及砒啶(0.12mL,1.497mmole)加入二氯甲烷(5.00mL)溶液中，于室温搅拌2小时并浓缩该溶液后，利用快速管柱层析法(硅胶体，35％的乙酸乙酯溶于己烷溶液)纯化剩余物，以得到固体产物(53mg,0.112mmole)；1H NMR(400MHz,CDCl3)8.28-8.24(m,2H),7.39-7.35(m,2H),4.43-4.41(m,2H),4.18(d,J＝2.4Hz,2H),3.80-3.78(m,2H),3.67-3.64(m,12H),2.40(t,J＝2.4Hz,1H)。将上述所得之化合物(28mg,0.0705mmole)、MMAE(50mg,0.0696mmole)、DIPEA(0.110mL,0.631mmole)、HOBT(9.5mg,0.0703mmole)、及砒啶(2.0mL)加入二甲基甲酰胺(7.5mL)溶液中，于室温下搅拌72小时并浓缩该溶液后，利用快速管柱层析法(硅胶体，4％之MeOH溶于CH2Cl2溶液)纯化剩余物，以得到固体产物60(47mg,0.0481mmole)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C51H85N5O13Na，计算值：998.6036，实测值：998.6051。
2.13化合物64(A13)之合成与特性
制备化合物61
在化合物2(300.0mg,0.50mmol)溶于30ml之EtOAc/MeOH(9:1)之溶液中添加Pd/C，将该作业空间抽真空后以H2填充三次，利用球型瓶使该作业空间保持在H2环境下，然后将该反应液于室温下搅拌1小时。待反应完成后，过滤移除Pd/C。蒸馏该滤出物以得到用于下一步骤的化合物(265.0mg,0.47mmol)。在溶有上述化合物(265.0mg,0.46mmol)、化合物2(170mg,0.47mmol)、及HOBT(105.0mg,0.70mmol)之CH2Cl2之溶液中添加EDCI(108.0mg,0.70mmol)。将该反应液于室温下搅拌14小时后，蒸馏该溶液，并利用管柱纯化该粗萃物以得到黄色油状的化合物61(300.0mg,0.33mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),7.78(s,1H),7.54(d,J＝1.6Hz,1H),7.44(dd,J＝1.6,8.8Hz,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.31-5.15(m,3H),5.02(d,J＝7.6Hz,1H),4.65(d,J＝14.8Hz,1H),4.53(d,J＝14.8Hz,1H),4.11(d,J＝9.2Hz,1H),4.03(s,2H),3.88(m,2H),3.75-3.43(m,17H),1.98(s,3H),1.96(s,3H),1.94(s,3H),1.38(s,9H),0.87(s,9H),0.05(s,6H)。
制备化合物62
在溶有化合物61(300.0mg,0.33mmol)的15mL的砒啶与醋酸混合溶液(砒啶:HOAc＝3:2)中添加2mL的TBAF，并于室温下搅拌14小时。蒸馏该溶液，利用管柱纯化该粗萃物以得到黄色油状的化合物62(220.0mg,0.27mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(s,1H),7.72(s,1H),7.67(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),7.43(s,1H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),5.33-5.21(m,3H),5.05(d,J＝7.6Hz,1H),4.67(d,J＝9.6Hz,1H),4.42(d,J＝13.6Hz,1H),4.11(d,J＝9.6Hz,1H),4.05(s,2H),3.90(m,2H),3.71-3.53(m,17H),2.05(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.42(s,9H)。
制备化合物63
取化合物62(220.0mg,0.27mmol)溶于8mL之CH2Cl2中，冷却至0℃。添加砒啶(0.20mL)及PNP氯甲酸酯，且使该混合物于室温下搅拌3小时。蒸馏该溶液，利用管柱纯化该粗萃物以得到用于下一步骤的化合物(80.0mg,0.082mmol)。取上一步骤得到的化合物(80.0mg,0.082mmol)及MMAE(60.0mg,0.082mmol)溶于5mL之THF中，添加TEA(0.1mL)加以反应，该反应混合物于室温下搅拌48小时。待反应完成后，添加35mL之EA以及20mL之0.5N HCl溶液。利用MgSO4将该有机层干燥后浓缩，利用管柱纯化该粗萃物以得到黄色油状之化合物63(70.0mg,0.05mmol).ESI-TOF m/z:1570.7932[M+Na+]。
制备化合物64
取化合物63(20.0mg,0.013mmol)溶于2.5mL之甲醇与水混合溶液(MeOH:H2O＝4:1)中，于0℃下添加Na2CO3加以反应，并于室温下搅拌该反应混合物3小时。待反应完成后，在减压下移除有机溶液，利用C18管柱纯化剩余物，以得到用于下一步骤的化合物A01-8。将上一步骤的化合物溶于1.6ml之CH2Cl2溶液中，添加0.40ml之TFA并于室温下搅拌1小时。该溶液经浓缩后，利用C18管柱纯化剩余物以得到化合物64(11.2mg,0.0085mmol)。ESI-TOF m/z:1306.6916[M-H]-。
2.14化合物60(A14)之合成与特性
制备化合物66
取化合物3(315.0mg,0.47mmol)、化合物65(220mg,0.43mmol)、及HOBT(87.0mg,0.65mmol)溶于DMF之溶液，添加EDCI(87.0mg,0.56mmol)，于室温下搅拌12小时。蒸馏该溶液后，利用管柱纯化粗产物后得到用于下一步骤之黄色油状化合物(200.0mg,0.18mmol)。将上一步骤得到的化合物(200.0mg,0.33mmol)加入15mL的砒啶与醋酸混合溶液(砒啶:HOAc＝3:2)中，添加2mL之TBAF，于室温下搅拌16小时。蒸馏该溶液，利用管柱纯化粗产物以得到黄色油状之化合物66(176.0mg,0.17mmol,two steps for 38％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.05(s,1H),7.67(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.47(s,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,1H),5.40-5.25(m,3H),5.06(d,J＝7.6Hz,1H),4.72(d,J＝12.8Hz,1H),4.42(d,J＝12.8Hz,1H),3.99(m,2H),3.75-3.52(m,27H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),1.94(s,3H),1.46(s,9H)。
制备化合物67
将化合物66(176.0mg,0.17mmol)溶于5mL之CH2Cl2中，冷却至0℃，再添加砒啶(27uL)和PNP氯甲酸酯(52mg,0.26mmol)，于室温下搅拌3小时。以CH2Cl2稀释该反应混合物并以1N HCl、饱和NaHCO3水溶液、及卤水清洗，利用MgSO4干燥有机层后浓缩，利用管柱纯化粗产物以得到用于下一步骤的化合物。将上一步骤得到的化合物(128.0mg,0.108mmol)及MMAE(78.0mg,0.108mmol)溶于4mL之DMF中，再添加TEA(100uL)及砒啶(87uL)加以反应，并于室温下搅拌48小时。蒸馏该溶液后，以管柱纯化粗产物后得到黄色油状化合物67(40.0mg,0.02mmol)。ESI-TOF m/z:1787.9224[M+Na+]。
制备化合物68
将化合物67(10.0mg,0.013mmol)溶于1.25mL之甲醇与水混合溶液(MeOH:H2O＝4:1)中，于0℃添加Na2CO3(1.8mg,0.017mmol)处理，该反应混合物于室温下搅拌3小时。待反应完成后，在减压下移除有机溶液。利用C18管柱纯化剩余物以得到用于下一步骤的化合物。将上一步骤得到的化合物溶于1.6ml之CH2Cl2中，添加0.40ml的TFA并于室温下搅拌1小时。该溶液经浓缩后，透过C18管柱纯化剩余物以得到化合物68(4.0mg)。ESI-TOF m/z:1307.5170[M-H]-。
2.15化合物80(A)之合成与特性
制备化合物70
将二乙二醇(Diethylene glycol，化合物69)(20g,0.188mol)溶于CH2Cl2(500mL)中，再添加TEA(29mL,0.207mol)，然后以冰水浴冷却之，在30分钟期间内逐滴加入溶于CH2Cl2(100mL)之TsCl(20g,0.094mol)。缓慢回温至室温后，静置反应1小时。移除溶剂后，利用硅胶柱层析法依序以20％EA/己烷及66％EA/己烷洗脱，以纯化得到14.4g(29.5％)之二乙二醇单-Ts(diethylene glycol mono-Ts，化合物70)。然后，将上述得到的二乙二醇单-Ts(化合物70)(12.61g,44.2mmol)及N-Boc-羟基胺(8.25g,62mmol)溶于CH2Cl2(400mL)中，再添加DBU(13.5mL,88.4mol)。反应48小时后，使用400mL之CH2Cl2稀释该反应液，并以1NHCl(100mL)清洗两次、以H2O(100mL)及卤水(200mL)清洗一次，有机层利用无水MgSO4干燥后蒸馏。利用硅胶柱层析法依序以33％EA/己烷以及50％EA/己烷(含5％MeOH)洗脱以纯化粗萃物，藉此得到1.5g(16.1％)之二乙二醇单-Ts(diethylene glycol mono-Ts，化合物71)。将该产物溶于CH2Cl2(70mL)中，再添加TEA(2.96mL,21.3mmol)，然后以冰水浴冷却之，在30分钟期间内逐滴加入溶于CH2Cl2(20mL)之TsCl(2g,9.4mmol)。缓慢回温至室温后，静置反应1小时。移除溶剂后，利用硅胶柱层析法依序以10％EA/己烷及40％EA/己烷洗脱以纯化，藉此得到1.31g(49％)的OTs-二乙二醇羟胺-Boc(OTs-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物72)。最后，将OTs-二乙二醇羟胺-Boc(化合物72)(1.3g,3.48mmol)溶于无水酒精(50mL)，再添加迭氮化钠(680mg,10.4mmol)，然后回流至隔夜。移除溶剂后，以EA(200mL)稀释并以H2O(50mL)及卤水(50mL)清洗，利用无水MgSO4干燥有机层后进行蒸馏。利用硅胶柱层析法以10％EA/己烷及40％EA/己烷洗脱以纯化粗萃物，藉此得到728mg(85％)之迭氮-二乙二醇羟胺-Boc(Azido-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物73)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.85-3.82(m,2H),3.54-3.51(m,2H),3.48(d,J＝4.88Hz,2H),3.21(d,J＝5.2Hz,2H),1.28(s,3H)。
制备化合物74
将迭氮-二乙二醇羟胺-Boc(化合物73)(168.5mg,0.684mmol)溶于甲醇(0.68mL)和EA(6.2mL)之混合液中。该溶液添加N2(g).Pd(OH)2(59mg)进行脱气并充入H2(g)5分钟，然后该反应液在相同条件下反应2小时。待反应完成后，使用硅藻土片过滤该粗萃物，并浓缩至干燥，不需再额外纯化即可得到145mg(96.2％)之胺基-二乙二醇羟胺-Boc(amino-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物74)。接着，将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸(化合物3)(322.6mg,0.482mmol)和上述化合物74(127.3mg,0.578mmol)溶于CH2Cl2(5mL)中，再添加EDCI(138.5mg,0.723mmol)和HOBt(74mg,0.48mmol)。8小时后，移除溶剂，接着利用硅胶柱层析法依序以15％EA/己烷及60％EA/己烷洗脱，以纯化该反应混合物，藉此得到312.2mg(74％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯-2’-OTBS-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物75)。将上述得到的化合物75溶解于砒啶(2.7mL)和醋酸(1.8mL)之混合物中，然后再添加TBAF(0.3mL,1M溶于THF溶液)。12小时后，移除溶剂，接着利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2洗脱该反应混合物以纯化，藉此得到218.1mg(80.4％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯-2’-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物76)。将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯-2’-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(化合物76)悬浮于无水CH2Cl2(5.5mL)中，再添加砒啶(240μL,2.95mmol)和4-硝基苯甲酰氯(260mg,1.26mmol)。2小时后，移除溶剂，接着利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及5％MeOH/CH2Cl2洗脱，藉以纯化该反应混合物并得到155.6mg(58.7％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OpNP-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物77)。然后，将MMAE(108.3mg,0.15mmol)溶解于THF(3.45mL)和砒啶(0.86mL)之混合物中，然后再添加DIPEA(260μL)、HOBt(6.9mg,0.048mmol)、及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(化合物77)(155.6mg,0.169mmol)。48小时后，移除溶剂，接着利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及7.5％MeOH/CH2Cl2洗脱该反应混合物，藉此以纯化得到145.7mg(57.4％)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB–琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物78)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.22(s,1H),8.2-7.95(m,2H),7.6-6.5(m,12H),5.4-5.15(m,5H),5.15-4.92(m,3H),4.85(d,J＝2.48Hz,1H),4.82-4.5(m,3H),4.49-3.98(m,7H),3.95-3.17(m,27H),3.14-2.46(m,13H),2.45-1.45(m,24H),1.39(s,9H),1.17(d,J＝7.2Hz,1H),1.05-0.45(m,30H)。
制备化合物79
将2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB–琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(化合物78)(145.7mg,0.097mmol)溶于MeOH(3.9mL)中，然后添加Na2CO3(32.3mg,0.31mmol)。1小时后，将H2O(194μL)添加至该反应混合物中并继续搅拌再使其反应1小时。接着，利用IR-120中和反应，使用硅藻土片过滤，蒸馏该粗萃物，并以C18管柱，依序利用100％H2O及40％乙腈/H2O进行洗脱，藉以纯化粗萃物以得到85mg(65.5％)之葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物79)。将20mg之葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺-Boc(化合物79)悬浮于无水CH2Cl2(1.0mL)中，添加TFA(0.25mL)，该反应液于0℃下搅拌10分钟，然后回温至室温后搅拌30分钟。该反应混合物被蒸馏至干燥后，通过C18管柱并依序以100％H2O及20％乙腈/H2O进行洗脱，以得到13mg(72％)之葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羟胺(Glucuranate-2’-MMAE-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie，化合物80)。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.22-7.9(m,1H),7.54-7.1(m,8H),5.4-5.1(m,2H),5.04(s,1H),4.73-4.25(m,2H),4.18(d,J＝8.28Hz,1H),4.05(bs,3H),3.9(s,1H),3.7-3.59(m,5H),3.54(m,2H),3.5-3.24(m,9H),3.18(s,1H),3.07(d,J＝3.08Hz,2H),2.97(s,1H),2.93(d,J＝2.52Hz,2H),2.82-2.24(m,6H),2.2-1.9(m,2H),1.83(s,2H),1.8-1.56(m,2H),1.55-1.47(m,1H),1.27(d,J＝6.4Hz,3H),1.18(d,J＝7.2Hz,1H),1.13(d,J＝9.58Hz,1H),1.06(d,J＝8.9Hz,2H),0.94(d,J＝7.54Hz,2H),0.94-0.5(m,14H).ESI-TOF m/z:1283.6622[M+Na]+。
2.16化合物86(A16)之合成与特性
制备化合物82
取化合物81(1.5g,6.756mmole)和EDCI(1.26g,8.1mmole)溶于甲醇(20mL)溶液中并搅拌之。于室温下搅拌16小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，以得到用于下一步骤之油状产物(1.51g,6.4mmole)。取N-Boc-羟胺(N-Boc-hydroxylamine)(1.28g,9.6mmole)及上述得到的化合物(1.51g,6.4mmole)溶于二氯甲烷(30mL)溶液，添加DBU(1.95g,12.8mmole)并于室温下搅拌16小时。该溶液经浓缩后，利用管柱层析法纯化该粗萃物，以得到油状产物(化合物82)(1.22g,4.22mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.09(s,1H),3.83(t,J＝6.8Hz,2H),3.66(s,3H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),1.64-1.49(m,4H),1.45(s,9H),1.39-1.30(m,6H)。
制备化合物83
取化合物82(1.22g,4.22mmole)、H2O(1.0mL)、及Na2CO3(2.24g,21.1mmole)溶于甲醇(9mL)溶液并搅拌之。于室温下搅拌24小时后，浓缩该溶液。以1N HCl(10mL)和乙酸乙酯萃取剩余物，有机层被浓缩后得到可用于下一步骤之油状产物(0.22g,0.8mmole)。取溶有上述化合物(0.22g,0.8mmol)及化合物2-1(0.5g,0.88mmol)之二氯甲烷(16mL)溶液，于该溶液中依序添加EDCI(0.16g,1.04mmole)及HOBT(0.162g,1.2mmol)，将该混合物于室温下搅拌12小时。于真空中浓缩该反应混合物后，利用快速管柱层析法纯化剩余物以得到油状产物(化合物83)(0.28g,0.34mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(dd,J＝2.8,8.8Hz,1H),7.31(d,J＝2.8Hz,1H),7.23(s,1H),7.15(s,1H),6.91(d,J＝8.8Hz,1H),5.34-5.25(m,3H),5.05(d,J＝6.8Hz,1H),4.72(d,J＝14.8Hz,1H),4.60(d,J＝14.8Hz,1H),4.13(d,J＝9.6Hz,1H),3.84(t,J＝6.4Hz,2H),3.73(s,3H),2.34(m,1H),2.08(s,3H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),1.72-1.61(m,4H),1.47(s,9H),1.40-1.33(m,6H),0.96(s,3H),0.12(s,6H)。
制备化合物84
混合含有化合物83(0.28g,0.34mmole)、TBAF(0.36mL,0.36mmole)、AcOH(2.1mL)、及砒啶(3.2mL)之溶液并搅拌之，于室温下搅拌12小时后，浓缩该溶液，利用快速管柱层析法纯化剩余物，以得到固体产物(化合物84)(0.18g,0.253mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(d,J＝2.4Hz,1H),7.18(s,1H),6.97(d,J＝8.4Hz,1H),5.40-5.23(m,3H),5.07(d,J＝7.2Hz,1H),4.74(d,J＝12.8Hz,1H),4.41(d,J＝13.2Hz,1H),4.10(d,J＝9.6Hz,1H),3.84(t,J＝6.4Hz,2H),3.71(s,3H),2.34(t,J＝7.6Hz,1H),2.10(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),1.68-1.56(m,4H),1.47(s,9H),1.40-1.35(m,6H)。
制备化合物85
将化合物84(180mg,0.253mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(76mg,0.379mmole)及砒啶(0.04mL,0.506mmole)溶于二氯甲烷，将该溶液于室温下搅拌12小时。该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法纯化剩余物，以得到用于下一步骤的固体产物(162mg,0.185mmole)。取上述化合物(70.8mg,0.080mmole)、MMAE(146mg,0.203mmole)、DIPEA(0.185mL,0.925mmole)、HOBT(9.65mg,0.0714mmole)、及砒啶(0.146mL)溶于二氯甲烷之溶液(6mL)并搅拌之。于室温下搅拌48小时后，浓缩该溶液，利用快速管柱层析法纯化剩余物，得到固体产物(化合物85)(95mg,0.065mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C73H113N7O23Na，计算值：1478.7780，实际值：1478.7828。
制备化合物86
取化合物85(20.0mg,0.015mmol)溶于5mL之甲醇与水混合溶液(MeOH:H2O＝4:1)中，于0℃添加Na2CO3(4.0mg,0.0371mmol)以反应。该反应混合物于室温下搅拌3小时。反应完成后，在减压下移除有机溶液，利用C18管柱纯化剩余物以得到用于下一步骤的化合物。将上述溶于1.6ml之CH2Cl2，再添加0.40ml之TFA，于室温下搅拌1小时。该溶液经浓缩后，利用C18管柱纯化剩余物，以得到化合物86(10.1mg,0.0076mmol)。ESI-TOF m/z:1214.6890[M-H]-。
2.17化合物90(A17)之合成及特性
制备化合物87
取氢化钠(6.2g,155mmole)及二乙二醇69(26g,245mmole)溶于四氢呋喃(300mL)之溶液，于0℃下逐滴加入甲基溴乙酸酯(25g,163mmole)，且于室温下搅拌该溶液16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，利用MeOH终止反应，并使用硅藻土片过滤，接着以MeOH清洗。集中过滤物和清洗物于减压下浓缩，使用快速管柱层析(硅胶体，2％MeOH溶于CH2Cl2)纯化该剩余物，藉此得到油状产物(8g,44.92mmole)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.11-4.10(m,2H),3.70-3.65(m,9H),3.56-3.54(m,2H)。将上述得到的化合物(8g,44.92mmole)及三乙基胺(12mL,86.33mmole)溶于二氯甲烷(100mL)溶液中，添加溶于CH2Cl2(100mL)之P-对甲苯磺酰氯(11.53g,60.48mmole)，该反应混合物于室温下搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，并以CH2Cl2清洗。该滤液于经真空浓缩后，使用快速管柱层析进行纯化(使用硅胶体，溶有35％乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油状产物(12g,36.10mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.77(d,J＝8.4Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),4.13(t,J＝4.8Hz,2H),4.09(s,2H),3.72(s,3H),3.67-3.58(m,6H),2.42(s,3H)。将DBU(7.0mL,46.85mmole)加入溶有N-Boc-羟胺(5.87g,44.09mmole)及上述得到的化合物(8.9g,26.78mmole)的四氢呋喃(160mL)混合溶液中，且于室温下对该混合溶液搅拌72小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，该溶液已被浓缩。使用管柱层析法纯化(使用硅胶体，乙酸乙酯)该粗萃物，以得到油状产物(4.05g,13.80mmole)。将上述得到的化合物(1g,3.41mmole)、H2O(0.5mL)、及LiOH(0.172g,4.099mmole)加入四氢呋喃(12mL)之溶液，并搅拌之。于室温下搅拌2小时后，加入1N HCl(10mL)终止反应，再利用乙酸乙酯和卤水进行分离。收集有机层，并使用乙酸乙酯(50mL×4)萃取水相层。集中的有机层经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，20％之MeOH溶于CH2Cl2)纯化剩余物，以得到油状产物(化合物87)(0.87g,3.11mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)3.95(m,4H),3.66-3.62(m,6H),3.32(s,1H),1.41(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C11H21NO7Na，计算值：302.1210，实测值：302.1233。
制备化合物88
将化合物87(0.4g,1.432mmol)及化合物2-1(0.532g,0.934mmol)溶于二氯甲烷(16mL)之溶液，并于该溶液中依序添加EDCI(0.22g,1.417mmole)及HOBT(0.126g,0.932mmol)，将该混合物于室温下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，含有67％乙酸乙酯的己烷)纯化该剩余物，以得到油状产物88(0.4676g,0.562mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.69(s,1H),7.61(s,1H),7.56(dd,J＝2.8,8.8Hz,1H),7.47(d,J＝2.8Hz,1H),6.91(d,J＝8.8Hz,1H),5.31-5.25(m,3H),5.04(d,J＝6.8Hz,1H),4.73(d,J＝15.2Hz,1H),4.61(d,J＝14.8Hz,1H),4.12-4.06(m,4H),4.00-3.98(m,2H),3.76-3.68(m,8H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.01(s,3H),1.41(s,9H),0.92(s,9H),0.09(s,6H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C37H58N2O17SiNa，计算值：853.3397，实测值：853.3385。
制备化合物89
取化合物88(0.4676g,0.562mmole)、TBAF(0.56mL,0.56mmole)、AcOH(3.4mL)及砒啶(5.5mL)之溶液并搅拌之，于室温搅拌12小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法(硅胶体，乙酸乙酯)对该剩余物进行纯化，以得到固体产物(0.36g,0.5mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.81(s,1H),7.95(s,1H),7.82-7.79(m,1H),7.33(d,J＝2.8Hz,1H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),5.35-5.23(m,3H),5.03(d,J＝7.2Hz,1H),4.74(d,J＝13.2Hz,1H),4.41(d,J＝12.8Hz,1H),4.11-4.02(m,7H),3.77-3.68(m,8H),2.07(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.41(s,9H)。将上述得到的化合物(90mg,0.126mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(100mg,0.495mmole)、及砒啶(0.11mL,1.423mmole)加入二氯甲烷(9mL)之溶液中并搅拌之，于室温下搅拌2小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法(硅胶体，35％乙酸乙酯溶于己烷)对剩余物进行纯化，以得到固体产物(70.8mg,0.080mmole)。将上述化合物(70.8mg,0.080mmole)、MMAE(58mg,0.08mmole)、DIPEA(0.125mL,0.7175mmole)、HOBT(9.65mg,0.0714mmole)、及砒啶(2.0mL)溶于二氯甲烷(6mL)溶液中并搅拌之，于室温下搅拌72小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法(硅胶体，4％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，得到固体产物(化合物89)(75mg,0.051mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C71H109N7O25Na，计算值：1482.7365，实测值：1482.7334。
制备化合物90
取化合物89(75mg,0.051mmole)、K2CO3(42mg,0.304mmole)、及H2O(0.4mL)溶于甲醇(2mL)之溶液并搅拌之，于室温下搅拌6小时后，使用AcOH终止反应并浓缩，利用C18管柱纯化剩余物后以得到固体产物(44mg,0.0333mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C64H101N7O22Na，计算值：1342.6892，实际值：1342.6881。取上述得到的化合物(44mg,0.0333mmol)溶于DCM(0.65mL)之溶液，于0℃下缓慢加入TFA(0.35mL)，该反应混合物于室温下搅拌2小时后浓缩。利用C18管柱纯化该粗产物，得到油状产物(化合物90)(36mg,0.029mmol)。以HRMS(ESI-TOF,M-H)计算C59H92N7O20，计算值：1218.6392，实际值：1218.6324。
2.18化合物94(A18)之合成与特性
制备化合物92
取氢化钠(0.7g,17.5mmole)及八乙烯醇91(10g,26.99mmole)之四氢呋喃(200mL)溶液，于0℃下逐滴添加甲基溴乙酸酯(1.7mL,16.67mmole)，该混合溶液于室温下搅拌16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，利用MeOH终止反应，使用硅藻土片过滤，并以MeOH清洗。集中过滤物和清洗物，于减压下浓缩，使用快速管柱层析(硅胶体，2％MeOH溶于CH2Cl2)纯化该剩余物，以得到油状产物(2.7g,15.16mmole)；1H NMR(400MHz,CDCl3)4.09(d,J＝1.2Hz,2H),3.67-3.53(m,34H)。取上述得到的化合物(2.7g,15.16mmole)及三乙基胺(3mL,21.58mmole)溶于二氯甲烷(30mL)之溶液，添加溶于CH2Cl2(20mL)之P-甲苯磺酰氯(2.8g,14.69mmole)，将该反应混合物于室温下搅拌16小时。观察到白色固体后，使用硅藻土片过滤，并以CH2Cl2清洗。该滤液于真空浓缩后，使用快速管柱层析(使用硅胶体，2％MeOH溶于CH2Cl2)进行纯化，得到油状产物(2.16g,3.62mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.73(d,J＝8.4Hz,2H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),4.10(t,J＝4.8Hz,2H),4.10(s,2H),3.69-3.52(m,35H),2.39(s,3H)。取上述化合物(2.16g,3.62mmole)及N-Boc-羟胺(1g,7.51mmole)溶于四氢呋喃(40mL)之溶液，添加DBU(1.45mL,9.705mmole)且该反应混合液于室温下搅拌72小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，该溶液已被浓缩。使用快速管柱层析(使用硅胶体，12％MeOH溶于CH2Cl2)纯化该粗萃物以得到油状产物(0.6g,1.076mmole)。取上述化合物(0.6g,1.076mmole)、H2O(0.15mL)、及LiOH(0.056g,1.335mmole)溶于四氢呋喃(3mL)之溶液并搅拌之。于室温下搅拌2小时后，加入1N HCl(10mL)终止反应，再利用乙酸乙酯和卤水进行分离。收集有机层，使用乙酸乙酯(50mL×4)萃取水相层。集中的有机层经浓缩后，剩余物利用快速管柱层析法(硅胶体，20％MeOH溶于CH2Cl2)进行纯化，得到油状产物(化合物92)(0.46g,0.846mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C23H45NO13Na，计算值：566.2783，实测值：566.2768。
制备化合物93
取化合物92(0.46g,0.846mmol)及化合物I(0.683g,1.2mmol)溶于二氯甲烷(0.51mL)之溶液，依序添加EDCI(0.18g,1.16mmole)及HOBT(0.114g,0.843mmol)，且该混合液于室温下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，5％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，以得到油状产物(0.51g,0.465mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.67(s,1H),7.70(s,1H),7.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.48(dd,J＝2.0,8.8Hz,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.30-5.25(m,3H),5.04(d,J＝6.8Hz,1H),4.70(d,J＝15.2Hz,1H),4.59(d,J＝15.2Hz,1H),4.13-4.08(m,3H),3.99-3.97(m,2H),3.73-3.55(m,33H),2.03(s,3H),2.01(s,3H),2.01(s,3H),1.44(s,9H),0.92(s,9H),0.08(s,6H)。将上述得到的化合物(0.51g,0.465mmole)、TBAF(0.49mL,0.49mmole)、AcOH(3mL)、及砒啶(5mL)之溶液于室温下搅拌12小时后，浓缩该溶液且该剩余物利用快速管柱层析法(硅胶体，5％MeOH溶于CH2Cl2)进行纯化，得到固体产物(0.49g,0.499mmole)；1H NMR(400MHz,CDCl3)8.91(s,1H),7.81(s,1H),7.48(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.42(d,J＝2.4Hz,1H),6.95(d,J＝8.8Hz,1H),5.32-5.23(m,3H),5.05(d,J＝7.6Hz,1H),4.69(d,J＝13.2Hz,1H),4.43(d,J＝13.2Hz,1H),4.10-4.07(m,3H),3.98-3.96(m,2H),3.72-3.56(m,33H),3.44(s,1H),2.07(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.43(s,9H)。将上述得到的化合物(122.5mg,0.125mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(100mg,0.495mmole)及砒啶(0.11mL,1.423mmole)溶于二氯甲烷(24mL)之溶液于室温下搅拌2小时。该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，35％乙酸乙酯溶于己烷)对剩余物进行纯化，得到固体产物(59mg,0.051mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.90(s,1H),8.26-8.23(m,2H),7.74(s,1H),7.66(d,J＝2.4Hz,1H),7.60(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),7.41-7.38(m,2H),7.04(d,J＝9.2Hz,1H),5.32-5.26(m,4H),5.19-5.10(m,2H),4.16(d,J＝9.2Hz,1H),4.08(s,2H),3.99-3.96(m,2H),3.73-3.56(m,33H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.43(s,9H)。取上述得到的化合物(90mg,0.0785mmole)、MMAE(60mg,0.084mmole)、DIPEA(0.14mL,0.8037mmole)、HOBT(22mg,0.163mmole)、及砒啶(2.0mL)溶于二甲基甲酰胺(6mL)之溶液并搅拌之。于室温下搅拌72小时后，浓缩该溶液并利用快速管柱层析法(硅胶体，MeOH溶于CH2Cl2)纯化该剩余物，得到固体产物(化合物93)(80mg,0.046mmole)。HRMS(ESI-TOF,M2Na+)用于计算C83H133N7O31Na，计算值：2884.9415，实测值：884.9360。
制备化合物94
取化合物93(80mg,0.046mmole)、K2CO3(38mg,0.276mmole)及H2O(0.5mL)溶于甲醇(2.5mL)之溶液并搅拌之。于室温下搅拌6小时后，利用AcOH终止反应并浓缩，利用C18管柱纯化剩余物，以得到固体产物(15mg,0.0095mmole)；以HRMS(ESI-TOF,M2Na+)计算C76H125N7O28Na，计算值：2814.9178，实测值：814.9132。于上述得到的化合物(15mg,0.0095mmole)溶于DCM(0.65mL)之溶液中，于0℃下缓慢添加TFA(0.35mL)，该反应混合物于室温下搅拌2小时后，经浓缩后利用C18管柱纯化粗萃物，以得到油状产物94(12mg,0.0081mmol)。HRMS(ESI-TOF,M2Na+)用于计算C71H117N7O26Na，计算值：2764.8916，实测值：764.9085。
2.19化合物99(A19)之合成及特性
制备化合物96
取化合物2(500.0mg,0.83mmol)溶于35ml之EtOAc/MeOH(6:1)之溶液，并于该溶液中添加Pd/C。对该作业空间抽真空后以H2填充三次，利用球型瓶使该作业空间保持在H2环境下，然后将该反应液于室温下搅拌1小时。待反应完成后，过滤移除Pd/C。蒸馏该滤出物以得到用于下一步骤的化合物。取上一步骤得到的化合物及化合物95(143mg,0.746mmol)溶于CH2Cl2之溶液，添加EDCI(173.0mg,1.12mmol)，于室温下搅拌15小时。该溶液经蒸馏后，利用管柱纯化粗产物，以得到黄色油状化合物96(350.0mg,0.47mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.19(s,1H),8.04(s,1H),7.71(dd,J＝2.0,8.4Hz,1H),7.62(d,J＝2.0Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),5.30-5.20(m,3H),5.04(d,J＝7.2Hz,1H),4.69(d,J＝14.8Hz,1H),4.58(d,J＝14.8Hz,1H),4.37(s,2H),4.12(d,J＝8.8Hz,1H),3.68(s,3H),2.01(s,3H),1.99(s,3H),1.99(s,3H),1.43(s,9H),0.9(s,9H),0.07(s,6H)。
制备化合物97
取化合物96(350.0mg,0.471mmol)溶于15mL之THF之溶液，添加0.50mL之TBAF，于室温下搅拌14小时。该溶液经蒸馏后，利用管柱纯化该粗产物，得到黄色油状化合物97(280.0mg,0.45mmol)。ESI-TOF m/z:627.2003(M-)。
制备化合物(98)
取化合物97(275.0mg,0.27mmol)溶于8mL之CH2Cl2中，冷却至0℃，添加砒啶(0.50mL)及PNP氯甲酸酯(176.0mg,0.87mmol)，且使该混合液于室温下搅拌3小时。该溶液经蒸馏后，利用管柱纯化粗产物，以得到用于下一步骤之化合物(120.0mg,0.15mmol)。将上一步骤得到的化合物(120.0mg,0.15mmol)及MMAE(120.0mg,0.16mmol)溶于5mL之THF溶液中，添加TEA(0.5mL)加以处理，将该反应混合物于室温下搅拌48小时后，待反应完成再添加50mL之EA及30mL之0.5N HCl。利用MgSO4将该有机层干燥后浓缩，利用管柱纯化该粗产物得到黄色油状之化合物98(85.0mg,0.062mmol)。ESI-TOF m/z:1587.8759[M--H]-。
制备化合物99
取化合物98(20.0mg,0.015mmol)溶于2.5mL之甲醇与水之混合溶液(MeOH:H2O＝4:1)中，于0℃下加入Na2CO3处理，并于于室温下对该反应混合物搅拌3小时。待反应完成后，在减压下移除有机层，利用C18管柱纯化该剩余物，得到用于下一步骤的化合物。将上一步骤得到的化合物溶于1.6ml之CH2Cl2溶液，添加0.40ml之TFA然后于室温下搅拌1小时。该溶液经浓缩后，利用C18管柱纯化剩余物，得到化合物99(10.3mg,0.0085mmol)。ESI-TOF m/z:1130.5896[M-H]-。
2.20化合物108(A20)之合成与特性
制备化合物101
取2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB-胺(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB-amine，化合物2-1)(1.9g,3.34mmol)和麸胺酸(化合物100)(412mg,1.67mmol)溶于CH2Cl2(25mL)中，再添加EDCI(1g,5.22mmol)、HOBt(13mg,0.083mmol)。8小时后，移除溶剂然后该反应混合物利用二氧化硅胶层析法依序以5％EA/己烷及20％EA/己烷洗脱纯化，以得到1.07g(48％)之双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB)-麸胺酸-N-Boc(Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OTBS-PAB)-glutamic-N-Boc,化合物101)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(bs,1H),8.19(bs,1H),7.62(dd,J＝1.84Hz,8.72Hz,1H),7.53(dd,J＝2.6Hz,8.72Hz,1H),7.42(dd,J＝2.16Hz,10.64Hz,2H),6.9(dd,J＝5.32Hz,8.8Hz,2H),5.28(m,7H),5.03(d,J＝6.84Hz,2H),4.69(dd,J＝2.4Hz,15.16Hz,2H),4.58(d,J＝14.96Hz,2H),4.28(bs,1H),4.12(q,J＝4.2Hz,2H),3.71(s,3H),3.7(s,3H),2.62-2.45(m,2H),2.32-2.18(m,1H),2.08-2.0(m,18H),1.75(s,3H),1.43(s,9H),0.92(s,9H),0.91(s,9H),0.09(s,6H),0.08(s,6H)。
制备化合物102
将双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OTBS-PAB)-麸胺酸-N-Boc(化合物101)(1.07,0.792mmol)溶于砒啶(9.0mL)和醋酸(6.0mL)之混合物中，再添加TBAF(1.0mL,1M in THF)。12小时后，移除溶剂然后该反应混合物利用二氧化硅胶层析法依序以CH2Cl2(100％)及8.3％MeOH/CH2Cl2洗脱纯化，以得到658mg(75％)之双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OH-PAB)-麸胺酸-N-Boc(Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OH-PAB)-glutamic-N-Boc，化合物102)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.5-7.33(m,4H),6.87(dd,J＝5.68Hz,8.8Hz,2H),5.91(d,J＝7.64Hz,1H),5.35(dd,J＝1.32Hz,9.44Hz,2H),5.3-5.18(m,4H),5.04(d,J＝7.64Hz,2H),4.6(d,J＝13.2Hz,2H),4.35(d,J＝13.32Hz,2H),4.16(dd,J＝3.64Hz,9.76z,2H),3.66(,J＝1.72Hz,6H),3.43(s,4H),2.98-2.92(m,1H),2.38(bs,2H),2.054(s,3H),2.051(s,3H),2.01(s,12H),1.37(s,9H),1.36(s,9H)。
制备化合物103
将双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OH-PAB)-麸胺酸-N-Boc(化合物102)(160mg,0.143mmol)悬浮于无水CH2Cl2(2.5mL)，再添加砒啶(200μL,2.86mmol)和4-硝基苯基氯化物(230mg,1.14mmol)。2小时后移除溶剂，利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)、接着4％MeOH/CH2Cl2洗脱以纯化，藉此得到131.4mg(63％)之双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB)-麸胺酸-N-Boc(Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-OpNP-PAB)-glutamic-N-Boc，化合物103)。然后，取MMAE(162mg,0.225mmol)溶于THF(4.0mL)及砒啶(1.0mL)之混合液中，再添加DIPEA(280μL)、HOBt(6.0mg,0.042mmol)、及双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-OpNP-PAB)-麸胺酸-N-Boc(化合物103)(131mg,0.09mmol)。48小时后移除溶剂，利用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及9％MeOH/CH2Cl2洗脱并纯化该反应混合物，藉此以得到119.3mg(51.6％)之双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)-麸胺酸-N-Boc(Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB)-glutamic-N-Boc，化合物104)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.5-8.8(m,2H),8.2-6.3(m,22H),5.4-5.28(m,8H),5.16-4.49(m,12H),4.48-3.88(m,15H),3.7(d,J＝2.87Hz,2H),3.74-3.6(m,8H),3.45(s,2H),3.4-3.15(m,17H),3.09(s,1H),3.02-2.88(m,6H),2.88-2.74(m,6H),2.73-2.52(m,4H),2.5-2.24(m,8H),2.24-1.85(m,38H),1.84-1.45(m,8H),1.45-1.23(m,12H),1.2-1.05(m,10H),1.03-0.4(m,60H)。
制备化合物106
将双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)-麸胺酸-N-Boc(化合物104)(119mg,0.046mmol)悬浮于无水CH2Cl2(2.8mL)中，再添加TFA(0.7mL)。该反应液于0℃下搅拌10分钟，回温至室温后再搅拌30分钟。该反应混合物蒸馏至干燥(与甲苯共沸3次)后，无须额外纯化便可得到双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)-麸胺酸-胺(化合物105)。将得到的化合物105和PEG4-羟胺-N-Boc酸(化合物52)(4.7mg,0.02mmol)悬浮于无水THF(1.5mL)中，再添加TEA(27.8μL,0.2mmol)、HOBt(0.14mg,0.001mmol)及EDCI(6mg,0.03mmol)。12小时后，移除溶剂并用硅胶柱层析法依序以CH2Cl2(100％)及15％MeOH/CH2Cl2洗脱以纯化，藉此得到50mg(87％)of双-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)-麸胺酸-PEG4-羟胺-N-Boc(Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’-MMAE-PAB)-glutamic-PEG4-hydroxylamine-N-Boc，化合物106)。将上述化合物溶于MeOH(2.7mL)中，然后添加Na2CO3(24.2mg,0.23mmol)。2小时后，将H2O(170μL)添加至该反应混合物中，该反应液继续搅拌2.5小时。利用IR-120中和反应液，使用硅藻土片过滤，蒸馏该粗萃物，并以C18管柱依序透过100％H2O及30％乙腈/H2O进行洗脱以纯化该粗萃物，以得到27.9mg(62％)之双-(葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)-麸胺酸-PEG4-羟胺-N-Boc(Di-(Glucuranate-2’-MMAE-PAB)-glutamic-PEG4-hydroxylamie-N-Boc，化合物107)。然后，取15mg之化合物107悬浮于无水CH2Cl2(0.8mL)，添加TFA(0.2mL)，将该反应液于0℃下搅拌10分钟。然后加热至室温后再搅拌30分钟。该反应混合物蒸馏至干燥后，通过C18管柱依序以100％H2O及25％乙腈/H2O洗脱纯化该反应混合物，以得到10mg(69.5％)之双-(葡萄醣醛酸酯-2’-MMAE-PAB)–麸胺酸-PEG4-羟胺(Di-(Glucuranate-2’-MMAE-PAB)-glutamic-PEG4-hydroxylamie，化合物108)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.7-7.0(m,26H),5.35-5.1(m,6H),4.7-4.45(m,8H),4.22-4.17(m,8H),4.05-3.9(m,4H),3.88-3.75(m,4H),3.7-3.4(m,26H),3.38-3.15(m,19H),3.15-2.85(m,18H),2.6-2.3(m,10H),2.28-1.2(m,37H),1.15-1.0(m,18H),1.0-0.5(m,60H)。
2.21化合物114(A21)之合成与特性
制备化合物110
取化合物109(2.0g,10.31mmol)及三乙基胺(1.56g,15.46mmol)溶于二氯甲烷(50mL)溶液，并添加3-巯基丙醇(1.04g,11.34mmole)，于室温下搅拌12小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，即表示该溶液已被浓缩。剩余物分别利用CH2Cl2、1N HCl、饱和NaHCO3(aq)及卤水萃取，将有机层集中后于真空中浓缩，利用快速管柱层析法纯化剩余物以得到油状产物(化合物110)(1.0g,4.8mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.76(t,J＝6.0Hz,2H),3.15(s,2H),2.77(t,J＝7.2Hz,2H),1.87(m,2H),1.47(s,9H)。
制备化合物111
取化合物110(1.0g,4.8mmole)、三乙基胺(1mL,9.7mmole)、及P-对甲苯磺酰氯(1.39g,7.275mmole)溶于二氯甲烷(50mL)之溶液。于室温下搅拌16小时后，浓缩该溶液以得到油状产物。将迭氮化钠(0.25g,3.83mmole)及上述得到的化合物(0.5g,1.28mmole)溶于乙醇之溶液，于80℃下搅拌16小时。浓缩该溶液且利用EA和卤水萃取剩余物，于真空中浓缩该有机层后得到化合物111(0.27g,1.17mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.42(t,J＝6.8Hz,2H),3.12(s,2H),2.72(t,J＝7.2Hz,2H),1.89(m,2H),1.47(s,9H)。
制备化合物112
取化合物111(1.38g,2.49mmole)、乙酸乙酯(5mL)、及Pd/C(0.5g)容于甲醇之溶液，于H2环境下搅拌之。待搅拌12小时隔夜后，使用硅藻土片过滤出Pd/C，并以甲醇清洗。该溶液于真空中浓缩后，得到油状产物。取上述化合物和化合物95(0.24g,1.17mmol)溶于二氯甲烷之溶液(15mL)，依序添加EDCI(0.236g,1.521mmole)和HOBT(0.206g,1.521mmol)，将该混合物于室温下搅拌12小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法纯化剩余物，得到油状产物(0.42g,1.11mmole)。将上一步骤得到的化合物(0.42g,1.11mmole)、H2O(1mL)、及KOH(0.28g,4.98mmole)溶于甲醇(9mL)溶液中。于室温下搅拌16小时后，该溶液加入1N HCl终止反应，并依序以CH2Cl2、1N HCl、及卤水萃取。及中溶液后浓缩得到用于下一步骤的油状产物(0.357g,1.11mmole)。将上一步骤得到的化合物(0.357g,1.11mmole)及化合物2-1(0.666g,1.17mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，再依序加入EDCI(0.223g,1.44mmole)和HOBT(0.195g,1.44mmol)，于室温下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，得到油状产物112(0.39g,0.447mmole)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),8.23(s,1H),7.94(s,1H),7.53-7.49(m,2H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),5.35-5.23(m,3H),5.06(d,J＝7.2Hz,1H),4.72(d,J＝15.2Hz,1H),4.60(d,J＝15.2Hz,1H),4.23(s,2H),4.15(d,J＝9.6Hz,1H),3.71(s,3H),3.40(m,2H),3.33(s,2H),2.64(t,J＝7.2Hz,2H),2.07(s,3H),2.04(s,3H),2.02(s,3H),1.86(m,2H),1.42(s,9H),0.92(s,9H),0.09(s,6H)。
制备化合物113
取化合物112(0.39g,0.447mmole)、TBAF(0.5mL,0.5mmole)、AcOH(3mL)、及砒啶(4.5mL)之溶液并搅拌之，于室温下搅拌12小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，以得到固体产物(0.29g,0.382mmole)。将上述化合物(0.29g,0.382mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(231mg,1.146mmole)、及砒啶(0.155mL,1.91mmole)加入二氯甲烷(20mL)溶液中，于室温下搅拌12小时，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法纯化该剩余物，以得到固体产物(110mg,0.12mmole)。将上述得到的化合物(110mg,0.12mmole)、MMAE(94mg,0.131mmole)、DIPEA(0.104mL,0.595mmole)、HOBT(18mg,0.131mmole)、及砒啶(94mg,1.19mmole)溶于二甲基甲酰胺(10mL)溶液中。于室温下搅拌72小时后，浓缩该溶液且利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，得到固体产物(化合物113)(52mg,0.035mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C72H110N8O24SNa，计算值：1525.7246，实测值：1525.71891。
制备化合物(114)
取化合物113(20.0mg,0.0133mmol)溶于甲醇与水混合溶液(MeOH:H2O＝4:1)中，于0℃加入Na2CO3(4.2mg,0.0399mmol)处理，将该反应混和物于室温下搅拌3小时。待反应完成后，于减压下移除有机溶液，并利用C18管柱对剩余物进行纯化以得到用于下一步骤的化合物。将上一步骤的化合物溶于4ml之CH2Cl2，添加1.0ml之TFA并于室温下搅拌1小时。该溶液经浓缩后，利用C18管柱纯化该剩余物，以得到化合物114(7.3mg,0.0057mmol)。ESI-TOFm/z:1301.6356[M-H]-。
2.22化合物119(A22)之合成与特性
制备化合物(116)
取三-甘胺酸115(10g,52.86mmol)加入含二恶烷(120mL)、水(60mL)及1M NaOH(60mL)之混合液中，并于冰水浴中搅拌之，再添加双-叔丁基焦碳酸酯(17.3g,79.29mmol)，持续于室温下搅拌6小时。该溶液于真空中浓缩至约10至15mL，以冰水浴冷却后，覆盖一层乙酸乙酯(约50mL)，并加入稀释的HCl溶液进行酸化调整至pH值约2至3。使用乙酸乙酯重复萃取该水相层，倒出乙酸乙酯萃取液，以水清洗后利用无水Na2SO4干燥，再于真空中蒸馏之，得到光滑固体之纯物质(12.5g,43.20mmol)。将上述得到的化合物(12.5g,43.20mmole)及EDCI(8.04g,51.79mmole)溶于甲醇(24mL)之溶液，于室温下搅拌16小时，浓缩该溶液，利用快速管柱层析法(硅胶体，8％之MeOH溶于CH2Cl2)对该剩余物进行纯化，以得到固体产物(10.45g,34.44mmole)。取上述得到的化合物(10.45g,34.44mmole)溶于DCM(65mL)之溶液，于0℃下缓慢添加TFA(35mL)。将该反应混合物于室温下搅拌2小时，浓缩后得到油状产物(5.88g,28.92mmol)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.04-3.59(m,4H),3.38-3.83(m,2H),3.71(s,3H)。将上述化合物(1.5g,7.381mmol)及化合物95(1.62g,8.473mmol)溶于二甲基甲酰胺(25mL)之溶液，依序添加EDCI(1.3g,8.37mmole)及HOBT(1g,7.40mmol)，该混合物于室温下搅拌48小时，且该反应混合物于真空中浓缩后，剩余物利用快速管柱层析法(硅胶体，6％MeOH溶于CH2Cl2)进行纯化，得到油状产物116(1.5g,3.99mmole)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.34(s,2H),3.98-3.93(m,6H),3.72(s,3H),1.47(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C14H24N4O8Na，计算值：399.1486，实测值：399.1488。
制备化合物117
取化合物116(0.28g,0.739mmole)、H2O(0.5mL)、及LiOH(0.037g,0.881mmole)溶于甲醇之溶液，于室温下搅拌2小时。该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，50％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，得到油状产物(0.24g,0.662mmole)。将上述得到的化合物(0.46g,0.846mmol)及化合物2-1(0.51g,0.895mmol)溶于二甲基甲酰胺(20mL)之溶液，再依序添加EDCI(0.18g,1.16mmole)及HOBT(0.114g,0.843mmol)，将该混合物于室温下搅拌48小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，5％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，得到油状产物(0.42g,0.460mmole)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.72(d,J＝2.4Hz,1H),7.74(dd,J＝2.4,9.2Hz,1H),7.02(d,J＝9.2Hz,1H),5.45(t,J＝9.6Hz,1H),5.36(d,J＝7.6Hz,1H),5.22-5.17(m,2H),4.68(q,J＝24.8Hz,2H),4.47(d,J＝9.6Hz,1H),4.32(s,2H),4.01(s,2H),4.00(s,2H),3.94(s,2H),3.71(s,3H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),2.02(s,3H),1.46(s,9H),0.96(s,9H),0.12(s,6H)。取上述所得化合物(0.42g,0.460mmole)TBAF(0.48mL,0.48mmole)、AcOH(3mL)、及砒啶(5mL)之溶液并搅拌之，于室温下搅拌12小时后，浓缩该溶液，并利用快速管柱层析法(硅胶体，9％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，得到固体产物(0.35g,0.438mmole)。取上述化合物(117mg,0.146mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(100mg,0.495mmole)、及砒啶(0.11mL,1.423mmole)溶于二氯甲烷(24mL)之溶液，于室温下搅拌2小时后，浓缩该溶液，利用快速管柱层析法(硅胶体，6％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，以得到固体产物117(100mg,0.107mmole)。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.32-8.29(m,2H),7.76(d,J＝2.4Hz,1H),7.61(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.52-7.50(m,2H),7.16(d,J＝8.8Hz,1H),5.49-5.43(m,2H),5.41-5.19(m,4H),4.51(d,J＝10.0Hz,1H),4.31(s,2H),4.01(s,2H),4.00(s,2H),3.93(s,2H),3.72(s,3H),2.06(s,3H),2.02(s,3H),2.02(s,3H),1.45(s,9H)。
制备化合物118
取化合物116(100mg,0.107mmole)、MMAE(69mg,0.096mmole)、DIPEA(0.173mL,0.995mmole)、HOBT(12mg,0.092mmole)、及砒啶(2.5mL)溶于二甲基甲酰胺(7mL)之溶液，于室温下搅拌72小时，浓缩该溶液，并利用快速管柱层析法(硅胶体，7％MeOH溶于CH2Cl2)对该剩余物进行纯化，以得到固体产物118(79mg,0.051mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C73H110N10O26Na，计算值：1565.7485，实测值：1565.7471。
制备化合物119
取化合物118(79mg,0.051mmole)、K2CO3(38mg,0.276mmole)、及H2O(0.5mL)溶于甲醇(2.5mL)之溶液，于室温下搅拌6小时后，以AcOH终止反应后浓缩之，利用C18管柱纯化剩余物后以得到固体产物(70mg,0.0499mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C66H102N10O23Na，计算值：1425.7012，实测值：1425.7016。将上述得到的化合物(70mg,0.0499mmole)溶于DCM(0.65mL)溶液中，于0℃下缓慢加入TFA(0.35mL)，将该反应混合物于室温下搅拌2小时后浓缩。利用C18管柱纯化该粗产物，以得到油状产物119(48mg,0.0368mmol)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C61H94N10O21Na，计算值：1325.6487，实测值：1325.6540。
2.23化合物125(A23)之合成与特性
制备化合物121
于0℃下将叔丁基溴乙酸乙酯(化合物109)(2.0g,10.25mmole)添加至溶有化合物120(1.97g,12.3mmol)及三乙基胺(1.56g,15.38mmol)之二氯甲烷(25mL)溶液中，且将该混合物于0℃至室温下搅拌16小时。该反应混合物于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化后，得到用于下一步骤的油状产物(1.9g,6.93mmol)。取上一步骤得到的化合物(1.9g,6.93mmole)及砒啶(1.66mL,20.8mmole)溶于二氯甲烷(30mL)之溶液，添加甲磺酰氯化物(1.03g,9.0mmole)并于室温下搅拌16小时。当TLC显示起始原料被完全消耗时，该溶液已被浓缩。使用快速管柱层析(使用硅胶体，35％溶于己烷的乙酸乙酯溶液)对该剩余物进行纯化，得到油状产物(化合物121)(1.72g,4.88mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.07(s,1H),4.02(s,2H),3.38(t,J＝5.2Hz,2H),3.29(t,J＝5.2Hz,2H),3.01(s,3H),1.47(s,9H)。
取化合物121(1.72g,4.88mmole)、H2O(10mL)、及KOH(2.19g,39.04mmole)溶于甲醇(10mL)之溶液，于室温下搅拌16小时。使用IR-120终止反应后过滤之，利用甲醇冲洗IR-120且合并溶液后浓缩以得到油状产物。将上述得到的化合物和化合物I(2.91g,5.12mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，再依序添加EDCI(1.0g,6.441mmole)及HOBT(1.0g,7.40mmol)，将该混合物于室温下搅拌16小时后，于真空下浓缩，且利用快速管柱层析法纯化剩余物，以得到油状产物(化合物122)(1.2g,1.416mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(s,1H),7.56(s,1H),7.37(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),5.37-5.20(m,4H),5.04(d,J＝7.2Hz,1H),4.66(d,J＝15.2Hz,1H),4.55(d,J＝15.2Hz,1H),4.14(d,J＝9.2Hz,1H),4.08(s,2H),3.67(s,3H),3.37(m,2H),3.23(m,2H),3.00(s,3H),2.00(s,3H),1.99(s,3H),1.98(s,3H),1.36(s,9H),0.87(s,9H),0.07(s,6H)。
制备化合物123
取化合物122(1.2g,1.416mmole)、TBAF(1.5mL,1.5mmole)、AcOH(9mL)、及砒啶(13.5mL)之溶液，于室温下搅拌12小时，该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，得到固体产物(0.98g,1.33mmole)。然后，于0℃下TFA(0.35mL)缓慢添加至含上述化合物(0.98g,1.33mmole)溶于DCM(0.65mL)之溶液，将该反应混合物于室温下搅拌2小时后，浓缩以得到产物。取上述化合物及化合物95(0.35g,1.60mmol)溶于二氯甲烷(10mL)之溶液，依序添加三乙基胺(0.175g,1.729mmole)、EDCI(0.268g,1.729mmole)、及HOBT(0.233g,1.729mmol)，将该混合物于室温下搅拌16小时后，于真空中浓缩该反应混合物，并利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化以得到油状产物(化合物123)(0.2g,0.25mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.80(s,1H),8.03(s,1H),7.53(m,1H),7.40(dd,J＝2.4,32.4Hz,1H),6.97(dd,J＝4.0,8.8Hz,1H),5.40-5.21(m,3H),5.10(t,J＝76Hz,1H),4.72(d,J＝12.8Hz,1H),4.42(m,1H),4.30(s,1H),4.11(s,2H),3.69(d,J＝2.8Hz,1H),3.51(m,2H),3.42(m,2H),3.03(s,3H),2.05(s,3H),2.04(s,3H),2.04(s,3H),1.46(s,9H)。
制备化合物125
取化合物123(0.2g,0.25mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(151mg,0.75mmole)、及砒啶(0.103mL,1.25mmole)溶于二氯甲烷(20mL)之溶液，于室温下搅拌12小时，该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，以得到固体产物(220mg,0.206mmole)。取上述化合物(100mg,0.103mmole)、MMAE(81.3mg,0.1133mmole)、DIPEA(66.6mg,0.515mmole)、HOBT(15.3mg,0.1133mmole)、及砒啶(81.5mg,1.03mmole)溶于二甲基甲酰胺(6mL)之溶液，于室温下搅拌48小时，使该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法对剩余物进行纯化，以得到固体产物(化合物124)(50mg,0.032mmole)。以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C72H111N9O26SNa计算值：1572.7253，实测值：1572.7324。取化合物124(50mg,0.032mmole)、K2CO3(25mg,0.182mmole)、及H2O(0.3mL)溶于甲醇(2mL)之溶液，于室温下搅拌6小时，该溶液以AcOH终止反应后浓缩，利用C18管柱层析法对剩余物进行纯化，以得到固体产物。然后，于0℃下将TFA(0.35mL)缓慢加入含有上述得到的化合物(44mg,0.0333mmol)之DCM(0.65mL)溶液，于室温下搅拌2小时，该溶液经浓缩后，利用C18管柱纯化该粗产物，以得到油状产物(化合物125)。ESI-TOF m/z:1308.6360[M-H]-。
2.24化合物130(A24)之合成与特性
制备化合物127
取双-甘胺酸(化合物126)(5g,37.84mmol)溶于含二恶烷(60mL)、水(30mL)及1MNaOH(30mL)之混合液中，使用冰水浴冷却之，添加双-叔丁基焦碳酸酯(12.38g,56.76mmol)，于室温下继续搅拌6小时。该溶液于真空中浓缩至10–15mL之体积，以冰水浴冷却后，覆盖一层乙酸乙酯(约50mL)，并加入稀释的HCl溶液进行酸化并调整至pH值2–3。使用乙酸乙酯重复萃取该水相层，倒出乙酸乙酯萃取液，以水清洗后利用无水Na2SO4干燥，再于真空中蒸馏之，得到光滑固体之纯物质(5.2g,17.97mmol)。取上述得到的化合物(5.2g,17.97mmol)及EDCI(3.38g,21.60mmole)溶于甲醇(24mL)之溶液，于室温下搅拌16小时，该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，4％MeOH溶于CH2Cl2)对该剩余物进行纯化，以得到固体产物(3.5g,11.54mmole)。于0℃下将TFA(18mL)缓慢加入含上述得到化合物(3.5g,11.54mmole)溶于DCM(33mL)之溶液，于室温下搅拌2小时，该溶液经浓缩后，得到油状产物(1.4g,9.58mmol)。取上述化合物(1.106g,7.568mmol)及化合物95(1.6g,8.369mmol)溶于二甲基甲酰胺(24mL)之溶液，依序添加EDCI(1.3g,8.374mmole)及HOBT(1g,7.40mmol)，于室温下搅拌48小时，该溶液于真空中浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，4％MeOH溶于CH2Cl2)对进行剩余物纯化，得到油状产物(化合物127)(0.41g,1.284mmole)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.34(s,2H),3.99(s,2H),3.97(s,2H),3.71(s,3H),1.47(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C12H21N3O7Na，计算值：342.1278，实测值：342.1281。
制备化合物128
将化合物127(0.41g,0.739mmole)、水(0.8mL)、及LiOH(0.065g,1.548mmole)溶于甲醇(10mL)溶液中并搅拌混合。于室温下搅拌2小时之后将该溶液浓缩，接着利用快速管柱层析法(硅胶体，50％MeOH溶于CH2Cl2)对该剩余物进行纯化，以得到油状产物(0.35g,1.146mmole)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.34(s,2H),3.98(s,2H),3.80(s,2H),1.47(s,9H)。将上述得到的化合物(0.35g,1.146mmol)和化合物2-1(0.76g,1.334mmol)溶于二甲基甲酰胺(20mL)之溶液，依序添加EDCI(0.22g,1.417mmole)及HOBT(0.155g,1.147mmol)，于室温下搅拌16小时，该溶液于真空浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，乙酸乙酯)对该剩余物进行纯化，以得到油状产物(0.67g,0.780mmole)；1H NMR(400MHz,MeOD)7.68(d,J＝2.4Hz,1H),7.48(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),5.45(t,J＝9.6Hz,1H),5.35(d,J＝8.0Hz,1H),5.23-5.18(m,2H),4.68(q,J＝24.8Hz,2H),4.47(d,J＝10.0Hz,1H),4.35(s,2H),4.03(s,2H),4.00(s,2H),3.71(s,3H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),2.01(s,3H),1.46(s,9H),0.96(s,9H),0.12(s,6H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C37H56N4O17SiNa，计算值：879.3302，实测值：879.3272。取上述得到的化合物(0.668g,0.78mmole)、TBAF(1.05mL,1.05mmole)、AcOH(5.6mL)、及砒啶(10mL)之溶液，于室温下搅拌12小时，该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，7％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，以得到固体产物(0.55g,0.74mmole)；1H NMR(400MHz,CDCl3)9.03(s,1H),8.83(s,1H),8.31(s,1H),7.76(s,1H),7.44(s,1H),7.40-7.38(m,1H),6.86(d,J＝8.8Hz,1H),5.33(t,J＝9.2Hz,1H),5.21(t,J＝9.6Hz,1H),5.05(d,J＝7.6Hz,1H),4.57(d,J＝13.6Hz,1H),4.39-4.32(m,3H),4.21(d,J＝10.0Hz,1H),3.92(s,2H),3.92(s,2H),3.66(s,3H),2.05(s,3H),2.01(s,3H),2.00(s,3H),1.40(s,9H)。将上述得到的化合物(183mg,0.247mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(210mg,1.042mmole)、及砒啶(0.3mL,3.709mmole)溶于二氯甲烷(20mL)溶液中，于室温下搅拌2小时，该溶液经浓缩后，利用快速管柱层析法(硅胶体，5％MeOH溶于CH2Cl2)对剩余物进行纯化，得到固体产物(化合物128)(116mg,0.128mmole)。1H NMR(400MHz,CDCl3)8.65-8.58(m,3H),8.25-8.23(m,2H),7.28(s,1H),7.67-7.64(m,2H),7.58(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),7.40-7.38(m,2H),7.28-7.26(m,1H),7.17-7.14(m,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,1H),5.32-5.28(m,2H),5.26-5.05(m,3H),4.39(s,2H),4.03(d,J＝6.0Hz,2H),3.99(d,J＝6.0Hz,2H),3.71(s,3H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.44(s,9H)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C38H45N5O21Na，计算值：930.2499，实测值：930.2468。
制备化合物129
将化合物128(6mg,0.128mmole)、MMAE(83mg,0.116mmole)、DIPEA(0.203mL,1.167mmole)、HOBT(18mg,0.131mmole)、及砒啶(0.8mL)溶于二甲基甲酰胺(8mL)之溶液，于室温下搅拌72小时，将该溶液浓缩之后，利用快速管柱层析法(硅胶体，8％MeOH溶于CH2Cl2)对该剩余物进行纯化，以得到固体产物(化合物129)(81mg,0.054mmole)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C71H107N9O25Na，计算值：1508.7270，实测值：1508.7298。
制备化合物130
取化合物129(81mg,0.054mmole)、K2CO3(38mg,0.276mmole)、及H2O(0.5mL)溶于甲醇(3mL)之溶液，于室温下搅拌6小时，该溶液经AcOH终止反应后浓缩，利用C18管柱纯化剩余物以得到固体产物(70mg,0.0499mmole)；以HRMS(ESI-TOF,MNa+)计算C64H99N9O22Na，计算值：1368.6797，实测值：1368.6902。于0℃下将TFA(0.35mL)缓慢加入含有上述得到的化合物(70mg,0.0499mmole)之DCM(0.65mL)溶液中，于室温下将该反应混合物搅拌2小时，该溶液经浓缩之后，利用C18管柱对粗产物进行纯化，得到油状产物(化合物130)(48mg,0.0368mmol)；以HRMS(ESI-TOF,MH+)计算C59H92N9O20，计算值：1246.6453，实测值：1246.6609。
实施例3：抗体药物复合体(ADC)之形成与特性
反应式5：TRZ-NKS或TRZ-NGKS透过肟接合(oxime-ligation)之承
载物复合方式
3.1透过TRZ-NKS或TRZ-NKS-D2执行肟接合接点专一性抗体药
物复合体的一般流程
于100mM醋酸缓冲液(pH 4.5)中，加入TRZ-NKS(5mg/mL)及3mM承载物(A22)，于37℃下作用3天，以执行抗体的丙酮与烷氧基胺-裂解性承载物(A22)之间的肟接合。在Amicon浓缩剂中以10,000分子量截断(Molecular Weight Cut Off，MWCO)与醋酸缓冲液进行缓冲液交换。透过Amicon浓缩剂以10,000MWCO使用PBS(pH 7.4)执行连续清洗，藉以移除多余的小分子。请参阅第4图及第5图，分别为利用SDS-PAGE分析TRZ-A22及TRZ-A11-D2之结果。
反应式6：TRZ-NAS透过键击化学之承载物复合方式
3.2经由TRZ-NAS之键击化学接点专一性抗体药物复合体的一般程
于1X PBS缓冲液(pH值7.4，含5至10％DMSO)中，添加3-5mg/mL之TRZ-NAS(含400μM之炔基-裂解性连结基、45mM之CuSO4、45mM之抗坏血酸钠)，于37℃下作用2-8小时，以在抗体上的迭氮基与炔基-裂解性承载物(A09)之间，进行经Cu(+)催化的键击反应。反应完成后，使用10mM EDTA终止反应。在Amicon浓缩剂中，以10,000MWCO与1X PBS缓冲液进行缓冲液交换。在Amicon浓缩剂中，以10,000MWCO使用PBS(pH 7.4)执行连续清洗，藉以移除多余的小分子。SDS-PAGE分析结果如第6图所示。
3.3ADC的DAR数量定性
制造ADC时，抗体对承载物之总承载量称为药物抗体比或DAR。利用质谱仪计算每一个ADC的DAR。使用10kDa超高速离心机，使ADC样品在三次浓缩/稀释循环中利用ddH2O进行脱盐处理。在正离子模式下进行质谱仪实验，建立于Xevo G2-XS QTOF装置(Waters,Manchester,UK)；该装置设有ESI离子源、3.0kV之毛细管电压以及150V之样品锥。在700–4000之m/z范围下收集完整的扫描图谱。使用Waters MassLynx软件控制装置以及处理数据。请参照第7图，TRZ-A22呈现出：对应至具有DAR数＝4之ADC的主要波峰，以及对应至具有DAR数＝3之ADC的一较小波峰。下列方程式系用于建立平均ADR数：
在此，变异性是相对丰富的，n＝抗体上的承载物(药物)数量，y％＝每一个ADC基于各波锋面积所计算出的波锋面积比。TRZ-A22的平均药物抗体比(DAR)系如表1所示，且所有ADC的平均DAR系如表2所示。
表1：各DAR数的比值(TRZ-A22)
波锋 DAR0 DAR1 DAR2 DAR3 DAR4
比值 - - - 13.7％ 86.3％
平均DAR：3.9
※以波锋面积为基准
表2：以MS图谱中ADC的各质量数的密度百分比为基准，所计算出来的DAR数
ADCs 平均DAR ADCs 平均DAR
TRZ-A01 3.5 TRZ-A12 3.8
TRZ-A01-D2 1.8 TRZ-A13 3.2
TRZ-A02 4.0 TRZ-A14 3.0
TRZ-A03 3.0 TRZ-A15 3.7
TRZ-A04 3.3 TRZ-A17 3.5
TRZ-A05 4.0 TRZ-A18 3.4
TRZ-A06 3.1 TRZ-A20 5.8
TRZ-A09 3.9 TRZ-A21 3.0
TRZ-A10 3.8 TRZ-A22 3.9
TRZ-A11 3.6 TRZ-A23 3.8
TRZ-A11-D2 1.9 TRZ-A24 3.5
由于特殊的制程，本发明之实施方式可具有相对高的平均DAR数。根据本发明之实施例，具有两个双分支醣基的抗体，其平均DAR数为3.0以上。相反地，在本技术领域中已知抗体的平均DAR数一般为2.0以下。具有两个单分支醣基的抗体，其平均DAR数为1.5至2.0。较高的平均DAR数表示：各抗体分子可以携带较多的承载体，且由本发明说明书中记载的实验证明：本发明的抗体药物复合体作为疗效药物更加有效且具有更大的经济效应。
实施例4：利用ELISA试验检测CHO-A01对HER2的结合能力
进行Her2结合ELISA试验系用于评估：在连结基与药物复合以后，TRZ的结合是否减少。将人类HER2重组蛋白胞外区域(extracellular domain，ECD)(0.025μg/ml；SinoBiological Inc.)加入碳酸盐涂覆缓冲液(pH 10.0)中，于4℃下涂覆于96孔盘(Corning)内静置隔夜。清洗后，将阻断(blocking)缓冲液(包含2％小牛血清蛋白及0.05％Tween20(溶于PBS))加入培养盘作用2小时。接着，再次清洗后，加入系列稀释的TRZ/TRZ-NKS/TRZ-A01，从0.00001μg/ml至3μg/ml(溶于3倍稀释的试验缓冲液)，作用1小时后，加入抗人类IgGHRP(Jackson Immuno Research Inc.)作用30分钟。最后，加入100μl的基质(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺,TMB)用于呈色，然后加入100μL之2.5N硫酸终止反应。利用Spectra Max M5微盘分析仪(Molecular Devices)测量450nm的吸光值，并利用四参数非线性回归方程式(4PL)作曲线拟合来分析数据。第8图显示为TRZ-A01的代表性结合曲线。在数量上，表3同时显示出：在Her2(ECD)的结合亲和力方面，TRZ-A01和其官能化TRZ-NKS相较于TRZ的EC50。结果显示：假设承载物复合不会改变抗原的结合亲和力，TRZ-A01、TRZ-NKS及TRZ对抗原的结合亲和力是有差异的。在其他承载物(A02至A24)上也可以观察到相同的结果。这些结果显示：在ADC复合后，不会影响TRZ-A01至A24对Her2的结合性。
表3：mAbs对Her2(ECD)的EC 50值(μg/mL)
mAb EC<sub>50</sub>(μg/mL) R<sup>2</sup>
Roche-TRZ 0.021 0.99
TRZ-A01 0.024 0.99
TRZ-NKS 0.026 0.99
如第8图所示，抗体药物复合体(即CHO-A01)保有市售抗体(即Roche-TRZ、IgG1κanti-HER2trastuzumab TRZ、Herceptin,Roche)的结合特性，显示复合不会改变ADC中抗体的构型。
实施例5：细胞毒杀性试验
将BT474细胞(2.5×103细胞/100μL/孔)成长并维持在90％Hybri-Care培养液(Modified Dulbecco's培养液)中，其中添加有30ng/mL EGF和10％胎牛血清蛋白。次日，使用培养液稀释抗体、ADC(TRZ或TRZ-A01)、或，再分别添加使最终浓度范围介于20.5-0.0031nM或1000-0.00001nM。持续培养5天，且利用CellTiter-Glo(Promega Inc.)藉由测量发光性来估算细胞存活数，等同于ATP的数量。利用Spectra Max M5微盘分析仪(Molecular Devices)收集数据，并利用四参数非线性回归方程式(4PL)作曲线拟合来分析数据。在培养液中的BT474细胞的数目设定为100％细胞存活性，而只有培养液的细胞数目设定为0％细胞存活性。
表4：在Her2正表现之BT-474细胞中，TRZ对ADCs的细胞毒杀性增量(EC50值of TRZ/ADC)之总表
如第9图所示，TRZ-A01引发的细胞毒杀性呈现剂量依赖性。相反地，在测试单独TRZ浓度的组别中显示出微弱的细胞毒杀性。此外，在Her2抗原负表现的MDA-MB231细胞中并没有观察到细胞毒杀性。这个结果指出ADC同时具有结合专一性及细胞毒杀性的优点。TRZ-A01-TRZ-A25相较于TRZ的相对效能系利用下列方程计算：相对效能＝(TRZ之EC50值)/(ADC之EC50值)，且结果整理于表4中。
其他Her2-正表现的癌细胞株，例如SKBR3、NCI-N87、JIMT-1、及MCF-7，并且同时使用TRZ-A01及TRZ诱发Her2-负表现的MDA-MB-231细胞进行细胞毒杀性试验。请参阅表5，结果显示所有Her2-正表现的细胞株对TRZ-A01比TRZ具有更高的反应。表5：比较TRZ-A01在HER2-正表现细胞株或HER2-负表现细胞株的细胞毒杀性
实施例6：活体功效动物模式
从台湾BioLasco购得六周大的雌性C.B-17SCID小鼠，所有的小鼠皆在右齿腹以皮下接种注入5x106个NCI-N87细胞。利用光标尺测量肿瘤生长并利用方程式:1/2[长度(mm)]×[宽度(mm)]2计算肿瘤体积。当肿瘤尺寸达到约300mm3体积时(在第28天)，将动物随机分成两组，每组3只小鼠，以TRZ-A01或载体(控制组)处理。TRZ-A01组系从腹腔给予5mg/kg的TRZ-A01(溶于无菌生理食盐水)，每周给药一次，共处理4周；且载体控制组系单独给予无菌生理食盐水。在整个实验期间，每两周记录肿瘤尺寸、体重、及死亡率。所有动物实验方法皆由泉盛生物科技股份有限公司(Fountain Biopharma)的动物实验管理小组(IACUC)批准并执行。
实验结束(第71天)后，两组肿瘤体积的差异系利用非成对t值测验做统计分析。和载体控制组相比，TRZ-A01组对活体肿瘤生长表现出显著的抑制效果。
如第10图所示，在NCI-N87异种移植模式中，ADC A01的抗肿瘤活性明显比载体控制组更加有效。在每7天处理一次，共4次的5mg/kg TRZ-A01处理以抑制NCI-N87的肿瘤生长，数据显示出肿瘤不但没有成长，实际上反而缩小。相较之下，控制组的肿瘤持续成长。这个令人印象深刻的结果证明本发明抗体药物复合体的功效。如此令人印象深刻的结果同样可证明本发明抗体药物复合体的每一个抗体分子上具有较多的承载物分子(即：在多数实施例中DAR为3.0以上)。药物抗体比(DAR)表示在抗体药物复合体中的每个抗体分子携带的药物分子数目。在ADC复合体中，DAR数目可由MS质谱仪以每一种ADC的密度百分比为基准所计算出来。
上述结果清楚指出本发明的抗体药物复合体是有效且专一的疗效药物。本发明部分实施例关于一种利用本发明ADC治疗疾病或症状的方法，其中ADC中的抗体单元可结合至特定目标，此时ADC中的药物单元发挥其治疗效果或细胞毒杀效果。
根据本发明实施例的方法可包括：将有效剂量的本发明ADC注入有治疗需要的一主体。本技术领域中具有通常知识者可了解特定ADC的有效剂量须依照疾病种类、病人条件、给药路径等而调整。本技术领域中具有通常知识者不需创造性的努力即能够决定出有效剂量。
本发明已经在有限的实施例下加以说明，本技术领域中具有通常知识者可从本发明所揭露内容得到启发，在不背离于此揭露之本发明申请专利范围之前提下推知其他可变化的实施方式。据此，本发明的范围仅受限于所依附的申请专利范围。

Claims (15)

1.一种抗体药物复合体，其包含如式(I)所示之结构或其药学上可接受之盐类：
其中，
Ab为一不具醣基之抗体；
G1及G2各自是相同或不同之一醣单元；
Cn1及Cn2各自是相同或不同之一复合单元；
L1和L2各自是相同或不同之一直接键结或一链接单元；
D1及D2各自是相同或不同之一药物单元以及
在x+y≠0的前提下，x和y系独立为0至8之整数。
2.如权利要求1所述之抗体药物复合体，其中该抗体结合至一目标，该目标系选自由：分化群19、分化群22、分化群27、分化群30、分化群33、分化群37、分化群70、分化群74、分化群79b、分化群138、分化群142、碳酸酐酶6、钙黏素、癌胚抗原相关细胞黏附分子5、LY6/PLAUR结构域蛋白3、Delta样配体3、上皮生长因子受器、上皮生长因子受器VIII、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3、肝配蛋白A型受体2、肝配蛋白A、叶酸受体蛋白1、纤维母细胞生长因子受体2、鸟苷酸环化酶C、人类表皮生长因子受体2、受体酪胺酸激酶、雌激素调节蛋白、间皮素、黏蛋白16、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2b、连接蛋白4、跨膜醣蛋白神经介素蛋白B、前列腺特异性膜抗原、SLIT及NTRK相似蛋白6、前列腺六跨膜上皮抗原1、滋养层细胞表面抗原2、滋养层醣蛋白、阶段特异性胚胎抗原4、五分子前趋醣脂质及Tn所组成之群组。
3.如权利要求1或2所述之抗体药物复合体，其中该醣单元具有如式(II-1a)所示之结构：
其中，
RN1a、RN1b、RN2a、及RN2b系独立选自由氢、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6酰基、及氮保护基团所组成之群组；其中氮保护基可为本技术领域中所熟知的氮保护基团，例如异丁基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、芐基、芐氧羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯芴基、及对甲氧基苄基；
[Ab]表示该抗体的接点；以及
[Cn]表示该复合单元的接点。
4.如权利要求1或2所述之抗体药物复合体，其中该醣单元具有如式(II-1b)所示之结构：
其中
[Ab]表示该抗体的接点；以及
[Cn]表示该复合单元的接点。
5.如权利要求1或2所述之抗体药物复合体，其中该醣单元具有如式(II-2a)所示之结构：
其中，
RN1a、RN1b、RN2a、及RN2b系独立选自由氢、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6酰基、及氮保护基团所组成之群组；
其中氮保护基可为本技术领域中所熟知的氮保护基团，例如异丁基氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、芐基、芐氧羰基、烯丙氧羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯芴基、及对甲氧基苄基；
[Ab]表示该抗体的接点；以及
[Cn]表示该复合单元的接点。
6.如权利要求1或2所述之抗体药物复合体，其中该醣单元具有如式(II-2b)所示之结构：
其中，
[Ab]表示该抗体的接点；以及
[Cn]表示该复合单元的接点。
7.如权利要求1至6的任一项所述之抗体药物复合体，其中该复合单元系选自由：式(III-1)、式(III-2a)、式(III-2b)、式(III-2c)、式(III-2d)、式(III-3)、式(III-4a)、式(III-4b)、式(III-4c)、及式(III-4d)之结构所组成之群组；
其中，
Q系Y1+Y2连接基团，其中Y1和Y2系独立选自由：直接键结、—(CH2)n—、—O—、—NH—、—C(O)—、—C(O)NH—、—NHC(O)—、—(CH2)nO—、—O(CH2)n—、—(CH2)n—C(O)—、—C(O)(CH2)n—、—(CH2)n—NH—、—NH—(CH2)n—、—(CH2)n—NHC(O)—、—C(O)(CH2)n—NHC(O)—、(CH2)nSCH2C(O)—、及—(CH2CH2O)m—所组成之群组；
R3a系选自由：氢、卤素、C1-C6烷基所组成之群组；
R3b系独立选自由：氢、卤素、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基、选择性被取代之C1-C24环烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3c系独立选自由：氢、卤素、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C6-C24芳基、选择性被取代之C7-C24芳烷基、选择性被取代之C4-C24杂芳基、及选择性被取代之C5-C24杂芳烷基所组成之群组；
R3d系独立选自由：氢、卤素、OH、-NO2、-CN、选择性被取代之C1-C6烷基、选择性被取代之C1-C6烷氧基所组成之群组；
n为1至8的整数，亦包括1及8；
m为1至4的整数，亦包括1及4；
[G]表示该醣单元的接点；以及
[L]表示该链接单元的接点。
8.如权利要求1至7的任一项所述之抗体药物复合体，其中该链接单元系选自由：式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、及式(IV-5)之结构所组成之群组；
其中，
[Cn]表示该复合单元的接点；以及
[D]表示该药物单元的接点；
并且m和n各自为0至6的整数，亦包括0及6。
9.如权利要求1至8的任一项所述之抗体药物复合体，其中该药物单元系选自由：单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F-单甲基澳瑞他汀D、美登素DM1/DM4、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B、埃博霉素A、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸盐、澳瑞他汀氨基喹啉、Halocombstatins、刺孢霉素θ、7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)、吡咯苯并二氮杂卓、水鬼蕉碱、环磷酸酯、Cribrostatin-6、Kitastatin、涡轮他汀1-4、海洛因他汀、及Silstatins所组成之群组。
10.如权利要求1至9中任一项所述之抗体药物复合体，其中该抗体药物复合体系利用一化合物所合成，该化合物系选自由下列A01至A24所组成之群组：
A01
A02
A03
A04
A05
A06
A07
A08
A09
A10
A11
A12
A13
A14
A15
A16
A17
A18
A19
A20
A21
A22
A23
A24
11.如权利要求1至4及7至9的任一项所述之抗体药物复合体，其中一药物抗体比为3以上。
12.如权利要求1至2及5至9的任一项所述之抗体药物复合体，其中一药物抗体比为介于1.5至2.0之间。
13.一种用于治疗癌症之组合物，其中该组合物包括如权利要求1至12的任一项所述之抗体药物复合体。
14.如权利要求13所述之组合物，其中该癌症为脑癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰脏癌、结肠癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌或前列腺癌。
15.如权利要求14所述之组合物，其中该癌症为乳癌或胃癌。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020249063A1 (en) * 2019-06-13 2020-12-17 Bio-Thera Solutions, Ltd. Methods for the treatment of trop2 positive diseases
US11407514B2 (en) * 2019-08-20 2022-08-09 B/E Aerospace, Inc. End bay assembly with deployable step and deployable step constructions
WO2023239803A1 (en) * 2022-06-08 2023-12-14 Angiex, Inc. Anti-tm4sf1 antibody-drug conjugates comprising cleavable linkers and methods of using same

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011968A2 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
WO2014177771A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
WO2015057699A2 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
WO2015057066A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2015157446A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
WO2016057769A2 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
WO2016109802A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Development Center For Biotechnology Site-specific conjugation through glycoproteins linkage and method thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6075134A (en) * 1997-05-15 2000-06-13 The Regents Of The University Of California Glycoconjugates and methods
US7070801B2 (en) * 2002-01-30 2006-07-04 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Sugar-modified liposome and products comprising the liposome
US10087236B2 (en) * 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US10851174B2 (en) * 2011-03-03 2020-12-01 University Of Maryland, Baltimore Core fucosylated glycopeptides and glycoproteins: chemoenzymatic synthesis and uses thereof
CN110201186A (zh) * 2012-10-23 2019-09-06 西纳福克斯股份有限公司 经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011968A2 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 Seattle Genetics, Inc. Beta-glucuronide-linker drug conjugates
WO2014177771A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
WO2015057066A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2015057699A2 (en) * 2013-10-15 2015-04-23 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
WO2015157446A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
WO2016057769A2 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
WO2016109802A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Development Center For Biotechnology Site-specific conjugation through glycoproteins linkage and method thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG TANG等: "One-pot N-glycosylation remodeling of IgG with non-natural sialylglycopeptides enables glycosite-specific and dual-payload antibody–drug conjugates", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》 *
PAMELA THOMPSON等: "Straightforward Glycoengineering Approach to Site-Specific Antibody−Pyrrolobenzodiazepine Conjugates", 《ACS MED. CHEM. LETT.》 *
PRADMAN K. QASBA: "Glycans of Antibodies as a Specific Site for Drug Conjugation Using Glycosyltransferases", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
QUN ZHOU等: "Site-Specific Antibody−Drug Conjugation through Glycoengineering", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
REMON VAN GEEL等: "Chemoenzymatic Conjugation of Toxic Payloads to the Globally Chemoenzymatic Conjugation of Toxic Payloads to the Globally Highly Efficacious Antibody−Drug Conjugates", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *
TIEZHENG LI等: "Glycosynthase Mutants of ESubstrate Specificity for Antibody Glycosylation Remodelingndoglycosidase S2 Show Potent Transglycosylation Activity and Remarkably Relaxed", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

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