TWI744413B - 抗體藥物複合體 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容提供一種抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate, ADC)，包括如式(I)所示之結構或其藥學上可接受之鹽類：
其中， Ab為不具醣基之抗體(即為抗體的蛋白質部分)； G1
及G2
可為相同或不同之醣單元； Cn1
及Cn2
可為相同或不同之複合單元； L1
和L2
可為相同或不同之連結單元； D1
和D2
可為相同或不同的藥物單元；以及 在x + y ≠ 0的前提下，x和y係獨立為0至8之整數。
Description
本發明係關於一種抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate, ADC)，尤指一種透過醣基使藥物單元專一性連接至抗體接點的抗體藥物複合體。
抗體藥物複合體(antibody-drug conjugat, ADCs)可提供治療多種疾病或症狀的標靶治療，例如提供癌症的標靶治療。抗體藥物複合體是一種複合分子，其包括連結至生物活性藥物(例如細胞毒殺性藥劑或藥物)的抗體。藉由組合特定抗體標的以及藥物療效，抗體藥物複合體可以辨別正常細胞與癌細胞，進而減少副作用。
抗體藥物複合體一般包括一可辨識特殊標記(例如腫瘤標記)之抗體以及藉由偶聯結至抗體之抗癌藥物(例如細胞毒素)。在身體內，抗體追蹤這些蛋白質標記，並使自己與癌細胞表面接觸。抗體與標的蛋白(抗原)之間的生化反應會引發腫瘤細胞內的訊號傳遞，而後使抗體藥物複合體內化；待抗體藥物複合體內化以後，細胞毒性藥物被釋放出來並且殺死癌細胞。由於此標靶過程，藥物具有較低的副作用。
在抗體藥物複合體中，抗體與細胞毒性藥物(例如抗癌藥物)之間的穩定連結相當重要。連結基(linkers)可為裂解性或非裂解性。在使用非裂解性連結基的情況下，抗體、連結基及細胞毒性藥物(抗癌藥物)全部皆進入標的癌細胞中，抗體可在癌細胞內被分解，而細胞毒性藥物可在細胞內被釋放出來。另一方面，在使用裂解性連結基的情況下，細胞毒性藥物可能會在標的細胞外就被釋放出來，可能引發針對鄰近癌細胞的「旁觀者殺傷效應」(bystander killing)。
在抗體藥物複合體早期的發展中，已經研究出部分的共軛化學性。在非選擇性的模式中，藥物基團通常會接觸抗體的離胺酸或半胱胺酸側鏈，因此，非選擇性的共軛方式使抗體藥物複合體一般包含具有不同藥物抗體比(drug-antibody ratio, DAR)的分子混合物，因此產生不同的藥物動力學性質。
近年來，生物科技已發展出接點專一性的共軛方式，能夠固定連結基和承載的細胞毒殺藥物的數量與準確的連結位置。舉例來說，此類方法包括經由硫基修飾的抗體、或其他修飾後具有結合區的相似抗體。
提供接點專一性接觸的另一種方法為：使承載物接觸抗體的醣基。即使該方法可提供接點專一性的接觸，但因抗體上醣基的異質性(heterogeneity)，該方法可能無法製造出同質的抗體藥物複合體。
典型的IgG包含位於Fc區域Asn297位置的N-醣基。N-醣基一般為具有相當結構異質性的雙分支(biantennary)複合型，其中核心五聚醣可以不同的核心海藻糖(Fuc)、等分N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、末端半乳糖(Gal)、及末端唾液酸(Sia)修飾。N-醣基的組成可影響Fc區域的構形，因而調節抗體性質，例如穩定性、免疫原性、效用功能(effector functions)、抗體介導的發炎反應、以及補體活化作用。
具有接點專一性的抗體藥物複合體係以異質性醣基為基礎，造成高度變異性的藥物抗體比(DAR)以及藥物動力學特性。因此，目前亟需發展一種較佳的接點專一性抗體藥物複合體之製備方法，以使組合物內具有實質相同的抗體藥物複合體。
本發明之實施方式係關於抗體藥物複合體，其利用醣基團與承載物接觸。抗體的醣基可以被修飾為實質相同物，此類醣基修飾可利用醣苷內切酶進行。例如，在天然抗體上的醣基可被醣苷內切酶切割分解成一種或多種醣基殘基。然後，具有特定結構的醣基可以與剩下的醣基殘基結合，以產生具有實質相同醣基結構的抗體。接著，這些抗體可用於製備抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate, ADC)。
本發明之抗體藥物複合體皆為實質均相化，它們在製造、品質控管、及體內藥物動力學特性上可具有較佳的性質，尤其是針對給藥系統的設計與監測的體內藥物動力學特性。
由於特殊的製程，本發明之實施方式可具有相對高的平均藥物抗體比。根據本發明之實施方式，具有兩個雙分支醣基的抗體，其平均藥物抗體比為3.0以上。相反地，一般來說，在本技術領域中已知抗體的平均藥物抗體比為2.0以下。具有兩個單分支醣基的抗體，其平均藥物抗體比為1.5至2.0。較高的平均藥物抗體比表示各抗體分子可以攜帶較多的承載體，且由本發明說明書中記載的實驗證明：本發明的抗體藥物複合體作為療效藥物可具有更大的功效。此外，因本發明的抗體藥物複合體僅需少量即可達到相同的承載體輸送量，故成本較低；由於抗體價錢昂貴，此項優點可讓病患省下不少的治療費用。
根據本發明的實施方式，具有特定結構的醣單元可以先和連結基-藥物單元(linker-drug moiety)結合，再與被切割的抗體複合。或者，具有特定結構的醣單元可以先與被切割的抗體複合，再和連結基-藥物單元結合。
根據本發明部分實施方式，「連結基-藥物」 (linker-drug)單元可以不用在與醣單元複合之前形成。換言之，連結基可以先和醣基連結，然後藥物單元再與產物單元接觸。
根據本發明的實施方式，一種抗體藥物複合體(ADC)可具有如式(I)所示之結構或其藥學上可接受之鹽類：
式(I) 其中， Ab為不具醣基之抗體(即為抗體的蛋白質部分)； G1
及G2
可為相同或不同之醣單元； Cn1
及Cn2
可為相同或不同之複合單元； L1
和L2
可為相同或不同之連結單元； D1
和D2
可為相同或不同的藥物單元；以及 在x + y ≠ 0的前提下，x和y係各自為從0至8之整數。
根據本發明部分實施方式，抗體藥物複合體中的抗體結合至一標的，該標的係選自由：分化群19 (Cluster of differentiation 19, CD19)、分化群22 (CD22)、分化群27 (CD27)、分化群30 (CD30)、分化群33 (CD33)、分化群37 (CD37)、分化群56 (CD56)、分化群70 (CD70)、分化群74 (CD74)、分化群79b (CD79b)、分化群138 (CD138)、分化群142 (CD142)、碳酸酐酶6(Carbonic anhydrase 6, CA6)、鈣黏素(p-Cadherin)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)、LY6/PLAUR結構域蛋白3(LY6/PLAUR Domain Containing 3, C4.4a)、Delta樣配體3 (Delta-like 3, DLL3)、上皮生長因子受器 (epidermal growth factor receptor, EGFR)、上皮生長因子受器VIII (epidermal growth factor receptor variant III, EGFRVIII)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3 (Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3, ENPP3)、肝配蛋白A型受體2 (ephrin type-A receptor 2, EphA2)、肝配蛋白A(EphrinA)、葉酸受體蛋白1(Folate Receptor 1, FLOR1)、纖維母細胞生長因子受體2 (Fibroblast growth factor receptor, FGFR2)、鳥苷酸環化酶C (Guanylate cyclase, GCC)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)、受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase, cKIT)、雌激素調節蛋白1(Estrogen-Regulated Protein LIV1)、間皮素(Mesothelin, MSLN)、黏蛋白16 (Mucin 16, MUC16)、鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白2b (Sodium-dependent phosphate transport protein 2B, NaPi2b)、連接蛋白4 (Nectin4)、跨膜醣蛋白神經介素蛋白B (Transmembrane glycoprotein neuromedin B, gpNMB)、前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen, PSMA)、SLIT及NTRK相似蛋白6 (SLIT and NTRK-like protein 6, SLITRK6)、前列腺六跨膜上皮抗原1 (six transmembrane epithelial antigen of the prostate, STEAP1)、滋養層細胞表面抗原2 (trophoblast cell surface antigen, TROP2)、滋養層醣蛋白(Trophoblast glycoprotein, 5T4)、階段特異性胚胎抗原4 (stage-specific embryonic antigen 4, SSEA4)、Globohexaosylceramide, (GloboH)、五分子前趨醣脂質(Gb5)、(Sialyl-Tn, STn)、及Tn所組成之群組。
根據本發明部分實施方式，醣基可選自由：雙醣、三醣、四醣、五醣、六醣、七醣、八醣、九醣、十醣及十一醣所組成之群組。
根據本發明之較佳實施方式，該醣單元可具有如式(II-1a)或式(II-2a)所示之結構：
式(II-1a)
式(II-2a) 其中， RN1a
、RN1b
、 RN2a
、及RN2b
各自獨立選自由氫、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6醯基、及氮保護基團所組成之群組；其中氮保護基團可為本技術領域中所熟知的合適氮保護基團，例如異丁基氧基羰基(isotertbutyloxycarboxy group, t-BOC)、9-芴基甲氧基羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl group, Fmoc)、芐基(benzyl group, Bn)、芐氧羰基(benzyloxycarbonyl group, Cbz)、烯丙氧羰基(allyloxycarbonyl group, Aloc)、2-（三甲基甲矽烷基）乙氧基羰基(2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl group, Teoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(2,2,2-trichloroethoxycarbonyl,Troc)、二苯甲基(diphenylmethyl group, Dpm)、三苯甲基(trityl group, Tr)、9-苯芴基(9-phenylfluorenyl group, PhFI)、及對甲氧基苄基(p-methoxybenzyl group, PMB)；[Ab] 表示抗體的接點；以及 [Cn] 表示複合單元的接點。
根據本發明之較佳實施方式，該醣單元可具有如式(II-1b)或式(II-2b)所示之結構：
式(II-1b)
式(II-2b)， 其中[Ab] 表示抗體的接點；[Cn] 表示複合單元的接點。
根據本發明之部分實施方式，該複合單元可選自由：式(III-1)、式(III-2a)、式(III-2b)、式(III-2c)、式(III-2d)、式(III-3)、式(III-4a)、式(III-4b)、式(III-4c)、及式(III-4d)之結構所組成的群組；
式(III-1)
式(III-2a)
式(III-2b)
式(III-2c)
式(III-2d)
式(III-3)
式(III-4a)
式(III-4b)
式(III-4c)
式(III-4d) 其中， Q係Y1+Y2連接基團(spacer group)，其中Y1和Y2係獨立選自由：直接鍵結、—(CH2
)n
—、—O—、—NH—、—C(O)—、—C(O)NH—、—NHC(O)—、—(CH2
)n
O—、—O(CH2
)n
—、—(CH2
)n
—C(O)—、—C(O)(CH2
)n
—、—(CH2)n
—NH—、—NH—(CH2
)n
—、—(CH2
)n
—NHC(O)—、—C(O)(CH2
)n
—NHC(O)—、(CH2
)n
SCH2
C(O)—、及 —(CH2
CH2
O)m
所組成之群組； R3a
係選自由：氫、鹵素、C1-C6烷基所組成之群組； R3b
係獨立選自由：氫、鹵素、-NO2
、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基、選擇性被取代之C1-C24環烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基、選擇性被取代之C7-C24芳烷基、選擇性被取代之C4-C24雜芳基、及選擇性被取代之C5-C24雜芳烷基所組成之群組； R3c
係獨立選自由：氫、鹵素、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基、選擇性被取代之C7-C24芳烷基、選擇性被取代之C4-C24雜芳基、及選擇性被取代之C5-C24雜芳烷基所組成之群組； R3d
係獨立選自由：氫、鹵素、OH、-NO2
、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基所組成之群組； n為1至8的整數，亦包括1及8； m為1至4的整數，亦包括1及4； [G] 表示醣單元的接點；以及 [L] 表示連結單元的接點。
根據本發明之部分實施方式，「連結單元」(linker moeity)可為一直接鍵結。換言之，藥物係直接連結到複合單元而不需中間連結基。根據本發明之部分實施方式，連結單元可為裂解性或非裂解性。裂解性的連結單元，例如：可包含化學鍵(如酯或醯胺)，其可水解/降解或可在體內被酵素切割。根據本發明之部分實施方式，連結單元可為水溶性或非水溶性。
根據本發明之較佳實施方式，連結單元可選自由：式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、及式(IV-5)結構所組成之群組；
式(IV-1)
式(IV-2)
式(IV-3)
式(IV-4)
式(IV-5) 其中， [Cn] 表示複合單元的接點； [D] 表示藥物單元的接點； 並且m和n各自為0至6的整數，亦包括0及6。
根據本發明之部分實施方式，該藥物單元(承載物)可選自由：單甲基澳瑞他汀E (Monomethyl auristatin E, MMAE)、單甲基澳瑞他汀F (Monomethyl auristatin F, MMAF)、單甲基澳瑞他汀D (Monomethyl auristatin D, MMAD)、美登素DM1/DM4 (Mertansine, Maytansinoid DM1/DM4) 、紫杉醇(Paclitaxel)、多西他賽(Docetaxel)、埃博黴素B (Epothilone B)、埃博黴素A (Epothilone A)、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸鹽(Auristatin tyramine phosphate)、澳瑞他汀氨基喹啉(Auristatin aminoquinoline)、Halocombstatins、刺孢霉素θ(Calicheamicin theta)、7-乙基-10-羥基-喜樹鹼(SN-38) (7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin (SN-38))、吡咯苯並二氮雜卓(Pyrrolobenzodiazepine,
PBD)、水鬼蕉鹼(Pancratistatin)、環磷酸酯(Cyclophosphate)、Cribrostatin-6、Kitastatin、渦輪他汀1-4 (Turbostatin 1-4)、海洛因他汀(Halocombstatins)、Silstatins、前微管菌素D (Pretubulysin D)、及微管菌素(Tubulysins) (微管菌素A、B、C、D、E、F、G、H、 I、U、V、及Z)所組成之群組。本發明另一目的係提供一種使用上述抗體藥物複合體做為用以治療癌症之醫藥組合物的方法。根據本發明之部分實施方式，該癌症可為腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、胃癌、子宮頸癌、卵巢癌或前列腺癌。
由下列敘述和依附之申請專利範圍，可明顯推知本發明之其他特徵和優點。
本發明之實施方式係關於利用醣基與承載物接觸的抗體藥物複合體。抗體的醣基可以被修飾為實質相同。在本發明中，「實質相同」表示80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、再更佳為95%以上的同質性(homogeneity)。此類醣基修飾可利用醣苷內切酶進行。例如，在天然抗體上的醣基可被醣苷內切酶切割分解成一種或多種醣基的殘基。然後，具有特定結構的醣基可以與剩下的醣基殘基結合，以產生具有實質相同醣基結構的抗體。接著，這些經醣基化修飾的抗體可用於製備抗體藥物複合體。另一種可能是，具有特定結構的醣基可與連結基或帶有藥物基團的連結基結合，接著再與經醣苷內切酶切割後的抗體結合。
根據本發明之實施方式，醣基化修飾可包含使用源自釀膿鏈球菌(Streptococcus Pyogenes
)之醣苷內切酶S2 (endoglycosidase S2, EndoS2)或其突變體，可提高轉醣化活性以及降低水解活性，使合成的抗體攜帶大量具有明確定義的N-醣基。這些帶有明確定義的N-醣基可接續用於製備抗體藥物複合體。
由於特殊的製程，本發明之實施方式可具有相對高的平均藥物抗體比。根據本發明之實施例，具有兩個雙分支(biantennary)醣基的抗體的平均藥物抗體比為3.0以上。相反地，一般而言在本技術領域中已知抗體的平均藥物抗體比為2.0以下。具有兩個單分支醣基的抗體，其平均藥物抗體比為1.5至2.0。較高的平均藥物抗體比表示：各抗體分子可以攜帶較多的承載體，且由本發明說明書中記載的實驗證明：本發明的抗體藥物複合體作為療效藥物可具有更大的功效。此外，因本發明的抗體藥物複合體僅需少量即可達到相同的承載體輸送量，故成本較低；由於抗體價錢昂貴，此項優點可讓病患省下不少的治療費用。
根據本發明之實施方式，抗體藥物複合體中的藥物單元(承載物)可以使用連結基與醣基接觸、或不使用連結基直接與醣基接觸。
根據本發明的實施方式，一種抗體藥物複合體可具有如式(I)所示之結構或其藥學上可接受之鹽類：式(I) 其中， Ab為不具醣基之抗體(即為抗體的蛋白質部分)； G1
及G2
可為相同或不同之醣單元； Cn1
及Cn2
可為相同或不同之複合單元； L1
和L2
可為相同或不同之連結單元； D1
和D2
可為相同或不同的藥物單元；以及 在x + y ≠ 0的前提下，x和y係獨立為0至8之整數。
根據本發明部分實施方式，抗體藥物複合體中的該抗體可自主結合至一標的，例如：分化群19 (CD19)、分化群22 (CD22)、分化群27 (CD27)、分化群30 (CD30)、分化群33 (CD33)、分化群37 (CD37)、分化群70 (CD70)、分化群74 (CD74)、分化群79b (CD79b)、分化群138 (CD138)、分化群142 (CD142)、碳酸酐酶6(CA6)、鈣黏素(p-Cadherin)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)、LY6/PLAUR結構域蛋白3(C4.4a)、Delta樣配體3 (DLL3)、上皮生長因子受器 (EGFR)、上皮生長因子受器VIII (EGFRVIII)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3 (ENPP3)、肝配蛋白A型受體2 (EphA2)、肝配蛋白A(EphrinA)、葉酸受體蛋白1(FLOR1)、纖維母細胞生長因子受體2 (FGFR2)、鳥苷酸環化酶C (GCC)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、受體酪胺酸激酶(cKIT)、雌激素調節蛋白1(LIV1)、間皮素(MSLN)、黏蛋白16 (MUC16)、鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白2b (NaPi2b)、連接蛋白4 (Nectin4)、跨膜醣蛋白神經介素蛋白B (gpNMB)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、SLIT及NTRK相似蛋白6 (SLITRK6)、前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)、滋養層細胞表面抗原2 (TROP2)、滋養層醣蛋白(5T4)、階段特異性胚胎抗原4 (SSEA4)、Globohexaosylceramide (GloboH)、五分子前趨醣脂質(Gb5)、(Sialyl-Tn, STn)及Tn所組成之群組。
根據本發明部分實施方式，醣基可選自由：雙醣、三醣、四醣、五醣、六醣、七醣、八醣、九醣、十醣及十一醣所組成之群組。根據本發明之較佳實施方式，該醣單元可具有如式(II-1a)或式(II-2a)所示之結構：式(II-1a)式(II-2a) 其中，RN1a
、RN1b
、 RN2a
、及RN2b
係獨立選自由氫、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6醯基、及氮保護基團所組成之群組；其中氮保護基可為本技術領域中所熟知的氮保護基團，例如異丁基氧基羰基(t-BOC)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、芐基(Bn)、芐氧羰基(Cbz)、烯丙氧羰基(Aloc)、2-（三甲基甲矽烷基）乙氧基羰基(Teoc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)、二苯甲基(Dpm)、三苯甲基(Tr)、9-苯芴基(PhFI)、及對甲氧基苄基(PMB)；[Ab] 表示抗體的接點；以及[Cn] 表示複合單元的接點。
根據本發明之較佳實施方式，該醣單元可具有如式(II-1b)或式(II-2b)所示之結構：式(II-1b)式(II-2b)， 其中[Ab] 表示抗體的接點；以及[Cn] 表示複合單元的接點。
根據本發明之部分實施方式，該複合單元可選自由：式(III-1)、式(III-2a)、式(III-2b)、式(III-2c)、式(III-2d)、式(III-3)、式(III-4a)、式(III-4b)、式(III-4c)、及式(III-4d)結構所組成之群組；式(III-1)式(III-2a)式(III-2b)式(III-2c)式(III-2d)式(III-3)式(III-4a)式(III-4b)式(III-4c)式(III-4d) 其中， Q係Y1+Y2連接基團(spacer group)，其中Y1和Y2係獨立選自由：直接鍵結、—(CH2
)n
—、—O—、—NH—、—C(O)—、—C(O)NH—、—NHC(O)—、—(CH2
)n
O—、—O(CH2
)n
—、—(CH2
)n
—C(O)—、—C(O)(CH2
)n
—、—(CH2)n
—NH—、—NH—(CH2
)n
—、—(CH2
)n
—NHC(O)—、—C(O)(CH2
)n
—NHC(O)—、(CH2
)n
SCH2
C(O)—、及 —(CH2
CH2
O)m
所組成之群組； R3a
係選自由：氫、鹵素、C1-C6烷基所組成之群組； R3b
係獨立選自由：氫、鹵素、-NO2
、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基、選擇性被取代之C1-C24環烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基、選擇性被取代之C7-C24芳烷基、選擇性被取代之C4-C24雜芳基、及選擇性被取代之C5-C24雜芳烷基所組成之群組； R3c
係獨立選自由：氫、鹵素、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基、選擇性被取代之C7-C24芳烷基、選擇性被取代之C4-C24雜芳基、及選擇性被取代之C5-C24雜芳烷基所組成之群組； R3d
係獨立選自由：氫、鹵素、OH、-NO2
、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基所組成之群組； n為1至8的整數，包含1及8； m為1至4的整數，包含1及4； [G] 表示醣單元的接點；以及 [L] 表示連結單元的接點。
根據本發明之較佳實施方式，連結單元可選自由：式(IV-1)、式(IV-2)、式(IV-3)、式(IV-4)、及式(IV-5)結構所組成之群組；式(IV-1)式(IV-2)式(IV-3)式(IV-4)式(IV-5) 其中， [Cn] 表示複合單元的接點；以及 [D] 表示藥物單元的接點； 並且m和n係獨立為0至6的整數，包含0及6。
根據本發明之部分實施方式，該藥物(承載物)可選自由：單甲基澳瑞他汀E (MMAE)、單甲基澳瑞他汀F (MMAF)、單甲基澳瑞他汀D (MMAD) 、美登素DM1/DM4 (Maytansinoid DM1/DM4) 、紫杉醇、多西他賽、埃博黴素B、埃博黴素A、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸鹽、澳瑞他汀氨基喹啉、Halocombstatins、刺孢霉素θ、7-乙基-10-羥基-喜樹鹼(SN-38)、吡咯苯並二氮雜卓(PBD)、水鬼蕉鹼、環磷酸酯、Cribrostatin-6、Kitastatin、渦輪他汀1-4、海洛因他汀、Silstatins、前微管菌素D (Pretubulysin D)、及微管菌素(Tubulysins，A、B、C、D、E、F、G、H、 I、U、V、及Z)所組成之群組。
根據本發明之實施方式，藥物單元可以先和連結基結合(在有使用連結基之情況下)，然後再與醣基結合(例如：透過上述複合單元與醣基結合)。若沒有使用連結基，藥物單元可直接與醣基結合。
連結基和藥物之間的結合可以透過本技術領域中任一合適方法所完成。本技術領域中具有通常知識者將依據連結基和藥物的性質進而選用特定方法，且本技術領域中具有通常知識者不需過度實驗即能夠完成此結合。在稍後的段落中將描述部分實施例。一旦製備出藥物-連結單元，即可與醣單元結合。
別種可行方式是，連結基可先和醣單元結合，然後再使藥物單元與連結基接觸。再次說明，這些方法為習知技術，本技術領域中具有通常知識者不需過度實驗即能夠進行這些反應。
可透過本技術領域中已知的多種利用溫和反應條件的方法以結合生物分子。例如：鍵擊化學(click chemistry)屬於一種生物相容性反應，其可用於結合標誌和生物分子(可參考H. C. Kolb; M. G. Finn; K. B. Sharpless (2001), "Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions
," Angewandte Chemie, Int’l Ed., 40(11): 2004–2021)。一種特別有效的鍵擊化學法係利用無銅、加壓的疊氮-炔基環加成法，將疊氮基添加至緊繃式炔基(例如環辛炔)，以形成新穎的五員環(five-membered ring)。此類鍵擊反應的一實例係於下列反應式中說明：
。
根據本發明部分實施方式，可以利用鍵擊化學法合成用於抗體藥物複合體的醣基-連結基單元。例如：醣基單元可包含一疊氮基，且連結基可包含環辛炔基(或相似的炔基)；以此類推。
除了鍵擊化學法以外，其他常用的耦合化學法也可用於本發明之實施方式。這些其他方法，例如可包括：透過加成或取代反應在酮/醛和胺之間形成希夫鹼(Schiff base，或肟(oxime))、或形成共價鍵等。
本發明之實施方式係由以下的實施例加以說明，本技術領域中具有通常知識者可了解這些實施例僅用於舉例說明，在不偏離本發明範圍的其他修改或變化亦可為之。此外，本技術領域中具有通常知識者可知曉以下實施例中的具體條件或數量。然而，這些具體條件或數量僅用於舉例說明而非用於限制本發明之範圍。
實施例
實施例1：經醣基化修飾抗體的製備與定性
反應式1：自CT(複合型)醣基製備NKS或NAS醣基
1.1製備NKS/NAS醣基
將CT(複合型)醣基進行唾液酸化以製備NKS/NAS醣基。將SCT(唾液酸化複合型)醣基(50.5 mg, 25 μmol溶於50 mM Tris-HCl緩衝液，pH值 7.4)於37℃下以唾液酸酶(sialidase)(75單位)處理24小時以獲得CT醣基，並使用薄層色層分析儀(Thin Layer Chromatography, TLC)監測獲得的CT醣基。然後將該溶液於80 ℃下加熱30分鐘，利用過濾移除失活的酵素，並將該溶液於真空中濃縮，接著透過G-20膠體層析(洗脫液，90%)純化出CT醣基粗萃物。
將CT醣基進行酵素法以製備NKS/NAS醣基。簡言之，將降鈣素(calcitonin, CT) (32.8 mg, 18 µmol)、三磷胞苷酸(cytidine triphosphate, CTP) (5 µmol) 、ManNAcN3
/ManNAcLev (40 µmol) 、丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate) (81 µmol) 、磷酸烯醇丙酮酸鹽(Phosphoenolpyruvate, PEP) (55 µmol) 、及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP) (5 µmol)溶於50 mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, Tris-HCl)緩衝液(pH 8.0)中。將α-(2,6)- 唾液酸轉移酶(20 單位)、唾液酸醛醇酶(20單位)、CMK (10單位)、丙酮酸激酶I(pyruvatekinase I, Pykf) (10單位)、多聚磷酸(polyphosphoric acid, PPA) (10單位)、及Pmcss (10單位)添加至該溶液中，且使該反應液於37℃下作用8小時，並使用薄層色層分析儀(TLC)監測該反應。待反應終止後，於100℃下加熱5分鐘使酵素失活。然後，以G25、二乙基氨基乙基(Diethylaminoethyl, DEAE)、及G25管柱純化所需之NKS/NAS (產率：29.1 mg, 80%)。ESI-TOF m/z: 2130.8349 ([M-H-
]-
of NKS), 2100.7804 ([M-
-H]-
of NAS)。
反應式2：NKS-噁唑林(oxazoline)或NAS-噁唑林之合成
1.2 形成NKS/NAS-噁唑林的一般流程
將NKS/NAS醣基(13.6 mg)及Na2
CO3
(78.75 mg)溶於H2
O (1.16 mL)中，冷卻至4℃，接著添加2-氯-1,3-二甲基-1H-苯並咪唑-3-鎓氯化物(2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium chloride, CDMBI) (48 mg)並將該反應液於4℃下以1000 rpm震盪2小時。該初萃液於3000 rpm下離心2分鐘，然後收集上清液待進一步純化。使用尺寸排除管柱(G25)，以0.01%的三乙醇胺/水(TEA (trithanolamine)/H2
O)接續100%的H2
O進行洗脫，收集產物然後凍乾，以得到白色粉末的NKS-噁唑林(NKS-ox)或NAS-噁唑林(NAS-ox)。
NAS-ox
：1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.09 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 5.12 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 4.8 (d,J
= 1.2 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.65-4.57 (m, 2H), 4.44 (d,J
= 7.6Hz, 1H), 4.38 (t,J
= 2.8 Hz, 1H), 4.23-4.13 (m, 4H), 4.06 (s, 4H), 4.25-3.46 (61H), 3.45-3.38 (m, 1H), 2.67 (dd,J
= 4 Hz, 12.8 Hz, 1H), 2.08-2.04 (m, 9H), 1.72 (t,J
= 12.4 Hz, 1H)。
NKS-ox
：1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.05 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 4.92 (s, 1H), 4.65-4.55 (m, 2H), 4.43-4.34 (m, 3H), 4.2-4.1 (m, 5H), 4.0-3.34 (m, 72H), 2.93-2.75 (m, 4H), 2.63 (dd,J
= 3.6 Hz, 12.4 Hz, 2H), 2.58-2.4 (m, 5H), 2.19 (s, 7H), 2.07-1.96 (m, 11H), 1.68 (t,J
= 12.0 Hz, 1H)。
反應式3：抗體(1)的醣基化修飾
1.3以單一容器化學酵素合成法的一般流程合成經醣基化修飾的賀癌平，其具有兩個修飾過的雙分支醣基(TRZ-NKS及TRZ-NAS)
取10 mg的賀癌平(Herceptin)溶於100 mM的TES緩衝液(pH值 7.0)中，再添加1至5 mg的EndoS2(或EndoS2的衍生物或突變體)，使最終抗體濃度為10 mg/mL。將該溶液於室溫下(30 ℃或37 ℃)反應1至4小時。然後，另取10-15 mg的EndoS2(或EndoS2的衍生物或突變體)添加至得到的賀癌平-N(F) (包含或不包含海藻糖的單GlcNAc；N 為GlcNAc且F為海藻糖)，冷卻至30 ℃，然後添加NKS/NAS-ox (6-8 mg) ，使最終抗體濃度為8 mg/mL，再反應1至1.5小時。待反應完成後，經轉醣化的賀癌平通過吸附管柱(Protein A)及陰離子交換管柱Capto S (GE Healthcare)純化。利用SDS-PAGE分析純化後的醣基化賀癌平(TRZ-NKS及TRZ-NAS)，並將緩衝液置換成磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline, PBS) (pH值7.4)待後續使用。
反應式4：抗體(2)的醣基化修飾
1.4經醣基化修飾的賀癌平後具有兩個修飾過的單觸角醣基(TRZ-NGKS)的一般製程
取50mg的TRZ-N溶於Tris緩衝液(pH 7.0)，使最終濃度為10mM的MnCl2
，混合1mg的β-1,4-半乳糖轉移酶，然後再添加5mg的尿嘧啶二磷酸半乳糖(UDP-Gal)，將該混合物於37℃下作用8小時，以生成TRZ-NG。接著合成TRZ-NGKS，在MgCl2
(10 mM)溶於Tris-HCl(100 mM)緩衝液(pH值8.0)中，將TRZ-NG與5 mmol的N-乙烯神經胺酸 (Neu5Ac)、0.05 mmol的ATP、0.5 mmol的CTP、10 mmol的PEP混合，再加入50 U的胞嘧啶核苷單磷酸激酶 (CMK)、120 U的CMP-唾液酸合成酶 (CSS)、100 U的丙酮酸激酶(pyruvatekinase, PK)、100 U的PPA及150 U的α-2,6-唾液酸轉移酶。將燒瓶置於25℃下作用至反應完成。利用質譜儀完善監控反應原料和產物(第2圖)。
1.5 醣基性質分析
利用GlycoWorks RapiFluor-MS N-醣基套組分析TRZ-NKS和 TRZ-NAS的醣基特性。根據操作手冊，從抗體水解出醣基並標誌上醣苷胺。標誌步驟後，利用HILIC SPE 微洗脫板(μElution plate)純化樣品。純化後的醣基利用Xevo G2-XS QToF結合Waters H-class UHPLC進行分析。利用ACQUITY UPLC 醣基 BEH 醯胺管柱 (2.1 mm X 150 mm, 1.7 μm, Waters Corp, Milford, MA) 以50分鐘梯度於0.4 mL/min流速下分離出醣基樣品。移動相A由50 mM的甲酸銨(溶於ddH2
O)所組成，以及移動相B由乙腈所組成。醣基分析是透過操作Xevo G2 XS QToF質譜儀在FastDDA模式下收集數據。
第3圖顯示TRZ、TRZ-NKS及TRZ-NAS的醣基特性比較結果。TRZ呈現出4.2%水平以上的高甘露糖型的N-醣基特性。相反地，TRZ-NKS及TRZ-NAS不具高甘露糖型的N-醣基。大多數從TRZ-NKS及TRZ-NAS釋放出來的醣基為經修飾的唾液酸化(Neu5AcN3
及Neu5AcLev)雙分支複合型醣基。
實施例2 ：承載物(A01-A24)的製備和特性
表1：經設計的承載物 
2.1化合物9 (A11)之合成與特性
製備化合物2
在化合物1(500.0 mg, 1.03 mmol)溶於20 ml EtOAc之溶液中添加NaBH(OAc)3
(500.0 mg, 1.54 mmol)，並於室溫下攪拌反應20小時。將該反應混合物用EtOAc稀釋並以1 N的HCl、飽和NaHCO3
水溶液及滷水清洗。該有機萃取層使用MgSO4
進行乾燥後濃縮以得到用於下一步驟的黃色固體化合物(485.0 mg)。將上述所得的化合物(450.0 mg, 0.93 mmol)、咪唑(69.4 mg, 1.02 mmol)及4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP) (11.4 mg, 0.093 mmol)溶於30 ml 的CH2
Cl2
溶液中，再添加重量為154.0 mg、濃度為1.02 mmol的叔丁基二甲基氯矽烷(tert-ButyldiMethylsilyl chloride, TBDMSCl)，將該反應液於室溫下攪拌15小時。將該反應混合物以CH2
Cl2
稀釋，並以1 N 之HCl、飽和NaHCO3
水溶液及滷水清洗。該有機萃取層使用MgSO4
進行乾燥後濃縮以得到黃色固體的化合物2(490.0 mg)。88%1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ 8.37 (t,J
= 1.6 Hz, 1H), 8.08 (dd,J
= 2.8, 9.2 Hz, 1H), 7.00 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 5.33 (m, 3 H), 5.23 (d,J
= 6.8 Hz, 1H), 4.70 (d,J
= 15.6 Hz, 1H), 4.56 (d,J
= 15.6 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 0.94 (s, 9H), 0.10 (s 3H), 0.10 (s, 3H)。
製備化合物3
將Pd(OH)2
添加至溶有化合物2(1.0 g, 1.67 mmol)的20 ml之EtOAc/MeOH (9:1)溶液中。此反應系統經抽真空後以H2
填充三次，利用球型瓶使該反應系統保持在H2
環境下，並於室溫下攪拌1小時。待反應完成後，過濾移除Pd(OH)2
。蒸發該濾出物以得到用於下一步驟的化合物2-1(930.0 mg)。在溶有化合物2-1(930.0 mg, 1.63 mmol)及琥珀酸酐(180.0 mg, 1.80 mmol)的20 ml CH2
Cl2
溶液中添加TEA (272 uL)。將該反應液於室溫下攪拌15小時後，利用管柱抽真空並純化以得到黃色油狀的化合物3 (2.78g)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.09 (s, 1H), 7.59 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.39 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 6.86 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.27 (m, 3H), 5.01 (d,J
= 6.8Hz, 1H), 4.69 (d,J
= 14.8 Hz, 1H),4.58 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.09 (d,J
= 8.4 Hz, 1H), 3.70 (s 3H), 2.88 (q,J
= 7.2 Hz, 8H),2.59 (bs, 4H), 2.03 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.17 (t,J
= 7.2 Hz, 9H), 0.92 (s , 9 H), 0.08 (s, 6H)。
製備化合物5
在溶有化合物3(289.0 mg, 0.432 mmol)、化合物4 (200 mg, 0.648 mmol)、及羥基苯並三唑(Hydroxybenzotriazole, HOBT) (100.0 mg, 0.648 mmol)之CH2
Cl2
溶液中添加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDCI) (100.0 mg, 0.648 mmol)。將該反應液於室溫下攪拌14小時後，將該溶液抽真空。利用管柱純化該粗萃物，以得到黃色油狀之化合物5 (340.0 mg, 0.35 mmol)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.78 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.53 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.41 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 6.85 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 6.75 (bs, 1H), 5.30 (m, 3H), 5.01 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 4.68 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.59 (d,J
= 15.2 Hz, 1 H), 4.10 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.70-3.15 (m, 12H), 3.40 (m, 2H), 2.60 (m, 4H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)。
製備化合物6
在溶有化合物5(300.0 mg, 0.312 mmol)的四氫呋喃(THF)溶液(25 mL)中添加375 uL的四丁基氟化銨(Tetrabutylammonium fluoride, TBAF)，於室溫下攪拌15小時。將該溶液抽真空後，利用管柱純化該粗產物，以得到黃色油狀之化合物6 (235.0 mg, 0.28 mmol)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.12 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.51 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.40 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.15 (bs, 1H), 6.9 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.30 (m, 3H), 5.02 (d,J
= 7.6 Hz, 1H), 4.68 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.40 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.12 (m, 1 H), 3.98 (m, 2H), 3.67 (s, 3 H), 3.66-3.50 (m, 12H), 3.40 (m, 2H), 2.60 (m, 4 H), 2.04 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.42 (s, 9H)。
製備化合物7
將化合物6(100.0 mg, 0.12 mmol)溶於5 mL之CH2
Cl2
並冷卻至0℃。將TEA (24.0 mg, 0.24 mmol)、DMAP (14.7 mg, 0.12mmol)、 對硝基苯氯甲酸酯(PNP Chloroformate) (47.7 mg, 0.24 mmol)添加至該混合物中，於室溫下攪拌3小時。將該反應混合物以CH2
Cl2
稀釋，並以1 N之HCl、飽和NaHCO3
水溶液及滷水清洗。該有機萃取層使用MgSO4
進行乾燥後濃縮，利用管柱純化該粗萃物以得到用於下一步驟的化合物A01-6。在溶有A01-6 (95.0 mg, 0.094 mmol)及MMAE (67.5 mg, 0.094 mmol)的THF之溶液(4 mL)中，加入TEA (19.0 mg, 0.188 mmol)進行處理。將該反液混合物於室溫下攪拌48小時，待反應完成後，將35 mL的乙酸乙酯(EA)及20 mL的HCl (0.5N)添加至該溶液中。該有機萃取層使用MgSO4
進行乾燥後濃縮，利用管柱純化該粗萃物以得到黃色油狀的化合物7 (98.0 mg, 0.06 mmol)。(ESI-TOF m/z: 1587.8759 [M-H]-
)。
製備化合物8
將化合物7 (20.0 mg, 0.013 mmol)溶於2.5 mL之甲醇與水混合溶液(MeOH：H2
O =4：1)中，於0℃加入Na2
CO3
處理，將該反應混合物於室溫下攪拌3小時。待反應完成後，在減壓環境下移除該有機層。該剩餘物利用C18管柱純化後得到化合物8(15.2 mg, 0.010 mmol, 77.0%)。ESI-TOF m/z: 1471.7639 [M+Na+
]。
製備化合物9
將化合物8 (10 mg, 2.99 mmol)溶於2 ml的CH2
Cl2
，再添加0.25 ml TFA，於室溫下攪拌1小時。濃縮該溶液並利用C18管柱純化該剩餘物，得到化合物9(6.5 mg, 77%)。ESI-TOF m/z: 1347.7178 [M-H]-
。
2.2 化合物15 (A02)之合成與特性
製備化合物11
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-琥珀酸3 (109 mg, 0.16 mmol)及炔基-PEG4-胺 10 (60 mg, 0.16)溶於CH2
Cl2
(5 mL)，再於該溶液中添加EDCI (46.4 mg, 0.244 mmol)、HOBt (2.5 mg, 0.015 mmol) 及DMAP (6.2 mg, 0.05 mmol)。4小時後，移除溶劑，接著透過矽膠柱層析法(silica gel chromatography)(依序以20% EA/己烷、50% EA/己烷洗脫)純化該反應混合物，藉以得到103 mg (73%)的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4 (化合物11)。然後，將化合物11(95 mg, 0.108 mmol)溶於砒啶(9 mL)及醋酸(3 mL)的溶液中，再添加TBAF (0.5 mL, 1 M溶於THF)。12小時後，移除溶劑，接著透過依序以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫的矽膠柱層析法純化該反應混合物，藉此以得到66.4 mg (80%) 的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OH-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4 (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OH-PAB-succinate-alkynyl-PEG4) (化合物12)。將得到的化合物12懸浮於無水CH2
Cl2
(2.6 mL)中，添加砒啶(122 mL, 0.88 mmol)和4-硝基氯化苯甲醯(74 mg, 0.36 mmol)。2小時後，移除溶劑並利用矽膠柱層析法純化(依序以CH2
Cl2
(100%)、及5%的MeOH/CH2
Cl2
洗脫)，藉此以得到46.6 mg (58%) 的2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4 (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OpNP-PAB-succinate-alkynyl -PEG4)(化合物13)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.12 (s, 1H), 8.24 (d,J
= 2.04 Hz, 2H), 7.57 (d,J
= 2.44 Hz, 1H), 7.5 (d,J
= 8.88 Hz, 1H), 7.39 (d,J
= 7.12 Hz, 1H), 6.98 (d,J
= 8.88 Hz, 1H), 6.76 (t,J
= 2.74 Hz, 1H), 5.37-5.28 (m, 3H), 5.24 (dd,J
= 11.92 Hz, 24.04 Hz,2H), 5.1 (d,J
= 14.32 Hz, 1H), 4.16 (d,J
= 9.08 Hz, 1H), 4.13 (d,J
= 2.4 Hz, 2H), 3.69 (s, 3H), 3.67-3.6 (m, 8H), 3.59-3.56 (m, 4H), 3.5 (t,J
= 4.8 Hz, 1H), 3.41 (t,J
= 4.8 Hz, 1H), 2.62 (ddd,J
= 4.6 Hz, 7.76 Hz,16.12 Hz, 4H), 2.41 (t,J
= 2.36 Hz, 1H), 2.35 (s, 1H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.0 (s, 3H)。
製備化合物14
將MMAE (30 mg, 0.043 mmol)溶於THF (2.0 mL)和砒啶(0.5 mL)之混合液中，再添加N,N-二異丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine, DIPEA) (80 mL)、HOBt (1.5 mg, 0.01 mmol)及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4 (化合物13) (40 mg, 0.043 mmol)。48小時後，移除溶劑並利用矽膠柱層析法純化(依序以CH2
Cl2
(100%)及7.5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫)，以得到38.4 mg (59%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基 l-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4 (2,3,4-tri-Ac-6-methy l-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-succinate-alkynyl-PEG4)(化合物14)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.0 (m, 1H), 7.67-7.25 (m. 6H), 7.24-6.9 (m, 3H), 6.81 (s, 1H), 6.7-6.45 (m, 2H), 5.42-5.29 (m, 4H), 5.29-4.88 (m, 4H), 4.8-4.55 (m, 2H), 4.22 (bs, 1H), 4.15 (s, 3H), 4.12-4.0 (m, 3H), 3.85-3.23 (m, 33H), 3.1-2.75 (m, 6H), 2.73-2.5 (m, 5H), 2.42 (d,J
= 2.0 Hz, 1H), 2.4-2.3 (m, 4H), 2.3-2.16 (m, 2H), 2.15-2.07 (m, 5H), 2.06 (s, 9H), 1.8-1.0 (m, 33H). ESI-TOF m/z: 1408.7366[M+Na]+
。
製備化合物15
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(化合物14) (30 mg, 0.02 mmol)溶於MeOH (1.0 mL)，再於該溶液中添加Na2
CO3
(7 mg, 0.063 mmol)。1小時後，將H2
O (40 mL)加入反應混合物中，並且於室溫下再攪拌1小時。利用IR-120中和該反應液，經過濾後將該粗萃物抽真空，並以C18管柱純化(依序以100% H2
O及50%的乙腈/H2
O洗脫)，接著得到12.3 mg (44.5%)的6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-炔基-PEG4(6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-succinate-alkynyl-PEG4)(化合物15)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.95 (m, 1H), 7.68 (d,J
= 7.9 Hz, 1H), 7.5-6.8 (m, 8H), 5.38 (d,J
= 6.7 Hz, 1H), 5.37-5.15 (m, 1H), 5.0 (d,J
= 6.7 Hz, 1H), 4.9 (s, 1H), 4.85-4.52 (m, 3H), 4.35-4.16 (bs, 2H), 4.15 (d,J
= 2.36 Hz, 3H), 4.1-3.2 (m, 32 H), 3.14-2.97 (m, 2H), 2.86-2.75 (m, 3H), 2.68-2.54 (m, 4H), 2.43 (t,J
= 2.36 Hz, 1H), 2.4-1.5 (m, 13H), 1.4-1.23 (m, 1H), 1.22 (s, 2H), 1.2 (s, 1H), 1.12-1.0 (m, 1H), 0.98-0.45 (m, 20H). ESI-TOF m/z: 1408.7366[M+Na]+
。
2.3 化合物23(A03)之合成與特性
製備化合物17
將p-甲苯磺醯氯(30g, 157mmole) 溶於 CH2
Cl2
(100mL)之溶液，逐滴加入含有四乙二醇(60g, 308mmole)及三乙基胺(47mL, 337mmole)之二氯甲烷溶液(100mL)中，於室溫下攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，並以CH2
Cl2
清洗。該濾液於真空濃縮後，使用快速管柱層析進行純化(使用矽膠體，含有10-20％之乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油狀中間物(40g, 115mmole)。然後，將上述得到的化合物(40g, 115mmole)加入含疊氮化鈉(20g, 307mmole)之N,N-二甲基甲醯胺溶液中，於80℃攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，並以CH2
Cl2
清洗。該濾液於真空濃縮後，使用快速管柱層析進行純化(使使用矽膠體，含有50至70％之乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油狀產物(化合物17)(24g, 109.5mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 3.67 (t,J
= 4.0 Hz, 2H), 3.62-3.61 (m, 10H), 3.57-3.55 (m, 2H), 3.34 (t,J
= 2.4 Hz, 2H), 2.66 (s, 1H)。
製備化合物18
將p-甲苯磺醯氯(26g, 136.8mmole)溶於CH2
Cl2
(40mL)之溶液，逐滴加入含有化合物17(24g, 109.5mmole)及三乙基胺(19mL, 136.8mmole)之二氯甲烷溶液 (40mL)，於室溫下攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，並以CH2
Cl2
清洗。該濾液於真空濃縮後，使用快速管柱層析進行純化(使用矽膠體，含有25-30％乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油狀的甲苯磺醯化產物(34.7g, 93mmole)。然後，將上述得到的甲苯磺醯化產物(10g, 26.78mmole)加入N-Boc-羥胺(5.35g, 40mmole)之二氯乙烷(30mL)溶液中，再添加DBU (8.07mL, 54mmole)後，於室溫下攪拌72小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，該溶液已被濃縮。使用快速管柱層析進行純化該粗萃物(使用矽膠體，含有35-30％乙酸乙酯的己烷溶液)，得到油狀產物(化合物18)(5.37g，產率60%)。以HRMS (ESI-TOF,MNa+) 計算C13H26N4O6Na，計算值：357.1745，實測值：357.1736。
製備化合物20
將化合物18(1.4g, 4.2mmole)及三苯基膦(2.89g, 11mmole)加入二氯甲烷(20mL)溶液中，於室溫下攪拌隔夜，該濾液於真空濃縮後，剩餘物使用快速管柱層析(矽膠體，含有90％乙酸乙酯的己烷溶液)進行純化，以得到油狀產物(1.09g, 3.53mmole)。然後，將化合物19 (1.46g, 5.52 mmol, 1.0 eq)及上述所得之中間化合物(1.09g, 3.53 mmole)加入N,N-二甲基甲醯胺(DMF)(90 mL)溶液中，再添加EDCI-HCl (1.06 g, 6.83 mmol)及HOBt (0.34 g, 2.52 mmol)。使用快速管柱層析(矽膠體，含有2％之MeOH的乙酸乙酯溶液)對該粗產物進行純化，以得到油狀產物(化合物20)(1.38g, 2.49mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.78 (s, 1H), 7.35-7.26 (m, 5H), 6.26 (s, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.99-3.97 (m, 2H), 3.70-3.68 (m, 2H), 3.67-3.58 (m, 8H), 3.53 (t,J
= 4.8 Hz, 2H), 3.42-3.39 (m, 2H), 2.31 (t,J
= 7.6 Hz, 2H), 2.12 (t,J
= 7.2 Hz, 2H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.30-1.27 (m, 4H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C28H46N2O9Na，計算值：577.3096，實測值：577.3080。
製備化合物(21)
將化合物20 (1.38g, 2.49mmole)和Pd/C (0.4g)溶於甲醇(10mL)溶液，於氫氣環境下攪拌之。待攪拌14小時隔夜後，使用矽藻土片過濾出Pd/C，並以甲醇清洗。該溶液於真空中濃縮後，使用快速管柱層析(矽膠體，含有2％之MeOH的CH2
Cl2
溶液)對該剩餘物進行純化，以得到油狀產物(化合物21)(0.5146g, 1.1mmole)。H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.98 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.00-3.98 (m, 2H), 3.70-3.68 (m, 2H), 3.64-3.61 (m, 8H), 3.54 (t,J
= 4.4 Hz, 2H), 3.43-3.41 (m, 2H), 2.30 (t,J
= 6.8z, 2H), 2.16 (t,J
= 7.6 Hz, 2H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.32-1.31 (m, 4H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C21H40N2O9Na，以得計算值：487.2626，實測值：487.2625。
製備化合物22
將化合物21(30 mg, 0.0646 mmol)和MMAE (35.5 mg, 0.0494 mmol)溶於DMF (2 mL)中，於0 ℃下依序添加焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate, DEPC) (0.31g, 0.181mmole)及DIPEA (0.03mL, 0.181 mmol)，該混合物於0 °C至室溫環境下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，使用快速管柱層析 (矽膠體，含有6-10％之MeOH的CH2
Cl2
溶液)對該剩餘物進行純化，以得到油狀產物22(52.6 mg, 0.0452mmole);以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C21H40N2O9Na，以得計算值：1186.7561，實測值：1186.7567。
製備化合物23
將化合物22溶於二氯甲烷(DCM) (0.7 mL)之溶液中，於0℃下緩慢添加TFA (0.3 mL)，於室溫下攪拌該反應混合物2小時。經濃縮後，使用快速管柱層析(矽膠體，含有6-10％MeOH之CH2
Cl2
溶液)對該粗產物進行純化，以得到油狀產物(化合物23)(33.6 mg, 0.032 mmol)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+) 計算C13H26N4O6Na，以得計算值：1086.7037，實測值：1086.7113。
2.4化合物25(A04)之合成與特性
製備化合物24
將四乙二醇16(40g, 207mmole)及氫化鈉(4.8g, 120mmole)加入四氫呋喃(250mL)溶液中，於0℃下再添加溴丙炔(7.4mL, 69mmole)，並於室溫下攪拌該反應混合物16小時。當薄層色層分析儀(TLC)顯示起始原料被完全消耗時，表示已濃縮該溶液。利用二氯甲烷(CH2
Cl2
)(4 x 30 mL)和水(H2
O)對剩餘物進行萃取，將有機層集中後使用硫酸鎂(MgSO4
)乾燥，乾燥後過濾。於真空中濃縮該濾出物後，使用快速管柱層析(矽膠體，含有15％乙酸乙酯的己烷溶液)對剩餘物進行純化，得到油狀產物24(14g, 60.3mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.17-4.16 (m, 2H), 3.70-3.62(m, 14H), 3.59-3.56(m, 2H), 2.40 (t,J
= 2.4 Hz, 1H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C11H20O5Na，計算值：255.1203，實測值：255.1202。
製備化合物25
將化合物24(920 mg, 3.96 mmol)溶於70 mL二氯甲烷之溶液，並添加戴斯-馬丁過碘烷(Dess-Martin Periodinane;2.25 g, 5.30 mmol)於該溶液中。在環境溫度下隔夜攪拌該反應混合物。利用溶於60 mL的飽和碳酸氫鈉之亞硫酸氫鈉終止反應。將該混合物分離，以飽和碳酸氫鈉、滷水洗滌有機層，並以硫酸鈉進行乾燥，過濾後於真空中濃縮。利用快速管柱層析法純化該剩餘物以得化合物(0.54g, 2.345mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.69 (s, 1H), 4.16-4.13 (m, 2H), 3.71-3.62(m, 14H), 2.40 (t,J
= 2.4 Hz, 1H)。將上述得到的化合物(12.8mg, 0.0556 mmol)及16μL醋酸添加至溶有MMAE(10 mg, 0.0139 mmol)的N,N-二甲基甲醯胺(DMF)之溶液(0.286 mL)中，接著添加2 mg之氰基硼氫化物。將該反應混合物於室溫下攪拌2小時，該反應混合物經濃縮並以快速管柱層析法純化，藉此得到化合物25(10 mg, 0.0107mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C50H85N5O11Na，計算值：954.6138，實際值：954.6303。
2.5化合物31(A05)之合成和特性
製備化合物27
將Boc-Val-Cit-PAB-OH (化合物26) (100 mg, 0.2 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(1.8 mL)溶液中，並添加TFA (0.45 mL)。於0 ℃下攪拌該反應液10分鐘，然後回溫至室溫後再攪拌30分鐘。將該反應混合物蒸餾至乾燥(以甲苯共沸3次)後，不需進一步純化便可得到Val-Cit-PAB-OH (化合物27)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.3-6.99 (m, 5H), 4.47 (m, 1H), 4.44 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.11 (m, 1H), 1.7 (m, 1H), 1.58 (m, 1H), 1.5 (m, 2H), 0.95 (q, 6H)。
製備化合物29
將得到的化合物27及炔基-PEG4-COOH (化合物28) (58 mg, 0.2 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(2.0 mL)中，再添加HOBt (2.7 mg, 0.02 mmol) 及EDCI (57 mg, 0.3 mmol)。12小時後，移除溶劑並透過矽膠柱層析純化(以CH2
Cl2
(100%)接著10%的MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫)，以得到80.8 mg (62%)之炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OH (化合物29)。將化合物29 (80 mg, 0.12 mmol)懸浮於無水DMF (2 mL)，然後再添加砒啶(58 mL, 0.72 mmol)及硝基苯甲醯氯(66.8 mg, 0.36 mmol)。2小時後，移除溶劑並以矽膠柱層析純化(依序以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫)，以得到63.7 mg (65%) 的炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP(化合物 30)。接著，將MMAE (33.4 mg, 0.047 mmol)溶於DMF (1.5 mL)和砒啶(0.5 mL)之混合溶液中，再添加DIPEA (72 mL)、HOBt (2 mg, 0.014 mmol)及炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP (alkynyl-PEG4-Val-Cit-PAB-OpNP，化合物 30) (38 mg, 0.047 mmol)。48小時後，移除溶劑並以矽膠柱層析純化(依序以CH2
Cl2
(100%)及15% MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫)該反應混合物，以得到30 mg (45%)之炔基-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(alkynyl-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物 31)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.48 (d,J
= 7.88 Hz, 2H), 7.3-7.05 (m, 7H), 5.14-4.9 (m, 2H), 4.6-4.37 (m, 3H), 4.19 (dd,J
= 2.76 Hz, 7.12 Hz,1H), 4.15-4.09 (m, 2H), 4.07 (d,J
= 2.36 Hz, 2H), 3.78 (s, 2H), 3.64-3.57 (m, 5H), 3.56-3.53 (m, 8H), 3.51 (s, 4H), 3.3 (t,J
= 10.8 Hz, 1H), 2.45 (d,J
= 3.32 Hz, 1H), 3.17 (s, 1H), 3.15-2.95 (m, 3H), 2.85-2.8 (m, 3H), 2.75 (t,J
= 2.36 Hz, 1H), 2.45-2.35 (m, 2H), 2.15-1.57 (m, 11H), 1.45 (m, 4H), 1.35-1.13 (m, 9H), 1.07 (q, 3H), 1.03 (t,J
= 7.08 Hz, 3H), 1.0-0.55 (m, 25H). ESI-TOF m/z: 1417.8368[M+Na]+
。
2.6 化合物35(A06)之合成與特性
製備化合物32
將含有氰化鈉(1.93g, 48.25mmole)及1-疊氮基-3,6,9,12-四氧雜十五烷(1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecane, 5g, 22.80mmole)之四氫呋喃(200mL)溶液，於0℃下將溴丙炔(6mL, 69.6mmole) 添加至該溶液中並於室溫下攪拌16 小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，即表示該溶液已被濃縮，利用CH2
Cl2
(4 × 30 mL)和H2
O對剩餘物進行萃取，將有機層集中後使用MgSO4
乾燥，乾燥後過濾。該濾出物於真空中濃縮後，使用快速管柱層析進行純化(使用矽膠體，含有35％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到油狀產物(化合物32)(5.4g, 20.9mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.17 (d,J
= 2.4 Hz, 2H), 3.67-3.64 (m, 14H), 3.36 (t,J
= 5.2 Hz, 2H), 2.40 (t,J
= 2.4 Hz, 1H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C11H19N3O4Na，計算值：280.1268實測值：280.1270。
製備化合物33
將三苯基膦(3.68g, 14mmole)和化合物32(2.9g, 11.3mmole)加入四氫呋喃(40mL)溶液中並攪拌之。於室溫下攪拌隔夜後，於真空中濃縮該溶液，且利用快速管柱層析(矽膠體，含有80% MeOH的CH2
Cl2
溶液)對剩餘物進行純化以得到油狀產物33(2.4g, 10.376mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.17-4.16 (m, 2H), 3.65-3.57 (m, 14H), 2.83 (t,J
= 4.8 Hz, 2H), 2.40 (t,J
= 2.0 Hz, 1H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算 C11H21NO4Na，計算值： 232.1543，實測值：232.1615。
製備化合物34
將化合物33(0.34g, 1.47 mmole)和琥珀酸酐(0.18g, 1.79 mmole)溶於四氫呋喃(12mL)中，再添加三乙基胺(0.35 mL, 2.51 mmole) 並於室溫下攪拌2小時。該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法 (矽膠體，含有5-6% MeOH的CH2
Cl2
溶液) 純化該剩餘物以得到油狀產物34 (2.4g, 10.376mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 6.79 (s, 1H), 4.16 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 3.68-3.58 (m, 12H), 3.52 (t,J
= 4.8 Hz, 2H), 3.43-3.39 (m, 2H), 2.64 (t,J
= 6 Hz, 2H), 2.51 (t,J
= 7.2 Hz, 2H), 2.42 (t,J
= 2.4 Hz, 1H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C15H25NO7Na，計算值：354.1523，實測值：354.1548。
製備化合物35
於0 ℃下依序將DEPC (0.014g, 0.0863mmole) 和DIPEA (0.021mL, 0.127 mmol)添加至含有化合物34 (24.5 mg, 0.0739 mmol)及MMAE (30 mg, 0.0418 mmol)溶於DMF (2.75 mL)之溶液中，並於0 °C下攪拌該混合物16小時。該反應混合物接著於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，含有4-7% MeOH之CH2
Cl2
溶液)純化該剩餘物，以得到油狀產物35(25.9 mg, 0.0251mmole)。以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C54H90N6O13Na，計算值：1053.6458，實測值：1053.6604。
2.7 化合物38(A07)之合成與特性
製備化合物36
將化合物24(1.14g, 4.908mmole)及氫化鈉(0.245g, 6.125mmole)溶於四氫呋喃(24mL)溶液中，再於0℃下逐滴加入溴乙酸甲酯(0.67mL, 6.865mmole)，並於室溫下攪拌該混合物16小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，利用MeOH終止反應，使用矽藻土片過濾，並以MeOH清洗。集中過濾物和清洗物，於減壓下濃縮，使用快速管柱層析對該剩餘物進行純化(矽膠體，含有70％乙酸乙酯的己烷溶液)以得到油狀產物(化合物36)(1.18 g, 3.877 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.10 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 4.07 (s, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.64-3.56 (m, 16H), 2.36 (t,J
= 2.4 Hz, 1H);以HRMS (ESI-TOF,MH+)計算C14H25O7，以得計算值：305.1595，實測值：305.1599。
製備化合物37
將化合物36 (1.18g, 3.877mmole)、水(6mL)、及LiOH (0.188g, 7.85 mmole)溶於四氫呋喃(10mL)之溶液，於室溫下攪拌2小時，加入1N的HCl (10mL)終止反應，再利用乙酸乙酯和滷水進行分離。收集有機層以使用乙酸乙酯(50mL × 4)萃取水相層。集中的有機層經濃縮後利用快速管柱層析法(矽膠體， 10-15% MeOH溶於CH2
Cl2
溶液)對剩餘物進行純化以得到油狀產物(化合物37)(0.6 g, 2.07 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.01 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.56-3.48 (m, 16H), 2.35 (t,J
= 2.0 Hz, 1H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C13H22O7Na， 計算值：313.1258，實測值：313.1261。
製備化合物38
將化合物37(38.8 mg, 0.1337 mmol)及MMAE (51 mg, 0.071 mmol) 溶於DMF (4 mL)，於0 ℃下依序添加DEPC (0.0334g, 0.206mmole)及DIPEA (0.034mL, 0.206 mmol)溶液中，且該混合物於0 ℃至室溫下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，4-6% MeOH 溶於 CH2
Cl2
) 對剩餘物進行純化，以得到油狀產物(化合物38)(49.2 mg, 0.0497mmole); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C52H87N5O13Na，以得計算值：1012.6193，實測值：1012.6186。
2.8化合物44(A08)之合成和特性
製備化合物40
取2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-胺(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OTBS-PAB-amine，化合物2-1，44 mg, 0.077 mmol)及DBCO-PEG4-酸 (DBCO-PEG4-acid，化合物39) (45 mg, 0.077)溶於CH2
Cl2
(4 mL)中，再添加EDCI (22.5 mg, 0.117 mmol)、HOBt (1.2 mg, 0.008 mmol)及DMAP (3 mg, 0.025 mmol)。6小時後，移除溶劑，且利用矽膠體層析法對反應混合物進行純化(依序以20% EA/己烷及75% EA/己烷進行洗脫)，得到56.7 mg (64.8%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-PEG4-DBCO (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OTBS-PAB-PEG4-DBCO，化合物40)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.65-7.59 (m, 1H), 7.58-7.55 (m, 1H), 7.46 (t,J
= 2.52 Hz, 2H), 7.4-7.26 (m, 5H), 7.23-7.18 (m, 1H), 6.87 (dd,J
= 1.04 Hz, 8.8 Hz,1H), 5.35-5.21 (m, 4H), 5.1 (dd,J
= 1.36 Hz, 13.84 Hz,1H), 5.04 (dd,J
= 4.4 Hz, 7.12 Hz,1H), 4.64 (dd,J
= 14..84 Hz, 44.64 Hz,1H), 4.12 (dd,J
= 3.25 Hz, 9.08 Hz,1H), 3.84-3.68 (m, 5H), 3.68-3.49 (m, 12H), 3.43 (t,J
= 5.28 Hz, 2H),3.31 (t,J
= 2.36 Hz, 2H), 2.47 (q,J
= 6.36 Hz, 1H), 2.37-2.13 (m, 2H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.0 (s, 3H), 1.97-1.91 (m, 2H), 2.91-1.8 (m, 1H), 1.48-1.17 (m, 6H), 0.91 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)。
製備化合物41
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-PEG4-DBCO (化合物40)(56 mg, 0.05 mmol)溶於含砒啶(0.63 mL)及醋酸(0.42 mL)之混合物中，然後再添加TBAF (72 mL, 1 M in THF)。12小時後，移除溶劑，且利用矽膠柱層析法(以20% EA/己烷及85% EA/己烷進行洗脫) 純化該反應混合物，以得到50.2 mg (98.6%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OH-PAB-PEG4-DBCO (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OH-PAB-PEG4-DBCO，化合物41)
。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.01 (s, 1H), 7.64 (dd,J
= 5.7 Hz, 9.9 Hz,2H), 7.45-7.28 (m, 6H), 6.89 (dd,J
= 1.07 Hz, 7.9 Hz,1H), 5.37-5.29 (m, 1H), 5.24 (d,J
= 8.16 Hz, 2H), 5.18 (d,J
= 12.2 Hz, 2H), 5.06 (t,J
= 4.36 Hz, 1H), 4.65 (d,J
= 13.2 Hz, 1H), 4.38 (dd,J
= 1.07 Hz, 8.9 Hz,1H), 4.0 (dd,J
= 8.07 Hz, 8.9 Hz,1H), 3.73 (t,J
= 5.68 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.65-3.46 (m, 13H), 3.42 (t,J
= 5.12 Hz, 2H), 3.28 (d,J
= 4.6 Hz, 2H), 2.53 (t,J
= 5.65 Hz, 1H), 2.22-2.12 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.0 (s, 3H), 1.93-1.89 (q,J
= 4.1 Hz, 2H), 1.87-1.69 (m, 2H), 1.45-1.15 (m, 8H)。
製備化合物42
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OH-PAB-PEG4-DBCO (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OH-PAB-PEG4-DBCO，化合物41)(50 mg, 0.049 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(1 mL)中，再添加砒啶(40 mL, 0.49 mmol)及4-硝苯甲醯氯(41.4 mg, 0.197 mmol)。2小時後，移除溶劑，且利用矽膠柱層析法對該反應混合物進行純化(依序以20% EA/己烷及60% EA/己烷進行洗脫)以得到36.3 mg (62.2%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-PEG4-DBCO (化合物42)。將MMAE (25.3mg, 0.035 mmol)溶於THF (1.6 mL) 及砒啶 (0.4 mL)之混合液中，再添加DIPEA (48 mL)、HOBt (2 mg, 0.014 mmol)、及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-PEG4-DBCO (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OpNP-PAB-PEG4-DBCO，化合物42)(36 mg, 0.03 mmol)於該溶液中。48小時後，移除溶劑，並利用矽膠柱層析法(以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫) 純化該反應混合物，以得到29 mg (55%) 之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-PEG4-DBCO (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-PEG4-DBCO，化合物43)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.8 (m, 1H), 7.7-7.18 (m, 14 H), 7.17-6.87 (m, 1H), 6.66-6.3 (m, 2H), 5.5-5.2 (m, 4H), 5.5-4.88 (m, 2H), 4.87-4.59 (m, 2H), 4.35-3.95 (m, 6H), 3.85 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 3.79-3.68 (m, 7H), 3.68-3.47 (m, 16 H), 3.44 (t,J
= 5.16 Hz, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.36-3.3 (m, 2H), 3.27 (s, 3H), 2.98 (s, 2H), 2.88 (s, 2H), 2.67-2.02 (m, 18H), 2.01 (s, 9H), 1.92 (bs, 2H), 1.81 (bs, 2H), 1.77-1.59 (m, 3H), 1.5-1.15 (m, 11H), 1.14-0.76 (m, 20H), 0.65 (d,J
= 3.34 Hz, 1H). ESI-TOF m/z: 1784.8878[M+Na]+
。
製備化合物44
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-PEG4-DBCO (化合物43)(10 mg, 0.005 mmol)溶於MeOH (0.5 mL)中，再將Na2
CO3
(1.62 mg, 0.015 mmol)加至該溶液中。1小時後，對該反應液添加H2
O (48 mL)並室溫下再攪拌1小時。以IR-120中和該反應液，經過濾後蒸餾粗萃物，並透過C18管柱(依序以100% 的H2
O(純水)及30% 乙腈/H2
O洗脫)純化該粗翠物，以得到5 mg (62%)之葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-PEG4-DBCO (Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-PEG4-DBCO)5 的化合物44。ESI-TOF m/z: 1619.8361[M-H]-
。
2.9 化合物50(A09)之合成及特性
製備化合物46
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-琥珀酸(化合物3)
(136 mg, 0.2 mmol)及BCN-PEG4-胺 (化合物45)(74.4 mg, 0.2 mmol)溶於CH2
Cl2
(7.8 mL)中，再添加EDCI (58 mg, 0.305 mmol)、HOBt (3.1 mg, 0.019 mmol)及DMAP (7.8 mg, 0.063 mmol)於該溶液中。4小時後，移除溶劑，並利用矽膠柱層析法對反應混合物進行純化(依序以20% EA/己烷及60% EA/己烷進行洗脫)，以得到135 mg (65%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (2,3,4-tri-Ac-6-methyl -Glucuranate-2’
-OTBS-PAB-succinate-PEG4-BCN,，化合物46)。將上述得到的化合物溶於砒啶(9 mL)及醋酸(3 mL)之混合物中，再添加TBAF (0.5 mL, 1 M溶於 THF)。12小時後，將溶劑移除，並利用矽膠柱層析法(依序以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫) 純化該反應混合物，以得到100 mg (85%) 之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OH-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物47)。ESI-TOF m/z: 928.3738[M+Na]+
。
製備化合物48
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (化合物47)(100 mg, 0.11 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(3.24 mL)中，再添加砒啶(89.6 mL, 1.1 mmol)及4-硝基苯甲醯氯(92.7 mg, 0.45 mmol)。2小時後，移除溶劑，利用矽膠柱層析法依序CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫以純化該反應混合物，得到82.3 mg (69.8%)之2,3,4-tri-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG4 -BCN (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OpNP-PAB-succinate -PEG4-BCN，化合物48)。然後，取MMAE (63.3mg, 0.088 mmol)溶於THF (4.0 mL) 及砒啶(1.0 mL)之混合物中，再添加DIPEA (120 mL)、HOBt (3 mg, 0.021 mmol)及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN48
(82.3 mg, 0.0768 mmol)。48小時後， 將溶劑移除並利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及7.5% MeOH/CH2
Cl2
進行洗脫以純化該反應混合物，得到50 mg (34.4%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-succinate-PEG4-BCN，化合物49)。將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (化合物49)(50 mg, 0.03 mmol)溶於MeOH (1.2 mL)中，再添加Na2
CO3
(10 mg, 0.095 mmol)。1小時後，添加H2
O (60 mL)至該反應混合物並再攪拌1小時。利用IR-120中和反應，經過濾後蒸餾粗萃物，並透過以C18管柱依序以100% H2
O及35% 乙腈/H2
O洗脫)以純化該粗萃物，以得到14.2 mg (31.4%)之葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG4-BCN (Glucuranate-2’
-MMAE-PAB- succinate-PEG4-BCN，化合物50)。1
H NMR (400 MHz, D2
O) δ7.62-7.17 (m, 8H), 5.26 (s, 2H), 5.01 (s, 1H), 4.75-4.42 (m, 2H), 4.4-4.17 (m, 2H), 4.01 (bs, 3H), 3.83 (bs, 1H), 3.73-3.51 (m, 18H), 3.5-3.26 (m, 12H), 3.15 (s, 2H), 3.05 (d,J
= 6.44 Hz, 2H), 3.01-2.9 (m, 3H), 2.84-2.42 (m, 6H), 2.21 (s, 3H), 2.16 (bs, 6H), 1.92-1.77 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 1H), 1.54-1.39 (m, 3H), 1.39-1.23 (m, 4H), 1.22-1.12 (m, 3H), 1.08 (d,J
= 6.48 Hz, 2H), 0.98 (d,J
= 6.55 Hz, 2H), 0.95-0.6 (m, 19H). ESI-TOF m/z: 1507.8027[M-H]-
。
2.10化合物54(A10)之合成與特性
製備化合物51
經氰化鈉(0.42g, 10.50mmole)及四乙二醇(化合物16)(6g, 30.89mmole)加入四氫呋喃(120mL)之溶液，再於0℃下逐滴加入溴乙酸甲酯(1.25mL, 10.5mmole)，於室溫下攪拌該混合物16小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，以MeOH終止反應，使用矽藻土片過濾，並以MeOH清洗。將過濾物和清洗物集中並於減壓下濃縮，使用快速管柱層析(矽膠體，4-6% MeOH溶於CH2
Cl2
)純化該剩餘物，以得到油狀產物(1.843 g, 6.92 mmole)。
將上述所得之化合物(0.49g, 1.84mmole)及三乙基胺(0.7mL, 5.02mmole)加入二氯甲烷(10mL)溶液，再添加溶於CH2
Cl2
(20mL)之P-甲苯磺醯氯(0.56g, 2.937mmole)，於室溫下攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，再以CH2
Cl2
清洗。過濾物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，75-85% 乙酸乙酯溶於己烷) 純化剩餘物，以得到油狀產物(0.367g, 0.872mmole)。
取N-Boc-羥胺(0.1762g, 1.323mmole)及上述所得化合物(0.367g, 0.873mmole)溶於四氫呋喃(4mL)之溶液，添加DBU (0.26mL, 1.74mmole)並於室溫下攪拌72小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，即表示該溶液已被濃縮。使用管柱層析法 (使用矽膠體，乙酸乙酯) 純化該粗萃物以得到油狀產物51(0.14g, 0.367mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.14 (s, 2H), 4.00-3.98 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.70-3.61 (m, 15H), 1.45 (s, 9H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C16H31NO9 Na，計算值：404.1891，實測值：404.1901。
製備化合物52
取化合物51 (68.4mg, 0.179mmole)、H2
O (0.05mL)、及LiOH (7.7mg, 0.183 mmole)加入四氫呋喃(1.00mL)溶液並攪拌之。於室溫下攪拌2小時後，使用1N HCl (10mL)終止反應，利用乙酸乙酯和滷水加以分離。集中有機層，以乙酸乙酯(50mL × 4)萃取水相層，集中的有機層經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，12-20% 之MeOH溶於CH2
Cl2
)純化剩餘物，以得到油狀產物(化合物52)(34.5mg, 0.0939 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.29 (s, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.86 (s, 2H), 3.65-3.61 (m, 14H), 1.45 (s, 9H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C15H29NO9Na，計算值：390.1735，實測值：390.1742。
製備化合物53
取化合物52(44.8 mg, 0.1219 mmol)及MMAE (46.5 mg, 0.065 mmol)溶於DMF (2.7 mL)之溶液，於0 ℃下依序添加DEPC (30.6 mg, 0.189mmole) 及DIPEA (0.030mL, 0.182 mmol)，並於0 ℃至室溫下攪拌該混合物16小時。該反應混合物於真空中濃縮，利用快速管柱層析法(矽膠體，3-6% 之MeOH溶於CH2
Cl2
)純化剩餘物，以得到油狀產物53(48.6 mg, 0.0455mmole)。以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算 C54H94N6O15Na，計算值：1089.6669，實測值：1089.6660。
製備化合物54
於0℃下緩慢將TFA (0.35 mL)加入溶有化合物53(52.6 mg, 0.0493 mmol)之DCM (0.65 mL)溶液中，並於室溫下攪拌該反應混合物2小時，再濃縮。利用管柱層析法(矽膠體，6-10% MeOH溶於CH2
Cl2
)純化該粗產物，以得到油狀產物54(29 mg, 0.030 mmol)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+) 計算C49H86N6O13Na，計算值：967.6326，實測值：967.6353。
2.11 化合物59(A11)之合成與特性
製備化合物55
將Boc-Val-Cit-PAB-OH (化合物26) (100 mg, 0.2 mmol)懸浮於無水DMF (1 mL)、THF (2 mL)及CH2
Cl2
(1 mL)之混合液中，再添加砒啶(97 mL, 1.2 mmol)及 4-硝基苯甲醯氯(115 mg, 0.62 mmol)。2小時後移除溶劑，並利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%) 5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫以純化，藉此得到89 mg (69%)之Boc-Val-Cit-PAB -OpNP (化合物55)。然後，將MMAE (88.6 mg, 0.123 mmol)溶於THF (2.8 mL)及砒啶(0.7 mL)之混合液中，再添加DIPEA (212 mL)、HOBt (5.6 mg, 0.039 mmol)及Boc-Val-Cit-PAB-OpNP (化合物55) (89 mg, 0.138 mmol)。48小時後，移除溶劑，該利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及15% MeOH/CH2
Cl2
洗脫以純化該反應混合物，藉此得到30 mg (45%)之Boc-Val-Cit-PAB-MMAE (化合物56)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 (t,J
= 7.2 Hz, 2H), 7.29-7.08 (m, 11H), 5.13-4.94 (m, 2H), 4.69-4.4 (m, 5H), 4.2-4.05 (m, 4H), 4.97 (bs, 1H), 3.81 (dd,J
= 2.5 Hz, 6.56 Hz, 1H), 3.77 (dt,J
= 9.2 Hz, 1.8 Hz, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 3.44 (m, 1H), 3.35-3.15 (m, 20H), 3.14-3.04 (m, 2H), 3..5-2.95 (m, 3H), 2.9-2.75 (m, 4H), 2.41-2.34 (m, 3H), 2.45 (s, 1H), 2.21 (s, 1H), 2.16-1.55 (m, 16H), 1.54-1.39 (m, 4H), 1.34 (s, 9H), 1.3 (bs, 2H), 1.11-0.95 (m, 11H), 0.9-0.6 (m, 42H)。
製備Boc-羥胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE (化合物 58)
將Boc-Val-Cit-PAB-MMAE (化合物56)(66 mg, 0.054 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(4.0 mL)中，再添加TFA (1.0 mL)，將該反應液於0 ℃下攪拌10 分鐘，然後加熱至室溫後再攪拌30分鐘。將該反應混合物蒸餾至乾燥(以甲苯共沸3次)後，無需進一步純化即可得到Val-Cit-PAB-MMAE (化合物57)。將所得化合物29溶於無水DMF (1.5 mL)中，再添加EA (75 mL)、DMAP (0.66 mg)、HOBt (0.73 mg)及 Boc-羥胺-PEG4-COOH (化合物51) (20 mg, 0.054 mmol)。16小時後，移除溶劑並利用矽膠柱層析法，依序以1% MeOH/CH2
Cl2
及10% MeOH/CH2
Cl2
洗脫，藉此純化以得到32.6 mg (41%)之Boc-羥胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE (Boc-hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物58)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.05 (m, 10H), 5.11-4.95 (m, 2H), 4.6-4.38 (m, 3H), 4.21 (dd,J
= 2.76 Hz, 7.0 Hz, 1H), 4.18-4.04 (m, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.82 (dd,J
= 3.36 Hz, 5.72 Hz, 2H), 3.63-3.4 (m, 16H), 3.35-3.15 (m, 15H), 3.0 (s, 2H), 2.83 (dd,J
= 2.66 Hz, 11.1 Hz, 3H), 2.43-1.4 (m, 13H), 1.07 (t,J
= 5.92 Hz, 3H), 1.03 (t,J
= 7.08 Hz, 3H), 0.95-0.6 (m, 26H). ESI-TOF m/z: 1494.8684[M+Na]+
。
製備羥胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(化合物 59)
將Boc-羥胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE (Boc-hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物58) (32 mg, 0.021 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(2.0 mL)中，添加TFA (0.5 mL)。將該反應液於0℃下攪拌10分鐘，然後加熱至室溫後再攪拌30分鐘。該反應混合物蒸餾至乾燥後，通過C18管柱依序以100% H2
O及40% 乙腈/H2
O洗脫，藉此得到18 mg (65%)之羥胺-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE (hydroxylamino-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE，化合物59)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.9-6.9(m, 11H), 5.25-4.95 (m, 2H), 4.65-4.37 (m, 2H), 4.21-3.9 (m, 6H), 3.73 (bs, 1H), 3.65-3.48 (m, 12H), 3.42-3.15 (m, 6H), 3.01 (s, 2H), 2.82 (d,J
= 10.5 Hz, 2H), 2.45-1.25 (m, 11H), 1.1-0.5 (m, 32H). ESI-TOF m/z: 1394.8241[M+Na]+
。
2.12化合物60(A12)之合成與特性
製備化合物60
取化合物24 (46.4mg, 0.150mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(150mg, 0.744mmole)、及砒啶(0.12mL, 1.497 mmole)加入二氯甲烷(5.00mL)溶液中，於室溫攪拌2小時並濃縮該溶液後，利用快速管柱層析法(矽膠體，35%的乙酸乙酯溶於己烷溶液)純化剩餘物，以得到固體產物(53mg, 0.112 mmole);1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.28-8.24 (m, 2H), 7.39-7.35 (m, 2H), 4.43-4.41 (m, 2H), 4.18 (d,J
= 2.4 Hz, 2H), 3.80-3.78 (m, 2H), 3.67-3.64 (m, 12H), 2.40 (t,J
= 2.4 Hz, 1H)。將上述所得之化合物(28mg, 0.0705mmole)、MMAE (50mg, 0.0696mmole)、DIPEA (0.110mL, 0.631mmole)、HOBT (9.5mg, 0.0703mmole)、及砒啶(2.0mL)加入二甲基甲醯胺(7.5mL)溶液中，於室溫下攪拌72小時並濃縮該溶液後，利用快速管柱層析法(矽膠體，4% 之MeOH溶於CH2
Cl2
溶液)純化剩餘物，以得到固體產物60
(47mg, 0.0481 mmole); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C51H85N5O13Na，計算值：998.6036，實測值：998.6051。
2.13化合物64(A13)之合成與特性
製備化合物61
在化合物2(300.0 mg, 0.50 mmol)溶於30 ml之EtOAc/MeOH (9:1)之溶液中添加Pd/C，將該作業空間抽真空後以H2
填充三次，利用球型瓶使該作業空間保持在H2
環境下，然後將該反應液於室溫下攪拌1小時。待反應完成後，過濾移除Pd/C。蒸餾該濾出物以得到用於下一步驟的化合物(265.0 mg, 0.47 mmol)。在溶有上述化合物(265.0 mg, 0.46 mmol)、化合物2(170 mg, 0.47 mmol)、及 HOBT (105.0 mg, 0.70 mmol)之CH2
Cl2
之溶液中添加EDCI (108.0 mg, 0.70 mmol)。將該反應液於室溫下攪拌14小時後，蒸餾該溶液，並利用管柱純化該粗萃物以得到黃色油狀的化合物61(300.0 mg, 0.33 mmol)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.71 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.54 (d,J
=1.6 Hz, 1H), 7.44 (dd,J
= 1.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.31-5.15 (m, 3H), 5.02 (d,J
= 7.6 Hz, 1H), 4.65 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.53 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.11 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.88 (m, 2 H), 3.75-3.43 (m, 17H), 1.98 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.38 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
製備化合物62
在溶有化合物61(300.0 mg, 0.33 mmol)的15 mL 的砒啶與醋酸混合溶液(砒啶:HOAc = 3:2)中添加2 mL 的TBAF，並於室溫下攪拌14小時。蒸餾該溶液，利用管柱純化該粗萃物以得到黃色油狀的化合物62(220.0 mg, 0.27 mmol)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.89 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 2.0, 8.8 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.33-5.21 (m, 3H), 5.05 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 4.67 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.05 (s, 2H), 3.90 (m, 2H), 3.71-3.53 (m, 17 H), 2.05 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.42 (s, 9H)。
製備化合物63
取化合物62 (220.0 mg, 0.27 mmol)溶於8 mL 之CH2
Cl2
中，冷卻至0℃。添加砒啶(0.20 mL)及PNP氯甲酸酯，且使該混合物於室溫下攪拌3小時。蒸餾該溶液，利用管柱純化該粗萃物以得到用於下一步驟的化合物(80.0 mg, 0.082 mmol)。取上一步驟得到的化合物(80.0 mg, 0.082 mmol)及MMAE (60.0 mg, 0.082 mmol)溶於5 mL之THF中，添加TEA (0.1 mL)加以反應，該反應混合物於室溫下攪拌48小時。待反應完成後，添加35 mL之EA以及20 mL之0.5N HCl溶液。利用MgSO4
將該有機層乾燥後濃縮，利用管柱純化該粗萃物以得到黃色油狀之化合物63(70.0 mg, 0.05 mmol). ESI-TOF m/z: 1570.7932 [M+Na+
]。
製備化合物64
取化合物63(20.0 mg, 0.013 mmol)溶於2.5 mL之甲醇與水混合溶液(MeOH : H2
O =4:1)中，於0℃下添加Na2
CO3
加以反應，並於室溫下攪拌該反應混合物3小時。待反應完成後，在減壓下移除有機溶液，利用C18管柱純化剩餘物，以得到用於下一步驟的化合物A01-8。將上一步驟的化合物溶於1.6 ml 之CH2
Cl2
溶液中，添加0.40 ml之TFA並於室溫下攪拌1小時。該溶液經濃縮後，利用C18管柱純化剩餘物以得到化合物64 (11.2 mg, 0.0085 mmol) 。ESI-TOF m/z: 1306.6916[M-H]-
。
2.14 化合物60(A14)之合成與特性
製備化合物66
取化合物3(315.0 mg, 0.47 mmol)、化合物65 (220 mg, 0.43 mmol)、及HOBT (87.0 mg, 0.65 mmol)溶於DMF之溶液，添加EDCI (87.0 mg, 0.56 mmol)，於室溫下攪拌12小時。蒸餾該溶液後，利用管柱純化粗產物後得到用於下一步驟之黃色油狀化合物(200.0 mg, 0.18 mmol)。將上一步驟得到的化合物(200.0 mg, 0.33 mmol)加入15 mL的砒啶與醋酸混合溶液(砒啶:HOAc = 3:2)中，添加2 mL之TBAF，於室溫下攪拌16小時。蒸餾該溶液，利用管柱純化粗產物以得到黃色油狀之化合物66(176.0 mg, 0.17 mmol, two steps for 38%)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (s, 1H), 7.67 (dd, J = 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.94 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.40-5.25 (m, 3H), 5.06 (d, J = 7.6 Hz, 1 H), 4.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 4.42 (d,J
= 12.8 Hz, 1H), 3.99 (m, 2H), 3.75-3.52 (m, 27 H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.46 (s, 9H) 。
製備化合物67
將化合物66(176.0 mg, 0.17 mmol)溶於5 mL之CH2
Cl2
中，冷卻至0℃，再添加砒啶(27uL)和PNP氯甲酸酯(52 mg, 0.26 mmol)，於室溫下攪拌3小時。以CH2
Cl2
稀釋該反應混合物並以1 N HCl、飽和NaHCO3水溶液、及滷水清洗，利用MgSO4
乾燥有機層後濃縮，利用管柱純化粗產物以得到用於下一步驟的化合物。將上一步驟得到的化合物(128.0 mg, 0.108 mmol)及MMAE (78.0 mg, 0.108 mmol)溶於4 mL 之DMF中，再添加TEA (100 uL)及砒啶(87 uL)加以反應，並於室溫下攪拌48小時。蒸餾該溶液後，以管柱純化粗產物後得到黃色油狀化合物67(40.0 mg, 0.02 mmol)。ESI-TOF m/z: 1787.9224 [M +Na+
]。
製備化合物68
將化合物67(10.0 mg, 0.013 mmol)溶於1.25 mL之甲醇與水混合溶液(MeOH : H2
O =4:1)中，於0℃添加Na2
CO3
(1.8 mg, 0.017 mmol)處理，該反應混合物於室溫下攪拌3小時。待反應完成後，在減壓下移除有機溶液。利用C18管柱純化剩餘物以得到用於下一步驟的化合物。將上一步驟得到的化合物溶於1.6 ml 之CH2
Cl2
中，添加0.40 ml的TFA並於室溫下攪拌1小時。該溶液經濃縮後，透過C18管柱純化剩餘物以得到化合物68 (4.0 mg)。 ESI-TOF m/z: 1307.5170 [M-H]-
。
2.15 化合物80(A)之合成與特性
製備化合物70
將二乙二醇(Diethylene glycol，化合物69) (20 g, 0.188 mol)溶於CH2
Cl2
(500 mL)中，再添加TEA (29 mL, 0.207 mol)，然後以冰水浴冷卻之，在30分鐘期間內逐滴加入溶於CH2
Cl2
(100 mL)之TsCl (20 g, 0.094 mol)。緩慢回溫至室溫後，靜置反應1小時。移除溶劑後，利用矽膠柱層析法依序以20% EA/己烷及66% EA/己烷洗脫，以純化得到14.4 g (29.5%)之二乙二醇單-Ts (diethylene glycol mono-Ts，化合物70)。然後，將上述得到的二乙二醇單-Ts (化合物70)(12.61 g, 44.2 mmol)及N-Boc-羥基胺(8.25 g, 62 mmol)溶於CH2
Cl2
(400 mL)中，再添加DBU (13.5 mL, 88.4mol)。反應48小時後，使用400 mL 之CH2
Cl2
稀釋該反應液，並以1N HCl (100 mL)清洗兩次、以H2
O (100 mL)及滷水(200 mL)清洗一次，有機層利用無水MgSO4
乾燥後蒸餾。利用矽膠柱層析法依序以33% EA/己烷以及50% EA/己烷(含5% MeOH)洗脫以純化粗萃物，藉此得到1.5 g (16.1%) 之二乙二醇單-Ts (diethylene glycol mono-Ts，化合物71)。將該產物溶於CH2
Cl2
(70 mL)中，再添加TEA (2.96 mL, 21.3 mmol)，然後以冰水浴冷卻之，在30分鐘期間內逐滴加入溶於CH2
Cl2
(20 mL)之TsCl (2 g, 9.4 mmol)。緩慢回溫至室溫後，靜置反應1小時。移除溶劑後，利用矽膠柱層析法依序以10% EA/己烷及40% EA/己烷洗脫以純化，藉此得到1.31 g (49%)的OTs-二乙二醇羥胺-Boc (OTs-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物72)。最後，將OTs-二乙二醇羥胺-Boc(化合物72)(1.3 g, 3.48 mmol)溶於無水酒精(50 mL)，再添加疊氮化鈉(680 mg, 10.4 mmol)，然後回流至隔夜。移除溶劑後，以EA (200 mL)稀釋並以H2
O (50 mL)及滷水 (50 mL)清洗，利用無水MgSO4
乾燥有機層後進行蒸餾。利用矽膠柱層析法以10% EA/己烷及40% EA/己烷洗脫以純化粗萃物，藉此得到728 mg (85%)之疊氮-二乙二醇羥胺-Boc (Azido-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物73)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ 3.85-3.82 (m, 2H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.48 (d,J
= 4.88 Hz, 2H), 3.21 (d,J
= 5.2 Hz, 2H), 1.28 (s, 3H)。
製備化合物74
將疊氮-二乙二醇羥胺-Boc (化合物73) (168.5 mg, 0.684 mmol)溶於甲醇(0.68 mL)和EA (6.2 mL)之混合液中。該溶液添加N2
(g). Pd(OH)2
(59 mg)進行脫氣並充入H2
(g)5分鐘，然後該反應液在相同條件下反應2小時。待反應完成後，使用矽藻土片過濾該粗萃物，並濃縮至乾燥，不需再額外純化即可得到145 mg (96.2%) 之胺基-二乙二醇羥胺-Boc (amino-diethylene glycol hydroxylamie-Boc，化合物74)。接著，將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-琥珀酸 (化合物3) (322.6 mg, 0.482 mmol)和上述化合物74 (127.3 mg, 0.578 mmol)溶於CH2
Cl2
(5 mL)中，再添加EDCI (138.5 mg, 0.723 mmol)和HOBt (74 mg, 0.48 mmol)。8小時後，移除溶劑，接著利用矽膠柱層析法依序以15% EA/己烷及60% EA/己烷洗脫，以純化該反應混合物，藉此得到312.2 mg (74%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯 -2’
-OTBS-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate -2’
-OTBS-PAB-succinate-PEG2- hydroxylamie-Boc，化合物75)。將上述得到的化合物75溶解於砒啶(2.7 mL)和醋酸(1.8 mL)之混合物中，然後再添加TBAF (0.3 mL, 1 M 溶於THF溶液)。12小時後，移除溶劑，接著利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫該反應混合物以純化，藉此得到218.1 mg (80.4%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯 -2’
-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate -2’
-OH-PAB-succinate-PEG2- hydroxylamie-Boc，化合物76)。將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄糖酸酯 -2’
-OH-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (化合物76)懸浮於無水CH2
Cl2
(5.5 mL)中，再添加砒啶 (240 mL, 2.95 mmol) 和4-硝基苯甲醯氯(260 mg, 1.26 mmol)。2小時後，移除溶劑，接著利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫，藉以純化該反應混合物並得到155.6 mg (58.7%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OpNP-PAB-succinate -PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物77)。然後，將MMAE (108.3mg, 0.15 mmol)溶解於THF (3.45 mL)和砒啶(0.86 mL)之混合物中，然後再添加DIPEA (260 mL)、HOBt (6.9 mg, 0.048 mmol)、及2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (化合物77)(155.6 mg, 0.169 mmol)。48小時後，移除溶劑，接著利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及7.5% MeOH/CH2
Cl2
洗脫該反應混合物，藉此以純化得到145.7 mg (57.4%)之2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB –琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB -succinate-PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物78)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ 9.22 (s, 1H), 8.2-7.95 (m, 2H), 7.6-6.5 (m, 12H), 5.4-5.15 (m, 5H), 5.15-4.92 (m, 3H), 4.85 (d,J
= 2.48 Hz, 1H), 4.82-4.5 (m, 3H), 4.49-3.98 (m, 7H), 3.95-3.17 (m, 27H), 3.14-2.46 (m, 13H), 2.45-1.45 (m, 24H), 1.39 (s, 9H), 1.17 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 1.05-0.45 (m, 30H) 。
製備化合物79
將2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB–琥珀酸酯-PEG2-羥胺-Boc(化合物78)(145.7 mg, 0.097 mmol)溶於MeOH (3.9 mL)中，然後添加Na2
CO3
(32.3 mg, 0.31 mmol)。1小時後， 將H2
O (194 mL) 添加至該反應混合物中並繼續攪拌再使其反應1小時。接著，利用IR-120中和反應，使用矽藻土片過濾，蒸餾該粗萃物，並以C18管柱，依序利用100% H2
O及40% 乙腈/H2
O進行洗脫，藉以純化粗萃物以得到85 mg (65.5%)之葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯 -PEG2-羥胺-Boc (Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-succinate -PEG2-hydroxylamie-Boc，化合物79)。將20 mg之葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯 -PEG2-羥胺-Boc(化合物79)懸浮於無水CH2
Cl2
(1.0 mL)中，添加TFA (0.25 mL)，該反應液於0℃下攪拌10分鐘，然後回溫至室溫後攪拌30分鐘。該反應混合物被蒸餾至乾燥後，通過C18管柱並依序以100% H2
O及20% 乙腈/H2
O進行洗脫，以得到13 mg (72%) 之葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB-琥珀酸酯-PEG2-羥胺 (Glucuranate-2’
-MMAE-PAB-succinate-PEG2-hydroxylamie，化合物80)。1
H NMR (400 MHz, D2
O) δ 8.22-7.9 (m, 1H), 7.54-7.1 (m, 8H), 5.4-5.1 (m, 2H), 5.04 (s, 1H), 4.73-4.25 (m, 2H), 4.18 (d,J
= 8.28Hz, 1H), 4.05 (bs, 3H), 3.9 (s, 1H), 3.7-3.59 (m, 5H), 3.54 (m, 2H), 3.5-3.24 (m, 9H), 3.18 (s, 1H), 3.07 (d,J
= 3.08Hz, 2H), 2.97 (s, 1H), 2.93 (d,J
= 2.52Hz, 2H), 2.82-2.24 (m, 6H), 2.2-1.9 (m, 2H), 1.83 (s, 2H), 1.8-1.56 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 1H), 1.27 (d,J
= 6.4Hz, 3H), 1.18 (d,J
= 7.2Hz, 1H), 1.13 (d,J
= 9.58Hz, 1H), 1.06 (d,J
= 8.9Hz, 2H), 0.94 (d,J
= 7.54Hz, 2H), 0.94-0.5 (m, 14H). ESI-TOF m/z: 1283.6622[M+Na]+
。
2.16 化合物86(A16)之合成與特性
製備化合物82
取化合物81(1.5g, 6.756mmole)和EDCI (1.26g, 8.1mmole)溶於甲醇(20mL)溶液中並攪拌之。於室溫下攪拌16小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，以得到用於下一步驟之油狀產物(1.51g, 6.4 mmole)。取N-Boc-羥胺(N-Boc-hydroxylamine)(1.28g, 9.6mmole)及上述得到的化合物(1.51g, 6.4 mmole)溶於二氯甲烷(30mL)溶液，添加DBU (1.95g, 12.8mmole)並於室溫下攪拌16小時。該溶液經濃縮後，利用管柱層析法純化該粗萃物，以得到油狀產物(化合物82)(1.22g, 4.22mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.09 (s, 1H), 3.83 (t,J
= 6.8 Hz, 2H), 3.66 (s, 3H), 2.29 (t,J
= 7.6 Hz, 2H), 1.64-1.49 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.39-1.30 (m, 6H)。
製備化合物83
取化合物82(1.22g, 4.22mmole)、H2
O (1.0mL)、及Na2
CO3
(2.24g, 21.1 mmole)溶於甲醇(9mL)溶液並攪拌之。於室溫下攪拌24小時後，濃縮該溶液。以1N HCl (10mL)和乙酸乙酯萃取剩餘物，有機層被濃縮後得到可用於下一步驟之油狀產物(0.22g, 0.8 mmole)。取溶有上述化合物(0.22g, 0.8 mmol)及化合物2-1(0.5g, 0.88 mmol)之二氯甲烷(16 mL)溶液，於該溶液中依序添加EDCI (0.16g, 1.04mmole)及HOBT (0.162g, 1.2 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌12小時。於真空中濃縮該反應混合物後，利用快速管柱層析法純化剩餘物以得到油狀產物(化合物83)(0.28g, 0.34mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64 (dd,J
= 2.8, 8.8 Hz, 1H), 7.31 (d,J
= 2.8 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.91 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.34-5.25 (m, 3H), 5.05 (d,J
= 6.8 Hz, 1H), 4.72 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.60 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.13 (d,J
= 9.6 Hz, 1H), 3.84 (t,J
= 6.4 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.34 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.72-1.61 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.40-1.33 (m, 6H), 0.96 (s, 3H), 0.12 (s, 6H)。
製備化合物84
混合含有化合物83(0.28g, 0.34mmole)、TBAF (0.36mL, 0.36mmole)、AcOH (2.1mL)、及砒啶(3.2mL)之溶液並攪拌之，於室溫下攪拌12小時後，濃縮該溶液，利用快速管柱層析法純化剩餘物，以得到固體產物(化合物84)(0.18g, 0.253 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.61 (dd,J
= 2.4, 8.4 Hz, 1H), 7.39 (s, 1 H), 7.35 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.97 (d,J
= 8.4 Hz, 1H), 5.40-5.23 (m, 3H), 5.07 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 4.74 (d,J
= 12.8 Hz, 1H), 4.41 (d,J
= 13.2 Hz, 1H), 4.10 (d,J
= 9.6 Hz, 1H), 3.84 (t,J
= 6.4 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.34 (t,J
= 7.6 Hz, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.68-1.56 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.40-1.35 (m, 6H)。
製備化合物85
將化合物84(180mg, 0.253mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (76mg, 0.379mmole)及砒啶(0.04mL, 0.506 mmole)溶於二氯甲烷，將該溶液於室溫下攪拌12小時。該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法純化剩餘物，以得到用於下一步驟的固體產物(162mg, 0.185 mmole)。取上述化合物(70.8mg, 0.080 mmole)、MMAE (146mg, 0.203mmole)、DIPEA (0.185mL, 0.925mmole)、HOBT (9.65mg, 0.0714mmole)、及砒啶(0.146mL)溶於二氯甲烷之溶液(6 mL)並攪拌之。於室溫下攪拌48小時後，濃縮該溶液，利用快速管柱層析法純化剩餘物，得到固體產物(化合物85)(95mg, 0.065 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算 C73H113N7O23Na ，計算值：1478.7780，實際值：1478.7828。
製備化合物86
取化合物85 (20.0 mg, 0.015 mmol)溶於5 mL之甲醇與水混合溶液(MeOH : H2
O =4:1)中，於0℃添加Na2
CO3
(4.0 mg, 0.0371 mmol)以反應。該反應混合物於室溫下攪拌3小時。反應完成後，在減壓下移除有機溶液，利用C18管柱純化剩餘物以得到用於下一步驟的化合物。將上述溶於1.6 ml 之CH2
Cl2
，再添加0.40 ml之TFA，於室溫下攪拌1小時。該溶液經濃縮後，利用C18管柱純化剩餘物，以得到化合物86(10.1 mg, 0.0076 mmol)。ESI-TOF m/z: 1214.6890[M-H]-
。
2.17化合物90(A17)之合成及特性
製備化合物87
取氫化鈉(6.2g, 155mmole)及二乙二醇69
(26g, 245mmole)溶於四氫呋喃(300mL)之溶液，於0℃下逐滴加入甲基溴乙酸酯(25g, 163mmole)，且於室溫下攪拌該溶液16小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，利用MeOH終止反應，並使用矽藻土片過濾，接著以MeOH清洗。集中過濾物和清洗物於減壓下濃縮，使用快速管柱層析(矽膠體，2% MeOH溶於 CH2
Cl2
)純化該剩餘物，藉此得到油狀產物(8 g, 44.92 mmole)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.11-4.10 (m, 2H), 3.70-3.65 (m, 9H), 3.56-3.54 (m, 2H)。將上述得到的化合物(8g, 44.92mmole)及三乙基胺(12mL, 86.33mmole)溶於二氯甲烷(100mL)溶液中，添加溶於CH2
Cl2
(100mL)之P-對甲苯磺醯氯(11.53g, 60.48mmole)，該反應混合物於室溫下攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，並以CH2
Cl2
清洗。該濾液於經真空濃縮後，使用快速管柱層析進行純化(使用矽膠體，溶有35％乙酸乙酯的己烷溶液)，以得到油狀產物(12g, 36.10mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.77 (d,J
= 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d,J
= 8.0 Hz, 2H), 4.13 (t,J
= 4.8 Hz, 2H), 4.09 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.67-3.58 (m, 6H),2.42 (s, 3H)。將DBU (7.0mL, 46.85mmole)加入溶有N-Boc-羥胺(5.87g, 44.09mmole)及上述得到的化合物(8.9g, 26.78mmole)的四氫呋喃(160mL)混合溶液中，且於室溫下對該混合溶液攪拌72小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，該溶液已被濃縮。使用管柱層析法純化(使用矽膠體，乙酸乙酯)該粗萃物，以得到油狀產物(4.05g, 13.80mmole)。將上述得到的化合物(1g, 3.41mmole)、H2
O (0.5mL)、及LiOH (0.172g, 4.099 mmole)加入四氫呋喃(12mL)之溶液，並攪拌之。於室溫下攪拌2小時後，加入1N HCl (10mL)終止反應，再利用乙酸乙酯和滷水進行分離。收集有機層，並使用乙酸乙酯(50mL × 4)萃取水相層。集中的有機層經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，20%之MeOH溶於CH2
Cl2
)純化剩餘物，以得到油狀產物(化合物87)(0.87g, 3.11 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 3.95 (m, 4H), 3.66-3.62 (m, 6H), 3.32 (s, 1H), 1.41 (s, 9H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算 C11H21NO7 Na，計算值：302.1210，實測值：302.1233。
製備化合物88
將化合物87 (0.4g, 1.432 mmol)及化合物2-1 (0.532g, 0.934 mmol)溶於二氯甲烷(16 mL)之溶液，並於該溶液中依序添加EDCI (0.22g, 1.417mmole)及HOBT (0.126g, 0.932 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，含有67%乙酸乙酯的己烷)純化該剩餘物，以得到油狀產物88(0.4676g, 0.562mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.69 (s, 1H), 7.61(s, 1H), 7.56 (dd,J
= 2.8, 8.8 Hz, 1H), 7.47 (d,J
= 2.8 Hz, 1H), 6.91 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.31-5.25 (m, 3H), 5.04 (d,J
= 6.8 Hz, 1H), 4.73 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.61 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.12-4.06 (m, 4H), 4.00-3.98 (m, 2H), 3.76-3.68 (m, 8H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.41 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.09 (s, 6H); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C37H58N2O17SiNa，計算值：853.3397，實測值：853.3385。
製備化合物89
取化合物88(0.4676g, 0.562mmole)、TBAF (0.56mL, 0.56mmole)、AcOH (3.4mL)及砒啶(5.5mL)之溶液並攪拌之，於室溫攪拌12小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法(矽膠體，乙酸乙酯)對該剩餘物進行純化，以得到固體產物(0.36g, 0.5 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.81 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.82-7.79 (m, 1H), 7.33 (d,J
= 2.8 Hz, 1H), 6.95 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.35-5.23 (m, 3H), 5.03 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 4.74 (d,J
= 13.2 Hz, 1H), 4.41 (d,J
= 12.8 Hz, 1H), 4.11-4.02 (m, 7H), 3.77-3.68 (m, 8H), 2.07 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.41 (s, 9H)。將上述得到的化合物(90mg, 0.126mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (100mg, 0.495mmole) 、及砒啶(0.11mL, 1.423 mmole)加入二氯甲烷(9mL)之溶液中並攪拌之，於室溫下攪拌2小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法(矽膠體，35%乙酸乙酯溶於己烷)對剩餘物進行純化，以得到固體產物(70.8mg, 0.080 mmole)。將上述化合物(70.8mg, 0.080 mmole)、MMAE (58mg, 0.08mmole)、DIPEA (0.125mL, 0.7175mmole)、HOBT (9.65mg, 0.0714mmole)、及砒啶(2.0mL)溶於二氯甲烷(6mL)溶液中並攪拌之，於室溫下攪拌72小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法(矽膠體，4% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，得到固體產物(化合物89)(75mg, 0.051 mmole)。以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C71H109N7O25 Na，計算值：1482.7365，實測值：1482.7334。
製備化合物90
取化合物89(75mg, 0.051 mmole)、K2
CO3
(42 mg, 0.304mmole)、及H2
O (0.4mL)溶於甲醇(2 mL)之溶液並攪拌之，於室溫下攪拌6小時後，使用AcOH終止反應並濃縮，利用C18管柱純化剩餘物後以得到固體產物(44mg, 0.0333 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C64H101N7O22Na，計算值：1342.6892，實際值：1342.6881。取上述得到的化合物(44mg, 0.0333 mmol)溶於DCM (0.65 mL)之溶液，於0℃下緩慢加入TFA (0.35 mL)，該反應混合物於室溫下攪拌2小時後濃縮。利用C18管柱純化該粗產物，得到油狀產物(化合物90)(36 mg, 0.029 mmol)。以HRMS (ESI-TOF, M-H)計算C59H92N7O20，計算值：1218.6392，實際值：1218.6324。
2.18化合物94(A18)之合成與特性
製備化合物92
取氫化鈉(0.7g, 17.5mmole)及八乙烯醇91
(10g, 26.99mmole)之四氫呋喃(200mL)溶液，於0℃下逐滴添加甲基溴乙酸酯(1.7mL, 16.67mmole)，該混合溶液於室溫下攪拌16小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，利用MeOH終止反應，使用矽藻土片過濾，並以MeOH清洗。集中過濾物和清洗物，於減壓下濃縮，使用快速管柱層析 (矽膠體，2% MeOH溶於CH2
Cl2
) 純化該剩餘物，以得到油狀產物(2.7 g, 15.16 mmole);1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 4.09 (d,J
= 1.2 Hz, 2H), 3.67-3.53 (m, 34H)。取上述得到的化合物(2.7 g, 15.16 mmole)及三乙基胺(3mL, 21.58mmole)溶於二氯甲烷(30mL)之溶液，添加溶於CH2
Cl2
(20mL)之P-甲苯磺醯氯(2.8g, 14.69mmole)，將該反應混合物於室溫下攪拌16小時。觀察到白色固體後，使用矽藻土片過濾，並以CH2
Cl2
清洗。該濾液於真空濃縮後，使用快速管柱層析(使用矽膠體，2% MeOH溶於CH2
Cl2
) 進行純化，得到油狀產物(2.16g, 3.62mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 7.73 (d,J
= 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d,J
= 8.0 Hz, 2H), 4.10 (t,J
= 4.8 Hz, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.69-3.52 (m, 35H), 2.39 (s, 3H)。取上述化合物(2.16g, 3.62mmole)及N-Boc-羥胺(1g, 7.51mmole)溶於四氫呋喃(40mL)之溶液，添加DBU (1.45mL, 9.705mmole)且該反應混合液於室溫下攪拌72小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，該溶液已被濃縮。使用快速管柱層析 (使用矽膠體，12% MeOH溶於CH2
Cl2
) 純化該粗萃物以得到油狀產物(0.6g, 1.076mmole)。取上述化合物(0.6g, 1.076mmole)、H2
O (0.15mL)、及 LiOH (0.056g, 1.335 mmole)溶於四氫呋喃(3mL)之溶液並攪拌之。於室溫下攪拌2小時後，加入1N HCl (10mL)終止反應，再利用乙酸乙酯和滷水進行分離。收集有機層，使用乙酸乙酯(50mL × 4)萃取水相層。集中的有機層經濃縮後，剩餘物利用快速管柱層析法(矽膠體， 20% MeOH溶於CH2
Cl2
)進行純化，得到油狀產物(化合物92)(0.46g, 0.846 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+
)計算 C23H45NO13Na，計算值：566.2783，實測值：566.2768。
製備化合物93
取化合物92(0.46g, 0.846 mmol)及化合物I (0.683g, 1.2 mmol)溶於二氯甲烷(0.51 mL)之溶液，依序添加EDCI (0.18g, 1.16mmole)及HOBT (0.114g, 0.843 mmol)，且該混合液於室溫下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，5% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，以得到油狀產物(0.51g, 0.465mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.67 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.55 (d,J
= 2.0 Hz, 1H), 7.48 (dd,J
= 2.0, 8.8 Hz, 1H), 6.90 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.30-5.25 (m, 3H), 5.04 (d,J
= 6.8 Hz, 1H), 4.70 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.59 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.13-4.08 (m, 3H), 3.99-3.97 (m, 2H), 3.73-3.55 (m, 33H), 2.03 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.44 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)。將上述得到的化合物(0.51g, 0.465mmole)、TBAF (0.49mL, 0.49mmole)、AcOH (3mL)、及砒啶 (5mL)之溶液於室溫下攪拌12小時後，濃縮該溶液且該剩餘物利用快速管柱層析法(矽膠體，5% MeOH溶於CH2
Cl2
)進行純化，得到固體產物(0.49g, 0.499 mmole);1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.91 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.48 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.42 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 6.95 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.32-5.23 (m, 3H), 5.05 (d,J
= 7.6 Hz, 1H), 4.69 (d,J
= 13.2 Hz, 1H), 4.43 (d,J
= 13.2 Hz, 1H), 4.10-4.07 (m, 3H), 3.98-3.96 (m, 2H), 3.72-3.56 (m, 33H), 3.44 (s, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.43 (s, 9H)。將上述得到的化合物(122.5mg, 0.125mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯(100mg, 0.495mmole)及砒啶(0.11mL, 1.423 mmole)溶於二氯甲烷(24mL)之溶液於室溫下攪拌2小時。該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，35% 乙酸乙酯溶於己烷)對剩餘物進行純化，得到固體產物(59mg, 0.051 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.90 (s, 1H), 8.26-8.23 (m, 2H), 7.74 (s, 1H), 7.66 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.60 (dd,J
= 2.4, 9.2 Hz, 1H), 7.41-7.38 (m, 2H), 7.04 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 5.32-5.26 (m, 4H), 5.19-5.10 (m, 2H), 4.16 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.99-3.96 (m, 2H), 3.73-3.56 (m, 33H), 2.04 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.43 (s, 9H)。取上述得到的化合物(90mg, 0.0785 mmole)、MMAE (60mg, 0.084mmole) 、DIPEA (0.14mL, 0.8037mmole) 、HOBT (22mg, 0.163mmole) 、及砒啶 (2.0mL)溶於二甲基甲醯胺(6mL)之溶液並攪拌之。於室溫下攪拌72小時後，濃縮該溶液並利用快速管柱層析法(矽膠體，MeOH溶於 CH2
Cl2
)純化該剩餘物，得到固體產物(化合物93) (80mg, 0.046 mmole)。HRMS (ESI-TOF,M2Na+
) 用於計算C83H133N7O31 Na，計算值：2884.9415，實測值：884.9360。
製備化合物94
取化合物93(80mg, 0.046 mmole)、K2
CO3
(38 mg, 0.276mmole)及H2
O (0.5mL)溶於甲醇(2.5 mL)之溶液並攪拌之。於室溫下攪拌6小時後，利用AcOH終止反應並濃縮，利用C18管柱純化剩餘物，以得到固體產物(15mg, 0.0095 mmole)；以HRMS (ESI-TOF, M2Na+)計算C76H125N7O28Na，計算值：2814.9178，實測值：814.9132。於上述得到的化合物(15mg, 0.0095 mmole)溶於DCM (0.65 mL)之溶液中，於0℃下緩慢添加TFA (0.35 mL)，該反應混合物於室溫下攪拌2小時後，經濃縮後利用C18管柱純化粗萃物，以得到油狀產物94(12 mg, 0.0081 mmol) 。HRMS (ESI-TOF, M2Na+)用於計算C71H117N7O26Na，計算值：2764.8916，實測值： 764.9085。
2.19化合物99(A19)之合成及特性
製備化合物96
取化合物2 (500.0 mg, 0.83 mmol)溶於35 ml之EtOAc/MeOH (6:1)之溶液，並於該溶液中添加Pd/C。對該作業空間抽真空後以H2
填充三次，利用球型瓶使該作業空間保持在H2
環境下，然後將該反應液於室溫下攪拌1小時。待反應完成後，過濾移除Pd/C。蒸餾該濾出物以得到用於下一步驟的化合物。取上一步驟得到的化合物及化合物95 (143 mg, 0.746 mmol)溶於CH2
Cl2
之溶液，添加EDCI (173.0 mg, 1.12 mmol)，於室溫下攪拌15小時。該溶液經蒸餾後，利用管柱純化粗產物，以得到黃色油狀化合物96 (350.0 mg, 0.47 mmol)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.19 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.71 (dd,J
= 2.0, 8.4 Hz, 1H), 7.62 (d,J
= 2.0 Hz, 1H), 6.90 (d,J
= 8.4 Hz, 1H), 5.30-5.20 (m, 3H), 5.04 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 4.69 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.58 (d,J
= 14.8 Hz, 1H), 4.37 (s, 2H), 4.12 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 0.9 (s, 9H), 0.07 (s, 6H)。
製備化合物97
取化合物96 (350.0 mg, 0.471 mmol)溶於15 mL之THF之溶液，添加0.50 mL之TBAF，於室溫下攪拌14小時。該溶液經蒸餾後，利用管柱純化該粗產物，得到黃色油狀化合物97(280.0 mg, 0.45 mmol)。ESI-TOF m/z: 627.2003 (M-
)。
製備化合物(98)
取化合物97 (275.0 mg, 0.27 mmol)溶於8 mL之CH2
Cl2
中，冷卻至0℃，添加砒啶(0.50 mL)及PNP氯甲酸酯(176.0 mg, 0.87 mmol)，且使該混合液於室溫下攪拌3小時。該溶液經蒸餾後，利用管柱純化粗產物，以得到用於下一步驟之化合物(120.0 mg, 0.15 mmol)。將上一步驟得到的化合物(120.0 mg, 0.15 mmol) 及MMAE (120.0 mg, 0.16 mmol)溶於5 mL之THF溶液中，添加TEA (0.5 mL)加以處理，將該反應混合物於室溫下攪拌48小時後，待反應完成再添加50 mL 之EA及30 mL之0.5 N HCl。利用MgSO4
將該有機層乾燥後濃縮，利用管柱純化該粗產物得到黃色油狀之化合物98(85.0 mg, 0.062 mmol)。ESI-TOF m/z: 1587.8759 [M-
-H]-
。
製備化合物99
取化合物98(20.0 mg, 0.015 mmol)溶於2.5 mL之甲醇與水之混合溶液(MeOH : H2O =4:1)中，於0℃下加入Na2
CO3
處理，並於於室溫下對該反應混合物攪拌3小時。待反應完成後，在減壓下移除有機層，利用C18管柱純化該剩餘物，得到用於下一步驟的化合物。將上一步驟得到的化合物溶於1.6 ml之CH2
Cl2
溶液，添加0.40 ml 之TFA然後於室溫下攪拌1小時。該溶液經濃縮後，利用C18管柱純化剩餘物，得到化合物99 (10.3 mg, 0.0085 mmol) 。ESI-TOF m/z: 1130.5896[M-H]-
。
2.20化合物108(A20)之合成與特性
製備化合物101
取2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB-胺 (2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OTBS-PAB-amine，化合物2-1) (1.9 g, 3.34 mmol) 和麩胺酸(化合物100) (412 mg, 1.67 mmol)溶於CH2
Cl2
(25 mL)中，再添加EDCI (1 g, 5.22 mmol)、HOBt (13 mg, 0.083 mmol)。8小時後，移除溶劑然後該反應混合物利用二氧化矽膠層析法依序以5% EA/己烷及20% EA/己烷洗脫純化，以得到1.07 g (48%)之 雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB)- 麩胺酸-N
-Boc (Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OTBS-PAB)-glutamic -N
-Boc, 化合物101)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ 8.72 (bs, 1H), 8.19 (bs, 1H), 7.62 (dd,J
= 1.84Hz, 8.72Hz, 1H), 7.53 (dd,J
= 2.6Hz, 8.72Hz, 1H), 7.42 (dd,J
= 2.16Hz, 10.64Hz, 2H), 6.9 (dd,J
= 5.32Hz, 8.8Hz, 2H), 5.28 (m, 7H), 5.03 (d,J
= 6.84Hz, 2H), 4.69 (dd,J
= 2.4Hz, 15.16Hz, 2H), 4.58 (d,J
= 14.96Hz, 2H), 4.28 (bs, 1H), 4.12 (q,J
= 4.2Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.7 (s, 3H), 2.62-2.45 (m, 2H), 2.32-2.18 (m, 1H), 2.08-2.0 (m, 18H), 1.75 (s, 3H), 1.43 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.91 (s, 9H), 0.09 (s, 6H), 0.08 (s, 6H) 。
製備化合物102
將雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OTBS-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (化合物101)(1.07 , 0.792 mmol)溶於砒啶(9.0 mL)和醋酸(6.0 mL)之混合物中，再添加TBAF (1.0 mL, 1 M in THF)。12小時後，移除溶劑然後該反應混合物利用二氧化矽膠層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及8.3% MeOH/CH2
Cl2
洗脫純化，以得到658 mg (75%)之雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OH-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OH-PAB)-glutamic-N
-Boc，化合物102)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ7.5-7.33 (m, 4H), 6.87 (dd,J
= 5.68Hz, 8.8Hz, 2H), 5.91 (d,J
= 7.64Hz, 1H), 5.35 (dd,J
= 1.32Hz, 9.44Hz, 2H), 5.3-5.18 (m, 4H), 5.04 (d,J
= 7.64Hz, 2H), 4.6 (d,J
= 13.2Hz, 2H), 4.35 (d,J
= 13.32Hz, 2H), 4.16 (dd,J
= 3.64Hz, 9.76z, 2H), 3.66 (,J
= 1.72Hz,6H), 3.43 (s, 4H), 2.98-2.92 (m, 1H), 2.38 (bs, 2H), 2.054 (s, 3H), 2.051 (s, 3H), 2.01 (s, 12H), 1.37 (s, 9H), 1.36 (s, 9H) 。
製備化合物103
將雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OH-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (化合物102)(160 mg, 0.143 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(2.5 mL)，再添加砒啶(200 mL, 2.86 mmol)和4-硝基苯基氯化物(230 mg, 1.14 mmol)。2小時後移除溶劑，利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)、接著4% MeOH/CH2
Cl2
洗脫以純化，藉此得到131.4 mg (63%)之雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-OpNP-PAB)-glutamic-N
-Boc，化合物103)。然後，取MMAE (162 mg, 0.225 mmol)溶於THF (4.0 mL)及砒啶 (1.0 mL)之混合液中，再添加DIPEA (280 mL)、HOBt (6.0 mg, 0.042 mmol)、及雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-OpNP-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (化合物103) (131 mg, 0.09 mmol)。48小時後移除溶劑，利用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及9% MeOH/CH2
Cl2
洗脫並純化該反應混合物，藉此以得到119.3 mg (51.6%) 之雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB)-glutamic-N
-Boc，化合物104)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3
) δ9.5-8.8 (m, 2H), 8.2-6.3 (m, 22H), 5.4-5.28 (m, 8H), 5.16-4.49 (m, 12H), 4.48-3.88 (m, 15H), 3.7 (d,J
= 2.87Hz, 2H), 3.74-3.6 (m, 8H), 3.45 (s, 2H), 3.4-3.15 (m, 17H), 3.09 (s, 1H), 3.02-2.88 (m, 6H), 2.88-2.74 (m, 6H), 2.73-2.52 (m, 4H), 2.5-2.24 (m, 8H), 2.24-1.85 (m, 38H), 1.84-1.45 (m, 8H), 1.45-1.23 (m, 12H), 1.2-1.05 (m, 10H), 1.03-0.4 (m, 60H) 。
製備化合物106
將雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB)-麩胺酸-N
-Boc (化合物104)(119 mg, 0.046 mmol)懸浮於無水CH2
Cl2
(2.8 mL)中，再添加TFA (0.7 mL)。該反應液於0 ℃下攪拌10分鐘，回溫至室溫後再攪拌30分鐘。該反應混合物蒸餾至乾燥(與甲苯共沸3次)後，無須額外純化便可得到雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯 -2’
-MMAE-PAB)- 麩胺酸-胺 (化合物105)。將得到的化合物105和PEG4-羥胺-N
-Boc酸 (化合物52)(4.7 mg, 0.02 mmol)懸浮於無水THF (1.5 mL)中，再添加TEA (27.8 mL, 0.2 mmol)、HOBt (0.14 mg, 0.001 mmol)及EDCI (6 mg, 0.03 mmol)。12小時後，移除溶劑並用矽膠柱層析法依序以CH2
Cl2
(100%)及 15% MeOH/CH2
Cl2
洗脫以純化，藉此得到50 mg (87%) of 雙-(2,3,4-三-Ac-6-甲基-葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB)-麩胺酸-PEG4-羥胺-N
-Boc (Di-(2,3,4-tri-Ac-6-methyl-Glucuranate-2’
-MMAE-PAB)-glutamic-PEG4-hydroxylamine-N
-Boc，化合物106)。將上述化合物溶於MeOH (2.7 mL)中，然後添加Na2
CO3
(24.2 mg, 0.23 mmol)。2小時後，將H2
O (170 mL)添加至該反應混合物中，該反應液繼續攪拌2.5小時。利用IR-120中和反應液，使用矽藻土片過濾，蒸餾該粗萃物，並以C18管柱依序透過100% H2
O及30% 乙腈/H2
O進行洗脫以純化該粗萃物，以得到27.9 mg (62%)之雙-(葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB)-麩胺酸-PEG4-羥胺-N
-Boc (Di-(Glucuranate-2’
-MMAE-PAB)-glutamic -PEG4-hydroxylamie-N
-Boc，化合物107)。然後，取15 mg之化合物107懸浮於無水CH2
Cl2
(0.8 mL)，添加TFA (0.2 mL)，將該反應液於0℃下攪拌10分鐘。然後加熱至室溫後再攪拌30分鐘。該反應混合物蒸餾至乾燥後，通過C18管柱依序以100% H2
O及25%乙腈/H2
O洗脫純化該反應混合物，以得到10 mg (69.5%)之雙-(葡萄醣醛酸酯-2’
-MMAE-PAB)–麩胺酸-PEG4-羥胺(Di-(Glucuranate-2’
-MMAE-PAB) -glutamic-PEG4-hydroxylamie，化合物108)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ7.7-7.0 (m, 26H), 5.35-5.1 (m, 6H), 4.7-4.45 (m, 8H), 4.22-4.17 (m, 8H), 4.05-3.9 (m, 4H), 3.88-3.75 (m, 4H), 3.7-3.4 (m, 26H), 3.38-3.15 (m, 19H), 3.15-2.85 (m, 18H), 2.6-2.3 (m, 10H), 2.28-1.2 (m, 37H), 1.15-1.0 (m, 18H), 1.0-0.5 (m, 60H) 。
2.21化合物114(A21)之合成與特性
製備化合物110
取化合物109 (2.0g, 10.31 mmol)及三乙基胺(1.56g, 15.46 mmol)溶於二氯甲烷(50 mL)溶液，並添加3-巰基丙醇(1.04g, 11.34mmole)，於室溫下攪拌12小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，即表示該溶液已被濃縮。剩餘物分別利用CH2
Cl2
、1N HCl、飽和NaHCO3
(aq)及滷水萃取，將有機層集中後於真空中濃縮，利用快速管柱層析法純化剩餘物以得到油狀產物(化合物110)(1.0g, 4.8mmole) 。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.15 (s, 2H), 2.77 (t, J =7
.2 Hz, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.47 (s, 9H) 。
製備化合物111
取化合物110(1.0g, 4.8mmole)、三乙基胺(1mL, 9.7mmole)、及 P-對甲苯磺醯氯(1.39g, 7.275mmole)溶於二氯甲烷(50mL)之溶液。於室溫下攪拌16小時後，濃縮該溶液以得到油狀產物。將疊氮化鈉(0.25g, 3.83mmole)及上述得到的化合物(0.5g, 1.28mmole)溶於乙醇之溶液，於80℃下攪拌16小時。濃縮該溶液且利用EA和滷水萃取剩餘物，於真空中濃縮該有機層後得到化合物111(0.27g, 1.17mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ3.42 (t,J
= 6.8 Hz, 2H), 3.12 (s, 2H), 2.72 (t,J
= 7.2 Hz, 2H), 1.89 (m, 2H), 1.47 (s, 9H)。
製備化合物112
取化合物111 (1.38g, 2.49mmole)、乙酸乙酯(5mL)、及Pd/C (0.5g)容於甲醇之溶液，於H2
環境下攪拌之。待攪拌12小時隔夜後，使用矽藻土片過濾出Pd/C，並以甲醇清洗。該溶液於真空中濃縮後，得到油狀產物。取上述化合物和化合物95 (0.24g, 1.17 mmol)溶於二氯甲烷之溶液(15 mL)，依序添加EDCI (0.236g, 1.521mmole)和HOBT (0.206g, 1.521 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌12小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法純化剩餘物，得到油狀產物(0.42g, 1.11mmole)。將上一步驟得到的化合物(0.42g, 1.11mmole)、H2
O (1mL)、及KOH (0.28g, 4.98 mmole)溶於甲醇(9mL)溶液中。於室溫下攪拌16小時後，該溶液加入1N HCl終止反應，並依序以CH2
Cl2
、1N HCl、及滷水萃取。及中溶液後濃縮得到用於下一步驟的油狀產物(0.357g, 1.11mmole)。將上一步驟得到的化合物(0.357g, 1.11mmole)及化合物2-1(0.666g, 1.17 mmol)溶於二氯甲烷(20 mL)中，再依序加入EDCI (0.223g, 1.44 mmole)和HOBT (0.195g, 1.44 mmol)，於室溫下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，得到油狀產物112
(0.39g, 0.447mmole) 。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.71 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.53-7.49 (m, 2H), 6.92 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.35-5.23 (m, 3H), 5.06 (d,J
= 7.2 Hz, 1H), 4.72 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.60 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.23 (s, 2H), 4.15 (d,J
= 9.6 Hz, 1H), 3.71(s, 3H), 3.40 (m, 2H), 3.33 (s, 2H), 2.64 (t,J
= 7.2 Hz, 2H), 2.07 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.86 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 0.92 (s, 9H), 0.09 (s, 6H) 。
製備化合物113
取化合物112(0.39g, 0.447mmole)、TBAF (0.5mL, 0.5mmole)、AcOH (3mL)、及砒啶(4.5mL)之溶液並攪拌之，於室溫下攪拌12小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，以得到固體產物(0.29g, 0.382 mmole)。將上述化合物(0.29g, 0.382 mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (231mg, 1.146 mmole)、及砒啶 (0.155 mL, 1.91 mmole)加入二氯甲烷(20mL)溶液中，於室溫下攪拌12小時，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法純化該剩餘物，以得到固體產物(110 mg, 0.12 mmole)。將上述得到的化合物(110mg, 0.12 mmole)、MMAE (94mg, 0.131mmole)、DIPEA (0.104mL, 0.595mmole)、HOBT (18mg, 0.131mmole)、及砒啶(94mg, 1.19mmole)溶於二甲基甲醯胺(10mL)溶液中。於室溫下攪拌72小時後，濃縮該溶液且利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，得到固體產物(化合物113) (52mg, 0.035 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C72H110N8O24SNa，計算值：1525.7246，實測值：1525.71891。
製備化合物(114)
取化合物113 (20.0 mg, 0.0133 mmol)溶於甲醇與水混合溶液(MeOH : H2
O =4:1)中，於0℃加入Na2
CO3
(4.2 mg, 0.0399 mmol)處理，將該反應混和物於室溫下攪拌3小時。待反應完成後，於減壓下移除有機溶液，並利用C18管柱對剩餘物進行純化以得到用於下一步驟的化合物。將上一步驟的化合物溶於4 ml之CH2
Cl2
，添加1.0 ml 之TFA並於室溫下攪拌1小時。該溶液經濃縮後，利用C18管柱純化該剩餘物，以得到化合物114
(7.3 mg, 0.0057 mmol)。ESI-TOF m/z: 1301.6356[M-H]-
。
2.22化合物119(A22)之合成與特性
製備化合物(116)
取三-甘胺酸115
(10 g, 52.86 mmol)加入含二惡烷(120 mL)、水(60 mL)及1 M NaOH (60 mL)之混合液中，並於冰水浴中攪拌之，再添加雙-叔丁基焦碳酸酯(17.3 g, 79.29 mmol)，持續於室溫下攪拌6小時。該溶液於真空中濃縮至約10至15 mL，以冰水浴冷卻後，覆蓋一層乙酸乙酯(約50 mL)，並加入稀釋的HCl溶液進行酸化調整至pH值約2至3。使用乙酸乙酯重複萃取該水相層，倒出乙酸乙酯萃取液，以水清洗後利用無水Na2
SO4
乾燥，再於真空中蒸餾之，得到光滑固體之純物質(12.5 g, 43.20 mmol)。將上述得到的化合物(12.5g, 43.20mmole)及EDCI (8.04g, 51.79mmole)溶於甲醇(24mL)之溶液，於室溫下攪拌16小時，濃縮該溶液，利用快速管柱層析法(矽膠體，8% 之MeOH溶於CH2
Cl2
)對該剩餘物進行純化，以得到固體產物(10.45g, 34.44 mmole)。取上述得到的化合物(10.45g, 34.44 mmole)溶於DCM (65 mL)之溶液，於0℃下緩慢添加TFA (35 mL)。將該反應混合物於室溫下攪拌2小時，濃縮後得到油狀產物(5.88g, 28.92 mmol) 。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.04-3.59 (m, 4H), 3.38-3.83 (m, 2H), 3.71 (s, 3H) 。將上述化合物(1.5g, 7.381 mmol)及化合物95 (1.62g, 8.473 mmol)溶於二甲基甲醯胺(25 mL)之溶液，依序添加EDCI (1.3g, 8.37mmole)及HOBT (1g, 7.40 mmol)，該混合物於室溫下攪拌48小時，且該反應混合物於真空中濃縮後，剩餘物利用快速管柱層析法(矽膠體，6% MeOH溶於CH2
Cl2
)進行純化，得到油狀產物116(1.5g, 3.99mmole) 。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.34 (s, 2H), 3.98-3.93 (m, 6H), 3.72 (s, 3H), 1.47 (s, 9H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算 C14H24N4O8Na，計算值：399.1486，實測值：399.1488。
製備化合物117
取化合物116 (0.28g, 0.739mmole)、H2
O (0.5mL)、及LiOH (0.037g, 0.881 mmole)溶於甲醇之溶液，於室溫下攪拌2小時。該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，50% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，得到油狀產物(0.24g, 0.662 mmole)。將上述得到的化合物(0.46g, 0.846 mmol)及化合物2-1 (0.51g, 0.895 mmol)溶於二甲基甲醯胺(20 mL)之溶液，再依序添加EDCI (0.18g, 1.16mmole)及HOBT (0.114g, 0.843 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌48小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，5% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，得到油狀產物(0.42g, 0.460mmole)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.72 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.74 (dd,J
= 2.4, 9.2 Hz, 1H), 7.02 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 5.45 (t,J
= 9.6 Hz, 1H), 5.36 (d,J
= 7.6 Hz, 1H), 5.22-5.17 (m, 2H), 4.68 (q,J
= 24.8 Hz, 2H), 4.47 (d,J
= 9.6 Hz, 1H), 4.32 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.94 (s, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.46 (s, 9H), 0.96 (s, 9H), 0.12 (s, 6H)。取上述所得化合物(0.42g, 0.460mmole) TBAF (0.48mL, 0.48mmole)、AcOH (3mL)、及砒啶(5mL)之溶液並攪拌之，於室溫下攪拌12小時後，濃縮該溶液，並利用快速管柱層析法(矽膠體，9% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，得到固體產物(0.35g, 0.438 mmole)。取上述化合物(117mg, 0.146mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (100mg, 0.495mmole)、及砒啶(0.11mL, 1.423 mmole)溶於二氯甲烷(24mL)之溶液，於室溫下攪拌2小時後，濃縮該溶液，利用快速管柱層析法(矽膠體，6% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，以得到固體產物117(100mg, 0.107 mmole)。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.32-8.29 (m, 2H), 7.76 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.61 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.52-7.50 (m, 2H), 7.16 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.49-5.43 (m, 2H), 5.41-5.19 (m, 4H), 4.51 (d,J
= 10.0 Hz, 1H), 4.31 (s, 2H), 4.01 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.93 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.45 (s, 9H)。
製備化合物118
取化合物116(100mg, 0.107 mmole)、MMAE (69mg, 0.096mmole)、DIPEA (0.173mL, 0.995mmole)、HOBT (12mg, 0.092mmole)、及砒啶(2.5mL)溶於二甲基甲醯胺(7mL)之溶液，於室溫下攪拌72小時，濃縮該溶液，並利用快速管柱層析法(矽膠體，7% MeOH溶於CH2
Cl2
)對該剩餘物進行純化，以得到固體產物118 (79mg, 0.051 mmole)。以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算C73H110N10O26Na，計算值：1565.7485，實測值：1565.7471。
製備化合物119
取化合物118(79mg, 0.051 mmole)、K2
CO3
(38 mg, 0.276mmole)、及H2
O (0.5mL)溶於甲醇(2.5 mL)之溶液，於室溫下攪拌6小時後，以AcOH終止反應後濃縮之，利用C18管柱純化剩餘物後以得到固體產物(70 mg, 0.0499 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C66H102N10O23Na，計算值：1425.7012，實測值：1425.7016。將上述得到的化合物(70 mg, 0.0499 mmole)溶於DCM (0.65 mL)溶液中，於0℃下緩慢加入TFA (0.35 mL)，將該反應混合物於室溫下攪拌2小時後濃縮。利用C18管柱純化該粗產物，以得到油狀產物119(48 mg, 0.0368 mmol)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+) 計算C61H94N10O21Na，計算值：1325.6487，實測值：1325.6540。
2.23 化合物125(A23)之合成與特性
製備化合物121
於0 ℃下將叔丁基溴乙酸乙酯(化合物109)(2.0g, 10.25mmole)添加至溶有化合物120 (1.97g, 12.3 mmol)及三乙基胺(1.56 g, 15.38 mmol)之二氯甲烷(25mL)溶液中，且將該混合物於0 °C至室溫下攪拌16小時。該反應混合物於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化後，得到用於下一步驟的油狀產物(1.9g, 6.93 mmol)。取上一步驟得到的化合物(1.9g, 6.93mmole)及砒啶(1.66mL, 20.8mmole)溶於二氯甲烷(30mL)之溶液，添加甲磺醯氯化物(1.03g, 9.0mmole)並於室溫下攪拌16小時。當TLC顯示起始原料被完全消耗時，該溶液已被濃縮。使用快速管柱層析(使用矽膠體，35％溶於己烷的乙酸乙酯溶液)對該剩餘物進行純化，得到油狀產物(化合物121) (1.72g, 4.88mmole) 。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.07 (s, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.38 (t,J
= 5.2 Hz, 2H), 3.29 (t,J
= 5.2 Hz, 2H), 3.01 (s, 3 H), 1.47 (s, 9H) 。
取化合物121 (1.72g, 4.88mmole)、H2
O (10mL)、及 KOH (2.19g, 39.04 mmole)溶於甲醇(10mL)之溶液，於室溫下攪拌16小時。使用IR-120終止反應後過濾之，利用甲醇沖洗IR-120且合併溶液後濃縮以得到油狀產物。將上述得到的化合物和化合物I (2.91g, 5.12 mmol)溶於二氯甲烷(30 mL)中，再依序添加EDCI (1.0g, 6.441mmole)及HOBT (1.0g, 7.40 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌16小時後，於真空下濃縮，且利用快速管柱層析法純化剩餘物，以得到油狀產物(化合物122)(1.2g, 1.416mmole) 。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.50 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.37 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 6.88 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.37-5.20 (m, 4H), 5.04 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.66 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.55 (d,J
= 15.2 Hz, 1H), 4.14 (d,J
= 9.2 Hz, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.67 (s, 3H), 3.37 (m, 2H), 3.23 (m, 2H), 3.00 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.36 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.07 (s, 6H) 。
製備化合物123
取化合物122(1.2g, 1.416mmole)、TBAF (1.5mL, 1.5mmole) 、AcOH (9mL) 、及砒啶(13.5mL)之溶液，於室溫下攪拌12小時，該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，得到固體產物(0.98g, 1.33 mmole)。然後，於0℃ 下TFA (0.35 mL)緩慢添加至含上述化合物(0.98g, 1.33 mmole)溶於DCM (0.65 mL)之溶液，將該反應混合物於室溫下攪拌2小時後，濃縮以得到產物。取上述化合物及化合物95(0.35g, 1.60 mmol)溶於二氯甲烷(10 mL)之溶液，依序添加三乙基胺(0.175g, 1.729mmole)、EDCI (0.268g, 1.729mmole)、及HOBT (0.233g, 1.729 mmol)，將該混合物於室溫下攪拌16小時後，於真空中濃縮該反應混合物，並利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化以得到油狀產物(化合物123)(0.2g, 0.25 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.80 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.53 (m, 1H), 7.40 (dd,J
= 2.4, 32.4 Hz, 1H), 6.97 (dd,J
= 4.0, 8.8 Hz, 1H), 5.40-5.21 (m, 3H), 5.10 (t,J
= 76 Hz, 1H), 4.72 (d,J
= 12.8 Hz, 1H), 4.42 (m, 1H), 4.30 (s, 1H), 4.11 (s, 2H), 3.69 (d,J
= 2.8 Hz, 1H), 3.51 (m, 2H), 3.42 (m, 2H), 3.03 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.46 (s, 9H)。
製備化合物125
取化合物123(0.2g, 0.25 mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (151mg, 0.75mmole)、及砒啶 (0.103mL, 1.25 mmole)溶於二氯甲烷(20mL)之溶液，於室溫下攪拌12小時，該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，以得到固體產物(220 mg, 0.206 mmole)。取上述化合物(100mg, 0.103 mmole)、MMAE (81.3mg, 0.1133mmole)、DIPEA (66.6mg, 0.515mmole)、HOBT (15.3mg, 0.1133mmole)、及砒啶(81.5mg, 1.03mmole)溶於二甲基甲醯胺(6mL)之溶液，於室溫下攪拌48小時，使該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法對剩餘物進行純化，以得到固體產物(化合物124) (50mg, 0.032 mmole)。以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C72H111N9O26SNa計算值：1572.7253，實測值：1572.7324。取化合物124(50mg, 0.032 mmole)、K2
CO3
(25mg, 0.182mmole)、及H2
O (0.3mL)溶於甲醇(2mL)之溶液，於室溫下攪拌6小時，該溶液以AcOH終止反應後濃縮，利用C18管柱層析法對剩餘物進行純化，以得到固體產物。然後，於0℃下將TFA (0.35 mL)緩慢加入含有上述得到的化合物(44mg, 0.0333 mmol)之DCM (0.65 mL)溶液，於室溫下攪拌2小時，該溶液經濃縮後，利用C18管柱純化該粗產物，以得到油狀產物(化合物125)。ESI-TOF m/z: 1308.6360 [M-H]-
。
2.24 化合物130(A24)之合成與特性
製備化合物127
取雙-甘胺酸(化合物126)(5 g, 37.84 mmol)溶於含二惡烷(60 mL)、水(30 mL) 及1 M NaOH (30 mL)之混合液中，使用冰水浴冷卻之，添加雙-叔丁基焦碳酸酯(12.38 g, 56.76 mmol)，於室溫下繼續攪拌6小時。該溶液於真空中濃縮至10–15 mL之體積，以冰水浴冷卻後，覆蓋一層乙酸乙酯(約50 mL)，並加入稀釋的HCl溶液進行酸化並調整至pH值2–3。使用乙酸乙酯重複萃取該水相層，倒出乙酸乙酯萃取液，以水清洗後利用無水Na2
SO4
乾燥，再於真空中蒸餾之，得到光滑固體之純物質(5.2 g, 17.97 mmol)。取上述得到的化合物(5.2 g, 17.97 mmol)及EDCI (3.38g, 21.60mmole)溶於甲醇(24mL)之溶液，於室溫下攪拌16小時，該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，4% MeOH溶於CH2
Cl2
)對該剩餘物進行純化，以得到固體產物(3.5g, 11.54 mmole)。於0℃下將TFA (18 mL)緩慢加入含上述得到化合物(3.5g, 11.54 mmole)溶於DCM (33 mL)之溶液，於室溫下攪拌2小時，該溶液經濃縮後，得到油狀產物(1.4g, 9.58 mmol)。取上述化合物(1.106g, 7.568 mmol)及化合物95 (1.6g, 8.369 mmol)溶於二甲基甲醯胺(24 mL)之溶液，依序添加EDCI (1.3g, 8.374mmole)及HOBT (1g, 7.40 mmol)，於室溫下攪拌48小時，該溶液於真空中濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，4% MeOH溶於CH2
Cl2
)對進行剩餘物純化，得到油狀產物(化合物127)(0.41g, 1.284mmole) 。1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.34 (s, 2H), 3.99 (s, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.71 (s, 3H), 1.47 (s, 9H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C12H21N3O7Na，計算值：342.1278，實測值：342.1281。
製備化合物128
將化合物127(0.41g, 0.739mmole)、水(0.8mL)、及LiOH (0.065g, 1.548 mmole)溶於甲醇(10mL)溶液中並攪拌混合。於室溫下攪拌2小時之後將該溶液濃縮，接著利用快速管柱層析法(矽膠體，50% MeOH溶於CH2
Cl2
)對該剩餘物進行純化，以得到油狀產物(0.35g, 1.146 mmole);1
H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.34 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.80 (s, 2H), 1.47 (s, 9H)。將上述得到的化合物(0.35g, 1.146 mmol)和化合物2-1
(0.76g, 1.334 mmol)溶於二甲基甲醯胺(20 mL)之溶液，依序添加EDCI (0.22g, 1.417 mmole) 及 HOBT (0.155g, 1.147 mmol)，於室溫下攪拌16小時，該溶液於真空濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，乙酸乙酯)對該剩餘物進行純化，以得到油狀產物(0.67g, 0.780mmole);1
H NMR (400 MHz, MeOD) 7.68 (d,J
= 2.4 Hz, 1H), 7.48 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.02 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.45 (t,J
= 9.6 Hz, 1H), 5.35 (d,J
= 8.0 Hz, 1H), 5.23-5.18 (m, 2H), 4.68 (q,J
= 24.8 Hz, 2H), 4.47 (d,J
= 10.0 Hz, 1H), 4.35 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 4.00 (s, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.46 (s, 9H), 0.96 (s, 9H), 0.12 (s, 6H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+
) 計算C37H56N4O17SiNa，計算值： 879.3302，實測值：879.3272。取上述得到的化合物(0.668g, 0.78mmole)、TBAF (1.05mL, 1.05mmole)、AcOH (5.6mL)、及砒啶(10mL)之溶液，於室溫下攪拌12小時，該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，7% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，以得到固體產物(0.55g, 0.74 mmole);1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.03 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.40-7.38 (m, 1H), 6.86 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.33 (t,J
= 9.2 Hz, 1H), 5.21 (t,J
= 9.6 Hz, 1H), 5.05 (d,J
= 7.6 Hz, 1H), 4.57 (d,J
= 13.6 Hz, 1H), 4.39-4.32 (m, 3H), 4.21 (d,J
= 10.0 Hz, 1H), 3.92 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.66 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.40 (s, 9H)。將上述得到的化合物(183mg, 0.247mmole)、4-硝基苯基氯甲酸酯 (210mg, 1.042mmole)、及砒啶(0.3mL, 3.709 mmole)溶於二氯甲烷(20mL)溶液中，於室溫下攪拌2小時，該溶液經濃縮後，利用快速管柱層析法(矽膠體，5% MeOH溶於CH2
Cl2
)對剩餘物進行純化，得到固體產物(化合物128)(116mg, 0.128 mmole)。1
H NMR (400 MHz, CDCl3) 8.65-8.58 (m, 3H), 8.25-8.23 (m, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.67-7.64 (m, 2H), 7.58 (dd,J
= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 7.40-7.38 (m, 2H), 7.28-7.26 (m, 1H), 7.17-7.14 (m, 1H), 7.01 (d,J
= 8.8 Hz, 1H), 5.32-5.28 (m, 2H), 5.26-5.05 (m, 3H), 4.39 (s, 2H), 4.03 (d,J
= 6.0 Hz, 2H), 3.99 (d,J
= 6.0 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.44 (s, 9H);以HRMS (ESI-TOF, MNa+) 計算C38H45N5O21Na，計算值：930.2499，實測值：930.2468。
製備化合物129
將化合物128 (6mg, 0.128 mmole)、MMAE (83mg, 0.116mmole)、DIPEA (0.203mL, 1.167mmole)、HOBT (18mg, 0.131mmole)、及砒啶(0.8mL)溶於二甲基甲醯胺(8mL)之溶液，於室溫下攪拌72小時，將該溶液濃縮之後，利用快速管柱層析法(矽膠體，8% MeOH溶於CH2
Cl2
)對該剩餘物進行純化，以得到固體產物(化合物129)(81mg, 0.054 mmole); 以HRMS (ESI-TOF,MNa+)計算 C71H107N9O25Na，計算值：1508.7270，實測值：1508.7298。
製備化合物130
取化合物129(81mg, 0.054 mmole)、K2
CO3
(38 mg, 0.276mmole)、及H2
O (0.5mL)溶於甲醇(3 mL)之溶液，於室溫下攪拌6小時，該溶液經AcOH終止反應後濃縮，利用C18管柱純化剩餘物以得到固體產物(70mg, 0.0499 mmole)；以 HRMS (ESI-TOF, MNa+)計算C64H99N9O22Na，計算值：1368.6797，實測值：1368.6902。於0℃下將TFA (0.35 mL)緩慢加入含有上述得到的化合物(70mg, 0.0499 mmole)之DCM (0.65 mL)溶液中，於室溫下將該反應混合物攪拌2小時，該溶液經濃縮之後，利用C18管柱對粗產物進行純化，得到油狀產物(化合物130) (48 mg, 0.0368 mmol) ; 以HRMS (ESI-TOF, MH+)計算C59H92N9O20，計算值：1246.6453，實測值：1246.6609。
實施例3：抗體藥物複合體(ADC)之形成與特性
反應式5：TRZ-NKS或TRZ-NGKS透過肟接合(oxime-ligation)之承載物複合方式
3.1 透過TRZ-NKS 或TRZ-NKS-D2執行肟接合接點專一性抗體藥物複合體的一般流程
於100 mM醋酸緩衝液(pH 4.5)中，加入TRZ-NKS (5 mg/mL)及3 mM承載物(A22)，於37℃下作用3天，以執行抗體的丙酮與烷氧基胺-裂解性承載物(A22)之間的肟接合。在Amicon濃縮劑中以10,000 分子量截斷(Molecular Weight Cut Off，MWCO)與醋酸緩衝液進行緩衝液交換。透過Amicon濃縮劑以10,000 MWCO使用PBS(pH 7.4)執行連續清洗，藉以移除多餘的小分子。請參閱第4圖及第5圖，分別為利用SDS-PAGE分析TRZ-A22及TRZ-A11-D2之結果。
反應式6：TRZ-NAS透過鍵擊化學之承載物複合方式
3.2 經由TRZ-NAS之鍵擊化學接點專一性抗體藥物複合體的一般流程
於1X PBS緩衝液(pH值 7.4，含5至10% DMSO)中，添加3-5 mg/mL 之TRZ-NAS (含400mM 之炔基-裂解性連結基、45 mM之CuSO4
、45 mM之抗壞血酸鈉)，於37 ℃下作用2-8小時，以在抗體上的疊氮基與炔基-裂解性承載物(A09)之間，進行經Cu (+)催化的鍵擊反應。反應完成後，使用10 mM EDTA終止反應。在Amicon濃縮劑中，以10,000 MWCO與1X PBS緩衝液進行緩衝液交換。在Amicon濃縮劑中，以10,000 MWCO使用PBS(pH 7.4)執行連續清洗，藉以移除多餘的小分子。SDS-PAGE分析結果如第6圖所示。
3.3 ADC的DAR數量定性
製造ADC時，抗體對承載物之總承載量稱為藥物抗體比或DAR。利用質譜儀計算每一個ADC的DAR。使用10 kDa 超高速離心機，使ADC樣品在三次濃縮/稀釋循環中利用ddH2
O進行脫鹽處理。在正離子模式下進行質譜儀實驗，建立於Xevo G2-XS QTOF裝置 (Waters, Manchester, UK)；該裝置設有ESI離子源、3.0 kV之毛細管電壓以及150 V之樣品錐。在700–4000之m/z範圍下收集完整的掃描圖譜。使用Waters MassLynx軟體控制裝置以及處理數據。請參照第7圖，TRZ-A22呈現出：對應至具有DAR數=4之ADC的主要波峰，以及對應至具有DAR數=3之ADC的一較小波峰。下列方程式係用於建立平均DAR數：
在此，變異性是相對豐富的，n=抗體上的承載物(藥物)數量，y%=每一個ADC基於各波鋒面積所計算出的波鋒面積比。TRZ-A22的平均藥物抗體比(DAR)係如表1所示，且所有ADC的平均DAR係如表2所示。
由於特殊的製程，本發明之實施方式可具有相對高的平均DAR數。根據本發明之實施例，具有兩個雙分支醣基的抗體，其平均DAR數為3.0以上。相反地，在本技術領域中已知抗體的平均DAR數一般為2.0以下。具有兩個單分支醣基的抗體，其平均DAR數為1.5至2.0。較高的平均DAR數表示：各抗體分子可以攜帶較多的承載體，且由本發明說明書中記載的實驗證明：本發明的抗體藥物複合體作為療效藥物更加有效且具有更大的經濟效應。
實施例4：利用ELISA試驗檢測 CHO-A01對HER2的結合能力
進行Her2結合ELISA試驗係用於評估：在連結基與藥物複合以後，TRZ的結合是否減少。將人類HER2重組蛋白胞外區域(extracellular domain，ECD) (0.025 µg/ml; Sino Biological Inc.)加入碳酸鹽塗覆緩衝液(pH 10.0)中，於4℃下塗覆於96孔盤(Corning)內靜置隔夜。清洗後，將阻斷(blocking)緩衝液(包含2%小牛血清蛋白及0.05% Tween20(溶於PBS) )加入培養盤作用2小時。接著，再次清洗後，加入系列稀釋的TRZ/TRZ-NKS/TRZ-A01，從0.00001 µg/ml 至3 µg/ml(溶於3倍稀釋的試驗緩衝液)，作用1小時後，加入抗人類IgG HRP (Jackson Immuno Research Inc.)作用30分鐘。最後，加入100 µl的基質(3,3’,5,5’- 四甲基聯苯胺, TMB)用於呈色，然後加入100 µL之2.5 N硫酸終止反應。利用Spectra Max M5微盤分析儀(Molecular Devices)測量450 nm的吸光值，並利用四參數非線性迴歸方程式(4PL)作曲線擬合來分析數據。第8圖顯示為TRZ-A01的代表性結合曲線。在數量上，表3同時顯示出：在Her2 (ECD)的結合親和力方面，TRZ-A01和其官能化TRZ-NKS相較於TRZ的EC50。結果顯示：假設承載物複合不會改變抗原的結合親和力，TRZ-A01、TRZ-NKS及 TRZ對抗原的結合親和力是有差異的。在其他承載物(A02至A24)上也可以觀察到相同的結果。這些結果顯示：在ADC複合後，不會影響TRZ-A01至A24對Her2的結合性。 表3：mAbs對Her2 (ECD)的EC 50值(µg/mL) 
如第8圖所示，抗體藥物複合體(即CHO-A01)保有市售抗體(即Roche-TRZ、IgG1κ anti-HER2 trastuzumabTRZ
、Herceptin,Roche
)的結合特性，顯示複合不會改變ADC中抗體的構型。
實施例5： 細胞毒殺性試驗
將BT474細胞(2.5×103
細胞/100µL/孔)成長並維持在90% Hybri-Care培養液(Modified Dulbecco's培養液)中，其中添加有30 ng/mL EGF 和10%胎牛血清蛋白。次日，使用培養液稀釋抗體、ADC (TRZ或TRZ-A01)、或承載物，再分別添加使最終濃度範圍介於20.5-0.0031 nM或1000-0.00001 nM。持續培養5天，且利用CellTiter-Glo (Promega Inc.)藉由測量發光性來估算細胞存活數，等同於ATP的數量。利用Spectra Max M5微盤分析儀(Molecular Devices)收集數據，並利用四參數非線性迴歸方程式(4PL)作曲線擬合來分析數據。在培養液中的BT474細胞的數目設定為100%細胞存活性，而只有培養液的細胞數目設定為0%細胞存活性。 表4 ：在Her2正表現之BT-474細胞中，TRZ對ADCs的細胞毒殺性增量(EC50值of TRZ/ADC)之總表 
如第9圖所示，TRZ-A01引發的細胞毒殺性呈現劑量依賴性。相反地，在測試單獨TRZ濃度的組別中顯示出微弱的細胞毒殺性。此外，在Her2抗原負表現的MDA-MB231細胞中並沒有觀察到細胞毒殺性。這個結果指出ADC同時具有結合專一性及細胞毒殺性的優點。TRZ-A01-TRZ-A25相較於TRZ的相對效能係利用下列方程計算：相對效能=(TRZ之EC50值)/(ADC之EC50值)，且結果整理於表4中。
其他Her2-正表現的癌細胞株，例如SKBR3、NCI-N87、JIMT-1、及 MCF-7，並且同時使用TRZ-A01及TRZ 誘發Her2-負表現的MDA-MB-231細胞進行細胞毒殺性試驗。請參閱表5，結果顯示所有Her2-正表現的細胞株對TRZ-A01比TRZ具有更高的反應。 表5：比較TRZ-A01在HER2-正表現細胞株或HER2-負表現細胞株的細胞毒殺性 
實施例6：活體功效動物模式
從臺灣BioLasco購得六週大的雌性C.B-17 SCID小鼠，所有的小鼠皆在右齒腹以皮下接種注入5x106
個NCI-N87細胞。利用游標尺測量腫瘤生長並利用方程式: 1/2 [長度 (mm)] × [寬度 (mm)]2
計算腫瘤體積。當腫瘤尺寸達到約300 mm3
體積時(在第28天)，將動物隨機分成兩組，每組3隻小鼠，以TRZ-A01或載體(控制組)處理。TRZ-A01組係從腹腔給予5 mg/kg的TRZ-A01(溶於無菌生理食鹽水)，每週給藥一次，共處理4週；且載體控制組係單獨給予無菌生理食鹽水。在整個實驗期間，每兩週記錄腫瘤尺寸、體重、及死亡率。所有動物實驗方法皆由泉盛生物科技股份有限公司(Fountain Biopharma)的動物實驗管理小組(IACUC)批准並執行。
實驗結束(第71天)後，兩組腫瘤體積的差異係利用非成對t值測驗做統計分析。和載體控制組相比，TRZ-A01組對活體腫瘤生長表現出顯著的抑制效果。
如第10圖所示，在NCI-N87異種移植模式中，ADC A01的抗腫瘤活性明顯比載體控制組更加有效。在每7天處理一次，共4次的5 mg/kg TRZ-A01處理以抑制NCI-N87的腫瘤生長，數據顯示出腫瘤不但沒有成長，實際上反而縮小。相較之下，控制組的腫瘤持續成長。這個令人印象深刻的結果證明本發明抗體藥物複合體的功效。如此令人印象深刻的結果同樣可證明本發明抗體藥物複合體的每一個抗體分子上具有較多的承載物分子(即：在多數實施例中DAR為3.0以上)。藥物抗體比(DAR)表示在抗體藥物複合體中的每個抗體分子攜帶的藥物分子數目。在ADC複合體中，DAR數目可由MS質譜儀以每一種ADC的密度百分比為基準所計算出來。
上述結果清楚指出本發明的抗體藥物複合體是有效且專一的療效藥物。本發明部分實施例關於一種利用本發明ADC治療疾病或症狀的方法，其中ADC中的抗體單元可結合至特定標的，此時ADC中的藥物單元發揮其治療效果或細胞毒殺效果。
根據本發明實施例的方法可包括：將有效劑量的本發明ADC注入有治療需要的一主體。本技術領域中具有通常知識者可了解特定ADC的有效劑量須依照疾病種類、病人條件、給藥路徑等而調整。本技術領域中具有通常知識者不需創造性的努力即能夠決定出有效劑量。
本發明已經在有限的實施例下加以說明，本技術領域中具有通常知識者可從本發明所揭露內容得到啟發，在不背離於此揭露之本發明申請專利範圍之前提下推知其他可變化的實施方式。據此，本發明的範圍僅受限於所依附的申請專利範圍。
無
第1圖為本發明實施例之TRZ(天然賀癌平(Herceptin))、TRZ-N(F)(切醣後的賀癌平)、以及TRZ-NAS/TRZ-NKS(經具有兩個修飾過的雙分支醣基醣基化修飾的賀癌平)的SDS-PAGE實驗結果。第1道：標準品，第2道：TRZ，第3道：TRZ-N(F)，第4道：TRZ-NAS/TRZ-NKS。
第2圖為本發明實施例之TRZ-N、TRZ-NG及TRZ-NGKS(經醣基化修飾的賀癌平，具有兩個修飾過的單分支醣基)的質譜圖。頂圖：TRZ-N，中圖：TRZ-NG，底圖：TRZ-NGKS。
第3圖為本發明實施例之TRZ (A圖)、TRZ-NKS (B圖)及TRZ-NAS (C圖)的醣基分析圖(glycan mapping)。各醣基波峰係利用線上MS分析連接至具螢光檢測的HPLC所判定。A圖右邊的表格列舉出甘露糖-5(Man-5)醣基的含量，其係按照多寡排列。
第4圖為本發明實施例之接點專一性抗體藥物複合體(ADCs) 的SDS-PAGE實驗結果。第1道：標準品，第2道：TRZ-NKS，第3道：TRZ-A22。
第5圖為本發明實施例之接點專一性抗體藥物複合體(ADCs)的SDS-PAGE實驗結果。第1道：標準品，第2道：TRZ-NGKS，第3道：TRZ-A11-D2。
第6圖為本發明實施例之接點專一性抗體藥物複合體(ADCs) 與時間相關的SDS-PAGE實驗結果。第1道：標準品，第2道：TRZ-NKS，第3道：TRZ-A09 (反應時間：15分鐘)，第4道：TRZ-A09 (反應時間：30分鐘)，第5道：TRZ-A09 (反應時間：60分鐘)，第6道：TRZ-A09 (反應時間：120分鐘)。
第7圖為本發明實施例之TRZ-A22及TRZ-NKS的質譜圖。頂圖：TRZ-A22，底圖：TRZ-NKS。
第8圖為本發明實施例之TRZ-A01對HER2的結合親和力評估(比較組：Roche-TRZ)。
第9圖為本發明實施例之TRZ-A01(具有抗體或毒素)於HER2正表現細胞株BT474的細胞毒殺性實驗結果。
第10圖為本發明實施例之ADC A01於NCI-N87異種移植模式中的抗腫瘤活性實驗結果。以5 mg/kg TRZ-A01 Q7D x 4處理能夠抑制NCI-N87的腫瘤生長。數據係以平均值± 標準差表示之。「**」表示與載體控制組比較下P＜ 0.01。
Claims (8)
- 一種抗體藥物複合體(antibody-drug conjugate,ADC)，其包含如式(I)所示之結構或其藥學上可接受之鹽類：
，其中[Ab]表示該抗體的接點；以及[Cn]表示該複合單元的接點；以及 該複合單元係選自由：
、
、
之結構所組成之群組，其中Q係Y1+Y2連接基團(spacer group)，其中Y1和Y2係獨立選自由：直接鍵結、-(CH2)n-、-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-(CH2)nO-、-O(CH2)n-、-(CH2)n-C(O)-、-C(O)(CH2)n-、-(CH2)n-NH-、-NH-(CH2)n-、-(CH2)n-NHC(O)-、-C(O)(CH2)n-NHC(O)-、(CH2)nSCH2C(O)-、及-(CH2CH2O)m-所組成之群組；R3a係選自由：氫、鹵素、C1-C6烷基所組成之群組； R3b係獨立選自由：氫、鹵素、-NO2、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基、選擇性被取代之C1-C24環烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基及選擇性被取代之C7-C24芳烷基所組成之群組；R3c係獨立選自由：氫、鹵素、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C6-C24芳基及選擇性被取代之C7-C24芳烷基所組成之群組；R3d係獨立選自由：氫、鹵素、OH、-NO2、-CN、選擇性被取代之C1-C6烷基、選擇性被取代之C1-C6烷氧基所組成之群組；n為1至8的整數，亦包括1及8；m為1至4的整數，亦包括1及4；[G]表示該醣單元的接點；以及[L]表示該連結單元的接點；且該連結單元係選自由式(IV-1)、式(IV-4)、及式(IV-5)之結構所組成之群組：
- 如請求項1所述之抗體藥物複合體，其中該抗體結合至一標的，該標的係選自由：分化群19(Cluster of differentiation 19,CD19)、分化群22(CD22)、分化群27(CD27)、分化群30(CD30)、分化群33(CD33)、分化群37(CD37)、分化群70(CD70)、分化群74(CD74)、分化群79b(CD79b)、分化群138(CD138)、分化群142(CD142)、碳酸酐酶6(Carbonic anhydrase 6,CA6)、鈣黏素(p-Cadherin)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5,CEACAM5)、LY6/PLAUR結構域蛋白3(LY6/PLAUR Domain Containing 3,C4.4a)、Delta樣配體3(Delta-like 3,DLL3)、上皮生長因子受器(epidermal growth factor receptor,EGFR)、上皮生長因子受器VIII(pidermal growth factor receptor variant III,EGFRVIII)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3,ENPP3)、肝配蛋白A型受體2(ephrin type-A receptor 2,EphA2)、肝配蛋白A(EphrinA)、葉酸受體蛋白1(Folate Receptor 1,FLOR1)、纖維母細胞生長因子受體2(Fibroblast growth factor receptor,FGFR2)、鳥苷酸環化酶C(Guanylate cyclase,GCC)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase,cKIT)、雌激素調節蛋白1(Estrogen-Regulated Protein LIV1)、間皮素(Mesothelin,MSLN)、黏蛋白16(Mucin 16,MUC16)、鈉依 賴性磷酸鹽轉運蛋白2b(Sodium-dependent phosphate transport protein 2B,NaPi2b)、連接蛋白4(Nectin4)、跨膜醣蛋白神經介素蛋白B(Transmembrane glycoprotein neuromedin B,gpNMB)、前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)、SLIT及NTRK相似蛋白6(SLIT and NTRK-like protein 6,SLITRK6)、前列腺六跨膜上皮抗原1(six transmembrane epithelial antigen of the prostate,STEAP1)、滋養層細胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen,TROP2)、滋養層醣蛋白(Trophoblast glycoprotein,5T4)、階段特異性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4)、Globohexaosylceramide,GloboH)、五分子前趨醣脂質(Gb5)、(Sialyl-Tn,STn)及Tn所組成之群組。
- 如請求項1所述之抗體藥物複合體，其中該藥物單元係選自由：單甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E,MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F,MMAF)、單甲基澳瑞他汀D(Monomethyl auristatin D,MMAD)、美登素DM1/DM4(Mertansine,Maytansinoid DM1/DM4)、紫杉醇(Paclitaxel)、多西他賽(Docetaxel)、埃博黴素B(Epothilone B)、埃博黴素A(Epothilone A)、CYT997、澳瑞他汀酪胺磷酸鹽(Auristatin tyramine phosphate)、澳瑞他汀氨基喹啉(Auristatin aminoquinoline)、Halocombstatins、刺孢霉素θ(Calicheamicin theta)、7-乙基-10-羥基-喜樹鹼(SN-38)(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin(SN-38))、吡咯苯並二氮雜卓(Pyrrolobenzodiazepine,PBD)、水鬼蕉鹼(Pancratistatin)、環磷酸酯(Cyclophosphate)、Cribrostatin-6、Kitastatin、渦輪他汀1-4(Turbostatin 1-4)、海洛因他汀(Halocombstatins)、及Silstatins所組成之群組。
- 如請求項1所述之抗體藥物複合體，其中該抗體藥物複合體係利用一化合物所合成，該化合物係選自由下列A01至A24所組成之群組：
- 如請求項1至4任一項所述之抗體藥物複合體，其中一藥物抗體比(Drug-to-Antibody Ratio,DAR)為3以上。
- 一種如請求項1至5任一項所述之抗體藥物複合體用於製備藥物之用途，其中該藥物用以治療一癌症。
- 如請求項6所述之用途，其中該癌症為腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、胃癌、子宮頸癌、卵巢癌或前列腺癌。
- 如請求項7所述之用途，其中該癌症為乳癌或胃癌。
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