CN109991203A - 一种用于检测赭曲霉素a的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。本发明所述试剂盒包括AP链溶液、SP链溶液、b1链溶液、b2链溶液、c链溶液和链霉亲合素功能化磁性颗粒。本发明利用级联DNA链置换反应介导的核酸信号放大策略，实现了赭曲霉素A的灵敏检测。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒用于赭曲霉素A的检测，工作时间仅20min，最低检测线为0.056ng/mL。本发明提供的试剂盒用于赭曲霉素A的检测无需核酸工具酶的参与，且信号放大效率高、速度快，具有检测速度快、灵敏度高等优点。

Description

一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒及方法。
背景技术
赭曲霉素(Ochratoxin)是一类由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌种产生的基本结构为苯甲酸异香豆素的次级代谢产物，包含7种结构类似物。其中，赭曲霉素A(OchratoxinA,OTA)广泛存在于谷类、咖啡和酒类等农作物及相关产品中，具有致畸、致突变和致癌作用，是毒性最强和对人类健康威胁最大的一类赭曲霉素。因此，赭曲霉素A的检测在食品安全等领域具有十分重要的意义。目前常用的赭曲霉素A检测方法主要包括色谱法(如高效液相色谱、气相色谱-质谱联用等)、薄层层析发、酶联免疫吸附法等。这些方法虽然具有特异性强、灵敏性高等优点，但也存在操作繁琐、仪器设备昂贵、检测耗时长等缺陷。
核酸适体(aptamer)是利用指数富集配体系统进化技术(Systemic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment,SELEX)从人工构建的单链核酸分子文库中筛选得到的能够高亲和力和高特异性结合目标分子的寡聚核苷酸片段。2008年，Curz-Aguado等人成功筛选得到了赭曲霉素A的核酸适体，这为赭曲霉素A的检测打开了新局面。尤其是近年来，通过将核酸适体与赭曲霉素A的识别结合过程与核酸信号放大策略相偶联，一系列高检测灵敏性和特异性的赭曲霉素A检测方法得以建立。但是，这些方法往往需要核酸工具酶的参与，不仅增加了检测成本，而且延长了检测耗时。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种无须核酸工具酶参与的快速、灵敏的赭曲霉素A检测试剂盒及方法。
本发明提供了以下技术方案：
一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒，所述试剂盒包括AP链溶液、SP链溶液、b1链溶液、b2链溶液、c链溶液和链霉亲合素功能化磁性颗粒；
所述AP链溶液中的AP链为赭曲霉素A的核酸适体；所述AP链的3’端修饰有生物素基团；
所述SP链溶液中的SP链包括区域1和区域2，所述区域1与所述AP链存在互补碱基序列；所述区域2为级联DNA链置换反应的启动模块；
所述b1链溶液中的b1链3'端修饰有猝灭基团；
所述b2链溶液中的b2链5'端修饰有荧光基团；
所述c链溶液中的c链为游离单链；
所述b1链与所述b2链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述c链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述SP链区域2存在互补碱基序列；
赭曲霉素A与AP链的结合力＞AP链与SP链的结合力；
b1链与SP链的结合力＞b1链与b2链的结合力；
c链与b1链的结合力＞b1链与SP链的结合力。
优选的，所述AP链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SP链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，所述b1链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述b2链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，所述c链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
优选的，SP链和AP链碱基互补序列长度为12～16bp；b1链和b2链碱基互补序列长度为14～18bp。
优选的，所述AP链溶液或所述SP链溶液的浓度独立为20～50μmol/L；所述b1链溶液、b2链溶液或所述c链溶液的浓度独立为1～5μmol/L。
本发明还提供了上述试剂盒在定量检测赭曲霉素A中的应用方法。
优选的，所述应用包括如下步骤：
(1)将AP链溶液和SP链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到AP/SP双链溶液；
(2)将b1链溶液和b2链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到b1/b2双链溶液；
(3)将所述AP/SP双链溶液与链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液混合，25～30℃反应15～20min，得到AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液；
(4)将待测样品与所述AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液混合，25～30℃反应30～60min，磁分离弃磁性颗粒，得到上清液；
(5)将所述b1/b2双链溶液、c链溶液和所述上清液混合，0～5℃反应15～25min，得到b1/c双链溶液；
(6)测定所述b1/c双链溶液的荧光发生强度。
优选的，步骤(3)所述链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液的制备方法包括如下步骤：
①将链霉亲合素功能化磁性颗粒与磷酸盐缓冲液混合，磁分离弃溶液，得到清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒；
②将所述清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒重悬于磷酸盐缓冲液中，得到链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为9～11mmol/L，pH值为7.4～7.6。
优选的，步骤(6)所述测定的实验条件为：激发波长490nm，发射波长扫描范围510～600nm。
有益效果：本发明提供了一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒，所述试剂盒包括AP链溶液、SP链溶液、b1链溶液、b2链溶液、c链溶液和链霉亲合素功能化磁性颗粒。本发明利用级联DNA链置换反应介导的核酸信号放大策略，实现了赭曲霉素A的灵敏检测。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒用于赭曲霉素A的检测，工作时间仅20min，最低检测线为0.056ng/mL。本发明提供的试剂盒用于赭曲霉素A的检测，无需核酸工具酶的参与，且信号放大效率高、速度快，具有检测速度快、灵敏度高等优点。
附图说明
图1为本发明所述赭曲霉素A检测原理示意图；
图2为本发明实施例1所述赭曲霉素A特异性识别结合的验证结果图；
图3为本发明实施例2检测200ng/mL赭曲霉素A以及对照样品时所得到的荧光光谱图；
图4为本发明实施例2检测0和200ng/mL赭曲霉素A时溶液最终在518nm处的荧光发射强度(F518)随时间的变化情况图；
图5包括图5-A和图5-B；其中，图5-A为检测不同浓度赭曲霉素A时得到的荧光光谱图；图5-B为溶液最终的F518随赭曲霉素A浓度的变化情况图；
图6为本发明实施例3所述干扰物质存在条件下赭曲霉素A的荧光检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒，所述试剂盒包括AP链溶液、SP链溶液、b1链溶液、b2链溶液、c链溶液和链霉亲合素功能化磁性颗粒；
所述AP链溶液中的AP链为赭曲霉素A的核酸适体；所述AP链的3’端修饰有生物素基团；
所述SP链溶液中的SP链包括区域1和区域2，所述区域1与所述AP链存在互补碱基序列；所述区域2为级联DNA链置换反应的启动模块；
所述b1链溶液中的b1链3'端修饰有猝灭基团；
所述b2链溶液中的b2链5'端修饰有荧光基团；
所述c链溶液中的c链为游离单链；
所述b1链与所述b2链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述c链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述SP链区域2存在互补碱基序列；
赭曲霉素A与AP链的结合力＞AP链与SP链的结合力；
b1链与SP链的结合力＞b1链与b2链的结合力；
c链与b1链的结合力＞b1链与SP链的结合力。
如图1所示，本发明采用的机理如下：
(1)设计两条DNA单链AP和SP，其中AP是赭曲霉素A的核酸适体(备注：核酸适体是人工筛选的能够与靶标分子特异性识别结合的单链核酸)且3'末端修饰有生物素基团，SP的一部分序列(区域1)与AP部分序列碱基互补，另一部分序列(区域2)可以作为级联DNA链置换反应的启动模块；在初始状态下，AP和SP在溶液中杂交形成双链，并通过生物素与链霉亲和素之间的结合反应共价修饰到链霉亲和素功能化磁性颗粒表面。
(2)另外设计三条参与级联DNA链置换反应的DNA探针b1、b2和c，其中b1链3'末端修饰有淬灭基团，b2链5'末端修饰有荧光基团，且b1和b2、b1和c分别存在部分碱基序列互补；在初始状态下，c以单链形式游离存在，b1和b2在溶液中杂交形成双链，导致荧光基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，荧光发射微弱。
(3)当检测体系中存在赭曲霉素A时，赭曲霉素A能够与磁性颗粒表面修饰的AP链发生特异性识别结合，导致AP/SP双链发生解链，SP链脱离磁性颗粒表面；磁性分离后，SP链保留在溶液中，此时，若向溶液中加入b1/b2双链和c链，级联DNA链置换反应得以发生。具体过程为：以SP链的区域2序列为启动模块，以b1/b2双链中b1链(区域3)末端暴露的若干个碱基为支点，SP链将b1/b2双链中的b2链置换下来，形成SP/b1双链；随后，以c链为启动模块，以新形成的SP/b1双链中b1链(区域4)末端暴露的若干个碱基为支点，c链将SP/b1双链中的SP链置换下来，形成b1/c双链；重新被置换出来的SP链可以进一步启动下一轮的级联DNA链置换反应；最终，溶液中产生大量的b1/c双链，荧光基团和淬灭基团在空间上彼此远离，荧光发射强。
(4)当检测体系中不存在赭曲霉素A时，AP/SP双链无法发生解链，磁性分离后，SP链未被保留在溶液中，此时，若向溶液中加入b1/b2双链和c链，级联DNA链置换反应不能发生；最终，溶液中存在大量的b1/b2双链，荧光基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，荧光发射微弱。
(5)通过测定溶液最终的荧光发射强度，可以实现赭曲霉素A的定量检测。
在本发明中，所述所述AP链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示；所述SP链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示。在本发明中，SEQ ID No.1所示序列是已知的赭曲霉素A的核酸适体序列；SEQ ID No.2所示序列并非已知序列，而是根据本发明的原理随机设计而成，其基本原则是：首先，SP链一部分序列能够与AP链形成双链结构，另一部分序列可以作为级联DNA链置换反应的启动模块；其次，为了保证赭曲霉素A与核酸适体结合能够导致AP/SP双链发生解链，SP链和AP链碱基互补序列长度优选为12～16bp。
在本发明中，所述所述b1链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3所示；所述b2链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示。在本发明中，SEQ ID No.3所示序列和SEQ ID No.4所示序列并非已知序列，而是根据本发明的原理随机设计而成，其基本原则是：①b1与b2链能够形成双链结构；②b1/b2双链可以为SP链提供优选由5～8个碱基组成的支点区域以发生链置换反应，形成SP/b1双链；③SP/b1双链为可以为c链提供优选由5～8个碱基组成的支点区域以发生链置换反应，形成b1/c双链；④为了保证DNA链置换反应的效率，b1链和b2链碱基互补序列长度优选为14～18bp。
在本发明中，所述c链的核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示。在本发明中，SEQ IDNo.5所示序列并非已知序列，而是根据本发明的原理随机设计而成，其基本原则是：首先，c链无法与b1/b2双链发生链置换反应；其次，c链能够与SP/b1双链发生链置换反应，形成b1/c双链；再次，b1/c双链能够在溶液中稳定存在，不能与其他DNA探针链发生反应。
在本发明中，所述AP链溶液或所述SP链溶液的浓度独立优选为20～50μmol/L；所述b1链溶液、b2链溶液或所述c链溶液的浓度独立优选为1～5μmol/L。
本发明还提供了一种定量检测赭曲霉素A的方法，包括如下步骤：
(1)将AP链溶液和SP链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到AP/SP双链溶液；
(2)将b1链溶液和b2链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到b1/b2双链溶液；
(3)将所述AP/SP双链溶液与链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液混合，25～30℃反应15～20min，得到AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液；
(4)将待测样品与所述AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液混合，25～30℃反应30～60min，磁分离弃磁性颗粒，得到上清液；
(5)将所述b1/b2双链溶液、c链溶液和所述上清液混合，0～5℃反应15～25min，得到b1/c双链溶液；
(6)测定所述b1/c双链溶液的荧光发生强度。
在本发明中，步骤(3)所述链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液的制备方法优选包括如下步骤：
①将链霉亲合素功能化磁性颗粒与磷酸盐缓冲液混合，磁分离弃溶液，得到清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒；
②将所述清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒重悬于磷酸盐缓冲液中，得到链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液。
所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为9～11mmol/L，更优选为10mmol/L；pH值优选为7.4～7.6，更优选为7.5。
在本发明中，步骤(6)所述测定的实验条件优选为：激发波长490nm，发射波长扫描范围510～600nm。
在本发明中，所述定量检测赭曲霉素A的方法优选包括如下步骤：
(a)配置AP/SP双链溶液，具体过程为：取DNA探针AP和SP的储备液按1:1的摩尔比置于微量管中，混合均匀后置于90～95℃水浴中反应5～10分钟，自然冷却到室温；所使用的AP和SP储备液的浓度为20～50μM，体积分别为5μL。
(b)配置b1/b2双链溶液，具体过程为：取DNA探针b1和b2的储备液按1:1的摩尔比置于微量管中，混合均匀后置于90～95℃水浴中反应5～10分钟，自然冷却到室温；所使用的b1和b2储备液的浓度为1～5μM，体积分别为10μL。
(c)制备AP/SP双链修饰的磁性颗粒，具体过程为：取5μL商品化的链霉亲和素功能化磁性颗粒置于微量管中，加入95μL 10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.5)，充分混合洗涤后进行磁性分离，弃去溶液；重复上述洗涤过程三次后，将磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH7.5)中；随后，向重悬液中加入2.5～5μL步骤(a)所得AP/SP双链溶液，充分混合后在25～30℃条件下反应15～20分钟，以实现AP/SP双链在链霉亲和素磁性颗粒表面的修饰；反应完成后，使用10mM PBS(pH 7.5)洗涤磁性颗粒三次，弃去溶液，将得到的AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中。
(d)将10μL含赭曲霉素A的样品溶液加入步骤(c)所得溶液中，充分混合后进行反应，反应温度为25～30℃，反应时间为0.5～1小时；反应完成后，使用100μL 10mM PBS(pH7.5)洗涤磁性颗粒，重复三次，最后弃去磁性颗粒，保留上清溶液。
(e)将20μL步骤(b)所得b1/b2双链溶液和20μL 1～5μM c链溶液加入步骤(d)所得的上清溶液中，通过机理(3)介绍的级联DNA链置换反应，形成大量的b1/c双链；反应温度为0～5℃，反应时间为15～25分钟；反应结束后，测定溶液最终的荧光发射强度，实现对赭曲霉素A的检测。
下面将结合实施例对本发明提供的技术方案进行清楚、完整地描述。应当注意，下面所列举的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
赭曲霉素A特异性识别结合的验证，其步骤如下：
(a)分别取5μL浓度为20μM DNA探针AP和SP(荧光标记)链的储备液置于微量管中，混合均匀后置于95℃水浴中反应5分钟，自然冷却到室温。
(b)取5μL商品化的链霉亲和素功能化磁性颗粒置于微量管中，加入95μL 10mMPBS(pH 7.5)，充分混合洗涤后进行磁性分离，弃去溶液；重复上述洗涤过程三次后，将磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中；随后，向重悬液中加入5μL步骤(a)所得AP/SP双链溶液，充分混合后在25℃条件下反应20分钟；反应完成后，使用10mM PBS(pH 7.5)洗涤磁性颗粒三次，弃去溶液，将得到的AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中。
(d)将10μL含200ng/mL赭曲霉素A的样品溶液加入步骤(b)所得溶液中，充分混合后在25℃条件下反应30分钟；反应完成后，使用100μL 10mM PBS(pH 7.5)洗涤磁性颗粒，重复三次，弃去溶液，将得到的磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中并进行流式细胞术分析，具体参数为：所用仪器是CytoFLEX S流式细胞仪，分析通道是FAM/FITC通道(488nm激发波长)。
相关寡核苷酸DNA链序列如下：
AP链：5'-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-生物素-3'。
SP(荧光标记)链：5'-atgctccctttacgcaaaaactctaataacttacctct-FAM-3'。
结果如图2所示。图2中，实验体系a未加入赭曲霉素A，此时，磁性颗粒有较强的荧光发射，这证明荧光标记的SP链已经通过与AP链的杂交以及生物素-链霉亲和素之间的反应成功修饰至磁性颗粒表面；实验体系b中则含有1.0ng/mL赭曲霉素A，从图中可以看出，此时，磁性颗粒的荧光发射仅与对照组(实验体系c，未修饰DNA链的链霉亲和素功能化磁性颗粒)相当，这说明荧光标记的SP链已经脱离磁性颗粒表面。以上结果表明：修饰在磁性颗粒表面的AP链能够特异性地识别结合赭曲霉素A，导致AP/SP双链发生解链，SP链脱离磁性颗粒表面。
实施例2
赭曲霉素A的定量检测，其步骤如下：
(a)分别取5μL浓度为20μM DNA探针AP和SP链的储备液置于微量管中，混合均匀后置于95℃水浴中反应5分钟，自然冷却到室温。
(b)分别取10μL浓度为1μM的DNA探针b1和b2链的储备液置于微量管中，混合均匀后置于95℃水浴中反应5分钟，自然冷却到室温。
(c)取5μL商品化的链霉亲和素功能化磁性颗粒置于微量管中，加入95μL 10mMPBS(pH 7.5)，充分混合洗涤后进行磁性分离，弃去溶液；重复上述洗涤过程三次后，将磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中；随后，向重悬液中加入5μL步骤(a)所得AP/SP双链溶液，充分混合后在25℃条件下反应20分钟；反应完成后，使用10mM PBS(pH 7.5)洗涤磁性颗粒三次，弃去溶液，将得到的AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬于100μL 10mM PBS(pH 7.5)中。
(d)将10μL含不同浓度赭曲霉素A的样品溶液加入步骤(c)所得溶液中，充分混合后在25℃条件下反应30分钟；反应完成后，使用100μL 10mM PBS(pH 7.5)洗涤磁性颗粒，重复三次，最后弃去磁性颗粒，保留上清溶液。
(e)将20μL步骤(b)所得b1/b2双链溶液和20μL 1μM c链溶液加入步骤(d)所得的上清溶液中，4℃条件下反应20分钟，形成大量的b1/c双链；反应结束后，以490nm为激发波长，在510～600nm范围内测定溶液最终的荧光发射强度，实现对赭曲霉素A的检测。
相关寡核苷酸DNA链序列如下：
AP链：5'-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-生物素-3'。
SP链：5'-atgctccctttacgcaaaaactctaataacttacctct-3'。
b1链：5'-agaggtaagttattagagcaga-FAM-3'
b2链：5'-Dabcyl-ctgctctaataactta-3'
c链：5'-ttctgctctaataacttacc-3'
结果如图3～5所示。
图3显示了本方法用于检测200ng/mL赭曲霉素A时所得到的荧光光谱，以及在一系列对照试验中所得到的荧光光谱。如图3所示，当体系中存在赭曲霉素A时，溶液在518nm附近有一个明显的荧光发射峰(图3a)；而在空白对照组，溶液在518nm附近仅有一个很小的背景发射峰(图3b)。同时，本发明使用一条只包含AP互补序列而没有级联DNA链置换反应模块序列的SP’链(序列为5'-atgctccctttacgcaaaaa-3')取代SP链进行了对照实验，发现这种情况下溶液最终在518nm附近的荧光发射也十分微弱(图3c)。上述结果证明，赭曲霉素A能够引起溶液最终在518nm附近荧光发射的显著增强，且这种增强作用来源于SP链启动的级联DNA链置换反应过程。也就是说，本发明提供的方法可以用于赭曲霉素A的荧光检测。
图4显示了本方法分别用于检测0和200ng/mL赭曲霉素A时溶液最终在518nm处的荧光发射强度(F518)随时间的变化情况。如图4所示：当体系中不存在赭曲霉素A时，SP链无法游离至溶液中，此时，b1/b2双链和c单链难以发生反应，F520基本保持不变(图4a)；当体系中存在200ng/mL赭曲霉素A时，SP链游离至溶液中，级联DNA链置换反应得以发生，F518随着时间增加而逐渐增大(图4b)。更重要的是，F518在20分钟后基本保持不变，说明几乎所有的荧光发射微弱的b1/b2双链转换成了荧光发射强的b1/c双链，说明本方法中设计的级联DNA链置换反应具有极强的信号放大速度。
图5-A显示了检测不同浓度赭曲霉素A时得到的荧光光谱。如图5-A所示，随着赭曲霉素A浓度的增加，溶液最终在518nm处的荧光发射也逐渐增强。这是合理的，因为越多的赭曲霉素A会引起越来越多的SP链脱离磁珠表面，因而可以更加高效地触发级联DNA链置换反应，导致更多的b1/b2双链最终转换成b1/c双链。
图5-B显示了溶液最终的F518随赭曲霉素A浓度的变化情况，从图5-B中可以看出，在0.1ng/mL至200ng/mL范围内，溶液最终的F518随赭曲霉素A浓度的增加而增大。另外，从图5B内嵌图中可以看出：溶液最终的F518与赭曲霉素A浓度的对数值(lgCOTA)在0.1ng/mL至120ng/mL范围呈线性相关，线性方程是F518＝1008lgCOTA+425(R2＝0.994)。根据线性方程计算得到本方法用于检测赭曲霉素A的检测限为0.056ng/mL，优于现有的绝大多数荧光检测方法。
实施例3
干扰物质存在条件下赭曲霉素A的荧光检测
食品样品中存在的其他真菌毒素可能会对赭曲霉素A的检测造成干扰。为了考察本方法用于赭曲霉素A检测的特异性和抗干扰能力，本实施例将120ng/mL赭曲霉素A分别与120ng/mL赭曲霉素B、赭曲霉素C、黄曲霉毒素B1、玉米烯酮混合，并按照实施例2中的步骤进行荧光检测。结果如图6所示。图6表明：干扰真菌毒素的存在并不会引起赭曲霉素A检测信号的变化，说明本方法具有很好的特异性和抗干扰性。
实施例4
以白酒为实际样本的赭曲霉素A荧光检测
为了研究本发明建立的荧光方法用于实际样本中赭曲霉素A检测的可行性，本实施例将不同浓度的赭曲霉素A溶解于白酒中制备得到白酒样品(加入赭曲霉素A浓度分别为2ng/mL、20ng/mL和40ng/mL)，并按照实施例2中的步骤进行荧光检测。如表1所示，白酒样品中赭曲霉素A检测的回收率为98.0～104.5％，表明该方法能够满足实际样本分析的需要。
表1白酒样品中检测赭曲霉素A的回收率
实施例5
将本发明提供的方法与已有的基于核酸适体和核酸信号放大策略的荧光方法进行比较，结果如表2所示。表2显示：本方法无须核酸工具酶的参与、具有更快的分析速度和更低的检测限。
表2基于核酸适体和核酸信号放大策略的赭曲霉素A荧光检测方法的比较
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海大学
<120> 一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctccctt tacgcaaaaa ctctaataac ttacctct 38
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggtaagt tattagagca ga 22
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgctctaat aactta 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttctgctcta ataacttacc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgctccctt tacgcaaaaa 20

Claims (10)

1.一种用于检测赭曲霉素A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括AP链溶液、SP链溶液、b1链溶液、b2链溶液、c链溶液和链霉亲合素功能化磁性颗粒；
所述AP链溶液中的AP链为赭曲霉素A的核酸适体；所述AP链的3’端修饰有生物素基团；
所述SP链溶液中的SP链包括区域1和区域2，所述区域1与所述AP链存在互补碱基序列；所述区域2为级联DNA链置换反应的启动模块；
所述b1链溶液中的b1链3'端修饰有猝灭基团；
所述b2链溶液中的b2链5'端修饰有荧光基团；
所述c链溶液中的c链为游离单链；
所述b1链与所述b2链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述c链存在互补碱基序列；
所述b1链与所述SP链区域2存在互补碱基序列；
赭曲霉素A与AP链的结合力＞AP链与SP链的结合力；
b1链与SP链的结合力＞b1链与b2链的结合力；
c链与b1链的结合力＞b1链与SP链的结合力。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述AP链的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SP链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述b1链的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述b2链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述c链的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SP链和AP链碱基互补序列长度为12～16bp；b1链和b2链碱基互补序列长度为14～18bp。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述AP链溶液或所述SP链溶液的浓度独立为20～50μmol/L；所述b1链溶液、b2链溶液或所述c链溶液的浓度独立为1～5μmol/L。
7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒在定量检测赭曲霉素A中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将AP链溶液和SP链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到AP/SP双链溶液；
(2)将b1链溶液和b2链溶液按1：1的溶质摩尔比混合，90～95℃水浴反应5～10min，得到b1/b2双链溶液；
(3)将所述AP/SP双链溶液与链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液混合，25～30℃反应15～20min，得到AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液；
(4)将待测样品与所述AP/SP双链修饰的磁性颗粒重悬液混合，25～30℃反应30～60min，磁分离弃磁性颗粒，得到上清液；
(5)将所述b1/b2双链溶液、c链溶液和所述上清液混合，0～5℃反应15～25min，得到b1/c双链溶液；
(6)测定所述b1/c双链溶液的荧光发生强度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液的制备方法包括如下步骤：
①将链霉亲合素功能化磁性颗粒与磷酸盐缓冲液混合，磁分离弃溶液，得到清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒；
②将所述清洗后的链霉亲合素功能化磁性颗粒重悬于磷酸盐缓冲液中，得到链霉亲合素功能化磁性颗粒的重悬液。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(6)所述测定的实验条件为：激发波长490nm，发射波长扫描范围510～600nm。
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