CN109985583B - 一种磁性荧光编码微球的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种磁性荧光编码微球的制备方法及其应用,该制备方法包括以下步骤:S1、制备未经改性的荧光磁性编码聚合物微球;S2、通过氧化所述聚合物微球,增加所述聚合物微球表面的羧基密度,改变所述聚合物微球表面特性。通过氧化荧光磁性编码聚合物微球,对聚合物微球表面进行改性,氧化时利用聚合物微球表面的双键,通过过氧自由基通过重排产生酸,从而产生羧基,增加聚合物微球表面的羧基密度,这样,经过表面改性的荧光磁性编码聚合物微球能够高效地结合大量的抗体蛋白分子,将抗体连接在微球表面以用于体外检测,通过特异性结合经连接标记物标记的蛋白分子,能够实现相应的检测功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域,特别是涉及一种磁性荧光编码微球的制备方法及其应用。
背景技术
在生物医学检测领域,最初发展的固相生物芯片技术在分析高浓度待测物方面有重要影响,但它在反应速度、定量检测和灵活性方面受到限制。为了解决这些问题,基于编码微球检测待测物的液相悬浮检测被发展,它有快的结合动力学、目标物检测的灵活性和高质量检测结果等优点。但是传统液相生物芯片分析结果会受到操作难度大,后期检测设备昂贵等问题。
随着计算机计算能力的提升,图像检测技术快速发展,成本迅速降低。借助于计算机技术将液相生物流式检测转换为图像检测,不仅仅降低了悬浮检测的成本,而且使得实验结果以图像形式呈现,更为直观准确。同时具有荧光和磁性的双功能微球促进了高效检测和分选。磁性荧光聚合物微球具有磁性和荧光性质,打破了单一性质的限制,荧光可以用来进行生物标记,超顺磁性可以进行固定分离富集,将检测物质固定在显像板,从而实现向图像检测的转换。
荧光磁性聚合物微球的合成方法主要有层层自组装法、包埋法、聚合法、溶剂溶胀法、原位合成法以及偶联法。上述的聚合物微球合成方法受到反应条件的制约,包括ph值,反应产物,还有产物会对环境有害。
如何将探针分子结合到微球上是悬浮检测中关键的一部分。聚合物微球表面连接抗体蛋白分子需要相应的结合位点,在以往的方法中可以利用聚合物微球本身的分解得到相应的结合位点,或者可以通过层层组装的方法获得新的结合位点。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足,提供。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种磁性荧光编码微球的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备未经改性的荧光磁性编码聚合物微球;
S2、通过氧化所述聚合物微球,增加所述聚合物微球表面的羧基密度,改变所述聚合物微球表面特性。
进一步地:
所述聚合物微球为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)微球。
步骤S2中使用臭氧氧化所述聚合物微球表面。
步骤S2还包括通过X射线光电子能谱分析检测所述聚合物微球表面O原子和C原子的变化曲线,并控制反应时间,以监测和控制微球表面羧基的增加。
步骤S1中利用微流控装置制备所述荧光磁性编码聚合物微球。
步骤S1中,以亲水性聚乙二醇二丙烯酸酯作为分散相,其含有适当的mPEG修饰的QDs和磷酸PEG修饰的磁颗粒,并在所述分散相中加2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-40-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)作为光引发剂;在十六烷中溶解表面活性剂以制备连续相;将分散相和连续相流体引入微流控装置,获得含有初级的聚合物微球的单体乳液,采用紫外光对所述单体乳液液滴进行原位光聚合。
在步骤S2之前还包括:通过外加磁场对步骤S1制备的荧光磁性编码聚合物微球进行富集筛选。
通过加磁场和改变磁场的方向轻微改动聚合物微球中磁颗粒的位置,使得其趋于聚合物微球中一边;通过改变聚合物微球中磁颗粒的位置以减少荧光的淬灭。
在载玻片加上磁场,加入含有荧光磁性编码微球的悬浮液,所述悬浮液通过磁场时候,磁性编码微球被固定在所述载玻片上,而未磁性编码微球随着所述悬浮液流过所述载玻片。
一种如所述的制备方法制备的磁性荧光编码微球的应用,包括以下步骤:
将抗体蛋白分子连接到经表面改性的所述磁性荧光编码微球上,优选地,连接的过程包括将所述磁性荧光编码微球和所述抗体蛋白分子在缓冲液中进行脱水缩合;
将经荧光标记的抗体和与所述磁性荧光编码微球连接的所述抗体蛋白分子特异性结合,将荧光标记物标记到所述磁性荧光编码微球上;
通过荧光显微镜成像,检测荧光标记物,以检测所述磁性荧光编码微球的特异性。
本发明具有如下有益效果:
本发明提出了一种磁性荧光编码微球的制备方法,对于采用荧光和磁颗粒对聚合物微球进行编码得到荧光磁性编码聚合物微球,通过氧化荧光磁性编码聚合物微球,对聚合物微球表面进行改性,氧化时利用聚合物微球表面的双键,通过过氧自由基通过重排产生酸,从而产生羧基,增加聚合物微球表面的羧基密度,这样,经过表面改性的荧光磁性编码聚合物微球能够高效地结合大量的抗体蛋白分子,将抗体连接在微球表面以用于体外检测,通过特异性结合经连接标记物标记的蛋白分子,能够实现相应的检测功能。本发明中可先利用磁场对荧光磁性编码聚合物微球进行富集,再在荧光显微镜下观察不同聚合物微球,通过图像检测方法对微球解码,实现在悬浮检测方面的应用。
优选的方案中,采用微流控装置和原位光聚合技术,制备均匀、尺寸可控的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)微球。优选的方案中采用臭氧氧化。PEGDA聚合物微球表面有大量的双键,利用臭氧氧化可以获得大量的羧基,可结合大量的抗体蛋白分子用于体外检测,实现生物检测上的应用。
采用微流控制备微球的方法,可以制备大小可控且均一、磁颗粒分布均匀的编码微球。利用微流控装置,可将含有标记物的溶液剪切成聚合物微球,通过聚合物微球表面改性,将抗体连接在微球表面,从而实现相应的检测功能。
附图说明
图1为本发明实施例中的荧光磁性编码微球在荧光显微镜下的图像;
图2为本发明实施例中的荧光磁性编码微球磁响应特性分析;
图3为本发明实施例中的荧光磁性编码微球磁颗粒对荧光特性影响;
图4为本发明实施例中的荧光磁性编码微球磁性筛选及成像过程;
图5为本发明实施例中的聚合物微球表面氧化后X射线光电子能谱分析图;
图6为本发明实施例中的聚合物微球特异性结合荧光标记的蛋白分子后的荧光强度及荧光显微镜下图像;
图7为本发明磁性荧光编码微球制备方法的基本流程图。
图8为本发明实施例中的微球制备流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是,下述说明仅仅是示例性的,而不是为了限制本发明的范围及其应用。
参阅图7和图8,在一种实施例中,一种磁性荧光编码微球的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备未经改性的荧光磁性编码聚合物微球4,如图8所示;
S2、通过氧化所述荧光磁性编码聚合物微球4,增加所述聚合物微球表面的羧基密度,改变所述聚合物微球表面特性。
在优选的实施例中,所述聚合物微球为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)微球。
在优选的实施例中,步骤S2中使用臭氧氧化所述聚合物微球表面。
在更优选的实施例中,步骤S2还包括通过X射线光电子能谱分析检测所述聚合物微球表面O原子和C原子的变化曲线,并控制反应时间,以监测和控制微球表面羧基的增加。
在优选的实施例中,步骤S1中利用微流控装置制备所述荧光磁性编码聚合物微球。
在更优选的实施例中,步骤S1中,以亲水性聚乙二醇二丙烯酸酯作为分散相,其含有适当的mPEG修饰的QDs和磷酸PEG修饰的磁颗粒,并在所述分散相中加2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-40-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)作为光引发剂;在十六烷中溶解表面活性剂以制备连续相;将分散相A和连续相B流体引入微流控装置,获得含有初级的聚合物微球的单体乳液,采用紫外光对所述单体乳液液滴进行原位光聚合。
在优选的实施例中,在步骤S2之前还包括:通过外加磁场对步骤S1制备的荧光磁性编码聚合物微球进行富集筛选。
在更优选的实施例中,通过加磁场和改变磁场的方向轻微改动聚合物微球中磁颗粒的位置,使得其趋于聚合物微球中一边;通过改变聚合物微球中磁颗粒的位置以减少荧光的淬灭。
在更优选的实施例中,在载玻片5加上磁场3,加入含有荧光磁性编码微球的悬浮液,所述悬浮液通过磁场时候,磁性编码微球被固定在所述载玻片5上,而未磁性编码微球随着所述悬浮液流过所述载玻片5。
一种如所述的制备方法制备的磁性荧光编码微球的应用,包括以下步骤:
将抗体蛋白分子连接到经表面改性的所述磁性荧光编码微球上,优选地,连接的过程包括将所述磁性荧光编码微球和所述抗体蛋白分子在缓冲液中进行脱水缩合;
将经荧光标记的抗体和与所述磁性荧光编码微球连接的所述抗体蛋白分子特异性结合,将荧光标记物标记到所述磁性荧光编码微球上;
通过荧光显微镜成像,检测荧光标记物,以检测所述磁性荧光编码微球的特异性。
在典型的实施例中,本发明磁性荧光编码微球的制备方法可包括以下步骤:
步骤一:制备大小均一、形貌相似的聚合微球。可利用微流控装置制备大小均一的荧光磁性编码微球,并可用荧光显微镜、荧光分度计进行表征聚合物微球。
图1所示为微球制备流程示意图。
荧光量子点修饰:在1ml QDs溶液中加入2ml甲醇,高速离心10000r/min。将离心后的溶液,除去上清液。加入5mg mPEG-SHg和3ml的二氯甲烷溶液,在摇床上震荡24h。溶液通风处内干燥后,加入2mlPEGDA溶液,超声1min,在摇床上震荡8h。
超顺磁颗粒修饰:因此取1ul的P10EO(PEO 10OH-terminated phosphonic acid)放置于充满酒精的10ml试管,再取1g四氧化三铁纳米颗粒放置于试管中,强力机械搅拌5min,超声10min,再放入机械旋转摇床匀速旋转反应12小时;反应后通过磁分离选出修饰后的四氧化三铁纳米颗粒,溶于1ml的PEGDA中,再进行强力机械搅拌5min,超声10min,之后放入旋转机械摇床中匀速反应8小时,既得到PEGDA/Fe3O4磁流体。在步骤一制备微球过程中。
利用步骤一中使用的标记物,在有磁场的情况下,磁颗粒标记的聚合物微球会被筛选出来;在特定波长激光激发的情况下,荧光标记的聚合物微球会呈现不同的颜色,可以经过图片处理,识别不同荧光微球。
步骤二:对荧光磁性编码微球磁性进行富集筛选,在磁场下,将磁性荧光微球固定在载玻片上。可通过图像检测分析微球。可分析微球的荧光和磁响应特性。
步骤三:氧化聚合物微球表面,优选利用臭氧氧化,增加微球表面羧基密度,改变聚合物微球表面特性。
步骤四:聚合物微球连接蛋白分子。可将表面改性的聚合物微球和蛋白分子在缓冲液中进行脱水缩合。
步骤五:抗原抗体特异性检测。利用荧光标记的抗体和聚合物微球连接的蛋白分子特异性结合,将荧光标记物标记到聚合物微球上。通过荧光显微镜成像,可以检测不同荧光标记物,以检测聚合物微球的特异性。
以下进一步描述具体实施例的制备方法和应用过程。
1、磁性荧光编码微球的制备及特性分析
(1)分散相为亲水性聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda,mw 250,Sigma-aldrich),含有适当的mPEG修饰的QDs和磷酸PEG修饰的磁颗粒,在分散相中加2-hydroxy-40-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone(98%,mw 224,tci)作为光引发剂,在十六烷(99%,Sigma-Aldrich)中溶解4wt%的表面活性剂(em 90,abil)制备连续相,并通过聚四氟乙烯管将分散连续流体引入微流控装置。流量控制采用两台注射器泵。采用紫外光对单体乳液液滴进行原位光聚合,最终产物保存在真空中,在烘箱中干燥一夜(50℃左右,0.1MPa左右)。最后获得的多种编码聚合物微球。磁性荧光编码过程可以参阅图8,紫外光2和磁场3两者几乎同时进行的,此时还未固化完全,而磁场3提供微球中磁颗粒的驱动。
(2)当使用磁铁作为外加磁场后,对均匀分散在乙醇溶液中的四氧化三铁纳米颗粒进行吸附,磁颗粒发生强烈响应,向磁铁方向运动,该响应时间很短。可以利用超顺磁纳米颗粒的磁响应,在微球固化前期,通过加磁场和改变磁场的方向可以轻微改动微球中磁颗粒的位置,使得其趋于一边,如图2中的(a)和(b)所示。如图2中的(e)和(f)的磁滞回线所示,磁颗粒的质量比为1%,磁化强度也约为1%,如图2中的(e)、(f)所示。利用磁颗粒良好的磁响应,可以实现对于微球的驱动,将磁铁置于左下和底部,可以得到图2中的(c)、(d)。磁颗粒本身对于激发荧光有淬灭的作用,如图3中的(a)所示,通过改变磁颗粒的位置可以减少荧光的淬灭,如图3中的(b)所示,有利于荧光检测。
其中用于标记微球的四氧化三铁纳米颗粒,该磁颗粒具有良好的磁响应,即使溶液中荧光磁性编码微球浓度很低,在通过有磁场的载玻片时,磁性编码的微球会被吸附在玻片上,随着流过的微球变多,玻片上的微球逐渐变多,富集在玻片上;在有磁性编码微球和没有磁性编码微球的混合溶液中,加磁场后,具有磁性编码的微球会迅速被筛选出来。
(3)参见图8,利用磁颗粒的磁响应,可以对微球进行富集作用,对已经固化的磁性荧光聚合物微球通过载玻片5时再加上磁场,此时磁场是为了将微球富集,固定在载玻玻片上。筛选出磁颗粒编码的微球,如图4中的(a)所示。如图4中的(b)所示,在载玻片加上磁场之后,加入荧光磁性编码微球的悬浮液,悬浮液体通过磁场时候,磁性编码微球会被固定在载玻片上,而没有磁性编码微球会随着悬浮液流过。通过荧光显微镜可以得到相应的激发荧光图像,从而利用计算机实现图像检测。
2、聚合物微球的表面改性及其生物检测
(1)使用臭氧发生器,搭建臭氧与PEGDA聚合物微球的反应装置,同时控制反应时间。利用X射线光电子能谱分析,可以测试氧化后聚合物微球表面O原子和C原子的变化曲线,以此推断出微球表面羧基的增加,如图5中的(a)至(f)所示。图5中的(a)谱线表示臭氧氧化前样品1xps全谱;(b)谱线表示臭氧氧化后样品2xps全谱;(c)谱线表示臭氧氧化前样品1C原子xps窄谱;(d)谱线表示臭氧氧化后样品2C原子xps窄谱;(e)谱线表示臭氧氧化前样品1O原子xps窄谱;(f)谱线表示臭氧氧化后样品2O原子xps窄谱。
(2)连接抗体蛋白分子具体步骤:
第一步:磁球的洗涤。用分析天平称取5mg经过臭氧氧化的量子点磁性编码微球,加入浓度为50mM,pH=5.1的MES缓冲液(含有0.03%的SDS)浸洗数次,用pH=6的MES溶液洗涤三遍。
第二步:称取12mgEDC和8mgNHS,分别溶于2mlpH=6的MES溶液中(低温),配制成6mg/mL的EDC和4mg/mL的NHS溶液。将5mg经过臭氧氧化的量子点磁性编码微球分散于其中,混合均匀后置于摇床上(37℃,60r/min)活化30min。
第三步:然后将含磁珠的溶液置于磁铁上1~2min,吸去上层清液,加入50μL1mg/mL的生物一抗抗体溶液,溶于1.5mlPBS中,在涡旋仪上混合均匀,置于摇床上(37℃,60r/min)孵育3h。反应结束后,将其置于磁铁上1~2min,弃去上层清液,用PBS溶液清洗3~4次,以除去未连接上的抗体。
第四步:上述微球加入1.5mL含0.1%Tween20与1%BSA的PBS,混匀后置于摇床上(37℃,150r/min)反应30min。将溶液置于磁铁上1~2min,弃掉上层清液,用PBS清洗3~4遍。
第五步:加入10uL含荧光染料标记的生物二抗,然后加入1.5ml PBS溶液,混匀后置于摇床上(37℃,150r/min)反应3h。将溶液置于磁铁上1~2min,弃掉上层清液,用PBS清洗3~4遍。
(3)抗原抗体特异性结合实验
利用酶标仪对反应后的聚合物微球分析荧光强度,在荧光显微镜下拍照聚合物微球在不同波段激光下的荧光图像,如图6中的(a)至(h)所示。图6中的(a)表示365nm激光激发红色微球的两组数据分析得到的荧光强度曲线;(b)表示480nm激光激发红色微球的两组数据分析得到的荧光强度曲线;(c)表示365nm激光激发黄色微球的两组数据分析得到的荧光强度曲线;(d)表示346nm激光激发黄色微球的两组数据分析得到的荧光强度曲线;(e)表示542nm激光激发红色微球鼠-鼠实验组得到的荧光;(f)表示480nm激光激发红色微球鼠-鼠实验组得到的荧光;(g)表示542nm激光激发红色微球兔-兔实验组得到的荧光;(h)表示346nm激光激发红色微球兔-兔实验组得到的荧光。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型,而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种磁性荧光编码微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备未经改性的荧光磁性编码聚合物微球,并通过外加磁场对制备的荧光磁性编码聚合物微球进行富集筛选,其中,在微球还未固化完全的固化前期,通过加磁场和改变磁场的方向轻微改动聚合物微球中磁颗粒的位置,使得其趋于聚合物微球中一边;通过改变聚合物微球中磁颗粒的位置以减少荧光的淬灭;
S2、通过氧化所述聚合物微球,增加所述聚合物微球表面的羧基密度,改变所述聚合物微球表面特性。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述聚合物微球为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)微球。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤S2中使用臭氧氧化所述聚合物微球表面。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤S2还包括通过X射线光电子能谱分析检测所述聚合物微球表面O原子和C原子的变化曲线,并控制反应时间,以监测和控制微球表面羧基的增加。
5.如权利要求1至2任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中利用微流控装置制备所述荧光磁性编码聚合物微球。
6.如权利要求1至2任一项所述的制备方法,其特征在于,以亲水性聚乙二醇二丙烯酸酯作为分散相,其含有适当的mPEG修饰的QDs和磷酸PEG修饰的磁颗粒,并在所述分散相中加2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮作为光引发剂;在十六烷中溶解表面活性剂以制备连续相;将分散相和连续相流体引入微流控装置,获得含有初级的聚合物微球的单体乳液,采用紫外光对所述单体乳液液滴进行原位光聚合。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,在载玻片加上磁场,加入含有荧光磁性编码微球的悬浮液,所述悬浮液通过磁场时候,磁性编码微球被固定在所述载玻片上,而未磁性编码微球随着所述悬浮液流过所述载玻片。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的制备方法制备的磁性荧光编码微球的应用,其特征在于,包括以下步骤:
将抗体蛋白分子连接到经表面改性的所述磁性荧光编码微球上,优选地,连接的过程包括将所述磁性荧光编码微球和所述抗体蛋白分子在缓冲液中进行脱水缩合;
将经荧光标记的抗体和与所述磁性荧光编码微球连接的所述抗体蛋白分子特异性结合,将荧光标记物标记到所述磁性荧光编码微球上;
通过荧光显微镜成像,检测荧光标记物,以检测所述磁性荧光编码微球的特异性。
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