CN109971745A - 石墨烯固定漆酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石墨烯固定漆酶的制备方法，该固定化漆酶是以一种具有极佳导电性能的二维晶体材料石墨烯作为载体，通过非特异性的吸附作用将漆酶固定在该载体上，其制备方法包括两个步骤：载体制备和漆酶固定，具体的，载体石墨烯制备是以苯酚为原料通过对三明治夹层状FePO4/dodecylamine纳米层复合物进行石墨化后进行剥离后合成的，漆酶固定是将漆酶非特异性吸附在分散均匀的石墨烯表面，再经离心、洗涤、干燥得到的固定化漆酶成品。采用本发明所采用的石墨烯作为载体可以显著提高酶催化反应过程中电子传递速率，提高反应效率，同时本方法制备所得到的固定化漆酶固定量大，活性高、稳定性好，且可从反应体系中回收、可反复多次使用，制备过程简单易行。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种石墨烯固定漆酶的制备方法，更具体的说是制备一种具有优良导电性质和极佳机械稳定性的碳纳米材料石墨烯固定化漆酶。
背景技术
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在多种生物体内。漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A、芳香胺等，在漆酶介体(ABTS、HBT等)存在下，漆酶还可以催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、N-取代对苯基二胺、有机磷化合物(农药)及二噁英等。由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在造纸工业、废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、生物传感器构建及食品工业等方面具有重要的使用价值。但由于漆酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处环境十分敏感，在使用过程中易受环境条件变化影响而导致变性失活，特别是游离酶与反应产物混合在一起，反应后不能回收，难以实现重复利用。而对酶进行固定后制成的固定化酶能克服上述缺点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还存在稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。
制备固定化酶的关键在于载体的选择，文献报导较多的可用于生物酶的固定化载体主要有表面富含功能基团的有机载体和机械稳定性较好的无机载体等。但这些载体材料普遍存在着合成价格昂贵，加工工艺复杂，分离效果差等缺点。近年来，石墨烯作为一种具有独特二维晶体结构材料，其所特有的电学、光学、机械和热的性质，以及其较大的比表面积，这些特性都是它能被广泛应用的基础。近年来，研究人员已经证明石墨烯类碳纳米材料具有极快的电子传递速率以及优秀的电催化特性。我们将这一性质应用到生物酶的固定化中，当石墨烯作为载体固定了生物酶后形成一种石墨烯-酶复合物，大大加快了在酶催化反应过程中反应体的电子传递速率，从而极大地提高反应效率。另外，石墨烯材料表现出表面化学惰性，耐酸耐碱性能强，在空气中不易氧化变质，因此，使用石墨烯作为载体固定化酶具有十分显著的优势。
近年来，固定化酶技术的研究得到了蓬勃的发展，目前用于固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价键结合法、包埋法等。其中，交联法和共价键结合法因反应条件较为剧烈，酶活力损失较大；包埋法由于底物结合部位和活性中心受载体封闭因而酶活损失较大；而吸附法具有条件温和、酶活力部位及其空间构象不易被破坏的特点，避免了交联剂的使用对酶分子造成的化学损伤，更大程度上保持了酶分子的天然构象，可以更大限度保留酶活。因此，在本发明中，利用石墨烯表面的π键与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上。该固定化漆酶不仅可回收反复使用，同时由于石墨烯优秀的导电性能能加快电子传递速率，该固定化漆酶在增强了漆酶的稳定性的同时也提高了酶活性。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种石墨烯固定漆酶的制备方法，利用石墨烯表面的π键与蛋白质表面供电子氨基酸间的相互作用将漆酶固定在该载体上，具体制备方法包括以下步骤：
(1)称取十二胺粉末溶解于无水乙醇中，称取四水氯化亚铁和磷酸二氢铵溶解于超纯水中，将十二胺的无水乙醇溶液与氯化亚铁和磷酸二氢铵的混合溶液混匀，离心收集得到的固体产物，固体产物进行真空干燥，用研钵将干燥后的固体产物研磨成粉末，再将粉末放入坩埚中；
(2)将坩埚放入管式炉的石英管中，低流速氩气保护氛围下进行煅烧，煅烧过程结束后，待产物冷却至室温，将产物从坩埚中刮出，将刮出的产物放入到特氟龙内衬的水热釜中，并向水热釜中加入浓盐酸至满，密封水热釜，将水热釜放置于烘箱中加热；
(3)待加热过程结束后，使用布氏漏斗抽滤，水洗得到的抽滤产物，水洗后再用无水乙醇清洗，真空干燥，即得到干燥的纯净的石墨烯粉末；
(4)取步骤(3)制得石墨烯粉末超声分散到到PBS缓冲液中，然后将氮气通入分散液中作为保护气防止漆酶失活，将游离漆酶溶液加入分散液中搅拌，离心分离出固定化酶，对固定化酶进行洗涤，即得固定化漆酶成品。
优选的是，步骤(1)中，所述磷酸二氢铵与四水氯化亚铁的摩尔比为1:1-1:1.1，磷酸二氢铵与十二烷胺的摩尔比为1:2.5-1:5。
在上述任一方案中优选的是，步骤(1)和步骤(3)中，真空干燥的条件为40℃，12小时。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，煅烧的条件为700℃，12小时。
在上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，烘箱加热的条件为180℃，24小时。
在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，加入的与石墨烯分散液混合的游离漆酶酶量为0.1-1.2mg，载体石墨烯的用量为1.0-4.0mg。
在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，搅拌和离心分离的温度均为4℃。
在上述任一方案中优选的是，步骤(4)中，对固定化酶洗涤的详细步骤为：用pH为7.0的PBS缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出。
本发明与现有技术相比：
(1)漆酶固定化过程中不使用交联剂，避免了交联剂对酶分子造成的化学损伤，酶以配位作用固定在载体上可以更大程度上保持酶分子的天然构象，更大限度保留酶活；提高酶对温度和环境pH条件的稳定度。
(2)所制备的固定化漆酶利用载体本身特有的促进电子传递的作用，有利于提高酶活性以及催化反应速率。
附图说明
图1为实施例一制得的石墨烯粉末的拉曼光谱图；
图2中，A为实施例一制得的石墨烯粉末原子力显微镜图；B为实施例一制得的石墨烯固定化漆酶原子力显微镜图；
图3为石墨烯固定化漆酶与原酶在不同pH(a)和温度(b)条件下稳定性的对比；
图4为石墨烯固定化漆酶与原酶活性的对比。
具体实施方式
为了更进一步了解本发明的发明内容，下面将结合具体实施例详细阐述本发明。
实施例一
载体制备，其步骤为：
(1)准确称取5g十二胺粉末，溶解于20ml无水乙醇中，称取1.590g的四水氯化亚铁和0.900g的磷酸二氢铵溶解于80ml超纯水中(磷酸二氢铵与四水氯化亚铁的摩尔比为1:1.02，磷酸二氢铵与十二烷胺的摩尔比为1:3.45)。45℃水浴中，将十二胺的无水乙醇溶液与氯化亚铁和磷酸二氢铵的混合溶液混匀，离心收集得到的固体产物，并在40℃下真空干燥36h，用研钵将干燥后的固体产物研磨成粉末，放入坩埚中。干燥后将坩埚放入管式炉中，低流速氩气保护氛围下，600℃煅烧24h；
(2)煅烧过程结束后，待产物冷却至室温后，将产物从坩埚中刮取下来，将其放入到特氟龙内衬的水热釜中，并向水热釜中加入20ml浓盐酸。密封水热釜，将水热釜放置于烘箱中，200℃加热24h。待加热过程结束后，使用布氏漏斗抽滤，水洗得到的抽滤产物30次，水洗后再用无水乙醇洗30次后，60℃下真空干燥12h，得到220mg干燥的纯净的石墨烯粉末；
本实施例制备的石墨烯粉体主要为四层的石墨烯，其拉曼光谱如图1所示，拉曼光谱的G峰(1579cm-1)和2D峰(2926cm-1)的出现表明本发明制备的石墨烯粉体具有典型的石墨结构特征，其原子力显微镜如图2(A)所示，从图中可以看出合成的石墨烯有明显片层状结构。且单片石墨烯厚度为1～2nm。
漆酶固定，其步骤为：
取上述方法制得的石墨烯粉末2.5mg超声分散到5mL的PBS(10mM,pH 7.0)缓冲液中，然后将氮气通入分散液中作为保护气防止漆酶失活，将0.5mL含有0.636mg游离漆酶溶液加入分散液中，在温度为4℃下搅拌1小时。随后，4℃条件下离心分离出固定化酶，用pH为7.0的PBS缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出，即得固定化漆酶成品。固定化酶的固定量为233mg/g载体。
实施例二
载体制备，其步骤为：
(1)准确称取5g十二胺粉末，溶解于20ml无水乙醇中，称取1.590g的四水氯化亚铁和0.900g的磷酸二氢铵溶解于80ml超纯水中(磷酸二氢铵与四水氯化亚铁的摩尔比为1:1.02，磷酸二氢铵与十二烷胺的摩尔比为1:3.45)。45℃水浴中，将十二胺的无水乙醇溶液与氯化亚铁和磷酸二氢铵的混合溶液混匀，离心收集得到的固体产物，并在40℃下真空干燥36h，用研钵将干燥后的固体产物研磨成粉末，放入坩埚中。干燥后将坩埚放入管式炉中，低流速氩气保护氛围下，600℃煅烧24h；
(2)煅烧过程结束后，待产物冷却至室温后，将产物从坩埚中刮取下来，将其放入到特氟龙内衬的水热釜中，并向水热釜中加入20ml浓盐酸。密封水热釜，将水热釜放置于烘箱中，200℃加热24h。待加热过程结束后，使用布氏漏斗抽滤，水洗得到的抽滤产物30次，水洗后再用无水乙醇洗30次后，60℃下真空干燥12h，得到220mg干燥的纯净的石墨烯粉末；
本实施例制备的石墨烯粉体主要为四层的石墨烯，其拉曼光谱如图1所示，拉曼光谱的G峰(1579cm-1)和2D峰(2926cm-1)的出现表明本发明制备的石墨烯粉体具有典型的石墨结构特征，其原子力显微镜如图2(A)所示，从图中可以看出合成的石墨烯有明显片层状结构。且单片石墨烯厚度为1～2nm。
漆酶固定，其步骤为：
取上述方法制得的石墨烯粉末1.25mg，超声分散到5mL的PBS(10mM,pH 7.0)缓冲液中，然后将氮气通入分散液中作为保护气防止漆酶失活，将0.5mL含有0.636mg游离漆酶溶液加入分散液中，在温度为4℃下搅拌0.5小时。随后，4℃条件下离心分离出固定化酶，用pH为7.0的PBS缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出，即得固定化漆酶成品。固定化酶的固定量为157mg/g载体。
实施例三
载体制备，其步骤为：
(1)准确称取5g十二胺粉末，溶解于20ml无水乙醇中，称取1.590g的四水氯化亚铁和0.900g的磷酸二氢铵溶解于80ml超纯水中(磷酸二氢铵与四水氯化亚铁的摩尔比为1:1.02，磷酸二氢铵与十二烷胺的摩尔比为1:3.45)。45℃水浴中，将十二胺的无水乙醇溶液与氯化亚铁和磷酸二氢铵的混合溶液混匀，离心收集得到的固体产物，并在40℃下真空干燥36h，用研钵将干燥后的固体产物研磨成粉末，放入坩埚中。干燥后将坩埚放入管式炉中，低流速氩气保护氛围下，600℃煅烧24h；
(2)煅烧过程结束后，待产物冷却至室温后，将产物从坩埚中刮取下来，将其放入到特氟龙内衬的水热釜中，并向水热釜中加入20ml浓盐酸。密封水热釜，将水热釜放置于烘箱中，200℃加热24h。待加热过程结束后，使用布氏漏斗抽滤，水洗得到的抽滤产物30次，水洗后再用无水乙醇洗30次后，60℃下真空干燥12h，得到220mg干燥的纯净的石墨烯粉末；
本实施例制备的石墨烯粉体主要为四层的石墨烯，其拉曼光谱如图1所示，拉曼光谱的G峰(1579cm-1)和2D峰(2926cm-1)的出现表明本发明制备的石墨烯粉体具有典型的石墨结构特征，其原子力显微镜如图2(A)所示，从图中可以看出合成的石墨烯有明显片层状结构。且单片石墨烯厚度为1～2nm。
漆酶固定，其步骤为：
取上述方法制得的石墨烯粉末为4mg，超声分散到5mL的PBS(10mM,pH 7.0)缓冲液中，然后将氮气通入分散液中作为保护气防止漆酶失活，将0.5mL含有0.636mg游离漆酶溶液加入分散液中，在温度为4℃下搅拌2小时。随后，4℃条件下离心分离出固定化酶，用pH为7.0的PBS缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出，即得固定化漆酶成品。固定化酶的固定量为221mg/g载体。
性能试验
固定化酶酶活性测试使用ABTS法检测，酶活性单位(U)定义为单位时间内1-μmol底物ABTS被酶催化氧化为ABTS·+稳定自由基所需的酶量。通过检测比较固定化酶和原酶活性，如图3所示，多测检测结果均表明固定化酶酶活高于原酶。
改变固定化酶分散液的pH值，比较固定化酶和原酶在不同pH条件下的稳定性，测试方法为ABTS法，结果如图4a所示，固定化酶的酶活保持度比原酶更好，能耐受更广阔的pH范围；将固定化酶和原酶保存于不同温度环境中(30,50和70℃)，固定时间测试酶活，结果如图4b所示，固定化酶在不同温度下的酶活保持更好。
本领域技术人员不难理解，本发明的石墨烯固定漆酶的制备方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种石墨烯固定漆酶的制备方法，按照先后顺序包括以下步骤：
(1)称取十二胺粉末溶解于无水乙醇中，称取四水氯化亚铁和磷酸二氢铵溶解于超纯水中，将十二胺的无水乙醇溶液与氯化亚铁和磷酸二氢铵的混合溶液混匀，离心收集得到的固体产物，固体产物进行真空干燥，用研钵将干燥后的固体产物研磨成粉末，再将粉末放入坩埚中；
(2)将坩埚放入管式炉的石英管中，低流速氩气保护氛围下进行煅烧，煅烧过程结束后，待产物冷却至室温，将产物从坩埚中刮出，将刮出的产物放入到特氟龙内衬的水热釜中，并向水热釜中加入浓盐酸至满，密封水热釜，将水热釜放置于烘箱中加热；
(3)待加热过程结束后，使用布氏漏斗抽滤，水洗得到的抽滤产物，水洗后再用无水乙醇清洗，真空干燥，即得到干燥的纯净的石墨烯粉末；
(4)取步骤(3)制得石墨烯粉末超声分散到到PBS缓冲液中，然后将氮气通入分散液中作为保护气防止漆酶失活，将游离漆酶溶液加入分散液中搅拌，离心分离出固定化酶，对固定化酶进行洗涤，即得固定化漆酶成品。
2.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述磷酸二氢铵与四水氯化亚铁的摩尔比为1:1-1:1.1，磷酸二氢铵与十二烷胺的摩尔比为1:2.5-1:5。
3.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)中，真空干燥的条件为40℃，12小时。
4.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，煅烧的条件为700℃，12小时。
5.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，烘箱加热的条件为180℃，24小时。
6.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，加入的与石墨烯分散液混合的游离漆酶酶量为0.1-1.2mg，载体石墨烯的用量为1.0-4.0mg。
7.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，搅拌和离心分离的温度均为4℃。
8.根据权利要求1所述的石墨烯固定漆酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，对固定化酶洗涤的详细步骤为：用pH为7.0的PBS缓冲溶液多次洗涤，直至洗涤液中没有蛋白检出。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112877321A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-06-01 | 南京工业大学 | 一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060194263A1 (en) * | 2004-09-30 | 2006-08-31 | Salah Boussaad | Small molecule mediated, heterogeneous, carbon nanotube biosensing |
| EP1826266A1 (en) * | 2006-02-23 | 2007-08-29 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Polypeptides with laccase activity |
| CN103738959A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-04-23 | 南京大学 | 一种c-14标记的石墨烯及其合成方法 |
| CN105441419A (zh) * | 2015-12-22 | 2016-03-30 | 陕西师范大学 | 一种磁性氧化石墨烯固定化的cpo及其制备方法和应用 |
| CN106636056A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-05-10 | 南京工业大学 | 氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060194263A1 (en) * | 2004-09-30 | 2006-08-31 | Salah Boussaad | Small molecule mediated, heterogeneous, carbon nanotube biosensing |
| EP1826266A1 (en) * | 2006-02-23 | 2007-08-29 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Polypeptides with laccase activity |
| CN103738959A (zh) * | 2014-02-19 | 2014-04-23 | 南京大学 | 一种c-14标记的石墨烯及其合成方法 |
| CN105441419A (zh) * | 2015-12-22 | 2016-03-30 | 陕西师范大学 | 一种磁性氧化石墨烯固定化的cpo及其制备方法和应用 |
| CN106636056A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-05-10 | 南京工业大学 | 氨基硅烷化磁性氧化石墨烯纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BIOCATALYSISNADIA A. SAMAK等: "CotA laccase immobilized on functionalized magnetic graphene oxidenano-sheets for efficient biocatalysis", 《MOLECULAR CATALYSIS》 * |
| EVERTON SKORONSKI等: "Immobilization of laccase from Aspergillus oryzae on graphenenanosheets", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》 * |
| 林鹿，詹怀宇: "《制浆漂白生物技术与原理 第2版》", 中国轻工业出版社 * |
| 欧阳科等: "磁性Fe3O4/石墨烯异质结固定漆酶特性及其对水中双酚A的降解研究", 《生态环境学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112877321A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-06-01 | 南京工业大学 | 一种制备石墨烯固定化酶的方法及其应用 |
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