CN109954112A - 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109954112A
CN109954112A CN201711418438.1A CN201711418438A CN109954112A CN 109954112 A CN109954112 A CN 109954112A CN 201711418438 A CN201711418438 A CN 201711418438A CN 109954112 A CN109954112 A CN 109954112A
Authority
CN
China
Prior art keywords
weight
parts
reagent
kit
powder
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711418438.1A
Other languages
English (en)
Inventor
沈剑刚
陈汉森
蔡宾
吴炜
李霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Tongrentang National Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Tongrentang National Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Tongrentang National Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Beijing Tongrentang National Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201711418438.1A priority Critical patent/CN109954112A/zh
Priority to PCT/CN2018/072551 priority patent/WO2019127672A1/zh
Publication of CN109954112A publication Critical patent/CN109954112A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/28—Mercury; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/36—Arsenic; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/413—Gall bladder; Bile
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/55—Glands not provided for in groups A61K35/22 - A61K35/545, e.g. thyroids, parathyroids or pineal glands
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/618—Molluscs, e.g. fresh-water molluscs, oysters, clams, squids, octopus, cuttlefish, snails or slugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A61K36/539—Scutellaria (skullcap)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A61K36/718—Coptis (goldthread)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
    • A61K36/744—Gardenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/906—Zingiberaceae (Ginger family)
    • A61K36/9066—Curcuma, e.g. common turmeric, East Indian arrowroot or mango ginger
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21068—Tissue plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒由试剂A和试剂B组成，所述试剂A由牛黄100重量份、水牛角浓缩粉200重量份、麝香25重量份、珍珠50重量份、朱砂100重量份、雄黄100重量份、黄连100重量份、黄芩100重量份、栀子100重量份、郁金100重量份和冰片25重量份组成，所述试剂B为组织纤溶酶原激活物，所述试剂A和试剂B的使用剂量依据患者卒中程度进行调整；所述试剂盒物降低了卒中的出血转化，提高整体的疗效。

Description

一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗缺血性卒中试剂盒及其应用，属于药物试剂盒领域。
背景技术
缺血型中风是指大脑供血动脉由于狭隘或者闭塞导致脑部供血不足，脑部组织坏死的病理过程。缺血型中风大约占中风总比例的85％。目前，组织纤溶酶原激活物(t-PA)是美国FDA唯一批准的用于治疗缺血型中风的溶栓药物。目前在临床治疗脑缺血型中风过程中，发病时间确诊在4.5小时以内的，符合诊治标准的，此时可静脉注射t-PA进行溶栓治疗。而超过4.5小时则不能再进行t-PA溶栓治疗。t-PA在4.5小时的时间窗内应用可以改善患者的预后和提高生活质量。然而，超过此时间窗应用t-PA则显著增加出血转化的几率，并产生神经毒性等副作用。t-PA引起的出血转化可能会使病人的预后恶化，因此大大限制了t-PA的应用。所以，如何使用t-PA溶栓的同时避免出血转化和神经毒性等问题是目前关于脑卒中治疗的研究热点。
基础和临床研究表明血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的破坏是t-PA引起出血转化的重要机制，其中多个细胞因子参与了血脑屏障破坏的过程，包括基质金属蛋白酶MMP-9，炎症因子，活性氮RNS，活性氧ROS等。这些因子都参与了BBB的破坏进而导致了出血转化。因此，调控这些靶点将可能减少t-PA引起的出血转化。
而现有研究表明：
(1)t-PA的治疗时间窗太短，无法让多数的脑卒中病人得到治疗。只有不足5％的人符合时间窗等条件得到t-PA的治疗。
(2)超过时间窗使用t-PA溶栓治疗将会显著增加出血转化和导致神经的可能性。
(3)t-PA溶栓虽然可以恢复脑部供血，但缺血再灌注本身会造成二次损伤，主要包括产生大量自由基等。
目前尚未有相应的药物或药物组合物可以有效解决这个技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒由试剂A和试剂B共同组成，其中，所述试剂A由牛黄50-150重量份、水牛角浓缩粉150-300重量份、麝香1-50重量份、珍珠1-100重量份、朱砂50-150重量份、雄黄50-150重量份、黄连50-150 重量份、黄芩50-150重量份、栀子50-150重量份、郁金50-150重量份和冰片1-50重量份组成，所述试剂B为组织纤溶酶原激活物。
本发明进一步优选一种试剂盒，其中，所述试剂A由牛黄80-120重量份、水牛角浓缩粉180-230重量份、麝香10-40重量份、珍珠20-80重量份、朱砂80-120重量份、雄黄80-120重量份、黄连80-120重量份、黄芩80-120重量份、栀子80-120重量份、郁金 80-120重量份和冰片10-40重量份组成。
更有选地，在上述一种试剂盒中，所述试剂A由牛黄100重量份、水牛角浓缩粉200重量份、麝香25重量份、珍珠50重量份、朱砂100重量份、雄黄100重量份、黄连100 重量份、黄芩100重量份、栀子100重量份、郁金100重量份和冰片25重量份组成。
本发明所述的“水牛角浓缩粉”为本领域公知的原料，其质量标准和制备方法均为公知，参见中国药典相关规定，可来源于市售商品，如邯郸市柏林药业有限公司生产的水牛角浓缩粉。
所述冰片优选为天然冰片。
所述试剂盒按单位时间的应用剂量(例如，单日时间)计，试剂A和试剂B的质量比为25.7:1-257:1。
所述试剂A具有改善神经功能，减少神经损伤。
本发明还提供了一种上述试剂盒在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用。
本发明还提供了一种上述试剂盒在制备改善缺血性卒中治疗中出血转化的药物中的应用。
在上述试剂盒在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用中，所述试剂A的使用方式为口服，所述试剂B的使用方式为静脉注射。
在上述试剂盒在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用中，所述试剂A的剂型为丸剂，所述丸剂由以下方法制得，将所述珍珠水飞或粉碎成极细粉，朱砂、雄黄分别水飞成极细粉；黄连、黄芩、栀子、郁金粉碎成细粉；将牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、冰片研细，与上述粉末配研，过筛，混匀，加炼蜜制成大蜜丸，或包金衣，即得所述试剂A；所述试剂B的剂型为静脉注射制剂，由以下方法制得，将组织纤溶酶原激活物使用生理盐水或注射用水配制为静脉注射液，即得所述试剂B。
在上述试剂盒在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用中，所述试剂A的使用剂量为每人1-10g/日，所述试剂B的使用剂量为每人每日0.9mg/kg，最高90mg。
缺血性卒中的t-PA应用原则为：每公斤体重最多给予0.9mg/kg，最高剂量不能超过 90mg。
本发明相对于现有技术具有如下优点：1.可以减少t-PA治疗引起的出血转化等副作用；2.采用传统中药与西药的组合复合物，从多个靶点作用机制上减少副作用，并进一步加强神经保护作用，提高疗效。
发明人采用大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型，并严格控制手术时间和动物体温等因素。在大鼠MCAO 2小时的时候给予口服所述试剂盒的重要部分0.25mg/kg的剂量(相当于人每天服用3g试剂A)，对照组使用生理盐水，并在MCAO 4.5小时的时候开始给予10mg/kg的t-PA，通过股静脉缓慢注射(10％的首剂量，剩余的在0.5小时完成注射)。在MCAO 5小时的时候完成注射并移除线栓造成缺血侧脑部再灌注。因此t-PA 应用的时间记为MCAO 5小时的时间点。实验分为4组，包括假手术组(Sham)，模型组(MCAO5hours reperfusion 19hours(脑梗塞5小时复灌19小时)，模型组加t-PA治疗组，模型组加试剂盒。在MCAO模型24小时结束后对大鼠死亡率，神经行为学，脑水肿，脑实质出血转化，脑细胞凋亡，嗜中性粒细胞细胞浸润，及其重要的细胞因子信号通路进行检测。所述实验模拟了临床上超过时间窗使用t-PA，并模拟了试剂盒的使用方法，并对试剂盒的效果进行多方面的检测。
在本发明中，我们首次在缺血型中风中使用该试剂盒进行研究。其中试剂A作为一种急救药，在缺血2小时的时候通过口服给药。根据本发明，试剂盒与单独使用t-PA组比较可以显著减少死亡率；试剂盒与单独使用t-PA组比较可以显著改善神经行为学；试剂盒与单独使用t-PA组比较发现，试剂盒可以显著减少脑水肿；试剂盒与单独使用t-PA 组比较发现，试剂盒可以显著减少脑部细胞凋亡；试剂盒与单独使用t-PA组比较发现，试剂盒可以显著减少过氧化物酶(MPO)表达；试剂盒与单独使用t-PA组比较发现，试剂盒可以减少基质金属蛋白酶MMP-9和过氧亚硝酸的表达。
缩略语和关键术语定义：
t-PA，tissue plasminogen activator，组织纤溶酶原激活物(德国勃林格殷格翰公司生产，临床剂量范围：每公斤体重最多给予0.9mg/kg，最高剂量不能超过90mg)
出血转化，是指在缺血型脑卒中后血管恢复血流灌注时发生的脑内出血现象。
附图说明：
图1：手术过程中体温控制稳定；
图2：试剂盒减少脑梗塞大鼠死亡率；
图3：试剂盒改善神经行为学；
图4：试剂盒减少大鼠脑水肿；
图5：试剂盒减少3-硝基酪氨酸(3-NT)和基质金属蛋白酶MMP-9的表达。
具体实施方式
下面的实施例仅用于进一步说明本发明但不限于本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。
实施例1
试剂盒中试剂A的配方：牛黄100重量份、水牛角浓缩粉200重量份、麝香25重量份、珍珠50重量份、朱砂100重量份、雄黄100重量份、黄连100重量份、黄芩100重量份、栀子100重量份、郁金100重量份和冰片25重量份。
制备方法为：将所述珍珠水飞或粉碎成极细粉，朱砂、雄黄分别水飞成极细粉；黄连、黄芩、栀子、郁金粉碎成细粉；将牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、冰片研细，与上述粉末配研，过筛，混匀，加炼蜜制成大蜜丸，或包金衣，即得所述试剂A；
试剂B的使用液配置，将t-PA使用生理盐水或注射用水配制为静脉注射液，即得所述试剂B；
下述实验例均以实施例1为例在大鼠模型上进行效果说明。
所述试剂A的使用剂量为0.25mg/kg，使用方式为口服；所述试剂B的使用剂量为10mg/kg，使用方式为静脉注射。
实验例1
分组与给药
实验大鼠随机分为以下4组，即假手术组(Sham)，模型组(MCAO5hoursreperfusion 19hourss)，模型加t-PA治疗组，试剂盒组。在大鼠MCAO 2小时的时候给予口服试剂A 丸剂0.25mg/kg的剂量，对照组使用生理盐水，并MCAO 4.5小时的时候开始给予10mg/kg 的t-PA，通过股静脉缓慢注射，在0.5小时内完成注射。在MCAO 5小时的时候完成注射并移除线栓造成再灌注。因此t-PA应用的时间记为MCAO 5小时的时间点。
动物实验中，试剂A口服的剂量257mg/kg(根据临床用量折算，试剂A每次3g,用于约70kg成人，再根据人与大鼠体表面积换算),t-PA静脉注射的剂量为10mg/kg，故而比例为25.7：1；然而需要说明的是，根据文献报道，由于凝血系统差异的原因，动物的t-PA使用量应该是人的十倍左右，也就是说，临床上t-PA的剂量是0.9mg/kg,因而，临床上试剂A与试剂B的质量比应该是257：1.。
大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的制备
SD实验大鼠(体重270-290g)采用4％异氟烷进行气体诱导麻醉，并使用2％异氟烷维持麻醉状态。固定大鼠头部，使用脱毛膏剔除颈部毛发，并沿着颈部中线剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，暴露颈总动脉。小心分离颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉，并尽量避免损害神经，结扎颈总动脉，颈外动脉。于颈外动脉两个结扎处中间剪断和游离颈外动脉，使之与颈内动脉拉成直线。在颈外动脉处造一小口，插入直径约为0.38mm的硅胶线栓，进入颈内动脉，一直前进到有阻力处(约为1.9cm-2cm)，堵住大脑中动脉(MCA)。固定线栓并缝合皮肤。由线栓进入大脑中动脉开始计算MCAO的时间。假手术组的操作与模型组一致，但不插入线栓。大鼠在术中使用加热垫维持体温，术后使用暖灯照射直至其恢复清醒。记录每一只大鼠整个手术操作的时间，和术前术后的体温，并进行统计确认各组操作时间和体温均没有显著差异。
死亡率评价
在MCAO 24小时结束时，计算存活的和死亡的大鼠数量，并进行统计分析。
神经行为学评分方法
在MCAO 24小时结束时，使用mNSS评分方法对试验大鼠的神经行为功能进行检测。mNSS是综合了感觉反射，运动，平衡等能力的行为学测试。其具体评分项表1：
表1mNSS神经行为学评分方法
根据以上标准，各项累计最高分为18分。得分越高表明动物的神经功能损伤越严重。
统计学方法
体温与麻醉时间分别使用One-way ANOVA进行统计检验。大鼠24小时死亡率使用卡方分析χ2 test进行统计检验，p<0.05认为统计学显著。神经行为学得分使用非参数检验Kruskal-Wallis进行统计检验，并以Dunnett's进行多重比较检验，p<0.05则认为统计学显著。
结果
1.手术麻醉时间与大鼠体温控制
结果见图1。
结果表明，各组之间的手术麻醉时间基本一致，术前术后体温维持稳定，各组之间没有差异。因此，本实验过程相对稳定。附图文字指代：Sham，假手术组；M5/R19模型(脑梗塞5小时复灌19小时)组；M5/R19+t-PA，模型加单纯t-PA治疗组；M5/R19+ t-PA+AN，模型加试剂盒。
2.试剂盒对脑梗塞大鼠的死亡率的影响
结果见图2。
结果表明，除假手术组外，其它组别在模型24小时后都具有一定死亡率。其中超过时间窗单独使用t-PA组的死亡率最高(总数14只，死亡8只)。试剂盒减少大鼠死亡率(总数10只，死亡1只)。*p<0.05，与模型组和试剂盒比较。
3.试剂盒对神经行为学的影响
结果见图3。
由上图可以看出，超过时间窗单独使用t-PA加重大鼠24小时的神经行为学表现，而试剂盒则可以显著改善神经行为学表现。*p<0.05，与模型组比较；##p<0.01，与单独使用t-PA组比较。
大脑中动脉梗塞模型是局灶脑缺血常用的模型，该模型能够较好的模拟临床大部分病人的梗塞情况，且梗塞位置固定，易操作，重复性高。本实验麻醉时间控制良好，大鼠术前术后体温稳定，说明实验过程控制良好。结果显示，超过4.5小时使用t-PA会增加大鼠死亡率和加重神经行为学损伤。而试剂盒可以显著减少死亡率和改善神经行为学功能。这一结果提示所述试剂A具有拮抗t-PA副作用的效应。
实验例2试剂盒减少脑水肿与出血转化
方法
分组与给药：如实验例1。
大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的制备：与实验例1相同。
脑水肿评价
大鼠在MCAO 24小时结束后，采用过量麻醉的方法处死，并用PBS缓冲液进行心脏灌注。每只大鼠灌注250ml，然后取大脑组织，在大脑磨具中均匀切成2mm厚度的脑片，并进行拍照。使用Image J软件计算各个脑片左右侧的面积，并以左侧面积总和除以右侧面积总和，得出水肿系数。
脑部出血转化评价
大鼠在MCAO 24小时结束后，采用过量麻醉的方法处死，并用PBS缓冲液进行心脏灌注。每只大鼠灌注250ml，然后取大脑组织，在大脑磨具中均匀切成2mm厚度的脑片，并进行拍照。根据照片对脑出血转化进行评价，其评价标准如下表2
表2
根据以上标准，每片脑组织最高得分为4分，一共计算5片脑组织出血情况，因而累计出血转化最高分为20分，最低分0分。分数越高表明出血程度越大。此外，发明人对出血的脑组织的片数也进行了统计，作为脑出血分布的另一个参考指标。
脑水肿与出血转化分别使用One-way ANOVA进行分析，并用Dunnett's多重检验。p<0.05认为统计学显著。
结果
1.试剂盒对大鼠脑水肿的影响
结果见图4。
结果表明，超过时间窗单独使用t-PA增加脑部水肿，而试剂盒可以显著减少t-PA引起的脑水肿。*p<0.05，与模型组比较；#p<0.05，与单独使用t-PA组比较。
2.试剂盒对大鼠出血转化的影响
结果表明，超过时间窗单独使用t-PA明显增加出血转化的分数，而试剂盒可以显著减少脑出血转化；其中，出血转化主要集中在第二，第三，第四脑片中，试剂盒可以降低各脑片出血转化分数，以及减少出血转化的脑片的总数量。**p<0.01，与模型组比较； #p<0.05，##p<0.01，与单独使用t-PA组比较。
超过时间窗应用t-PA主要的副作用在于增加血脑屏障破坏，从而导致脑水肿和出血转化，而这些对中风预后有重要的影响，因此超过时间窗溶栓的同时也带来了损伤。结果表明试剂盒可以减少脑水肿和出血转化。这说明试剂盒的策略可以减少t-PA的副作用，提高整体疗效。
实验例3试剂盒减少脑部细胞神经凋亡与嗜中性粒细胞浸润
方法
分组与给药：如实验例1。
大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的制备：与实验例1相同。
细胞凋亡评价
大鼠在MCAO 24小时结束后，采用过量麻醉的方法处死，并用PBS缓冲液进行心脏灌注。每只大鼠灌注250ml，然后取大脑组织，在大脑磨具中均匀切成2mm厚度的脑片，并使用4％多聚甲醛进行固定。固定后制成10uM冰冻切片，使用TUNEL试剂盒对脑片进行孵育检测，并用DAPI染核，在荧光显微镜下拍摄荧光信号，检测凋亡细胞。
嗜中性粒细胞浸润评价
如上所述制成10uM冰冻切片，并使用MPO抗体于4度冷库孵育脑片过夜，清洗脑片并使用荧光二抗于室温孵育。然后使用DAPI染核，清洗之后在荧光显微镜下拍摄 MPO荧光信号。
结果
1.试剂盒对大鼠脑部神经凋亡的影响
荧光实验结果表明，超过时间窗单独使用t-PA显著增加脑部皮层(cortex)及纹状体(striatum)的细胞凋亡；而试剂盒可以减少脑部皮层和纹状体的细胞凋亡。该结果提示试剂盒具有抗凋亡的作用。
2.试剂盒对大鼠脑部嗜中性粒细胞浸润的影响
实验结果表明，超过时间窗单独使用t-PA治疗明显增加了脑部MPO(嗜中性粒细胞的标记物)的表达量；而试剂盒可以显著减少MPO的表达。以上结果提示试剂盒减少脑卒中后嗜中性粒细胞的浸润。
以上结果表明试剂盒对脑部细胞凋亡和脑部嗜中性粒细胞浸润均有改善作用，揭示了试剂盒具有抗凋亡和抗炎症的作用。
实验例4试剂盒减少过氧亚硝酸，抑制基质金属蛋白酶-9
方法
分组与给药：如实验例1。
大脑中动脉梗塞(MCAO)模型的制备：与实验例1相同。
氮自由基，基质金属蛋白酶表达检测
大鼠在MCAO 24小时结束后，采用过量麻醉的方法处死，并用PBS缓冲液进行心脏灌注。每只大鼠灌注250ml，然后取大脑组织，分为左右两侧，收集左侧(缺血侧) 脑组织，并冻存于-80度冰箱。在分析蛋白表达时，首先使用组织匀浆器加入PBS对组织进行匀浆，然后取出100ul已经匀浆的组织，加入300ul细胞裂解液RIPA(含有1％蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)于冰上进行裂解细胞提取蛋白。半小时后使用离心机13000g转速离心并吸取上清作为蛋白样品。使用Bradford assay对蛋白浓度进行测定，然后调节每个样本的总上样量为40ug，进行蛋白western blot电泳分析。使用3-硝基酪氨酸(3-NT)作为过氧亚硝酸的标记(footprint)对过氧亚硝酸的量进行间接测定。对 MMP-9的表达也使用western blot分析的方法进行测定。
结果
1.试剂盒对过氧亚硝酸，基质金属蛋白酶-9的影响
结果见图5
实验结果表明，超过时间窗单独使用t-PA明显增加了3-NT，MMP-9的表达，而使用试剂盒明显减少3-NT和MMP-9的表达(β-actin为参照物)。以上结果提示试剂盒可以抑制过氧亚硝酸，基质金属蛋白酶-9等参与出血转化的重要靶点，从而起到减少脑出血转换和保护脑细胞的作用。
发明人之前的研究结果显示过氧亚硝酸(ONOO-)活性氮自由基和基质金属蛋白酶MMP-9在t-PA引起的出血转化中起到重要作用，ONOO-和MMP-9信号是调控出血转化的重要靶点。这里实验显示试剂盒可以显著下调由t-PA引起的3-NT(ONOO-的标记物) 和MMP-9的过表达。因此组合物中的试剂A可能通过下调ONOO-和MMP-9对脑出血转化起到改善作用。
综合以上4个实验例，试剂盒在治疗缺血型脑卒中可以明显减少脑水肿与出血转化风险，减少死亡率和改善神经行为学功能，对脑部具有抗凋亡抗炎症的效应，而其作用靶点则可能包括基质金属蛋白酶MMP-9，过氧亚硝酸ONOO-等。因此试剂盒用于治疗缺血型脑卒中具有显著的作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗缺血性卒中的试剂盒，所述试剂盒由试剂A和试剂B共同组成，其特征在于，所述试剂A由牛黄50-150重量份、水牛角浓缩粉150-300重量份、麝香1-50重量份、珍珠1-100重量份、朱砂50-150重量份、雄黄50-150重量份、黄连50-150重量份、黄芩50-150重量份、栀子50-150重量份、郁金50-150重量份和冰片1-50重量份组成，所述试剂B为组织纤溶酶原激活物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A由牛黄80-120重量份、水牛角浓缩粉180-230重量份、麝香10-40重量份、珍珠20-80重量份、朱砂80-120重量份、雄黄80-120重量份、黄连80-120重量份、黄芩80-120重量份、栀子80-120重量份、郁金80-120重量份和冰片10-40重量份组成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A由牛黄100重量份、水牛角浓缩粉200重量份、麝香25重量份、珍珠50重量份、朱砂100重量份、雄黄100重量份、黄连100重量份、黄芩100重量份、栀子100重量份、郁金100重量份和冰片25重量份组成。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述冰片为天然冰片。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒按单日时间计，试剂A和试剂B的质量比为25.7:1-257:1。
6.一种权利要求1所述的试剂盒在制备治疗缺血性卒中的药物中的应用。
7.一种权利要求1所述的试剂盒在制备改善缺血性卒中治疗中出血转化的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述试剂A的使用方式为口服，所述试剂B的使用方式为静脉注射。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂A的剂型为丸剂，所述丸剂由以下方法制得，将所述珍珠水飞或粉碎成极细粉，朱砂、雄黄分别水飞成极细粉；黄连、黄芩、栀子、郁金粉碎成细粉；将牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、冰片研细，与上述粉末配研，过筛，混匀，加炼蜜制成大蜜丸，或包金衣，即得所述试剂A；所述试剂B的剂型为静脉注射制剂，由以下方法制得，将组织纤溶酶原激活物使用生理盐水或注射用水配制为静脉注射液，即得所述试剂B。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂A的使用剂量为每人1-10g/日，所述试剂B的使用剂量为每人每日0.9mg/kg,最高90mg。
CN201711418438.1A 2017-12-25 2017-12-25 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用 Pending CN109954112A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711418438.1A CN109954112A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用
PCT/CN2018/072551 WO2019127672A1 (zh) 2017-12-25 2018-01-15 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711418438.1A CN109954112A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109954112A true CN109954112A (zh) 2019-07-02

Family

ID=67020816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711418438.1A Pending CN109954112A (zh) 2017-12-25 2017-12-25 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109954112A (zh)
WO (1) WO2019127672A1 (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103611075A (zh) * 2013-09-13 2014-03-05 辽宁仙草堂药业股份有限公司 牛黄醒脑制剂及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101579506A (zh) * 2008-05-14 2009-11-18 北京和润创新医药科技发展有限公司 一种安宫牛黄制剂及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103611075A (zh) * 2013-09-13 2014-03-05 辽宁仙草堂药业股份有限公司 牛黄醒脑制剂及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
腾飞，等: "《中国缺血性中风中成药合理使用指导规范》全国巡讲启动——北京同仁堂安宫牛黄丸进入《规范》", 《医药资讯》 *
陈汉森，等: "One-Compound-Multi-Target: Combination Prospect of Natural Compounds", 《CURRENT NEUROPHARMACOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019127672A1 (zh) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
de Haan et al. Magnesium sulfate therapy during asphyxia in near-term fetal lambs does not compromise the fetus but does not reduce cerebral injury
Shi et al. Panax notoginseng saponins administration modulates pro-/anti-inflammatory factor expression and improves neurologic outcome following permanent MCAO in rats
Geng et al. The effects of hyperbaric oxygen on macrophage polarization after rat spinal cord injury
US20170312310A1 (en) Use of nitrite salts in chronic ischemia
US10772827B2 (en) Composition for treating apoplexy through nasal administration
US11524055B2 (en) Methods for treating diseases mediated by ERBB4-positive pro-inflammatory macrophages
DE112011102356T5 (de) Pharmazeutische Kombinationszusammensetzung und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Zuständen, die mit dem Herz-Kreislauf-System in Verbindung stehen
CN111093748A (zh) 含有低浓度氙和氩的气体混合物提供神经保护作用而不抑制血栓溶解剂的催化活性
KR19980702724A (ko) 시티콜린을 이용한 경색크기의 감소 방법
KR20070004781A (ko) 인터페론-타우를 포함하는 약학적 조성물
CN104523676A (zh) 京尼平用于预防或治疗缺血性脑损伤的用途
ES2689042T3 (es) Uso de 3-n-butil isoindolina cetona en la preparación de fármacos para prevenir y tratar el infarto cerebral
CN109954112A (zh) 一种抗缺血性卒中的试剂盒及其应用
CN113117090B (zh) 以胞内蛋白纳米颗粒渗透压为靶点治疗人体水肿的药物组合物及应用
Lin et al. Metformin ameliorates neuronal necroptosis after intracerebral hemorrhage by activating AMPK
TWI736173B (zh) 牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物、牛樟芝菌絲體的液態培養萃取物的化合物及其用於治療缺血性腦中風的用途
Hou et al. Neuroprotective Effects of Vinpocetine Against Ischemia-Reperfusion Injury Via Inhibiting NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway
CN113827587A (zh) 丹酚酸a在制备预防血栓性脑缺血的药物中的应用
Anwar et al. Efficacy of intralesional injection of platlet rich plasma in combination with methoterexate in chronic plaque psoriasis
WO2017048157A1 (ru) Комбинаторная терапия для лечения геморрагического шока и последствий черепно-мозговой травмы
CN115300630B (zh) 贝母生物碱类化合物在制备预防和/或治疗脑缺血导致的疾病的药物中的应用
CN106668865B (zh) 用于治疗脑缺血的药物组合物、制剂及其应用
CN108853483B (zh) 经修饰的胸腺素β4在治疗脑缺血再灌注损伤方面的用途
CN108567920B (zh) 一种治疗急性缺血性中风的中药组合物
JP2008519032A (ja) Ｆｇｆ−２０の調合物、生成方法および使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40006090

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190702