CN109952526A - 用于分析显微镜的尺寸校准的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于分析显微镜的校准元件的实施方案,所述校准元件包括当通过光束照射时表现出对比度的特征的大致上非周期性的图案。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月8日提交的美国临时专利申请62/418,969的权益。该申请的内容通过引用全部并入本文中。
技术领域
本发明一般地涉及改进的校准刻度和用于校准分析显微镜的方法。
背景技术
通常认为,分析显微镜的不同实施方案用于各种应用,并且通常通过共用光束路径提供多种操作模式,用于检查样品。例如,配置用于化学分析或材料分析的分析显微镜的实施方案可以提供两种或更多种操作模式,所述操作模式包括可见光观察以及使用分析光束来检查感兴趣波长的样品,用于化学分析或材料分析。本领域普通技术人员应该理解,可以使用红外光、拉曼散射光或相关领域中通常使用的其他方法来实现化学分析或材料分析。
分析显微镜的典型实施方案产生以各种放大率级别拍摄的样品的图像,所述图像具有物理单位的精确尺寸和坐标,所述物理单位的精确尺寸和坐标实现了对图像中的样品进行详细分析。所使用的物理单位的实例对于相关技术中的普通技术人员是公知的(例如公制单位如微米(μm)、英制单位如英寸、比率(例如μm:像素)等等)。通常,每个图像中提供的尺寸刻度取决于用户所选择的光学配置(例如放大级别、附件等),并且重要的是每个图像中提供的尺寸刻度忠实于任何给定配置的显微镜的实际放大率。还应当理解,用于显微镜台的绝对位置基准对于能够使图像中的尺寸刻度与显微镜台的物理位置相关是重要的,使得例如用户可以在将来可靠地返回到标本上期望的感兴趣区域。
获取和应用精确比例因子和绝对坐标的过程通常被称为分析显微镜的“校准”。在某些情况下,使用校准的“镜台测微计”作为位置基准,通过费力且容易出错的过程实现校准。例如,镜台测微计通常包括掩模版,该掩模版包括精确刻度,所述刻度可以通过物镜观察或者通过显微镜(例如摄像机)使用光学成像部件成像。标准掩模版实施方案包括在单个轴上排序的一系列规则间隔的划分(例如,线或其他视觉指示器),当通过目镜或在图像中观察时,所述划分可以提供一个或多个参考元件。在当前描述的实施例中,两个掩模版划分可以提供参考点,使用参考点来计算像素中的距离值(例如,在掩模版上的两个选定点之间)。掩模版的划分的间隔被精确地校准且是已知的,使得基于该放大等级的转换因子可以被使用来确定处在该特定的显微镜配置处的尺寸刻度(例如μm:像素)。
通常理解的是,使用掩模版的基于视觉的校准过程容易出错,因为它需要用户手动选择掩模版上的点(例如,掩模版刻度线的边缘),该掩模版用于基于特别放大的距离的测量。如果需要在不同的轴上进行校准,则还必须使用不同的掩模版定向来重复该过程。例如,用户选择的点取决于特定用户的个人判断和意见,并且不一定是真实于掩模版刻度提供的精确位置,或者与掩模版刻度提供的精确位置一致。然后,用户选择的点的变化转换为所计算的像素数量的误差和从像素计算确定的合成信息。这种错误的可能后果的实施例包括可称为“图像配准误差”的内容,其指的是由于与各个图像相关联的刻度的不准确性而不能精确地对准多个图像(例如,连接的或重叠的图像)。
还通常认识到,标准掩模版实施方案受到以下事实的影响:它们受限于难以在宽范围的放大率和多个轴上使用的单个周期性刻度水平。例如,在分析显微镜的一些实施方案中可用的全范围放大率可以跨越约20倍的放大率变化,其中单个标准掩模版不具有足够的刻度以使得能够在整个范围内精确地分辨划分。换句话说,标准掩模版的刻度中的单个周期可以在特定的放大范围内工作,但是在更高的放大率下对视场中的划分数量具有严格的限制,并且不能解决在较低的放大率下的划分。因此,必须使用具有不同刻度的标准掩模版的多个实施方案,或者必须选择在单个标准掩模版实施方案的有限放大率范围内工作。
同样重要的是要注意,标准掩模版实施方案的周期性不适于使用校准软件进行自动化,校准软件通常不能识别产生精确校准结果所需的刻度上的每个标记。在本实施例中,采用标准掩模版的图像的傅立叶变换的校准软件通常产生多个最大值(例如,峰值)而不是可以精确地用于校准图像的尺寸刻度的单个最大值。
由于不能在整个宽的放大率范围内有效地校准而产生的另一个问题包括不能自动检测分析显微镜的放大率设置的水平(例如,识别物镜的放大率级别)。例如,当通过某种机制改变显微镜放大率设置时,通常没有通知计算机软件或用户的自动指示。相关领域的普通技术人员应该理解,放大率的改变可以通过用户(例如通过物镜的手动改变)或通过随时间的组件特性的改变(例如,光学配置的劣化)或响应于环境变化(例如,温度)发生。在某些情况下,自动识别系统中的组件的精心设计的设备可以提供放大级别与预期级别不同的一些指示,但即使这样的设备也可能出错。例如,使用不正确的放大率级别会导致有害的结果,例如物镜与样品或镜台之间的物理接触,所述物理接触可能潜在地损坏组件或使样品不可用。此外,使用不同的放大率设置进行的所假设的分析可以导致户或软件失去对样品上的期望的感兴趣区域的跟踪。
还应当理解,具有不同放大率级别的不同物镜通常相对于彼此在焦点的精确位置(有时也称为焦斑)处具有一些差异。此外,当物镜被移出光路,然后返回到所述光路(例如,可以包括在位置处的2.5μm的差)时,相同的物镜可以具有一定程度的焦斑位置差。这些差异可以被称为“偏心误差”,其可以导致所得图像中的元素的位置差异,而无需精确测量和计算偏移校正值。
因此,需要一种改进的校准刻度,其适于自动化并可在宽范围的放大率级别范围内使用。
发明内容
本文针对说明性而非限制性的实现方式来描述用于解决这些和其它需求的系统、方法和产品。各种替代、修改和等效物均是可能的。
描述了用于分析显微镜的校准元件的实施方案,所述校准元件包括大致上非周期性的特征图案,所述大致上非周期性的特征图案在被光束照射时呈现对比度。
此外,描述了放大率测量系统的实施方案,其包括:显微镜镜台,所述显微镜镜台配置用于在已知距离上平移;校准元件,所述校准元件设置在显微镜镜台上,所述校准元件包括在被光束照射时呈现对比度的大致上非周期性的特征图案;一个或多个检测器,所述检测器通过物镜收集特征的非周期性图案的多个图像;以及计算机,所述计算机被配置成基于平移之前和之后的非周期性图案的图像的相关性来确定物镜的放大率级别。
此外,描述了用于测量放大率的方法的实施方案,所述方法包括:获取在被光束照射时呈现对比度的特征的非周期性图案的图像,其中校准元件包括非周期性图案并且设置在分析显微镜的镜台上;将镜台平移已知距离;获取非周期性图案的第二图像;以及确定物镜的放大率级别,所述物镜基于第一图像和第二图像中的非周期性图案的相关性获取第一图像和第二图像。
另外,描述了用于确定图像之间的偏移的方法的实施方案,所述方法包括:获取在被光束照射时呈现对比度的特征的非周期性图案的光学图像,其中校准元件包括非周期性图案,并且被放置在分析显微镜的镜台上;获取非周期性图案的分析图像;以及基于光学图像和分析图像中的非周期性图案的相关性确定光学图像与分析图像之间的偏移。
上述实施方案和实现方式不一定是相互包含或排斥的,并且可以以不冲突和其它可能的任何方式组合,无论它们是与相同或不同的实施方案或实现方式相关联地呈现。一个实施方案或实现方式的描述并不旨在限制其它实施方案和/或实现方式。此外,在替代实现方式中,本说明书别处描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术可以与本发明内容中描述的任何一个或多个功能、步骤、操作或技术组合。因此,上述实施方案和实现方式是说明性的而不是限制性的。
附图说明
从以下结合附图的详细描述中将更清楚地理解以上和其它特征。在附图中,相同的附图标记表示相同的结构、元件或方法步骤,附图标记的最左边的数字表示其中参考元件首次出现的附图的编号(例如,元件120首次出现是在图1中)。然而,所有这些惯例均旨在是典型或说明性的,而不是限制性的。
图1是分析显微镜和相关计算机系统的一个实施方案的简化图示;
图2是图1的包括镜台和校准元件的分析显微镜的一个实施方案的简化图示;
图3是图2的校准元件的一个实施方案的实施例;
图4A和图4B是图2的示例不同的特征尺寸的校准元件的一个实施方案的实施例;
图5是图2中由相对于彼此偏移一定程度的校准元件的图案的两个图像的实施例;
图6A和图6B是识别图5的移位程度的互相关函数的结果的一个实施方案的实施例;
图7是图2中相对于彼此偏移一定程度的校准元件的图案的两个图像的实施例;
图8A和图8B是识别图7的移位程度的互相关函数的结果的一个实施方案的实施例;
图9是图2的校准元件的图案的光学图像和分析图像的实施例;
图10A和图10B是识别获得图9的图像的检测器之间的偏移程度的互相关函数的结果的一个实施方案的实施例;
图11A和图11B是识别十字线元件位置的函数的结果的一个实施方案的实施例;
图12是用于确定放大率级别的方法的一个实施方案的功能框图;
图13是用于确定分析图像与光学图像之间的一定程度的偏移的方法的一个实施方案的功能框图;
图14A是表示平移后的样品镜台位置的数据点的一个实施方案的实施例;
图14B是表示使用位置编码器进行平移后的样品镜台的位置的数据点的一个实施方案的实施例;
图15A是表示使用位置编码器进行平移后的样品镜台的位置的数据点的一个实施方案的实施例;以及
图15B是表示使用位置编码器和校准元件进行平移后的样品镜台的位置的数据点的一个实施方案的实施例。
在附图的全部多个视图中,相同的参考标记是指相对应的部分。
具体实施方式
如下面将更详细描述的,所描述的发明的实施方案包括校准元件,该校准元件包括大致上非周期性的特征图案,所述大致上非周期性的特征图案使在宽范围的放大率级别上能够校准分析显微镜。更具体地,大致上非周期性的图案包括多维度的特征,所述多维度的特征使得校准软件能够使过程自动化并产生优异的结果,尤其是当与需要视觉检查的手动方法相比较时。
图1提供了能够与计算机110和样品130交互(例如,用于加载到分析显微镜120中)的用户101以及计算机110与分析显微镜120之间的网络连接的简化说明性示例。应当理解,图1的实施例示例了元件之间的直接网络连接(例如,包括由闪电螺栓表示的有线或无线数据传输),然而示例性网络连接还包括经由其他装置(例如,开关、路由器、控制器和计算机等),并且因此不应被视为限制性的。
计算机110可以包括任何类型的计算机平台,例如工作站、个人计算机、平板电脑、“智能电话”、服务器、计算集群(本地的或远程的)或任何其它现有或未来的计算机或计算机群。计算机通常包括已知组件,例如一个或多个处理器、操作系统、系统存储器、存储器存储设备、输入输出控制器、输入输出装置以及显示设备等。还应当理解,可以使用不止一种计算机100的实现方式来在不同实施方案中执行各种操作,因此图1中的计算机110的表示不应被视为限制性的。
在一些实施方案中,计算机110可以采用包括计算机可用介质的计算机程序产品,计算机可用介质具有存储在其中的控制逻辑(计算机软件程序,包括程序代码)。当由处理器执行时,控制逻辑使处理器执行本文描述的一些或全部功能。在其它实施方案中,一些功能主要在使用例如硬件状态机的硬件中实现。执行硬件状态机以便执行本文描述的功能对于相关领域的技术人员来说是显而易见的。同样在相同或其它实施方案中,计算机110可以采用因特网客户端,所述因特网客户端可以包括能够经由网络访问远程信息的专用软件应用程序。网络可以包括本领域普通技术人员公知的许多不同类型的网络中的一个或多个。例如,网络可以包括局域网或广域网,所述局域网或广域网采用通常被称为TCP/IP协议栈的协议来进行通信。网络可以包括具有互连的计算机网络的全球系统的网络,所述网络通常被称为因特网,或者还可以包括各种内部网架构。相关领域的普通技术人员还将理解,网络环境中的一些用户可能更喜欢使用通常被称为“防火墙”(有时也被称为包过滤器或边界保护装置)的设备来控制进出硬件系统和/或软件系统的信息流量。例如,防火墙可以包括硬件元件或软件元件或其某种组合,并且通常被设计成强制执行由用户(例如网络管理员等)设置的安全策略。
在本文所述的实施方案中,分析显微镜120可包括当前可用的或将来可用的任何分析显微镜。例如,分析显微镜120可包括Olympus BX51显微镜,其可配备有0.5x摄像机适配器和1/4英寸对角CCD摄像机(例如Sen-Tech STC-C83USB-AT-B),其在旁边具有测量4.65微米的方形像素。同样在所描述的实施方案中,镜台210被机动化并且进行位置校准(例如,先前H7550T)。
在图2所示的示例性实施例中,分析显微镜120包括配置用于平移已知距离的镜台210和设置在镜台210上的校准元件220。在本文描述的实施方案中,镜台210被机动化并且可以在一个或多个软件和/或固件实施方案的操作控制下。此外,精确地校准镜台210的平移,使得平移距离非常准确。校准元件220的实施方案可以包括各种物理配置,包括但不限于未连接的元件,例如透明/不透明的滑动件或“晶片”(例如硅晶片等),其被配置成与台210或元件直接耦合。与显微镜载物台210相关联(例如,安装的板、贴纸、印刷元件、涂漆元件等)。例如,校准元件220可以设置在透明载玻片的底表面上(例如,以相关领域中已知的一些其他方式印刷/涂漆、压印、蚀刻或粘附),使得其可以从上方成像(例如,图案可以通过载玻片成像)。在一些应用中,载玻片的顶表面的焦平面与载玻片的底表面的焦平面之间的距离(例如,由于载玻片的厚度)可以是有用的。此外,当样品130放置在载玻片的顶表面上以供分析显微镜120分析时,校准元件220的一个或多个区域可以是可见的(例如,不被样品130遮挡),使得校准元件220的特征可以,例如,在获取样品130的图像的过程中用于实时分析。还应当理解,校准元件220可以设置在载玻片的顶表面上,因此该实施例不应被视为限制性的。
校准元件220的实施方案包括多维的大致上非周期性的图案230,所述图案包括特征,所述特征在由可见光(例如可以包括具有对人眼可见的波长范围的光或者可以包括具有单个可见波长的单色光)束或分析光束照射是表现出对比度。分析显微镜120的实施方案包括一个或多个光学图像检测器,所述光学图像检测器通常响应于可见光(例如摄像机)通过显微镜物镜240的实施方案收集与校准板220相关联的图案230的图像。在一般情况下,分析显微镜120的实施方案包括物镜240的多个实施方案(例如,2、4、6个等),每个实施方案均提供不同的放大率级别。重要的是,物镜240的一些实施方案可以在它们各自的放大率级别下提供与另一实施方案的重叠视场,并且与分析显微镜120相关联的物镜240的所有实施方案的组合提供宽范围的放大率级别。此外,分析显微镜120的实施方案包括一个或多个分析图像检测器,所述分析图像检测器通常响应于分析光(例如光谱仪)通过显微镜物镜240收集与校准板220相关联的大致上非周期性的图案230的图像。
图3中示例了校准元件220的示例性实施方案,所述校准元件220包括反射和吸收光的波长的不同特征。例如,校准元件220包括图案230,所述图案230包括大致上非周期性特征结构的多维水平,其中通过可见光束或分析光束照射时,个体的特征表现出对比度。本文所使用的术语“非周期性”通常是指特征类型(例如,亮特征类型或暗特征类型)的出现,所述特征类型相对于其他特征类型大致上不以规则间隔重复。如上所述,适用于化学分析或材料分析的任何光束适合于分析光束,例如激光束(例如通常用于分析拉曼散射)或红外光束。特别是,图3示出的校准元件220,所述校准元件220包括可以被称为粗略特征结构和细致特征结构的那些,所述粗略特征结构和细致特征结构的每一个在大致上非周期性设置中发生。在所描述的实施方案中,图案230可以在与物镜240的实施方案的视场相关联的校准元件220的至少两个区域上大致上是非周期性的。在一些实施方案中,第一区域可包括范围为50μm至600μm(例如500μm)之间的尺寸,并且第二区域可以包括在范围为5μm至60μm之间的尺寸(例如50μm)。例如,用于区域的镜台210的平移距离应足够大,使得所述镜台在包括用于获取图像的物镜240的视场的图像中行进至少一个像素距离。此外,所采用的平移距离不应超过图像中总视场的约1/2。在当前描述的实施例中,当超出范围的限制时,下面描述的相关函数可能变得越来越不有效。
图3还包括十字线315,所述十字线315可用作与校准元件220相关联的位置基准。例如,如下面将更详细描述的那样,校准软件可以使用十字线315作为位置基准来确定校准元件220内的感兴趣区域和/或定位位置。
图4A示出了包括大特征420的阵列的图案230的另一实施例,所述图案作为大致上正方形的亮区域以及大致上正方形的暗区域两者出现。在一些实施方案中,亮区域包括反射结构(例如像镜子),暗区域可以包括吸收结构(例如像砖墙)或者在一些实施方案中可以包括透射结构(例如像窗户)。图4A还提供了沿着图案230的边缘的大刻度453的实施例,所述刻度示例了大特征420的边界。例如,在图4A的实施例中所示例的实施方案中,图案230包括具有80行和80列的大特征420的正方形尺寸。然而,应当理解,图案230可以根据各种因素和条件而具有不同数量的行和列,因此图4A的实施例不应被视为限制性的。
从图4A中还可以明显看出,大特征420包括大致上非周期性的结构,其中例如图案230中的光反射结构或光吸收结构不呈现大致上重复的图案。此外,在所描述的实施方案中,每个大特征420的组成是随机的,具有光反射结构或光吸收结构的相同概率,但是应当理解,可以容忍某种程度的周期性并且被认为是在本发明的范围内。例如,图案230中的周期性程度可导致多个附加峰值(例如,除了通过如下所述的互相关函数计算的“最大值”之外)。在某些实施方案中可以容忍额外的峰值,并且因此可以容忍周期性程度,只要峰值比与计算的最大值相关联的峰值更小并且更暗(例如,容易可与最大值区分)。同样在本示例中,图案230可以包括在远离感兴趣区域的距离刻度的区域中的一些重复(例如,包括用于校准操作的两个或更多个视场)。换句话说,包括来自第一区域的重复的区域被分开一足够的距离,使得使用图案230的第一区域的多个视场对校准操作没有影响。还应当理解,在本文描述的实施方案中,大特征420的尺寸以及小特征430中存在一致性,所述一致性也是可以容忍的。然而,大特征420和/或小特征430的尺寸的变化也可以被采用来进一步增加图案230的大致地非周期性质,因此被认为在所描述的发明的范围内。
另外,在图4A中可见的每个大特征420内存在可识别的精细结构尺寸,所述精细结构尺寸在图4B中进一步例证,图4B提供图4A的区域460的放大视图。如图4B的示例中所示例的那样,精细结构尺寸包括小特征430,所述小特征430再次设置成光反射结构和光吸收结构的大致上非周期性的图案。图4B还提供了沿着区域460的边缘的小刻度457的实施例,所述小刻度示例了在每次出现大特征420时的小特征430的边界。应当理解,在大特征420的大致上亮的实施方案中,小特征430的大致上亮的实施方案以比暗实施方案以更高的频率发生,尽管本质上仍然大致上是非周期性的。例如,小特征430的亮实施方案可以在大特征420的大致上亮的的实施方案中以大约75%的概率(例如,>50%且<100%)发生。类似地,在大特征420的大致上暗的实施方案中,小特征430的大致上暗的实施方案以比亮的实施方案以更高的频率发生。同样,在本实施例中,小特征430的暗的实施方案可以在大特征420的大致上较暗的实施方案中以大约75%的概率发生(例如,>50%且<100%)。
继续图4B的实施例,小特征430的每个实施方案可以包括已知尺寸的正方形形状,但是其他形状也是可能的(例如六边形等)。例如,小特征430的实施方案在分析显微镜120的最高放大率下应该大于与检测器实施方案相关联的像素。因此,如果在最高放大率级别处的像素为约等于校准元件220上的1μm的物理距离,则小特征430的尺寸应该大于1μm。通常,每个大特征420均包括设定数量的行和列的小特征430。例如,在一些实施方案中,大特征420可以包括具有8行和8列小特征430的正方形形状,如图4B中可见的那样(例如,使用刻度453和457作为参考)。再次,取决于各种因素和条件,大特征420可具有不同数量的行和列,因此图4B的实施例不应被视为限制性的。
在本文所描述的实施方案中,可以采用软件程序来生成校准元件220的图案230。例如,软件程序可以在与分析显微镜120相关联的计算机110上或在任何其他计算机上运行,并且可以被配置成改变参数,使得程序的每次运行均产生图案230的不同配置。例如,软件程序可以采用随机数发生器的“重新种子”方法来产生图案230的独特特征配置。
而且,图案230中的个体特征应该被适当地确定尺寸,使得在与分析显微镜120相关的物镜240的实施方案的每个放大率级别下从校准元件220获取的图像的视场中存在至少3个清晰可辨的特征(例如,大特征430或小特征420)。因此,校准元件220上的图案230的多维方面提供了超过标准掩模版实施方案的明显优势。重要的是,图案230的大致上非周期性的多维结构在宽范围的放大率级别上支持本文所述的校准和对准过程。例如,校准元件220的单个实施方案可以在大约38:1的范围内使用。在本示例中,该范围可以包括由可以与分析显微镜120一起使用的4x、100x和150x物镜提供的放大率级别,但是应当理解,也可以使用由物镜240的实施方案提供的其他组合和范围。。而且,校准软件可以使用大特征420、小特征430或两者来执行各种校准操作。
在一些实施方案中,可以在可见光束或分析光束的反射中表现出对比度。在所描述的实施方案中,校准元件220的非周期性多维图案包括反射可见光束和分析光束两者的特征(例如金属涂覆的特征)以及吸收可见光束和分析光束的特征(例如黑铬涂层特征或光刻胶涂层特征)。例如,校准元件220的图案230可以制造为熔融石英上的黑铬涂层特征的图案。在本例中,校准元件220可以包括约3.2mm的在侧面的正方形尺寸,并且图案230可包括约40μm的在侧面的大特征420和约8μm的在侧面小特征430。重要的是,在一些实施方案中,没有必要校准图案230的个体特征的尺寸,以获得物理距离的绝对精度。例如,通常校准机动化镜台210的实施方案以提供精确的运动和位置。因此,图案230的多维尺度使得能够通过使用图像中的参考点(例如,特征420和/或430)之间的测量数量的像素与行进的实际物理距离(例如,从镜台210平移的精确距离)来精确计算由分析显微镜120所采用的任何放大率级别。通过知晓物镜240的每个实施方案的μm/像素物理距离的比率,放大率级别被容易地计算出,并且不需要与图案230相关联的特征的确切物理尺寸的知识。
如上所述,计算机110包括处理器和用于在其上执行所存储的软件。当前描述的发明的实施方案包括一个或多个软件应用程序,所述软件应用程序被配置成基于校准元件220平移一定距离之前和之后的图案230的两个或更多个图像的相关性来确定校准元件220的物理距离的偏移以及物镜240的放大率级别。例如,在一些实施方案中软件应用程序执行图像移位分析,包括比较两个图像中的特征的相对位置,其中与第二图像中的校准元件220相关联的特征的位置已经从第一图像的位置改变一定程度。图5提供了第一图像510和第二图像520的示例性实施例,第一图像510和第二图像520的每个均包括视场内的特征505的图像(例如,小特征430的实施方案)。在本实施例中,特征505的左边缘位于第一图像510中的x轴上的大约+200像素位置处,相对于特征505的左边缘的位置位于第二图像520中的x轴上的大约0像素位置处。应当理解,方向(例如,X/Y;+/-)和移位幅度可以变化,因此图5不应该被认为是限制性的。
在本文描述的一些或所有实施方案中,镜台210的校准被认为是尺寸基准。在一些实施方案中,图像偏移可以在X轴或Y轴的特定放大率下高达图像的视场的约50%,并且最小图像偏移可以包括像素的一部分(例如像素的1/2、1/3或1/4)。以像素为单位找到图像偏移的幅度可以使用各种方法来执行,例如通过如下所述的互相关函数。同样在所描述的实施方案中,可以在第二轴线(例如,X轴中的第一移位和Y轴上的第二移位)中进行第二移位,这使得能够对每个轴线进行单独的校准。例如,这种方法对于不具有正方形像素形状的摄像机是有用的。
例如,使用包括在图像之间的x和/或y方向上相对于彼此移位的特征的两个图像g1和g2,傅里叶相关函数C是:
C=||F-1(F(g1)F(g2)*)|| 方程式1
其中:
g1和g2包括二维像素阵列g1(x,y)和g2(x,y);
F(g)是二维傅立叶变换;
F-1(G)是二维逆傅里叶变换;
**是复共轭;以及
||g||是绝对值
图6A提供了位于图像中的位置(x,y)处的所计算的最大值610(例如,亮点对应于互相关函数的最大值)的示例性实施例,所述位置(x,y)等于相对于第二图像520的第一图像510中的特征之间的像素位移。如本文所述,有利的是,图案230大致上是非周期性的,以确保结果仅存在一个最大的互相关函数。图6B进一步显示了与计算的最大值610相关的峰值的水平剖面和垂直剖面以及精确计算的移位值。在本实施例中,图6B显示了0.73垂直像素和209.67水平像素的图像偏移。重要的是要注意,在本实施例中,在计算出的像素位移值被解析到小于一个像素然后将其转换成物理距离测量,本实施方案中所述物理距离测量包括在水平镜台上的10μm的水平偏移。小于一个像素的图像中的非预期的小垂直偏移可归因于摄像机围绕分析显微镜120的光轴相对于镜台的坐标轴的旋转,所述旋转在第一图像的获取与第二图像的获取之间发生。识别这种旋转的能力是自动化系统的有益且重要的特征。还应当理解,图像之间的图案230的一些旋转是可能的(例如,具有镜台平移的错误,用户干预等),其中类似地识别旋转。
如上所述,软件应用程序可以计算显微镜物镜240的放大率级别。例如计算互相关函数后,软件执行将像素数的所计算的移位(例如,来自互相关函数)乘以摄像机的像素尺寸(例如,以μm/像素为单位)以及将该结果除以在镜台210上的校准元件220的实际平移距离(例如以μm为单位)的操作,所述操作的结果然后除任何相机中继透镜放大率(例如反转图像并延伸光学管的透镜或透镜组)。继续图5、图6A和图6B的实施例,计算的物镜240的放大率级别为:
(209.67*4.65)/10/1=97.49
继续本实施例,软件然后可以基于计算的放大率级别与表格中列出的物镜240的实施方案之间的最接近匹配来识别分析显微镜120中的物镜240,所述表格为列表中的物镜240的每个实施方案提供放大率级别。在该实施例中,软件将物镜240识别为安装在分析显微镜120中的物镜240的100x实施方案。这在利用自动聚焦例程的分析显微镜120的实施方案中是重要的,其中物镜240的不正确识别可导致使用不正确的参数(例如,基于物镜240的不同实施方案的特性)。在一些情况下,这会产生灾难性的结果,其中一个或多个部件(例如,物镜240、显微镜镜台210、校准元件220)可能通过因试图使用错误的参数聚焦图像而使物镜240与镜台210碰撞而发生损坏。
在单独的实施例中,包括10x的放大率级别和0.5x的照相机中继透镜放大率的物镜240实施方案用于捕获校准元件220的第一图像710,平移校准元件220的100μm的物理距离,并随后捕获如图7的实施例中提供的校准元件220的第二图像720。在本实施例中,软件应用程序使用大特征420来计算最大值810,所述最大值810包括相对于图像720的图像710的0.565垂直像素和108.056水平像素的图像偏移,如图8A和图8B所显示的那样。因此,在本实施例中,软件应用程序计算物镜240的放大率级别为:
(108.056*4.65)/100/0.5=10.05
此外,如本文所述,分析显微镜120的一些实施方案可包括提供分析光束的一个或多个元件和相关联的检测元件,例如通过物镜240收集校准元件220的分析图像的光谱仪。在一些或所有所描述的实施方案中,软件应用程序可以以与用于计算移位的方法相同的方式使用分析图像,如针对上述光学图像所描述的那样。另外,软件应用程序可以使用校准元件220的相同实施方案来使用光学图像和分析图像的组合。例如,使用本文所述的方法,软件应用程序计算移位值,以测量摄像机与光谱检测器之间的相对对准,所述相对对准然后通过机械对准它们或通过再处理软件中的图像来用于对准两个检测器。这很重要,因为视频图像通常用于识别样品130上的感兴趣点以进行光谱分析。而且,良好的配准为用户101提供了信心,即光谱测量忠实地表示样品130的空间特征。
图9提供了分析图像910和视频图像920的示例性实施例,两者均取自校准元件220的大约相同区域。校准元件220的照明被从下面提供,以及光谱仪使用50x的放大率级别(例如使用约2μm点尺寸)通过物镜240收集透射光。然后软件应用程序计算出“chemigram”,它是表示在每个点收集的光的总强度的光谱图像。在本实施例中,当与导致分析图像910的粗略外观的视频图像相比时,光谱仪具有有限的空间分辨率。虽然该现象,但是图像偏移计算相对不受影响,如图10A和10B的实施例所示,其示出了计算的最大值1010。因此,如图10A和10B中提供的实施例所示的那样,虽然两个图像是以不同的方式并且在不同的分辨率和噪声水平下收集的,但是软件应用程序准确地报告了0.31像素的垂直移位和22.05像素的水平移位。
而且,如上所述,所描述的实施方案包括确定校准板220相对于物镜240的绝对位置并且在一些情况下镜台210的位置的能力。例如,如图3所示,十字线315的位置可以由光学图像中的强度值场中的“倾角”表示。在一些情况下,这可以包括跨越图案230的对比度的大约50%的差异,所述图案230由软件应用程序识别。例如,软件应用程序将沿X轴(例如水平方向)和Y轴(例如垂直方向)的场强值相加以生成轮廓,例如图11A中所示的类型。软件可以进一步分析轮廓,以识别可以测量到像素的一小部分内的每个倾角的质心,如图11B中的X轴所示。在本实施例中,X轴或Y轴的质心可以位于距表示图像中的十字线315的位置的零(例如0)位置一定距离处。例如,在一些像素中,对于X轴,距离零的十字线315的垂直距离,以及对于Y轴,距离零的十字线315的水平距离。然后,软件应用程序可以使用镜台210将校准元件220的位置偏移一些期望的程度,以将物镜240的视场与期望的位置对准。
在一些实施方案中,十字线315可以用来查找可以被称作为“有效”位置的内容。例如,可以使用具有低放大率级别的物镜240的实施方案,使得十字线315处于视场中(例如,镜台210也可以在一个或多个方向上平移)。使用如上所述的互相关方法校准视频刻度(每单位距离的像素),并且根据图像中“倾角”的质心确定十字线的位置。然后将镜台210移动到十字线315在视频图像中居中的位置,并且将镜台210的位置记录为“有效”位置。在相同或替代实施方案中,十字线315可以用来找到物镜240的每个实施方案中不同的“有效”位置。例如,物镜240的一些实施方案可以被识别为“偏心的”(例如,彼此不完全同心,而是简单地确保物镜240共享它们的视场的一部分)。十字线315可用于为每个物镜确定单独的“有效”位置,使得每个物镜240的焦点均位于相同位置处,从而允许自动移除定心误差。在一些实施方案中,可以针对每个物镜240预先计算X/Y偏移值,并针对透镜的特定特征将其用于图像处理中。此外,如果通过物镜240的实施方案的移动发生偏心误差,使得物镜240的相同实施方案的焦点不重复返回相同位置,则图案230可用于在物镜240发生变化的每次动态地计算偏移值。
图12提供了用于确定物镜240的放大率级别的方法的说明性实施例,所述方法在步骤1200处开始,校准元件220设置在镜台210上。在步骤1205处,从校准元件220的区域获取图案230的图像(例如,光学的或分析的图像)(例如,区域取决于物镜240的视场),镜台210在步骤1210处沿着X轴和/或Y轴平移一定程度,并且在步骤1215处,在校准元件220的第二区域处获取图案230的第二图像(例如光学或分析的图像)。然后在步骤1220处,通过关联如上所述的第一图像和第二图像中的图案230的各方面来确定物镜240的放大率级别。如果希望识别物镜240,如决策元件1230所示的那样,则是所确定的放大率级别与分析显微镜120相关的物镜240的实施方案的已知放大率之间最接近的匹配的物镜240的实施方案被选择,并且该方法在步骤1299处结束。
图13还提供了用于确定光学图像与分析图像之间的偏移程度的方法的示例性实施例,该方法在步骤1300开始,校准元件220设置在镜台210上。在步骤1305处,从校准元件220的区域获取图案230的光学图像(例如,区域取决于物镜240的视场),并且在步骤1315处,获取在校准元件220的相同区域处的图案230的分析图像。然后在步骤1320处,通过关联如上所述的光学图像和分析图像中的图案230的各方面来确定偏移程度,并且该方法在步骤1399处结束。
实施例:
在一些实施方案中,分析显微镜120可以采用一个或多个“位置编码器”(有时也称为“位置传感器”)来将驱动误差控制为零,电机的实施方案用于平移镜台210的位置(例如,步进电机)。例如,图14A示例了表示使用步进电机进行平移后的镜台210的位置的数据点,该步进电机使镜台210移动设定数量的“步骤”。可以容易地看出,由位置编码器补救的位置之间的距离存在高度的可变性,如图14B所示的数据点所示的那样。
然而,即使使用位置编码器,即使当编码器指示级210处于正确位置时,镜台210也易受可能显著影响镜台位置的精度的条件的影响。例如,图15A示例了当使用位置编码器时从镜台210的位置获得的数据点。然而,由于温度变化引起的“热漂移”,镜台210的实际位置可以显著变化。图15B示例了使用校准元件220测量的如图15A所示的相同镜台位置的数据点。可以容易地看出,镜台210的位置稳定地偏离由位置编码器识别的位置(例如,在图15B的Y轴上)。此外,图15B还示出了分析显微镜120可能经历某种物理冲击,导致最后三行数据点变得彼此更接近(例如,在图15B的X轴上)。在本实施例中,校准元件220的使用与位置编码器的使用互补,并且在一些实施方案中可以用作位置编码器的替代。
已经描述了各种实施方案和实现方式,对于相关领域的技术人员来说,显然前述仅是说明性的而非限制性的,仅通过示例的方式给出。用于在所示实施方案的各种功能元件之间分配功能的许多其它方案是可能的。在替代实施方案中,任何元件的功能均可以以各种方式执行。
Claims (38)
1.一种用于分析显微镜的校准元件,其包括当被光束照射时呈现对比度的特征的大致上非周期性的图案。
2.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述光束包括激光光束。
3.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述分析光束包括红外光束。
4.权利要求1所述的校准元件,其中所述对比度在所述光束的反射中表现。
5.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述大致上非周期性的图案包括多个多维特征。
6.根据权利要求5所述的校准元件,其中所述多个多维特征包括大特征和小特征。
7.根据权利要求6所述的校准元件,其中每个大特征均包括多个小特征。
8.根据权利要求6所述的校准元件,其中所述大特征包括约40μm的正方形尺寸,以及所述小特征包括约8μm的正方形尺寸。
9.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述大致上非周期性的图案包括反射所述光束的特征和吸收所述光束的特征。
10.根据权利要求9所述的校准元件,其中反射所述光束的特征包括金属涂覆的特征。
11.根据权利要求9所述的校准元件,其中吸收所述光束的所述特征包括黑色镀铬的特征。
12.根据权利要求9所述的校准元件,其中吸收所述光束的所述特征包括光致抗蚀剂涂覆的特征。
13.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述大致上非周期性的图案还包括十字线。
14.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述图案在至少两个平移距离上是非周期性的。
15.根据权利要求14所述的校准元件,其中所述第一平移距离在50μm至600μm之间的范围内,并且所述第二平移距离在5μm至60μm之间的范围内。
16.根据权利要求1所述的校准元件,其中所述大致上非周期性的图案被设置在载玻片上。
17.根据权利要求16所述的校准元件,其中所述大致上非周期性的图案被设置在所述载玻片的底表面上,使得所述大致上非周期性的图案从上方通过所述载玻片成像。
18.一种放大率测量系统,其包括:
显微镜镜台,所述显微镜镜台被配置用于在已知距离上平移;
校准元件,所述校准元件设置在所述显微镜镜台上,所述校准元件包括在被光束照射时呈现对比度的特征的大致上非周期性的图案;
一个或多个检测器,所述检测器通过物镜收集特征的非周期性图案的多个图像;以及
计算机,所述计算机被配置成基于平移之前和之后的所述非周期性的图案的图像的相关性来确定所述物镜的放大率级别。
19.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述计算机被进一步配置成以基于所述所确定的放大率级别与每个均与物镜的实施方案相关联的多个放大率级别中的一个之间最接近的匹配来确定获取所述图像的所述物镜。
20.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述检测器包括光谱仪。
21.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述检测器包括光学照相机。
22.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述对比度在所述光束的反射中呈现。
23.根据权利要求22所述的放大率测量系统,其中所述非周期性的图案包括反射所述光束的特征和吸收所述光束的特征。
24.根据权利要求23所述的放大率测量系统,其中反射所述光束的所述特征包括金属涂覆的特征。
25.根据权利要求23所述的放大率测量系统,其中吸收所述光束的所述特征包括黑色镀铬的特征。
26.根据权利要求23所述的放大率测量系统,其中吸收所述光束的所述特征包括光致抗蚀剂涂覆的部分。
27.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述校准元件包括十字线元件。
28.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述图案在至少两个平移距离上是非周期性的。
29.根据权利要求28所述的放大率测量系统,其中所述第一平移距离在50微米至600微米之间的范围内,并且所述第二平移距离在5微米至60微米之间的范围内。
30.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述校准元件设置在安装在所述显微镜镜台上的样品载玻片上。
31.根据权利要求30所述的放大率测量系统,其中所述校准元件设置在所述载玻片的底表面上,使得所述校准元件通过所述载玻片从上方成像。
32.根据权利要求18所述的放大率测量系统,其中所述校准元件被安装在所述显微镜镜台上。
33.一种用于测量放大率的方法,包括:
获取在被光束照射时呈现对比度的特征的非周期性的图案的图像,其中校准元件包括所述非周期性的图案,并且被设置在分析显微镜的镜台上;
在已知距离上平移所述镜台;
获取所述非周期性的图案的第二图像;以及
基于在所述第一图像和所述第二图像中的非周期性的图案的相关性,确定获取所述第一图像和所述第二图像的物镜的放大率级别。
34.根据权利要求33所述的方法,其还包括基于所述所确定的放大率级别与每个均与物镜的实施方案相关联的多个放大率级别中的一个之间的最接近匹配来识别获取所述第一图像和所述第二图像的所述物镜。
35.根据权利要求33所述的方法,其中所述第一图像和所述第二图像包括分析图像。
36.根据权利要求33所述的方法,其中所述第一图像和所述第二图像包括光学图像。
37.一种用于确定图像之间偏移的方法,包括:
获取当被光束照射时呈现对比度的特征的非周期性的图案的光学图像,其中校准元件包括所述非周期性图案,并且被设置在分析显微镜的镜台上;
获取所述非周期性的图案的分析图像;以及
基于所述光学图像和所述分析图像中的所述非周期的图案的相关性来确定所述光学图像和所述分析图像之间的偏移。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述偏移指示光学检测器与分析检测器之间的相对对准的差异。
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