CN109952033A - 用于减少微生物的强制空气臭氧反应器 - Google Patents

用于减少微生物的强制空气臭氧反应器 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于灭活细菌和/或减少食品或其容器上的微生物数量的装置，所述食品或其容器易受到表面和次表面微生物存在的影响，所述装置包括可密封室，所述可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体流动穿过可密封室的抽空风扇。本发明还提供了一种用于灭活细菌和/或减少食品或其容器上的微生物数量的方法，所述食品或其容器易受到表面和次表面微生物存在的影响，所述方法包括a)在可密封室中提供多个食品或容器，所述可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过可密封室的抽空风扇；b)通过调节可密封室中的湿度达到预定的湿度，在食品或容器的表面上产生冷凝；c)运行臭氧发生器和抽空风扇以产生预定的排气速度，使臭氧发生器产生的臭氧气体在一段预定的停留时间内穿过可密封室；和d)从可密封室排出臭氧气体。本发明进一步提供了一种用于降低容器中或容器上的细菌、酵母、霉菌和霉病的水平的方法。

Description

用于减少微生物的强制空气臭氧反应器
技术领域
本发明一般涉及用于减少食品及其容器中微生物数量的方法和装置。在此参考苹果描述了本发明的方法和装置，以助于理解本发明。然而，本领域技术人员应该清楚，所述方法和装置的适用性不限于苹果。相反，所述方法和装置可以适用于减少易受到不良表面和次表面(sub-surface)微生物存在的影响的其他产品的微生物数量，如其他水果和蔬菜、蜂蜜(beehives)及其容器。
背景技术
2014年12月，美国多个州爆发的李斯特菌病与涂覆有焦糖的苹果消费有关。在接下来的几个月里，一项调查显示李斯特菌来源于受影响的苹果表面，其中，在生产过程中，用作手柄的签子刺破苹果时，随之将李斯特菌引入苹果内部。虽然由糖苹果引起李斯特菌病的风险仍然被认为很低，但在焦糖苹果的生产过程中，仍需要采取预防的措施。
这种预防的措施的一个例子是在水性消毒杀菌剂中清洗苹果。但是，由于成本和空间限制以及将水引入生产设施的顾虑，水洗系统并不总是实用的。此外，这种消毒方式在去除污染方面的效力有限(减少量<1log cfu)，并且可能导致交叉污染(Perez-Rodriguezet al.,2014,“Study of the cross-contamination and survival of Salmonella infresh apples”,International Journal of Food Microbiology,184,92-97，其全部的公开内容通过引用并入本文)。此外，苹果上的残留水分阻碍了苹果上焦糖的涂覆，从而在生产过程中造成困难。因此，无水方法(例如，过氧化氢蒸气)更加适合于糖苹果的生产，而且，与传统的收获后的清洗方法相比，无水方法已被证明能有效净化产品(Back et al.,2014,“Effect of hydrogen peroxide vapor treatment for inactivating SalmonellaTyphimurium,Escherichia coli 0157:H7and Listeria monocytogenes on organicfresh lettuce.”Food Control,44,78-85，其全部的公开内容通过引用并入本文)。
臭氧与抗微生物活性有关，并被美国食品和药物监督管理局指定为一般认为安全(GRAS)。(参见，例如，Sharma and Hudson,“Ozone gas is an effective and practicalantibacterial agent”,Am J Infect Control.2008Oct；36(8):559-63，其全部的公开内容通过引用并入本文)。，例如，美国专利号6,485,769和6,162,477描述了使用含臭氧的溶液对食品进行净化的方法。但是，水通常是食品生产设施中的污染源。此外，如上文所述的无水方法更适用于某些类型的食品，包括糖苹果。
最近，建议使用臭氧气体。(参见，例如，Khadre et al.,2001,“Microbiologicalaspects of ozone applications in food:A review”,Journal of Food Science,66,1262-1252，其全部的公开内容通过引用并入本文)。之前的研究表明，在储藏室的气氛中引入臭氧可以减少水果上的微生物量(Yaseen et al.,2015,“Ozone for post-harvesttreatment of apple fruits”,Phytopathologia Mediterranea,54,94-103，其全部的公开内容通过引用并入本文)。但是，在储藏室中以较低的水平(0.5-2ppm)施加臭氧，以防止设备过度腐蚀以及减少对工人的危害。因此，需要延长暴露时间来实现微生物的减少，虽然接触每一个苹果都具有挑战。
本发明涉及方法和装置，该方法和装置利用强制气流引入的气态臭氧来减少食品(如水果和蔬菜、蜂蜜及其容器)中的微生物，特别是李斯特菌数量。本发明还适用于减少塑料容器表面上的总需氧量以及酵母和霉菌水平。根据本发明，利用强制空气引入臭氧，使得使用更高的臭氧浓度成为可能，并便于控制甚至是(相对被动的)气流穿过多个物体(例如苹果)的容器。当在苹果加工系统的干燥部分的早期阶段引入臭氧时，会获得额外的优势。在这个阶段，水果周围的相对湿度很高，所以从理论上讲，微生物细胞对臭氧致死效应的敏感性增加(Miller et al.,2013,“A review on ozone-based treatments for fruit andvegetables preservation”,Food Engineering Reviews,5,77-106and de Candia etal.,2015,“Eradication of high viable loads of Listeria monocytogenescontaminating food-contact surfaces.Frontiers in Microbiology,6,12，其公开的内容通过引用并入本文)。
发明内容
本发明提供了一种用于灭活细菌和/或减少易受到表面和次表面微生物存在的影响的食品或其容器上的微生物数量的方法，所述方法包括在可密封室中提供多个所述食品或容器，该可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过可密封室的抽空风扇；通过调节可密封室中的湿度达到预定的湿度，在食品或容器的表面上产生冷凝；运行臭氧发生器和抽空风扇，以产生预定的排气速度，使臭氧发生器产生的臭氧气体在足以杀死99-99.999％的细菌的一段预定的停留时间内穿过可密封室；以及从可密封室排出臭氧气体。
本发明还提供一种用于降低容器中或容器上的细菌、酵母、霉菌(mold)和霉病(mildew)的水平的方法，所述方法包括在可密封室中提供一个或多个所述容器，该可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过可密封室的抽空风扇；通过调节可密封室中的湿度达到预定的湿度，在容器的表面上产生冷凝；运行臭氧发生器和抽空风扇以产生预定的排气速度，使臭氧发生器产生的臭氧气体在一段预定的停留时间内穿过可密封室；以及从可密封室排出臭氧气体。
附图说明
图1：示出了根据本文所述的本发明的实施方案的装置的图示。
图2：说明了根据本发明的实施方案用于减少苹果中微生物数量的方法的步骤1(冷凝)。臭氧滑门关闭。包裹苹果的箱和罩(hood)往下放。门打开。运行干燥器的排气风扇，向上穿过苹果抽出暖空气，并在苹果表面上产生冷凝。
图3：说明了根据本发明的实施方案用于减少苹果中微生物数量的方法的步骤2(臭氧化)。臭氧滑门打开。包裹苹果的箱和罩往下放。门关闭。运行臭氧发生器，臭氧气体开始向下沉。低速运行抽空风扇使臭氧气体分散穿过苹果。
图4：说明了根据本发明的实施方案用于减少苹果中微生物数量的方法的步骤3(抽空)。臭氧滑门保持打开。包裹苹果的箱和罩往下放。门关闭。臭氧发生器关闭。高速运行抽空风扇以从室中排出臭氧气体，通过干燥器排气开放管道和臭氧发生器开放管道抽入新鲜的空气。
图5：说明了根据本发明的实施方案用于减少苹果中微生物数量的方法的步骤4(空气干燥)。
图6：示出了根据本文所述的本发明的实施方案的装置的强制空气臭氧反应器的图示。
图7：示出了根据本文所述的实验1的实验装置的臭氧处理室和接种的苹果的位置的示意图。
图8：示出了单核细胞增多性李斯特菌和乳杆菌的对数减少，该单核细胞增多性李斯特菌和乳杆菌接种到苹果上，然后在不同的时间段内以6g/h的速率引入臭氧处理。暴露5分钟时，测量的臭氧浓度为30ppm±2，10分钟时为55ppm±2，15分钟时为77ppm±2。
图9：示出了排气风扇速度对处理室内测量的臭氧浓度的影响。
图10：示出了乳杆菌的对数减少，该乳杆菌被接种到苹果上，在臭氧室内，采用不同风扇排气速度进行处理。将接种的苹果放置在苹果堆内的不同位置，然后处理20分钟。
图11：示出了乳杆菌的对数减少，该乳杆菌被接种到苹果上，然后在以250cfm或500cfm风扇排气速度下运行的的反应器中，用臭氧进行处理。每个点代表位于苹果堆内不同点的5个苹果的平均值。
图12：示出了在500cfm下运行的反应器中测量的臭氧浓度。示出了具有不同结束点的五种不同运行。
图13：示出了实验1中使用的干燥器系统的示意图。苹果干燥步骤：用拉伸包装包裹待干燥的箱的侧面。罩往下放置，确保良好的密封。打开风扇，干燥苹果。
图14A和14B：示出了在实验室规模的反应器中，在苹果柱(column)顶部或底部的苹果的次表面的温度分布图。在顶部引入臭氧并穿过苹果堆抽出。反应器内的环境温度为23℃。
图15：示出了与实验2中未处理的对照组相比，在强制空气臭氧反应器中处理的未接种的可重复使用的塑料容器(RPC)中的总需氧量以及酵母和霉菌数量的图。
图16：示出了处理时间对乳杆菌的对数减少的影响的图，该乳杆菌被接种到苹果上，然后在强制空气臭氧反应器中处理。将苹果放置在苹果堆(2箱)的顶部、中部和底部，然后在实验1中在500cfm的排气风扇速度下，用臭氧进行处理。
具体实施方式
尽管参考灭活细菌和/或减少水果，特别是苹果中的微生物数量来描述本文所述的本发明的各方面，但应理解，所描述的方法、装置和相关组件可用于减少其他类型的食品或产品种的微生物数量。
此外，本文所述的方法和装置的特定实施方案和示例是说明性的，并且在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下，可以对这些实施方案和示例引入许多改变。在本发明和所附权利要求的范围内，不同说明性的实施方案和/或示例的要素和/或特征，可彼此组合和/或彼此替代。
定义
如本文所使用的，并且除非另有说明，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的定义。
如本文所使用的，在数值或范围的上下文中，“约”表示所述或要求保护的数值或范围的±10％。本文公开的任何范围是指该范围内的所有百分之一、十分之一和整数单位量都作为本发明的一部分具体公开。因此，“约”所述值具体包括该所述值。例如，约20分钟的范围是指在20±10％分钟的范围内的所有测量值，包括20分钟。
通过一系列实验，如本文所述的方法和装置的发明人表明，通过臭氧气体熏蒸，可以在产品，特别是苹果上杀灭李斯特菌。在这一系列实验中，结果范围为从2-log到5-log的杀灭量。每“log”减少表明杀灭程度为10倍。也就是说，李斯特菌的杀灭量为99％(2-log)至99.999％(5-log)。这些最初的阳性实验室结果表明，有必要进行更大的商业规模应用测试。因此，建造了足够大，以容纳1600-3000磅苹果的臭氧室，其包括了由发明人研发的苹果干燥器系统，并连接到臭氧发生器、电控制和安全系统。所述干燥器系统的示意图如图13所示。在实验1中讨论了在所述大规模臭氧室中进行的实验的结果。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于灭活细菌和/或减少易受到表面和次表面微生物存在的影响的食品或其容器上的微生物数量的装置，所述装置包括可密封室，该可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过可密封室的抽空风扇。
在本文所述的装置的一实施方案中，该装置还包括臭氧传感器。在另一个实施方案中，该装置还包括干燥器组件，所述干燥器组件包括罩和干燥器排气风扇。
在一实施方案中，可密封室具有容纳1-3000磅，优选为10-3000磅食品的容量。在另一个实施方案中，可密封室具有容纳约1600-3000磅食品的容量。在另一个实施方案中，可密封室具有容纳至少1、至少10、至少100或至少200磅食品的容量。
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于灭活细菌和/或减少易受到表面和次表面微生物存在的影响的食品或其容器上的微生物数量的方法，所述方法包括a)在可密封室中提供多个所述的食品或容器，该可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过可密封室的抽空风扇；b)通过调节可密封室中的湿度达到预定的湿度，在食品或容器的表面上产生冷凝；c)运行臭氧发生器和抽空风扇，以产生预定的排气速度，使臭氧发生器产生的臭氧气体在一段预定的停留时间内穿过可密封室；和d)从可密封室排出臭氧气体。
在本文所述的方法的实施方案中，细菌是李斯特菌。在另一个实施方案中，细菌是沙门氏菌或大肠杆菌。
在一个实施方案中，食品是水果或蔬菜。在另一个实施方案中，食品是苹果、甜瓜、莴苣(例如，切碎的莴苣)、蘑菇、西葫芦、黄瓜或蜂蜜。在另一个实施方案中，食品是种子、香料、茶、谷物、干果或坚果。在另一个实施方案中，食品包括加工食品。
在一个实施方案中，预定的湿度为约70-100％或约65-85％，优选为约80-90％或约85％。在另一个实施方案中，停留时间大于10分钟。在另一个实施方案中，停留时间在约20分钟和约40分钟之间，具体地，约20分钟或约40分钟。
在一个实施方案中，预定的排气速度为约10-1500cfm。在另一个实施方案中，预定的排气速度为约250-700cfm，优选为约300-600cfm或约500cfm。
在一个实施方案中，在步骤c)中，可密封室中的臭氧浓度保持在约4-20ppm，持续足以杀死99-99.999％的细菌的一段时间。在另一个实施方案中，在步骤c)中，可密封室中的臭氧浓度保持在约14-20ppm或4-6ppm，持续足以杀死99-99.999％的细菌的一段时间。
在一个实施方案中，可密封室具有容纳1-3000磅，优选为10-3000磅食品的容量。在另一个实施方案中，可密封室具有容纳约1600-3000磅食品的容量。在另一个实施方案中，可密封室具有容纳至少1磅、至少10磅、至少100磅或至少200磅食品的容量。
在本文所述的方法的一个实施方案中，所述方法不包括使含臭氧的液体与食品或容器接触的步骤。在另一个实施方案中，以约1-60g/h，优选为约6-60g/h的速率将臭氧引入可密封室中。
在一实施方案中，提供了一种装置，该装置包括可密封室、臭氧发生器和(优选地)双速抽空风扇。可密封室还可以包括连接到房间排气风扇的内部臭氧传感器。该装置还可包括干燥器设备组件，该干燥器设备组件包括罩和干燥器排气风扇，该罩位于待消毒的食品的顶部的箱上。所述装置的图示如图1所示。在图1中，使用以下图例：101：氧气；102：臭氧发生器；103：臭氧气体；104：苹果箱(底部有开口)；105：通风设备；106：接种的苹果。
在另一个实施方案中，本文所述的方法和装置可适用于将生物膜中和容器(可重复使用的塑料容器(RPC))表面上的假单胞菌减少至只能通过富集来检测的低水平。在进一步的实施方案中，本文所述的方法和装置可以适用于减少容器(特别是塑料容器和食品与蜂蜜的容器)中的总需氧量以及酵母和霉菌的数量。还可以设想，在本发明的范围内，同时(在单次运行中)减少容器和其所容纳的食品中的微生物数量。
在另一个实施方案中，本文所述的方法和装置可以适用于减少食品上的农药。
根据本发明的一个实施方案，下文描述了使用所述装置减少食品和容器中的微生物数量的方法的步骤。
以下图例用于图2-5和13：
1：臭氧滑门
2：臭氧发生器
3：干燥器排气风扇
4：可调节罩
5：房间排气风扇
6：苹果箱
7：密封/可密封室
8：内部臭氧传感器
9：抽空风扇
10：碳过滤器
11：房间臭氧传感器
12：塑料片
13：塑料托盘
第1步：冷凝(如图2所示)
将苹果箱(6)从冷却器(温度36-40℉)中取出，并用透明塑料包装从顶部包裹到底部，以确保它们是气密的。箱堆的顶部是打开的，底部的箱子的底部也是打开的。应注意，该特定的布置可以改变，以实现类似的效果。换句话说，产品保存在优选垂直的容器内，该容器对其四围的环境是封闭的，而顶部和底部是开放的。出于实验目的，本文通过将开放式的箱堆叠并将它们连接点处各自的四周密封，以形成容器。将包裹好的箱堆放置在可密封室(7)中，并使用气压缸系统将可调节罩(4)密封地降低到顶部的箱上。紧密的配合很重要，以使苹果(6)不能被绕开。臭氧发生器滑门(1)关闭。室门保持打开。运行通过可调节罩(4)与箱堆流体连接的干燥器排气风扇(3)(在这种情况下，为2400cfm)，穿过箱堆底部的开口并穿过苹果(6)向上抽出暖空气，在苹果(6)上形成表面冷凝。运行风扇(在这种情况下，为10-15分钟)以使室内达到所需的70-100％的湿度，优选为约80-90％或约85％的湿度。然后关闭干燥器风扇(3)。
第2步：臭氧化(如图3所示)
一旦达到所需的湿度并且关闭干燥器风扇(3)，室门就牢固地关闭并锁住。打开臭氧滑门(1)。运行臭氧发生器(2)，臭氧气体穿过可调节罩(4)进入并向下穿过苹果容器。可以根据臭氧化室的大小来选择臭氧发生器输出(臭氧率)。
抽空风扇(9)以低速(例如300-600cfm)在室的底部运行，以使臭氧气体分散穿过苹果，并在室中产生负压。气流被引导穿过产品的床层，产生压差和湍流。应该根据被臭氧化的产品选择抽空风扇的速度。
臭氧从顶部到底部穿过苹果向下抽出，然后通过抽空风扇(9)和碳过滤器(10)向外抽出，然后排出室外。臭氧的停留时间会根据苹果的大小、箱的容积以及被苹果上任何有机化合物隔离(sequestered)的臭氧量而改变。当臭氧穿过苹果时，室内的靠近抽空风扇(9)的臭氧传感器(8)就会监测臭氧气体的浓度。在臭氧化过程中，选择排气风扇速度，以获得在14和20ppm之间变化的浓度。当浓度停止攀升并达到所需的暴露时间，臭氧化过程就完成，则关闭臭氧发生器(2)。
可选地，如果房间传感器(11)在房间内检测到臭氧，则会发出警报，并且房间排气风扇(5)将会运行。
第3步：抽空(如图4所示)
关闭臭氧发生器(2)。抽空风扇(9)以大约1000cfm的速度高速运行，以从室中排出臭氧气体，通过干燥器排气开放管道和臭氧发生器开放管道抽入新鲜空气。这需要大约40秒，直到室内的臭氧传感器(8)读数为0。
第4步：空气干燥(如图5所示)
一旦从室中抽空臭氧，门就打开以及臭氧滑门(1)关闭。苹果箱(6)保持包裹和可调节罩(4)往下放。干燥器排气风扇(3)运行，向上穿过苹果抽出暖空气，直至室温(90分钟)。
提供了上述实施方案中提到的具体工艺参数作为示例。本领域技术人员会认识到许多工艺参数是相互关联的。例如，在臭氧化步骤期间，目标臭氧浓度可以根据食品的类型、批量大小和臭氧室大小而变化。气流必须足以将臭氧发生器产生的臭氧均匀地分散穿过产品床层。空气速度太低，臭氧不会均匀分散，只能在产品床层的某些位置达到杀灭。发明人已经确定，500cfm的气流通过2400磅的72个计数大小(count size)的苹果(堆放在3个4’×4’×3’的箱里)，可以达到将每小时60g(每分钟1g)输送的臭氧均匀分散以及最佳的细菌杀灭效果。此过程可以按比例放大和缩小。
在一实施方案中，所要求保护的用于灭活易受到表面和次表面微生物存在的影响的食品上的细菌的方法的工艺参数如下：
臭氧：
1)在160立方英尺容器中，每分钟0.1至3克，相当于每立方英尺0.000625克和每立方英尺0.01875克的比率。
2)每分钟0.1至3克进入2400磅苹果，相当于每磅食物每分钟0.00004167克和每磅食物每分钟0.00125克的比率。
3)每分钟0.1克至3克，持续40分钟，相当于每2400磅苹果4克至120克臭氧的比率。
4)臭氧浓度将根据所选择的具体工艺参数而变化。例如，发明人发现500cfm的气流会导致臭氧浓度峰值为4-6ppm。
气流：在10cfm至1500cfm之间穿过160立方英尺容器中的食品床层，相当于每立方英尺容器0.0625cfm和每立方英尺容器9.375cfm气流的比率。目标空气速度可以取决于可密封室的大小。
温度：36℉至90℉。
湿度：70％和100％。
容器的大小/食品的表面积：每个4’×4’×3’的箱容纳800磅苹果或72个计数大小(在蒲式耳中的72个苹果)的1350个苹果。每个苹果平均重0.6磅(260克)。每个苹果的表面积平均为37平方英寸(230cm2)。因此，在每个箱中处理49,950平方英寸(310,500cm2)的产品表面。
可以使用于上述比率计算其他类型和大小的食品的参数，例如樱桃、莴苣和西瓜。具体而言，每单位重量的樱桃的表面积大于每单位重量的苹果的表面积。每单位重量的西瓜的表面积小于每单位重量的苹果的表面积。因此，实现所需的细菌杀灭水平所要求的臭氧暴露，对于樱桃而言将会较高，而对于西瓜而言则会较低。可以通过例如调节气流和/或停留时间和/或使用不同大小的可密封室来调节臭氧暴露水平。
使用不同大小的可密封室在本文所述的方法和装置的范围内，包括与使用小型风扇的标准微波炉相对应的大小的可密封室，以及用于批量生产处理器的更大单位。
臭氧停留时间：停留时间取决于产品体积和臭氧浓度。发明人已经发现对于每箱800磅的三箱苹果，在停留时间为40分钟时，可获得最佳结果。
臭氧监测器(5)可以任选地安装在房间内，如果检测到0.1ppm臭氧，该臭氧监测器被编程为自动关闭室，并启动房间排气风扇(5)。
本发明的装置和方法优于先前已知的消毒方法，因为其是环保的。具体地，本发明的方法不使用水，从而节约淡水，避免产生含刺激性消毒化学品(如氯或氨)的化学废水。此外，臭氧气体分解成氧气，不会留下危险或有害的副产品。
最后，本文提及的任何实施方案或特征与任何其他单独提及的实施方案或特征中的一个或多个的组合预期在本发明的范围内。
实验
实验1：研发用于灭活糖苹果生产中的苹果上的单核细胞增多性李斯特菌的强制 空气臭氧反应器
概要
已经使用实验室和商业规模研究的组合对强制空气臭氧反应器净化苹果的效力进行评估。在实验室研究中，研究了臭氧气体穿过接种有单核细胞增多性李斯特菌的苹果的流动动力学。在一定条件下，可以将苹果上的李斯特菌水平降低2.12-3.07log cfu。构建了一个商业规模的装置，其能够在一次运行中处理两大包苹果(2000磅)。为了便于商业试验，选择与李斯特菌相比对臭氧具有相同抗性的乳杆菌菌株。通过有效性研究，发现对接种到苹果上的替代物灭活处理的均一性和致死性取决于空气动力学和处理时间。在一定条件下，李斯特菌的替代物可以减少4.42log cfu。总之，已经证明强制空气臭氧处理可应用于筛选法(hurdle approach)中，以管理在苹果加工过程中与李斯特菌相关的风险。
材料和方法
使用的细菌和接种苹果
本研究中使用的病原体包括产志贺毒素的大肠杆菌-STEC，血清型O157：H7(两种菌株)和O111、O45、O26中的一种菌株，以及单核细胞增多性李斯特菌(血清型4a、4b、1/2b、1/2a和3a)。这些分离菌具有特殊的相关性，因为它们与过去的疾病爆发有关，并且从圭尔夫大学食品科学文化馆收藏中获得。在整个研究中具体使用单核细胞增多性李斯特菌血清型4b(从新鲜农产品中分离)和食果糖乳杆菌(从葡萄酒中分离)。食果糖乳杆菌ATCC 8288也作为单核细胞增多性李斯特菌的替代物应用于本研究中，并从美国模式培养物保藏中心(亚特兰大，美国)获得。
每种细菌的浓度通过光密度(OD)和连续稀释确定。每种细菌稀释至相同浓度(8-log10CFU/ml)后，与大肠杆菌菌株以及单核细胞增多性李斯特菌菌株混合在一起，制备最终接种物。
在使用前，将接种物在4℃下储存长达12小时，并在取出后，涡旋1分钟。将每种细菌染色剂划线涂布在选择性琼脂上，以允许分离单个菌落，然后将其除去，并在37℃下，在50ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中培养24小时或在30℃下，MRS肉汤中培养48小时(乳杆菌的情况)。通过离心(SorvallTM ST8)(5000g，10分钟)收获细胞，并将颗粒重悬于生理盐水中，至最终细胞密度为8log cfu/ml，涡旋(IKATM Vortex 3Shaker)1分钟，在4℃下储存48小时，以允许适应压力。弃去上清液。
提供未涂蜡的苹果和整个卷心莴苣头，在4℃下储存直至使用。重要的是，所使用的产品完好无损，没有明显的机械损伤的迹象，如挫伤和磨损。因此，不会使用具有任何明显损坏(挫伤、切口、茎干缺失)迹象或任何酸败的苹果。通过除去在加工过程中具有机械损伤的最外层叶子，为莴苣头处理做好了准备。
用100μl浓度为8-log10CFU/ml的测试细菌，在果实顶部周围的外皮上，点样接种苹果，然后在生物安全柜中干燥20分钟至4小时，接着转移至4℃，干燥最多24小时。为了使细菌内化，将1ml悬浮液加入到茎干的缝隙中，并在真空下放置1分钟，从真空中取出并放置1分钟，然后再抽真空1分钟。通过将整个果实与100ml生理盐水一起放入塑料袋中，从苹果回收细菌。将果实手动揉搓60秒，并用生理盐水配制稀释系列。在MRS琼脂上涂布有乳杆菌的改良牛津配方琼脂(MOx)上计数单核细胞增多性李斯特菌。在两种情况下，将平板放在30℃下孵育48-72小时，然后计数典型的菌落。两种情况下的检测下限均为3log cfu/苹果。
灭活接种到苹果上并用臭氧处理的单核细胞增多性李斯特菌和乳杆菌
如上文所述，用单核细胞增多性李斯特菌或乳杆菌接种苹果。然后将已接种的苹果(5个用李斯特菌接种，5个用乳杆菌接种)放置在PVC生物泡中，并暴露于6g/h速率的臭氧中。处理完成后，如上文所述回收臭氧处理的存活者，并确定相对于对照组的对数数量减少。
实验室规模的强制空气臭氧反应器
反应器由臭氧发生器(NetechTM，臭氧输出6g/h，流速10l/分钟，功率120W，50/60Hz)组成，位于容器(3.5’×3.5’×3.5’-1/2”的胶合板箱，内衬0.157”波纹塑料)的基部或顶部，围绕其周边密封和/或封闭，顶部和底部开口，将苹果放入(30cm深度)的穿孔箱中(图6)。在图6中，使用了以下图例：601：940系列气体检测发送器(transmitter Aeroqual)；602：探针-温度、臭氧浓度和湿度；603：臭氧气体；604：氧气；605：4个UV灯(254nm)和排气风扇；606：加热灯；607：排气；608：苹果(30cm深度)；609：臭氧发生器；610：加湿器；和611：风扇。
臭氧通过风扇以9.5m/s的速度向上或向下牵引穿过苹果堆(用CFM/CMM温差式风速计-ExtechTM-型号#AN100-20测量，点平均气流和3％的速度精度)。反应器是一个封闭系统，湿度通过加湿器(Honeywell#3043-5974-0，1-加仑容量，36小时运行时间，低-高设置)稳定在65-85％的相对湿度。使用气体检测器940系列监测装置(奥克兰，新西兰)测量温度、湿度和臭氧浓度，该气体检测器940系列监测装置使用气体检测器校准，其认证的精度为<±0.008ppm 0-0.1ppm，<±10％0.1-0.5ppm。
空气经风扇从腔室排出，经过4个UV灯(254nm)分解处理后的残余臭氧。苹果的温度使用温度计探针(Fisher ScientificTMTraceableTM-准确度±0.05℃-范围-50°至+150℃)记录，放置在果堆中间的苹果果实中0.5或1.0cm处。将处理时间设定为20分钟，然后取出苹果，将其细分为堆顶部的、中部的或底部的苹果。如上文所述将存活的单核细胞增多性李斯特菌回收，并在MOx上进行计数，使用未处理的果实确定初始量。
接种产品后，允许病原体有时间附着，如上文所述，然后将其放置在腔室中，暴露于6g/h速率的臭氧中。参数在所述腔室中进行控制，臭氧浓度从产生后5分钟的30ppm到20分钟后的80ppm。湿度稳定在85-90％，由加湿器保持恒定，温度为24.4℃至26.8℃。处理完成后，残余臭氧通过4个UV灯(254nm波长-臭氧破坏峰值)分解，并用风扇将其从腔室中除去。回收臭氧处理后的存活者(如下文所述)，并确定相对于对照组的对数数量减少。
气流对苹果臭氧净化效力的影响
为了确定臭氧的引入点是否影响这一过程，进行了效力试验，其中气体在不同地点引入腔室中。在一种布置中，将臭氧发生器放置在容纳有30cm深度的苹果的穿孔容器的底部。将三个接种的苹果放置在基部、中部或顶部。臭氧经吹风机穿过苹果床层抽出，然后废气通过UV灯，降解残余臭氧。在另一种布置中，将臭氧放置在苹果上方(腔室外)，气流被强制向下流动。将湿度、温度和臭氧浓度保持在上文所述的恒定的速率。
臭氧灭活多层苹果上的单核细胞增多性李斯特菌的效力
用单核细胞增多性李斯特菌接种苹果，并在室温(21℃)下使其附着2小时。然后将接种的苹果(n＝3)放置在托盘(底部)的中排(B)，并用未接种的苹果填满该层。将另一层接种的苹果(n＝3)放置在苹果床层上(中部)，并再次用未接种的果实填满该层。最后，将3个接种的苹果放置在双层，并用未接种的苹果包围(顶部)。因此，托盘总共有3层苹果。将苹果放置在腔室中，然后在持续20分钟的相对高湿度下，用臭氧处理20分钟。
有条件的苹果的臭氧处理
为了确定臭氧对具有和不具有冷凝物的苹果的效力，进行了试验。用李斯特菌接种苹果，一组在放置在4℃下12小时，另一组保持在20℃。将苹果从4℃取出，然后直接放置在处理室中，施加臭氧(6ppm)20分钟。
商业规模强制空气臭氧发生器反应器
用7log cfu乳杆菌悬浮液接种苹果，并在冷却器中转移至设备。反应器由放置在4.0’×3.5’×10.0’不锈钢装置顶部的发生器组成(Medallion Indoor Environmental，型号03-20-24UV超高输出-二十24”AT987臭氧灯、224/240伏AC 50/60HZ 8安培，最大臭氧输出161.2g/h，最大空气容量1200CFM)，该不锈钢装置以60g/h(37ppm)的速率将臭氧引入不锈钢室。
在使用之前，将箱内的苹果保持在冷却器中，并直接转移至处理室，确保在果实表面上形成冷凝物。每个试验使用两箱(3.9’×3.3’×2.5’)的苹果，苹果彼此在顶部堆叠并用塑料薄膜包裹，以容纳苹果堆内的臭氧。通过臭氧输送喷嘴的盖子，在箱的顶部形成密封，其中空气速度由位于反应器基部的排气风扇控制(图7)。使用臭氧监测器(2B TechTM，型号106-L，范围0-100ppm臭氧，精度1.5ppb)在臭氧排出口附近测量臭氧浓度。腔室内的臭氧浓度的范围在50ppm-100ppm。完成该过程后，处理时间和风扇速度以及抽空步骤通过电子的方式设置，，风扇抽出臭氧，穿过4个25W灯(在254nm，100小时和80℉下测量，24”长和15mm直径-标准UV灯(序列号#05-1348))。
将接种的苹果布置在腔室的顶部、中部或底部。完成该过程后，取出苹果并计数存活的乳杆菌。
细菌回收和计数
莴苣
处理后，将莴苣头切碎，悬浮在500ml生理盐水中并浸泡(stomached)1分钟，在生理盐水中制备稀释系列。为了计数STEC，接着将样品展开涂布在麦康凯山梨糖醇琼脂(MacConkey Sorbitol agar)(CT-SMAC)和显色培养基(CHROMagar)上，在37℃下孵育24小时。将单核细胞增多性李斯特菌涂布在改良牛津琼脂(MOX)上，在35℃下孵育24-48小时。
苹果
在以与莴苣相同的方式从苹果中回收病原体遇到了挑战后，进行基线研究以确定从苹果表面回收李斯特菌的合适方法。用100μl李斯特菌[8-logCFU]点样接种苹果，然后使其附着4小时。然后通过三种方法中的其中一种回收李斯特菌，以评估每种方法的效率。方法如下：方法(1)将整个苹果放置在无菌塑料袋中，悬浮在100ml生理盐水中，并手动摩擦1分钟。对于方法(2)，使用削皮器除去苹果皮，然后将苹果皮放置在50ml生理盐水中，剧烈摇晃1分钟。最后，方法(3)与方法(2)所述相同，除了使用实验室顶级搅拌机将果皮均质化。无论如何，在回收方法中，在生理盐水中制备稀释系列，然后展开涂布在改良牛津琼脂(MOX)上，在35℃下孵育24-48小时。假定的阳性菌落是记录为log CFU的计数。
孵育温度对李斯特菌附着性的影响
为了确定李斯特菌的孵育温度对其与苹果的附着性是否重要，将细菌在25℃(李斯特菌表达鞭毛)和37℃(即，不表达鞭毛)下培养。在被除去之前(如上文所述的方法1)，允许细菌有时间附着到苹果上。
统计分析
每个实验重复至少三次，分析一式三份的样品。将细菌数量转化为log10值，平均值之间的差异使用ANOVA结合Tukey检验进行计算。
结果
食果糖乳杆菌作为单核细胞增多性李斯特菌替代物的适用性
使用置于引入抗微生物气体的生物气泡内的接种苹果，评估了乳杆菌对臭氧的相对抗性(相比于单核细胞增多性李斯特菌)。研究发现，臭氧处理对乳杆菌和单核细胞增多性李斯特菌灭活的程度取决于施加的时间(臭氧浓度)。相对而言，与接受相同臭氧暴露的乳杆菌相比，单核细胞增多性李斯特菌的对数减少没有显著差异(P>0.05)(图8)。因此，乳杆菌菌株是单核细胞增多性李斯特菌的合适替代物，其可用于商业试验以获得臭氧处理的效力。
气流方向对臭氧灭活接种到苹果的单核细胞增多性李斯特菌效力的影响
将接种的苹果放置在实验室规模的反应器中，然后通过在容器顶部或底部引入气体，采用臭氧处理。相对湿度保持在65-85％相对湿度，处理时间设定为20分钟(表1)。
发现李斯特菌的对数数量减少与苹果在堆内的位置无关，也与臭氧在床层的顶部或基部引入无关(表1)。结果表明，臭氧可以成功地注入穿过苹果床层，从而能与果实均匀接触，而不管气流方向如何。
表1：接种到苹果上，然后在顶部或底部反应器中处理的李斯特菌的对数数量减少，如图6所示。在装入反应器之前，对最初储存在4℃的苹果果实进行处理20分钟。这里报告了样品的平均值，然后是标准误差(标准差除以样本大小n的平方根，其中n≥3)。
相同字母后面的平均值没有显著差异。
尽管臭氧与苹果的接触与堆内果实的位置无关，但是床层内关于果实的温度曲线存在差异。具体地说，接收进来的臭氧流的苹果比基部的苹果升温更快(图14A和14B)。与果实内1cm深度相比，0.5cm深度的苹果的温度升高更快。结果的重要性在于，如果存在温差，苹果表面将保留水分(冷凝)。与基部的苹果相比，堆顶部的苹果的快速升温将导致更高的水分除去速率，继而降低臭氧的效力。然而，根据李斯特菌可比较的对数数量减少(不管苹果在床层的位置如何)，情况并非如此。表面苹果可能暴露于更高浓度的臭氧，以弥补表面水分的减少。
商业规模强制空气臭氧反应器
基于实验室试验的发现，如前所述构建商业规模的反应器。从工程角度来看，更容易地将臭氧引入装置的顶部，然后将其向下穿过苹果堆抽出，并在腔室的底部排出。在验证试验中，将接种的苹果放置在苹果堆中的不同位置，以确定臭氧处理是否均匀地施加到苹果上。臭氧浓度由上文所述的臭氧监测器确定，并且用风速计(如上文所述)监测气流，该风速计在设定的时间段内，以cfm测量空气速度和体积测量值的组合，其中1立方英尺等于约28升。
图9示出了排气速度(立方英尺/分钟)对强制空气臭氧反应器内臭氧浓度的影响。将两个苹果箱放置在反应器中，并将排气风扇的速度设定为给出不同的空气速度。将臭氧引入反应器顶部，并在穿过苹果床层后测量。进行处理20分钟，每30秒记录一次臭氧浓度。
使用放置在不同位置的气流计测量反应器不同部分的空气速度。通过使用设定为500cfm的设定气流设置，臭氧入口处的进气量为0.08m3/s，在苹果堆底部下降至6.6×10- 3m3/s，在空气出口下降至0.27m3/s。反应器不同部分的空气速度的变化反映了入口、床层和出口的直径/面积。
在排气口附近测量的臭氧浓度取决于空气速度(图9)。在低排气速度下，臭氧浓度稳定运行10分钟，并达到最高的气体浓度。随着空气速度的增加，腔室内的臭氧水平降低，同时达到稳定浓度的抗菌气体的时间也减少。在最高排气速度(700cfm)下，记录的臭氧浓度为4ppm，与施加较慢的风扇速度相比，臭氧浓度显著降低。
在低风扇排气速度下，接种到苹果上的乳杆菌的对数数量减少取决于苹果在堆内的位置。具体而言，与在苹果堆基部的苹果相比，在苹果堆顶部的苹果获得了显著更高的对数数量减少。然而，随着空气速度增加超过500cfm，与苹果堆底部相比，顶部的乳杆菌的对数数量减少没有显著差异。在测试的最高风扇速度(700cfm)下，苹果堆顶部的乳杆菌的对数减少量显著低于位于苹果堆中部或苹果堆底部的那些。因此，优选的排气速度在500-600cfm范围内。排气速度的影响可能是由于臭氧浓度和苹果堆周围的流动动力学的结合。在低排气风扇速度下，臭氧将主要积聚在床层的顶部，然后缓慢地牵引穿过。随着风扇速度增加，被牵引穿过发生器的空气稀释臭氧浓度，但通过床层的流动更均匀。在最高风扇速度(700cfm)下，被牵引穿过臭氧装置的空气导致臭氧浓度高度稀释(稀释至杀灭活性降低的浓度点)，尽管臭氧可以积聚在苹果堆的主体中。无论如何，优选的排气速度在500-600cfm之间(图10)。
图10示出了在不同排气速度下操作的强制空气臭氧反应器内，置于顶部、中部或底部的苹果上的乳杆菌的对数数量减少。
在苹果茎干周围点样接种乳杆菌，5个果实放置在苹果堆的顶部，5个放置在中部，5个放置在箱子底部。在顶部引入臭氧并以排气风扇设定的不同速率穿过苹果堆(2箱)抽出。处理20分钟后，取出苹果并回收乳杆菌。
使用500cfm的排气速度进行试验，以评估处理时间对臭氧介导的接种到苹果上的乳杆菌的灭活效力的影响(图16)。研究发现，与没有臭氧的空气被牵引穿过苹果堆的对照组相比，6或10分钟的处理时间没有显著差异(0.19±0.29log cfu减少)。然而，与较低时间相比，处理时间>20分钟支持显著更大的对数减少。将处理时间增加到40分钟，记录的对数数量减少并没有显著增加。
使用250cfm和500cfm的排气速度进行试验，以评估处理时间对臭氧介导的接种到苹果上的乳杆菌的灭活效力的影响。结果发现，对于以250cfm进行的试验，与没有臭氧的空气被牵引穿过苹果堆的对照组相比，6或10分钟的处理时间没有显著差异(0.19±0.29logcfu减少)。然而，与较低时间相比，处理时间>20分钟支持显著更大的对数减少。将处理时间增加到40分钟，记录的对数数量减少并没有显著增加。
以类似的方式，使用较高的风扇排气速度(500cfm)进行的试验并未导致5或10分钟的乳杆菌数量的显著变化。然而，随后发现乳杆菌的对数减少随时间增加。施加的最长处理(40分钟)导致乳杆菌数量减少4.42log cfu。
虽然不希望受理论束缚，但发明人认为，处理的有效性不仅与预定的排气速度有关，也与穿过产品/容器的床层的压差以及表面的湍流有关。
讨论/结论：
建立臭氧引入速率，使得腔室内的相对稳定浓度达到约14-20ppm臭氧。将数据作为一个整体，在这种臭氧浓度下，对苹果进行净化的合适处理条件为10-40分钟，优选为15-25分钟，最优选为约20分钟的处理时间；风扇排气速度为500-600cfm。这些条件将导致床层内的臭氧均匀分布，同时支持整个苹果堆中的李斯特菌替代物平均减少4.42±0.30logcfu。
实验2：使用强制空气臭氧反应器对可重复使用的塑料板条箱(RPC)进行净化
材料和方法
将荧光假单胞菌(Pesudomonas fluorescens)接种于TSB中，在30℃下培养24小时，并通过离心收获细胞，然后重悬于生理盐水中至OD600＝0.2。在未使用的RPC上的内侧基部和侧面上标记区域(2-3cm2)，其中，未使用的RPC上沉积有0.1ml假单胞菌悬浮液。将RPC保持在23℃，并用10ml体积(每标记区域)的TSB喷洒接种区域，总共5天，以支持生物膜的形成。另外，在臭氧处理前4小时，接种假单胞菌，以比较新沉积细胞的灭活。
强制空气臭氧处理
进行了两次试验，第一次在苹果箱上放置一个开口的和一个紧缩的板条箱。将箱子放置在臭氧反应器中，处理40分钟。在第二次试验中，将RPC放置在堆叠内的不同位置，该堆叠按照交付给水果和蔬菜包装商的方式进行布置。将堆叠中紧缩的RPC放置在臭氧反应器中，处理30分钟。
除了接种的RPC外，未接种的板条箱通过从内部采集海绵样品进行取样。在臭氧处理之前，对10个随机选择的RPC进行取样，在处理之后，对10个不同的RPC进行取样。
微生物分析
采用海绵从板条箱的基部和侧壁上的接种区域回收假单胞菌。采用未经臭氧处理的单独的一组板条箱确定初始水平。将海绵悬浮在30ml生理盐水中，并通过浸泡均匀化60s。采用匀浆制备稀释系列，随后将其涂布在假单胞菌琼脂上，并在30℃下孵育48小时。在没有回收菌落的情况下，将匀浆加入等体积的TBS中，并在30℃下孵育24小时。将富集的培养物划线到假单胞菌琼脂上，并在30℃下孵育24小时，之后检查典型的菌落。
将来自未接种的RPC的海绵样品悬浮在30ml生理盐水中，并通过浸泡均匀化。制备稀释系列，并涂布TSA上，在34℃下孵育，以确定总需氧量，并涂布在马铃薯葡萄糖琼脂上，在25℃下孵育5天，以确定酵母和霉菌数量。
结果：
接种的RPC
未接种的RPC
见图15
结论
强制空气臭氧反应器的处理可以将生物膜中和RPC表面上的假单胞菌减少到足够低只能通过富集来检测的水平。尽管在位于堆叠中部和底部的那些板条箱中检测到更高频率的阳性样品，但一般而言，臭氧处理的净化效果与堆叠内的RPC位置无关。臭氧处理将内源的微生物水平降低至低于总需氧量以及酵母和霉菌的可接受水平。

Claims (27)

1.用于灭活细菌和/或减少食品或其容器上的微生物数量的方法，所述食品或其容器易受到表面和次表面微生物存在的影响，所述方法包括：
a)在可密封室中提供多个所述食品或容器，所述可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过所述可密封室的抽空风扇；
b)通过调节所述可密封室中的湿度达到预定的湿度，在所述食品或容器的表面上产生冷凝；
c)运行所述臭氧发生器和所述抽空风扇以产生预定的排气速度，使所述臭氧发生器产生的臭氧气体在一段预定的停留时间内穿过所述可密封室；和
d)从所述可密封室排出臭氧气体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是李斯特菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是沙门氏菌或大肠杆菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述食品是水果或蔬菜。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述食品是苹果、甜瓜、莴苣、蘑菇、西葫芦、黄瓜或蜂蜜。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述食品是种子、香料、茶、谷物、干果或坚果。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述预定的湿度为约70-100％或约65-85％，优选为约80-90％或约85％。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述停留时间大于10分钟。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述停留时间在约20分钟和约40分钟之间。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述预定的排气速度为约10-1500cfm。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述预定的排气速度为约250-700cfm，优选为约300-600cfm或约500cfm。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，在步骤c)中，其中所述可密封室中的臭氧浓度保持在约4-20ppm，持续足以杀死99-99.999％的细菌的一段时间。
13.根据权利要求12所述的方法，在步骤c)中，其中所述可密封室中的臭氧浓度保持在约14-20ppm或4-6ppm，持续足以杀死99-99.999％的细菌的一段时间。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述可密封室具有容纳1-3000磅，优选为10-3000磅食品的容量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述可密封室具有容纳约1600-3000磅食品的容量。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述可密封室具有容纳至少1磅、至少10磅、至少100磅或至少200磅食品的容量。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，所述方法不包括使含臭氧的液体与所述食品或容器接触的步骤。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，以约1-60g/h，优选为约6-60g/h的速率将臭氧引入所述可密封室中。
19.根据权利要求1所述的方法，其中：
(i)预定的湿度为约70-100％，
(ii)停留时间大于10分钟，
(iii)预定的排气速度为约10-1500cfm，和
(iv)在步骤c)中，所述可密封室中的臭氧浓度保持在约4-20ppm。
20.一种用于灭活细菌和/或减少食品或其容器上的微生物数量的装置，所述食品或其容器易受到表面和次表面微生物存在的影响，所述装置包括可密封室，所述可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过所述可密封室的抽空风扇。
21.根据权利要求20所述的装置，所述装置还包括臭氧传感器。
22.根据权利要求20或21所述的装置，所述装置还包括干燥器组件，所述干燥器组件包括罩和干燥器排气风扇。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的装置，其中所述可密封室具有容纳1-3000磅，优选为10-3000磅食品的容量。
24.根据权利要求23所述的装置，其中所述可密封室具有容纳约1600-3000磅食品的容量。
25.根据权利要求20-22中任一项所述的装置，其中所述可密封室具有容纳至少1磅、至少10磅、至少100磅或至少200磅食品的容量。
26.用于降低容器中酵母、霉菌和/或霉病的水平的方法，所述方法包括：
a)在可密封室中提供一个或多个所述容器，所述可密封室可操作地连接到i)用于产生臭氧气体的臭氧发生器，和ii)用于强制臭氧气体垂直流动穿过所述可密封室的抽空风扇；
b)通过调节所述可密封室中的湿度达到预定的湿度，在一个或多个所述容器的表面上产生冷凝；
c)运行所述臭氧发生器和所述抽空风扇以产生预定的排气速度，使所述臭氧发生器产生的臭氧气体在一段预定的停留时间内穿过所述可密封室；和
d)从所述可密封室排出臭氧气体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述容器是可重复使用的塑料容器(RPC)。
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