CN109942688A - 靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用,属于生物医药技术领域。本发明通过化学合成,获得了靶向结合Sox2蛋白的多肽药物;将靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42加入食管鳞癌细胞KYSE450的细胞培养基中,通过细胞增殖实验、划痕、细胞侵袭以及成瘤实验鉴定该多肽药物的功能表明该多肽药物使细胞增殖速率降低,细胞迁移能力、侵袭能力下降,成瘤能力差,具有显著的肿瘤抑制功能,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及到靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用。
背景技术
前期,我们通过建立了高通量的肽适配子文库和筛选方法(具体应用请见专利ZL201410339641.X),并筛选获得了几个与Sox2蛋白紧密结合的肽适配子(具体应用请见专利ZL201510263530.X),同时验证了它们的功能,在此基础上,我们对P42肽适配子进行化学合成和修饰。
Sox2蛋白是一个强大的转录因子,在多个肿瘤的恶性进程(如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖,侵袭转移,肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性等)的多个方面起重要作用。
肿瘤细胞增殖实验主要包括细胞计数和克隆形成实验,细胞计数实验可以通过直接计数以及其他检测方法如CCK8等方法完成。划痕实验是通过在培养的细胞中进行划痕来检测细胞的迁移能力,它反映肿瘤细胞的运动能力。
肿瘤细胞侵袭实验是一个模拟体内环境,依赖肿瘤细胞分泌蛋白酶降解基质,从而使细胞具备转移能力的能力测试,它从一定程度反映了细胞的侵袭和转移潜能。而成瘤实验可在小鼠体内真实反映处理后的细胞肿瘤再生能力,常用于药物的筛选。
发明内容
本发明的目的是提供一个具有特定空间构象并能特异靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用。通过细胞增殖实验、划痕、细胞侵袭以及成瘤实验对该多台药物的功能鉴定,表明该多肽药物使细胞增殖速率降低,细胞迁移能力、侵袭能力下降,成瘤能力差,具有显著的肿瘤抑制功能,具有重要的应用价值。
靶向结合Sox2蛋白的多肽药物,其序列为:TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPVWFSTLFFPLFFLISLARGPC。该序列包含特异靶向结合Sox2蛋白的肽适配子FSTLFFPLFFL,同时在其氨基端添加了红色荧光标记基团TAMRA和穿透肽序列YGRKKRRQRRR。
上述靶向结合Sox2蛋白的多肽药物经化学合成,并让其中的2个半胱氨酸形成一个二硫键,以此形成具有特定结构的空间构象。同时化学合成没有特异靶向结合Sox2蛋白的肽适配子FSTLFFPLFFL的TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPV
WISLARGPC作为对照。
上述靶向结合Sox2的多肽药物的化学合成方法为:以Fmoc-AA树脂为原料,以HOBT为活化剂,DIC为缩合剂,Collidine为碱试剂合成带保护的肽树脂;再经切割液切割得肽粗品;肽粗品经空气氧化法氧化获得精品多肽药物。其中Fmoc-AA:DIC:HOBT:collidine的体积比为1:1:1:2, Fmoc-AA缩合过程用量过量2.5倍,每一步缩合都经过凯撒试剂(Kaisertest)检测,如颜色呈阳性则重复缩合氨基酸;切割液为:三氟醋酸:EDT:水:对甲酚的体积比为87.5:5:2.5:5;空气氧化法为:肽粗品溶于纯水,用氨水调pH值到9,室温搅拌反应24小时。
上述靶向结合Sox2蛋白的多肽药物功能的鉴定,包括以下步骤:
1)肿瘤细胞增殖实验:在接种同样量细胞的食管鳞癌细胞KYSE450细胞培养基中添加靶向结合Sox2蛋白的多肽药物和对照,并在一天后,往细胞培养基中加入CCK8,在第三天、第五天、第七天测定每个孔的吸光值OD450和OD650 ,以此反映细胞的增殖情况并统计分析;
2)肿瘤细胞划痕实验:在接种同样量细胞的食管鳞癌细胞KYSE450细胞培养基中添加靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42和对照,并在一天后,用枪头在细胞中划线,用PBS清洗后拍照,48小时后,在最初拍照划痕位置继续拍照,并统计结果;
3)肿瘤细胞侵袭实验:将同样量的食管鳞癌细胞KYSE450细胞接种到涂布Matrigel的Transwell小室后,在上室培养基中添加0.02 ug/uL的等量多肽药物Peptide 42和对照,上室的血清浓度为5vol%,下室血清浓度为20vol%,48小时后观察穿透膜的细胞并计数和统计分析;
4) 肿瘤细胞成瘤实验:将同样量的食管鳞癌细胞KYSE450细胞和Matrigel混合后接种到裸鼠皮下,在肉眼可见的肿瘤形成后,分别注射等量的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42和对照,经多次注射后,观察肿瘤的生长并对形成的肿瘤进行剥离和称重,统计分析。
本发明的有益效果在于:
(1)通过化学合成方法,获得了空间构象固定,并利于示踪和穿透进入细胞的多肽药物Peptide 42和对照;
(2)利用细胞增殖、细胞划痕修复、细胞侵袭体外实验证实了靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42对肿瘤细胞恶性进程的抑制作用;
(3)利用体内成瘤实验,证实了靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42对肿瘤起始发生起抑制作用,能被用于制备食管鳞癌治疗的候选药物。
附图说明
图1多肽药物和对照的空间构象图。a:多肽药物Peptide 42的空间构象图;b:对照的空间构象图。
图2 KYSE450细胞经多肽药物Peptide42和对照处理后的增殖实验结果图。
图3 KYSE450细胞经多肽药物Peptide42和对照处理后的划痕修复实验结果图。A:多肽药物Peptide42和对照处理后的KYSE450细胞划痕修复结果;B:多肽药物Peptide42和对照处理KYSE450细胞的伤痕愈合率柱形分析统计结果。
图4 KYSE450细胞经多肽药物Peptide42和对照处理后的侵袭实验结果图。A:多肽药物Peptide42和对照处理后的KYSE450细胞侵袭结果;B:多肽药物Peptide42和对照处理KYSE450细胞侵袭柱形分析统计结果。
图5 KYSE450细胞皮下成瘤多肽药物Peptide42和对照处理实验结果图。A:多肽药物Peptide42和对照处理后的KYSE450细胞荷瘤裸鼠图;B:多肽药物Peptide42和对照处理后的KYSE450细胞在裸鼠体内成瘤后剥离的肿瘤图;C:多肽药物Peptide42和对照处理后的KYSE450细胞在裸鼠体内成瘤的肿瘤统计柱形结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中的实验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验,均设置为独立的三次重复实验,结果取平均值。
实施例1靶向结合Sox2的多肽药物的化学合成
靶向结合Sox2的多肽药物的化学合成方法为:以Fmoc-AA树脂为原料,以HOBT为活化剂,DIC为缩合剂,Collidine为碱试剂合成带保护的肽树脂;再经切割液切割得肽粗品;肽粗品经空气氧化法氧化获得精品多肽药物。其中Fmoc-AA:DIC:HOBT:collidine体积比为1:1:1:2, Fmoc-AA缩合过程用量过量2.5倍,每一步缩合都经过凯撒试剂(Kaiser test)检测,如颜色呈阳性则重复缩合氨基酸。
所需合成多肽的序列为:对照:TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPVWISLARGPC和多肽药物Peptide 42:TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPVW FSTLFFPLFFLISLARGPC。
序列中各氨基酸投料量及试剂的投料量的计算:
以K表示过量2.5倍的投料量。
K=2.5×m树脂×Loading=2.5×2g×0.26mmol/g=1.3mmol
活化剂:m(HOBT)=M(HoBt) ×K=0.135g/mmol×1.3mmol=0.176g
缩合剂:V(DIC)=M(DIC) ×K/0.81=0.126g/mmol×1.3mmol/0.81g/ml=0.2ml
碱试剂:
V(collidine)=2×M(collidine)×K/0.80g/ml=2×0.124g/mmol×1.3mmol/0.80g/ml=0.40ml
m(pro)=M(pro) ×K=0.3374g//mmol×1.3mmol=0.439g
m(Gly)=M(Gly) ×K=0.2973g/mmol×1.3mmol=0.386g
m(Arg)=M(Arg)×K=0.6448g/mmol×1.3mmol=0.838g
m(Ala)=M(Ala)×K=0.3113g/mmol×1.3mmol=0.404g
m(Leu)=M(Leu) ×K=0.3534g/mmol×1.3mmol=0.459g
m(Ser)=M(Ser) ×K=0.3834g/mmol×1.3mmol=0.498g
m(Ile)=M(Ile) ×K=0.3534g/mmol×1.3mmol=0.459g
m(Trp)=M(Trp) ×K=0.5265g/mmol×1.3mmol=0.684g
m(Val)=M(Val) ×K=0.3224g/mmol×1.3mmol=0.419g
m(cys)=M(cys) ×K=0.5857g/mmol×1.3mmol=0.761g
m(Gln)=M(Gln)×K=0.6107g/mmol×1.3mmol=0.794g
m(Lys)=M(Lys) ×K=0.4685g/mmol×1.3mmol=0.609g
m(Tyr)=M(Tyr) ×K=0.4596g/mmol×1.3mmol=0.597g
m(TAMRA)=M(TAMRA) ×K=0.430g/mmol×1.3mmol=0.559g
靶向结合Sox2的多肽药物的化学合成的具体步骤为:
1)合成带保护的肽树脂
①脱Fmoc保护基团
取2g Fmoc-Cys(trt)-2-Chlorotrityl Resin放入接肽瓶中,该树脂的取代度为0.26mmol/g,加入适量CH2Cl2使树脂膨胀,然后把CH2Cl2抽掉。加入12ml 20vol%piperidine/DMF溶液振荡5min,抽干,再加入12ml 20vol% piperidine/DMF溶液振荡15min,然后抽干,用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,抽干,取10-20颗树脂作Kaisertest 检测呈阳性,假若是呈阴性,则重复以上脱帽步骤。
②Fmoc-Pro-OH的缩合
称取Fmoc-Pro -OH 0.439g,HOBT 0.176g 加入上面接肽瓶中。加入12ml(AR)级的DMF,0.4ml collidine,0.2ml DIC,密封后放入振荡器中反应1小时,温度控制在35°C,反应结束后,将反应液抽干,用DMF洗树脂3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,抽干,取10-20颗树脂作Kaiser test显阴性,假若程阳性则重复上面缩合反应操作直到反应完全Kaiser test显阴性通过。再脱Fmoc保护基团加入12ml 20vol% piperidine/DMF溶液振荡5min,抽干,再加入12mL 20vol% piperidine/DMF溶液振荡15min,然后抽干,用DMF洗3次,MeOH洗3次,CH2Cl2洗3次,抽干,取10-20颗树脂作Kaiser test 检测呈阳性,假若是呈阴性,则重复以上脱帽步骤。
③再依次缩合Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH等,序列中的氨基酸,缩合过程是从C端往N端逐个缩合,缩合方法同步骤2的Fmoc-Pro-OH相同,合成带保护的肽树脂。
2) 切割得肽粗品
将步骤1得到的保护的肽树脂加入到20mL的三氟醋酸:EDT:水:对甲酚体积比为87.5:5:2.5:5的混合液中,室温振荡2.5小时,过滤,用三氟醋酸洗树脂2次,滤液加无水乙醚得白色固体,反复用无水乙醚洗涤,得肽粗品0.45g。
3)氧化得精品多肽
称取0.3g肽粗品溶于200mL纯水,用氨水调pH值到9,室温搅拌反应24小时后,取样品检测ms,等氧化完全后,经过分离纯化冷冻后得到98%的精品多肽。制备所得的多肽药物Peptide 42和对照的空间构象图见图1。
实施例2
靶向结合Sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗增殖分析,包括以下步骤:
1)对食管鳞癌细胞KYSE450使用胰酶消化离心后进行细胞计数, 96孔板中每孔接种1000个细胞。在接种时添加含有0.02ug/uL浓度化学合成多肽Peptide42或对照的完全培养基培养细胞。每组重复5孔,共四组。
2)培养24h,吸去旧培养基,每孔加入100μL新鲜完全培养基,并加入10μL CCK8溶液。
3)在细胞培养箱内继续培养0.5-4h后,450nm和650nm波长下分别测定其吸光值OD450和OD650。
4)分别在第三天,第五天,第七天重复步骤2,3。
5)用GraphPad软件对吸光值数据进行统计分析。每个实验重复三次,采用方差统计T检验。
结果见图2,图2结果表明:与对照组相比,多肽Peptide42能显著抑制食管鳞癌细胞KYSE450细胞的增殖。
实施例3
靶向结合Sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗划痕分析,包括以下步骤:
1)使用10cm dish培养KYSE450细胞,待丰度达到80%时,用胰酶消化后离心,并计数细胞,在6孔细胞培养板中每孔接种1×106个细胞,接种时使用含有0.02μg/μL浓度化学合成多肽Peptide42和对照的完全培养基培养细胞,并在接下来的过程中使用同样的培养基;
2)待细胞贴壁培养达到80%的丰度时,在超净工作台中用灭菌的200μL黄色枪头划线,使划线的宽度一致,便于后期的统计观察;
3)划线完后用PBS洗两遍,洗去残留漂浮细胞,并在放大倍数为40×显微镜下拍照,便于与迁移后进行比较。
4)48小时候,继续在前次拍照位置进行拍照(图3A所示),采用Image-Pro Plus6软件统计细胞迁移的面积并计算迁移率(图3B所示),由图可知,与对照相比,添加了多肽药物Peptide 42后,细胞的迁移能力显著降低。
实施例4
靶向Sox2的合成多肽药物用于食管鳞癌治疗侵袭分析,包括以下步骤:
1)消化KYSE450细胞,离心后计数,每个小室接种1×104个细胞
2)将Matrigel处理过的小室插入培养的24孔板中,下室为20vol%FBS的RPMI1640培养基;
3)接种后的第二天,使用含有0.02μg/μl浓度化学合成多肽Peptide 42和对照添加至上室细胞培养基中;
4)在细胞培养箱内培养48h后进行细胞固定和结晶紫染色;
5)吸去小室内部培养基,用棉签刮掉内部未迁移的细胞;
6)小室浸入PBS中把残余培养基洗净后放置到4%PAF液中固定15min;
7)PBS洗两次,然后转移小室浸入到1%结晶紫水溶液中,室温染色30min;
8)用水把表面残留的结晶紫晾干,小室放置到载玻片上,倒置显微镜下拍照观察(图4A所示);
9)对每组4个重复进行细胞计数后经Graphpad Prism5软件统计分析(图4B所示)。每个实验重复三次,采用方差统计T检验。由图可知,与对照相比,添加了多肽药物Peptide 42后,细胞的侵袭能力显著降低。
实施例5
靶向结合Sox2的多肽药物用于食管鳞癌治疗体内成瘤能力分析,包括以下步骤:
1)用胰酶消化处于对数生长期的KYSE450细胞,用完全培养液收集细胞到15mL离心管(培养皿用PBS洗1-2次以充分收集细胞)。用PBS清洗细胞3次,用无血清培养基和Matrigel体积比为1:1的混合液重悬细胞,细胞浓度为2.5×107个/mL。
2)在裸鼠的背部双侧皮下注射0.2mL细胞悬液,裸鼠为4周龄雄性。
3)密切观察裸鼠的成瘤情况。在小鼠体内形成肉眼可见的肿瘤时(注射细胞1周后),每隔一天往肿瘤体内注射100μL 0.04μg/μL多肽药物Peptide 42和对照,共注射10次(图5A所示)。
4)四周后处死裸鼠;取出皮下肿瘤,拍照、称重(图5B所示),并将各组重量进行统计学分析(图5C所示)。由图可知,与对照相比,注射了多肽药物Peptide 42后,细胞的体内成瘤能力显著降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 靶向结合Sox2蛋白的多肽药物的合成及应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> Peptide 42
<400> 1
Thr Ala Met Arg Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
Cys Gly Pro Val Trp Phe Ser Thr Leu Phe Phe Pro Leu Phe Phe Leu
20 25 30
Ile Ser Leu Ala Arg Gly Pro Cys
35 40
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Thr Ala Met Arg Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
Cys Gly Pro Val Trp Ile Ser Leu Ala Arg Gly Pro Cys
20 25
Claims (8)
1.靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42,其特征在于:多肽药物的氨基酸序列为TAMRA-YGRKKRRQRRRCGPVWFSTLFFPLFFLISLARGPC。
2.根据权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42,其特征在于:其氨基端携带红色荧光基团TAMRA和穿透肽序列YGRKKRRQRRR,在多肽中将2个半胱氨酸氧化形成1个二硫键。
3.一种如权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42的合成方法,其特征在于:以Fmoc-AA树脂为原料,以HOBT为活化剂,DIC为缩合剂,Collidine为碱试剂合成带保护的肽树脂;再经切割液切割得肽粗品;肽粗品经空气氧化法氧化获得精品多肽药物。
4.根据权利要求3所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42的合成方法,其特征在于:Fmoc-AA:DIC:HOBT:collidine体积比为1:1:1:2,Fmoc-AA缩合过程用量过量2.5倍;切割液为:三氟醋酸:EDT:水:对甲酚体积比为87.5:5:2.5:5;空气氧化法为:肽粗品溶于纯水,用氨水调pH值到9,室温搅拌反应24小时。
5.一种如权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42的应用,其特征在于:多肽药物Peptide 42用于抑制肿瘤细胞的恶性进程。
6.一种如权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42的应用,其特征在于:多肽药物Peptide 42用于抑制肿瘤的起始发生。
7.一种如权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42在制备肿瘤治疗药物中的应用。
8.一种如权利要求1所述的靶向结合Sox2蛋白的多肽药物Peptide 42在制备食管鳞癌治疗药物中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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