CN109925309B

CN109925309B - 洋芹脑衍生物用于制备抗癌药物的用途

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Publication number: CN109925309B
Application number: CN201711368497.2A
Authority: CN
Inventors: 连秀屘; 杨定亚; 陈家章; 张筱君; 盂施妤
Original assignee: Syi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Syi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN109925309A

Abstract

本发明提供洋芹脑衍生物用于制备抗癌药物的用途，所述衍生物包含AP‑02、AP‑04及AP‑05；所述有效剂量为每次0.016～9.56mg/kg，优选的有效剂量为每次0.041～4.88mg/kg，最优选的有效剂量为每次0.081～2.44mg/kg；所述衍生物细通过细胞凋亡、大量表达肿瘤抑制蛋白p53以达成抑制肿瘤生长的功效。

Description

洋芹脑衍生物用于制备抗癌药物的用途

【技术领域】

本发明涉及洋芹脑衍生物用于抗癌的医药用途，特别是指一种可以抑制癌细胞增殖，以达到抗癌效果的活性物质。

【背景技术】

洋芹脑(Apiole)，又称为欧芹脑、洋芹醚(Apiol)、洋芫荽醚，该物质是1715年在德国莱比锡的一位药剂师亥姆霍兹·克里斯多福·林克(Heinrich Christoph Link)以蒸汽蒸馏挥发油时，所发现的无色针状并有微弱的香气的结晶体(一种氧化碳氢固体成份)，化学式又称为洋芹脑(2,5-二甲黄樟油精)，1855年已发现洋芹脑(Apiole)是一种有效的通经剂。洋芹脑(Apiole)的作用和莳萝脑(Dillapiol，C12H14O4，222.24)的作用也有些类似，都具有共同的(抗菌、杀虫、镇静)药理作用。天然的洋芹脑(Apiole)主要存在于欧芹(Petroselinum crispum)、芹菜(Apium graveolens)、水芹菜(Oenanthe aquatica)、绣线菊草/水芹(Oenanthe crocata)、莳罗(Anethum graveolens)、甜茴香(Foeniculumvulgare)、草胡椒(Peperomia pellucida)、荜澄茄(Piper cubeba)、独活/野芹菜(Levisticum officinale)、黄樟/北美檫树(Sassafras albidum)…等植物中。

近年死于癌症的中国人逐年增加，根据2012年中国城市居民死亡率及构成数据显示，癌症死亡占所有死因的比例为26.8％，为所有死因之首，故癌症的防治与治疗的重要性已逐渐受到重视。

虽然洋芹脑的医疗效果已引起人们广泛的注意，且台湾地区专利申请号TW201141474揭示了洋芹脑在制造用于治疗结肠直肠癌的医药品上的用途，并且揭示了医药组合物、细胞周期抑制剂以及结肠直肠癌细胞毒杀试剂，但是针对其衍生物的抗癌成分功效的研究并不多。又美国专利US 20130012477揭露了洋芹脑衍生物AP-02可用于抑制细胞色素P450，因此其可作为杀虫剂。洋芹脑衍生物AP-04是常用于化合物合成的中间产物，其功能作用所述不多。

虽然已有证据显示洋芹脑具有抗结肠直肠癌的功能，但其衍生物的抗癌功效仍不清楚。因此，本申请的发明人鉴于上述洋芹脑所具有的抗结肠直肠癌功效，乃亟思研究分析洋芹脑的其他衍生物的抗癌功效，并经多年苦心孤诣潜心研究后，终于成功研发完成本申请的洋芹脑衍生物用于抗癌的医药用途。

【发明内容】

本发明的目的即在于提供洋芹脑衍生物用于制备抗癌的药物的用途。

为达成前述发明目的，其中该衍生物的结构式如以下所示：

其中R₁及R2分别表示氢原子、具有1-3个碳原子的烷基、有1-3个碳原子的烯基、有1-3个碳原子的炔基及有1-3个碳原子的醚基。

为达成前述发明目的，其中该衍生物为AP-02(5-Allyl-6-methoxybenzo[d][1,3]dioxole)，即为5-烯丙基-6-甲氧基苯并[d][1,3]1,3-二氧杂环戊烯，具有下列化学结构：

为达成前述发明目的，其中该AP-04(5-methoxybenzo[d][1,3]dioxole)为5-甲氧基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯，具有下列化学结构：

为达成前述发明目的，其中该AP-05(5-ally benzo[d][1,3]dioxole)为5-烯丙基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯，具有下列化学结构：

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物的有效剂量为每次0.016～9.56mg/kg。为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物的优选的有效剂量为每次0.041～4.88mg/kg。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物的最优选的有效剂量为每次0.081～2.44mg/kg。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞、肺癌细胞及乳癌细胞的增殖。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物可通过促进细胞凋亡以达成抑制肿瘤生长的功效。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物通过大量表达肿瘤抑制蛋白p53以达成抑制肿瘤生长的功效。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物包括药学上可接受的载剂、赋型剂、稀释剂。

为达成前述发明目的，其中该洋芹脑衍生物的剂型选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆、和胶囊构成的群组。

【附图说明】

图1A为(乳房)癌细胞株MDA-MB-231的MTT试验的分析结果；

图1B为(乳房)癌细胞株ZR75的MTT试验的分析结果；

图1C为(乳房)正常细胞株MCF-10A的MTT试验的分析结果；

图2A为(肺)癌细胞株A549的MTT试验的分析结果；

图2B为(肺)癌细胞株PE089的MTT试验的分析结果；

图2C为(肺)正常细胞株HEL-299的MTT试验的分析结果；

图3A为(肝)癌细胞株Hep3B的MTT试验的分析结果；

图3B为(肝)癌细胞株HepG2的MTT试验的分析结果；

图3C为(肝)正常细胞BNL cl.2的MTT试验的分析结果；

图4A为(肠)癌细胞株Colon 205的MTT试验的分析结果；

图4B为(肠)癌细胞株HT-29的MTT试验的分析结果；

图4C为(肠)正常细胞株FHC的MTT试验的分析结果；

图5为不同剂量AP-02的毒杀癌细胞能力测试；

图6A、图6B为细胞周期及诱发凋亡的分析；

图7A为AP-02的肿瘤抑制效果；

图7B为小鼠的体重下降程度分析；

图8为老鼠肿瘤细胞的蛋白质表达分析。

【具体实施方式】

本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。本发明所使用的材料，除非特别指明，皆为市售易于取得的材料。

实施例1、3中抗癌药物的体外(细胞实验)肿瘤抑制效果的评估

所使用的Apiole及其衍生物AP-02、AP-04、AP-05，共四个抗癌药物分别为：

实验细胞株采用大肠(Colon)、乳(Breast)、肺(Lung)以及肝(Liver)的各二株癌细胞株和一株正常细胞株，分别为：二株人类大肠癌细胞株(HT-29和colon205)及一株正常人类大肠上皮细胞株(FHC)。二株人类乳癌细胞株(MDA-MB231和ZR75)及一株正常人类乳房上皮细胞(MCF-10A)。二株肺癌细胞株(A549和PE089)及一株正常人类肺脏细胞株(HEL-229)以及二株肝脏癌细胞株(Hep3B和HepG2)及一株正常人类肝脏细胞株(BNL cl.2)。并进行以下分析：

1.细胞存活率分析(MTT)试验：

使用MTT试验来进行试验，测试4种药物是否具有抑制癌细胞生长的能力。将细胞培养至细胞盘中后，加入不同浓度的药物一同培养进行作用持续5天，之后利用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)染料进行染色评估。MTT是一种可接受氢离子的黄色化合物染料，作用于活细胞粒腺体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素C的作用下，四氮唑环(tetrazolium)会裂开，因而产生藍色的甲瓒结晶，甲瓒结晶的生成量与活细胞数目成正比(死细胞中SDH消失，不能将MTT还原)。利用DMSO将甲瓒溶解出来之后，再利用吸亮度的测定可以去评估有多少细胞存活。可利用O.D.值得知细胞还原MTT的能力(甲瓒形成量)，此O.D.值代表粒腺体的活性，即活细胞数目。因此MTT试验是判断细胞生长的指标。

针对4种抗癌药物(Apiole、AP-02、AP-04、AP-05)进行毒杀癌细胞评估，给予0、0.1、1、10、50、100μg/ml的不同浓度的癌细胞与正常细胞并作用48小时。乳房细胞株

图1A结果显示Apiole无法抑制MDA-MB-231癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为45.45μg/ml、AP-04为373.40μg/ml、AP-05为63.37μg/ml，其中又以AP-02抑制癌细胞生长效果最佳。图1B结果也显示Apiole、AP-02、AP-04、AP-05无法抑制ZR75癌细胞生长。

图1C实验结果显示Apiole不会影响MCF-10A正常细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为27.63μg/ml、AP-04为181.40μg/ml、AP-05为26.44μg/ml。肺细胞株

图2A结果显示Apiole无法抑制A549癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为67.11μg/ml、AP-04为189.96μg/ml、AP-05为80.93μg/ml。又图2B结果显示Apiole、AP-04无法抑制PE089癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为38.36μg/ml、AP-05为50.11μg/mlAP-02其抑制癌细胞生长效果最佳。图2C的实验结果显示Apiole不会影响HEL-299正常细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为10.20μg/ml、AP-04为37.14μg/ml、AP-05为15.31μg/ml。肝细胞株

图3A实验结果显示Apiole、AP-04无法抑制Hep3B癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为22.61μg/ml、AP-05为53.79μg/ml，其中AP-02抑制癌细胞生长效果最佳。另一实验结果显示(如图3B所示)Apiole也无法抑制HepG2癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为40.21μg/ml、AP-04为81.04μg/ml、AP-05为37.55μg/ml。

图3C实验结果显示Apiole、AP-04不会影响BNL cl.2正常细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为67.74μg/ml、AP-05为87.10μg/ml。

肠细胞株

图4A结果显示Apiole无法抑制Colon 205癌细胞生长。其药物IC50分别为---AP-02为3.31μg/ml、AP-04为92.98μg/ml、AP-05为22.30μg/ml，其中AP-02抑制癌细胞生长效果最佳。另一实验结果如图4B所示，Apiole无法抑制HT-29癌细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为7.69μg/ml、、AP-04为626.80μg/ml、AP-05为11.27μg/ml。AP-02抑制癌细胞生长效果最佳。

图4C结果显示Apiole不会影响FHC正常细胞生长。其余药物IC50分别为---AP-02为52.77μg/ml、AP-04为101.30μg/ml、AP-05为56.14μg/ml。

统计上述实验结果如表一，结果发现AP-02对抑制细胞生长的效果较好。此外抑制肠癌细胞(Colon 205及HT-29细胞)生长效果优于正常细胞(FHC细胞)。因此选择AP-02作为使用的药物，而Colon 205及HT-29作为实验细胞株。

表一

单位：μg/ml

2.细胞存活率分析

使用细胞存活率分析测试4种药物是否具有毒杀癌细胞的能力。将细胞株培养至细胞盘中后，分别将8x 10⁵个Colon 205及HT-29细胞加入6cm盘中，每种细胞各7盘。分别加入(1μg/ml、5μg/ml、30μg/ml)等低、中、高三种剂量的DMSO、AP-02培养48小时。之后，将死细胞和活细胞收集在同一管中，利用台盼蓝计算死/活细胞的数量。台盼蓝是一种大分子染剂，活细胞的细胞膜完整且具有选择性通透性，因此台盼蓝无法渗入活细胞中，因而不会显色；反之，细胞死亡后其细胞膜破裂，因此台盼蓝会进入死细胞，进而将细胞染成蓝色。藉此方法得知细胞的存活率。

图5的结果显示，AP-02对于Colon 205及HT-29细胞的毒杀癌细胞的效果佳。Colon205细胞用低、中、高剂量处理后其癌细胞存活率分别为64.6％、53.9％、25.1％；而HT-29细胞则为89％、66.9％、40.1％。

3.细胞周期及凋亡分析：

由1(MTT)&2(细胞存活率分析)项的细胞实验结果，筛选出对药物最敏感的癌细胞株及抑癌效果及毒杀癌细胞能力最强的药物。将癌细胞株培养在细胞盘中，以不同剂量(低、中及高剂量)的药物处理，作用培养48小时后将细胞用胰蛋白酶切下，清洗后先用酒精进行固定，固定后的细胞使用碘化丙啶(PI)进行染色。PI能够插入DNA碱基对中，并在受到488nm激发后放出在562-588nm间波长的激发光。因此，可以利用这种特性去确认药物是否会影响癌细胞的细胞周期；抑或促进癌细胞细胞凋亡。

根据上述MTT及存活率实验结果，最后选择Colon 205作为实验模式细胞株，利用流式细胞仪分析AP-02(1μg/ml、5μg/ml、30μg/ml)对于细胞周期及诱发细胞凋亡的影响。分别将8x 10⁵个Colon 205细胞加入6cm盘中，共8盘。先利用含0.04％FBS的饥饿培养基(starvation medium)进行饥饿培养(starvation)，16小时候，一盘细胞加入正常的培养基(含10％FBS)(此组别称为Re-serum)、一盘细胞继续加入含0.04％FBS的饥饿培养基及DMSO、其他分别加入AP-02(1μg/ml、5μg/ml、30μg/ml)，Lope-01(1μg/ml、5μg/ml、30μg/ml)。培养48小时后，收集细胞利用流式细胞仪进行细胞周期及诱发细胞凋亡的分析。

实验结果显示，饥饿组相较于Re-serum组其G1有捕获现象，但于AP-02加药组在不同剂量处理后，都没有观察到捕获现象。因此，AP-02处理后并不会影响细胞周期(如图6)。但在Sub-G1之区域随着加药的剂量增加，Sub-G1比率也随之增加。经过统计分析后，实验结果得知在AP-02组别中，随着加药剂量由低至高增加，Sub-G1由3％增加至17.3％。

实施例2药物的体内(动物试验)肿瘤抑制效果的评估：

由上述细胞实验结果筛选出对药物最敏感的癌细胞株及抑癌效果及毒杀癌细胞能力最强的药物进行以下动物实验。使用4周大的裸鼠(Nude mice)来进行动物试验，每只老鼠在背侧植入新鲜培养的2X 10⁶个癌细胞悬浮液，待肿瘤长出后进行测量，从而对老鼠进行分组。组别分为无药物对照组(赋形剂)、高剂量药物1实验组、中剂量药物1实验组、低剂量药物1实验组，一共4组，每组各7只老鼠，共需28只老鼠。药物给予方式为每周一次进行腹腔注射，持续观察并等待肿瘤大小成长至待测大小时停止给药，通过计算肿瘤大小来判定抗体抑制的效果。

根据先前MTT实验数据证实AP-02在大肠癌细胞株中的IC50低于乳癌、肺癌及肝癌细胞株，因此以大肠癌细胞株Colon 205为动物实验模式的癌细胞株并利用腹腔注射给予AP-02与Lope-01。4周大的裸鼠在背侧异种移植2x 10⁶个细胞，待肿瘤长出后进行测量，从而对老鼠进行分组，组别分为无药物对照组给予PBS、AP-02 1mg/kg、AP-02 5mg/kg、AP-0230mg/kg，一共4组，每组各7只裸鼠，共28只裸鼠，药物给予方式为每周二次进行腹腔注射，连续给予6周，结束后将其杀死。肿瘤大小计算方式为肿瘤/体积(mm³)＝(w2x l)/2，w代表肿瘤宽度(mm)、l代表肿瘤长度(mm)，每次给予药物时记录老鼠重量来评估药物毒性。图7A实验数据结果显示，对照组PBS组别的肿瘤生长速率相较于给药组快，所有药物中AP-025mg/kg对抑制肿瘤生长的效果最好。此外分析小鼠体重数据(如图7B)，结果显示，随着周数的增加，肿瘤的成长体重均略微下降，其中施加AP-02 5mg/kg使体重下降程度最小，但其抑制肿瘤生长的效果最好，综合上述结果显示，AP-02 5mg/kg或许有机会在将来成为有效的大肠癌临床用药。

实施例3药物的动物实验肿瘤抑制机制的探讨：

从动物实验低、中、高剂量的AP-02和PBS组别随机各取两只老鼠的肿瘤，利用均质机将其磨碎并抽取其蛋白进行西方墨点法实验，利用细胞凋亡相关抗体探讨药物的抑癌机制。

实验数据显示如图8，细胞凋亡相关蛋白p53、Bad、Bcl2和Apaf 1皆于AP02(5mg/kg)组别中明显的大量表达，而caspase 9、caspase 3和caspase 8皆可于AP02(1mg/kg)观察到活化态的表达，各组肿瘤间以GAPDH作为内部对照。由实验结果得知，AP02能通过大量表达肿瘤抑制蛋白p53进而达到抑制肿瘤生长的目的。

由上述实施例可知，AP-02抑制Colon 205及HT-29细胞其癌细胞生长的效果高于FHC细胞。AP-02对于Colon 205细胞的毒杀癌细胞的效果最佳，且不影响Colon205细胞的细胞周期。又，AP-02会促进Colon 205细胞造成细胞凋亡，其中以5mg/kg抑制肿瘤生长的效果最好，但造成小鼠体重下降程度最小。AP02 1能通过大量表达肿瘤抑制蛋白p53进而达到抑制肿瘤生长的目的。

依据2005年美国食品药物管理局所公告的实验初期估算方法(成人健康志愿者治疗中初始临床试验的最大安全起始剂量的评估)，按人体与小鼠的换算系数为12.3倍计算，且以小鼠每公斤体重有效剂量为0.2-120mg/kg换算，人类每次的投药有效剂量为(0.2/12.3)～(120/12.3)＝0.016～9.56(mg/kg)；另以优选的剂量0.5-60mg/kg换算，人类每次优选的投药剂量为(0.5/12.3)～(60/12.3)＝0.041～4.88(mg/kg)；以最优选有效剂量试算，人类每次最优选的有效剂量为(1/12.3)～(30/12.3)＝0.081～2.44(mg/kg)。

综上所述，本申请不仅在技术思想上确属创新，并具备熟知的传统方法所不及的上述多项功效。

Claims

1.一种洋芹脑衍生物用于制备抗癌药物的用途，

其中该衍生物为AP-04(5-methoxybenzo[d][1,3]dioxole)，为5-甲氧基苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯，具有下列化学结构：

且所述洋芹脑衍生物可抑制肝癌细胞HepG2及大肠癌细胞Colon 205的增殖。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述洋芹脑衍生物的有效剂量为每次0.016～9.56mg/kg。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述洋芹脑衍生物可通过促进细胞凋亡来达成抑制肿瘤生长的功效。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述洋芹脑衍生物系通过大量表达肿瘤抑制蛋白p53来达成抑制肿瘤生长的功效。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该洋芹脑衍生物包括药学上可接受的载剂、赋型剂、稀释剂。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述洋芹脑衍生物的剂型选自溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆、和胶囊构成的群组。