CN109925277A - 一种多糖基温度响应性纳米凝胶及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖基温度响应性纳米凝胶及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：将水溶性多糖溶于水制备得到多糖水溶液；将引发剂硝酸铈铵溶于水制备得到引发剂水溶液；制备得到交联剂溶液；向所述多糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，在多糖糖环上引发自由基；加入温度响应性单体，形成纳米聚集体；得到多糖基温度响应性纳米凝胶水溶液；在恒温条件下，向步骤七制备得到的纳米凝胶水溶液中逐滴滴加促淋巴管再生药物，避光反应24‑48h，反应结束后透析纯化，冻干，最后得到多糖基温控释药纳米粒子即多糖基温度响应性纳米凝胶。利用多糖基温控释药纳米粒子的粒径可控性，可以主动靶向淋巴脉管系统，保证治疗的精准性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种以多聚糖基载药温敏纳米凝胶及其用于制备促淋巴管再生靶向控释药物中的应用。
背景技术
淋巴循环对体液的平衡有重要作用，淋巴回流障碍可引发远端组织水肿，淋巴系统生理结构的缺损中断易导致阻塞性淋巴水肿[1]，其一旦形成病理过程很难逆转，是世界难治性疾病之一。淋巴水肿的治疗分为对症治疗和对因治疗[3]，对症治疗以保守治疗为主，也是目前世界范围淋巴水肿应用最广的治疗，其中最具代表性的是我院张涤生院士1964年应用祖国医学原理首创的烘绑疗法[4]，通过局部高温烘疗使局部组织液和蛋白质重吸收，以此来减轻组织水肿，已被国际淋巴学会评为治疗肢体淋巴水肿非手术治疗较为有效的方法之一。尽管如此，从治疗效果而言，优良率也仅仅在50％左右，而且由于无法修复局部缺损中断的淋巴管，从根本上解除水肿存在的病因，所以易复发，需要长期甚至终生维持治疗，极大的降低了患者的生活质量。因此，要想彻底治疗淋巴水肿，必须采用对因治疗。
目前对因治疗主要是手术治疗，但是由于创伤大，存在供区牺牲问题，大多数患者很难接受，而且在淋巴管网大范围破坏的情况下，手术治疗很难做到重建和修复淋巴通路。随着再生医学的发展，生长因子和干细胞疗法为淋巴水肿的治疗开拓了新的途径，但是由于其对操作技术和储存环境要求很高，而且价格昂贵，又受到医学伦理的制约，尤其是易导致肿瘤复发和转移，对于肿瘤淋巴结清扫术后引起的肢体淋巴水肿患者的安全性无法确定，因此，需要建立一种安全性高、能够精准靶向病变部位并能受局部微环境调控释药的促淋巴管再生药物递送系统。目前烘疗已经证实是淋巴水肿较为有效的治疗方法，如果能在此基础上促淋巴管再生，实现对因治疗和对症治疗的协同作用，将为淋巴水肿的治愈带来极大的希望，因此，研发一种能够靶向定位淋巴道、受烘疗环境调控释药、安全有效地促淋巴管再生的药物递送系统成为治疗淋巴水肿亟待解决的难题。
发明内容
本发明提供了一种多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，并将其应用于促淋巴管再生药物的温控释放中。本发明针对淋巴水肿现有的有效治疗方式-烘疗法，制备出能够结合烘疗温度促淋巴管再生的控释药物。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一，将水溶性多糖溶于水制备得到多糖水溶液；
步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于水制备得到引发剂水溶液；
步骤三，将双官能团交联剂溶于水，制备得到交联剂溶液；
步骤四，在氮气保护下，向所述多糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，均匀搅拌，用硝酸调节pH值，反应一段时间，在多糖糖环上引发自由基；
步骤五，向步骤四的体系中加入温度响应性单体，反应一段时间，形成接枝共聚物，通过自组装力形成纳米聚集体；
步骤六，向步骤五的体系中加入步骤三所述交联剂溶液，使纳米聚集体更加稳定；
步骤七，反应一段时间后终止反应，然后进行透析或离心除去未反应的杂质分子，得到多糖基温度响应性纳米凝胶水溶液。
步骤八，在恒温条件下，向步骤七制备得到的纳米凝胶水溶液中逐滴滴加促淋巴管再生药物，避光反应24-48h，反应结束后透析纯化，冻干，最后得到多糖基温控释药纳米粒子即多糖基温度响应性纳米凝胶。
优选地，所述的水溶性多糖为葡聚糖，壳寡糖或羟丙基纤维素；
优选地，所述的双官能团交联剂为二烯丙基二硫醚或N,N-亚甲基双丙烯酰胺；
优选地，所诉的引发反应pH范围为1-2，引发反应时间为3-10min；
优选地，所述的温度响应性单体为N-乙烯基己内酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL)，N-羟甲基丙烯酰胺(NHMAAm)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，N,N-二乙基丙烯酰胺(DEAA)，乙烯甲基醚(VME)中的一种或几种；
优选地，所述的促淋巴管再生药物为，9-顺式维甲酸，VEGF-C，VEGF-D中的一种或几种；
步骤七中所述多糖基温度响应性纳米凝胶体具有交联结构。
多糖基温控释药纳米粒子的粒径可通过改变多糖、单体、交联剂的种类及比例来调节，最终，在室温条件下，使其粒径在50-300nm范围内。
多糖基温控释药纳米粒子的VPTT在39℃-42℃，使其在此温度范围内可以控制促淋巴管再生药物的释放。
多糖基温度响应性纳米凝胶的应用，其可用于制备促淋巴管再生靶向控释药物。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：作为药物载体的多糖基温度响应性纳米凝胶可以通过一步法快速、大量的合成。所得的纳米凝胶粒径均一，且其粒径可通过改变多糖、单体、交联剂的种类及比例来调节，其VPTT可通过选择单体的种类或调整不同单体的比例进行调节。此多糖基温控释药纳米粒子具有温敏性，结合烘疗温度，可用于药物控释系统。同时本发明利用多糖基温控释药纳米粒子的粒径可控性，可以主动靶向淋巴脉管系统，保证治疗的精准性。
附图说明
下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明，其中：
图1是温敏纳米凝胶扫描电镜图像。
图2是VEGF-C标准曲线的确定：(a)不同浓度VEGF-C的UV-Vis吸收曲线；(b)VEGF-C在278nm的吸收标准曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
葡聚糖基纳米凝胶体系实现了淋巴道的靶向定位，该体系为纳米尺度三维互穿网络，由亲水性或两亲性高分子组成，具有粒径可控、生物相容性好、载药率高等优点，并拥有传统纳米药物载体所不具有的刺激响应性(如温度、pH、还原环境等)，被认为是一种非常有前途的药物控释载体，前期也已证实其能够高效的接载药物，并能在pH和还原环境下响应性可控释药，同时也初步研发出其温度响应的性能，为借助烘疗实现药物控释提供可能，但是如何整合上述研究成果来研发一种理想的烘疗温度响应性促淋巴管再生药物靶向控释纳米凝胶体系(heating-Temperature responsive Durg targeted andcontrolledrelease Nanogels，TDN)来调控淋巴管再生治疗淋巴水肿还需要明确以下几个核心问题：(1)纳米凝胶体系引入温度响应性单体和接载促淋巴管再生药物后如何进一步调控合成参数再次实现淋巴道的靶向定位；(2)如何调控温度响应性相关参数实现烘疗温度响应性能以及实现后能否做到响应温度控释药物；(3)接载何种药物能够实现淋巴管再生的调控以及如何评估其用于治疗淋巴水肿的安全性和有效性。
如何实现淋巴道靶向定位是本项目的首要问题，其主要取决于TDN粒径的分布范围，因此如何调控合成参数使其粒径分布具有淋巴道的高度选择性是本项目首先要解决的第一个科学问题。采用皮下注射的纳米材料，粒径控制在50-300nm之间能够选择性进入淋巴管，小于50nm则进入血管，大于300nm则留在注射部位。荧光修饰后的葡聚糖基纳米凝胶具有淋巴道高度选择性，能够靶向定位淋巴道。本申请通过TDN粒径随投料比、温敏单体含量和载药量的变化规律，优化其淋巴管高度选择性范围的粒径的合成参数，使其能够靶向淋巴通路，为其后续发挥可控释药性能提供保障。
实现TDN的靶向定位后，如何实现烘疗温度响应性可控释药是其能否成为理想的促淋巴管再生药物递送系统的关键，也是本项目需要解决的第二个科学问题。基于Flory-Huggins理论，温度响应性纳米凝胶体系在体积相转变温度(volume phase transitiontemperature,VPTT)附近会发生粒径的骤然减小，因为温度响应性纳米凝胶分子结构中通常含有一定比例的疏水和亲水基团，温度的变化会影响这些基团的亲/疏水性，以及大分子链之间或大分子链和水之间的氢键作用，从而引起结构变化使粒径骤然减小，药物随纳米凝胶的脱水而释放，从而达到温度响应性释药。更为重要的是，其药物的释放还具有“开-关”模式，能够真正做到量化可控释放，这是由于温度的变化导致表层的凝胶在快速收缩而内部扩散通道的变化并不大，内部的溶胀与表层的收缩使得正在向外扩散的药物水溶液受到一种挤压力，表现为药物扩散速度陡然增大。随着时间增长，纳米粒凝胶表面无渗透性的致密表层厚度在加大，最终阻止了药物的释放从而实现药物递送系统所要求的“开-关”切换要求，而这种温度响应性“开-关”性能正好为借助烘疗环境实现药物控释提供可能。用于治疗淋巴水肿的远红外烘疗机，箱内温度一般在39℃-42℃之间，略高于人体生理温度，因此可利用此系统实现温度39℃-42℃时量化可控释放促淋巴管再生药物，达到淋巴水肿对症治疗和对因治疗的完美结合。
因此本申请通过调控VPTT位于39℃-42℃范围内来实现烘疗温度的响应性，主要通过在合成过程中引入VPTT范围在30-40℃左右的温度响应性单体N-乙烯基己内酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL)，但是由于单纯的NVCL对于调节纳米凝胶的VPTT值有限，因此在此基础上再引入其他温度响应性单体使得VPTT值有所上升，达到所需的稍高于体温的要求。因此可以通过探索不同单体的比例，寻找出VPTT在39℃-42℃时最合适的温度响应性单体的剂量范围、最佳投料比以及最大载药量等相关技术参数，明确其温度响应性可控释药性能，为其在烘疗环境时在淋巴道内可控释药提供保障。
在实现TDN淋巴道靶向定位和温度响应性可控释药性能后，选择接载何种药物才能调控淋巴管再生做到安全、有效地治疗淋巴水肿，是其能够走向临床应用的前提。近年来，随着乳腺癌和盆腔肿瘤发病率的增高，肿瘤根治术大面积淋巴结清扫和术后放疗引起的肢体淋巴水肿逐年上升，成为淋巴水肿主要致病原因。而淋巴管再生医学中最常用的是干细胞和生长因子VEGF-C，但是其尚未解决的调控难题易导致患者肿瘤复发和转移，因此需要寻找一种安全的有效的促淋巴管再生药物。维甲酸(retinoic acid，RA)是维生素A的衍生物，9-顺式维甲酸(9-cisRA)是其最重要的同分异构体之一。近年来研究发现，9-cisRA具有促淋巴管再生抑制淋巴水肿的作用，最重要的是它还具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用，已经广泛应用于肿瘤的预防和研究治疗，而且美国FDA已经批准可用于kaposi肉瘤和慢性手部湿疹的治疗。因此，9-cisRA成为可用于临床治疗肿瘤术后引起的肢体淋巴水肿的促淋巴管再生药物的最佳选择。然而常规给药方法与途径发现维甲酸具有较大的副作用和临床反应，因此如何其接载在淋巴道高度靶向性温度响应性药物控释系统，希望在降低毒副作用的同时，大幅度提高在病灶部位的组织分布，以期实现促淋巴管再生的安全性和有效性。
实施例1
葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶及其制备方法
室温条件下，将葡聚糖溶于水制成葡聚糖(Dex)溶液备用；将硝酸铈铵溶于水溶剂制成硝酸铈铵水溶液备用；在氮气的保护和均匀搅拌下，向葡聚糖溶液中加入硝酸铈铵溶液，并用酸调节pH值，然后继续搅拌一段时间，使葡聚糖产生足够多的自由基；在此体系中加入N-乙烯基己内酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL)单体，并搅拌一段时间，使单体聚合形成聚合物，并与葡聚糖通过自组装力形成纳米聚集体系；再向其中加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，固定之前所形成的纳米聚集体系，以提高体系的稳定性，一段时间后终止反应，得到含葡聚糖基温度响应性纳米粒子的溶液；将所得的溶液透析去除杂质，提纯后的纳米粒子冷冻干燥，制得葡聚糖基温度响应性纳米粒子储存备用；在恒温条件下，向制备得到的纳米凝胶水溶液中逐滴滴加促淋巴管再生药物9-顺式维甲酸，避光反应24-48h，反应结束后透析纯化，冻干，最后得到9-顺式维甲酸温度响应性释放的载药纳米凝胶，如图1所示。
实施例2
葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶的细胞毒性实验
取实施例1中葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶按照0.5ug/ml的浓度加入淋巴管内皮细胞培养基EGM-2-MV中，与淋巴管内皮共培养24小时、48小时和72小时后，结果显示淋巴管内皮细胞活性和数量和纯培养的对照组相比都无明显的改变，说明葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶具有良好的生物相容性，细胞毒性小。
实施例3
葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶的生物安全性
动物实验结果显示，取实施例1中相当于人体局部注射用量10倍与100倍的葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶注射于无菌级小鼠(共20只每组4只Balb/c小鼠北京华阜康生物技术有限公司)后肢足垫皮下，观察30天后和注射生理盐水的对照组比较后未发现体重和行为学有显著改变，同时对其血液肝肾功能检测只发现肝功能谷丙转氨酶和谷草转氨酶在注射后24小时有一过性升高，30天后对其肝脏、肾脏、心脏和脾脏进行病理学检测，和注射生理盐水的对照组相比并未发现显著改变，说明了葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶在生物安全性方面是安全的。
实施例4
葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶的温度响应性
取已制备好的样品2mI，加入2ml PBS，充分混匀。取4m上述制备的稀释溶液，加入比色皿。将含有样品溶液的比色皿置入紫外分光光度仪(uv—VISspectrometer,Cary一100，Varian)，观察其在波长300nm处的具有一定的吸收值变化，该紫外分光光度仪具有温控和搅拌功能的，其VPTT为样品溶液的吸收值急剧增加到50％时的温度，在35-45℃之间。
实施例5
葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶促淋巴管再生的有效性将生理盐水10ul经皮内给药方式注入动物模型作为空白对照组，将未载药的温度响应性纳米凝胶经皮内给药方式注入动物模型作为阴性对照组，将实施例1中同剂量的葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶经鼠尾静脉给药方式注入动物模型体内作为靶向对照组，将和葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶载药量相同的纯9-顺式维甲酸经皮内给药方式注入动物模型体内作为阳性对照组，将同剂量葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶经皮内给药方式注入动物模型体内但不联合烘疗技术作为温度响应性对照组，将葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶经皮内给药方式注入动物模型体内并联合烘疗技术作为实验组。皮内给药位点为小鼠趾蹼。通过MR小鼠淋巴管造影可以明确淋巴管缺损部位的大体淋巴管再生和再通情况，通过淋巴管缺损部位的组织学检测来明确局部的微淋巴管密度，通过淋巴管缺损部位的组织匀浆ELISA检测来明确局部的促淋巴管再生因子表达情况。将不同组别的试剂注入下肢淋巴水肿的小鼠模型体内，在注入前、注入后1周、2周、3周、4周、6周和8周这7个时间点分别对其淋巴管再通情况、微淋巴管密度以及促淋巴管再生因子表达情况进行检测，发现葡聚糖基9-顺式维甲酸温度响应性释放载药纳米水凝胶实验组相较于其他组淋巴管再通数目最多，微淋巴管密度最大，促淋巴管再生因子也是表达最高，因此具有明显的促淋巴管再生作用。
实施例6
通过验制备得到VEGF-C标准曲线，如图2所示，(a)不同浓度VEGF-C的UV-Vis吸收曲线；(b)VEGF-C在278nm的吸收标准曲线。根据VEGF-C紫外可见光吸收的标准曲线，得到VEGF-C的负载率为2.6％，负载效率为64.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一，将水溶性多糖溶于水制备得到多糖水溶液；
步骤二，将引发剂硝酸铈铵溶于水制备得到引发剂水溶液；
步骤三，将双官能团交联剂溶于水，制备得到交联剂溶液；
步骤四，在氮气保护下，向所述多糖水溶液中加入所述引发剂水溶液引发自由基，均匀搅拌，用硝酸调节pH值，反应一段时间，在多糖糖环上引发自由基；
步骤五，向步骤四的体系中加入温度响应性单体，反应一段时间，形成接枝共聚物，通过自组装力形成纳米聚集体；
步骤六，向步骤五的体系中加入步骤三所述交联剂溶液，使纳米聚集体更加稳定；
步骤七，反应一段时间后终止反应，然后进行透析或离心除去未反应的杂质分子，得到多糖基温度响应性纳米凝胶水溶液；
步骤八，在恒温条件下，向步骤七制备得到的纳米凝胶水溶液中逐滴滴加促淋巴管再生药物，避光反应24-48h，反应结束后透析纯化，冻干，最后得到多糖基温度响应性纳米凝胶多糖基温控释药纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述的水溶性多糖为葡聚糖，壳寡糖或羟丙基纤维素。
3.根据权利要求1所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述的双官能团交联剂为二烯丙基二硫醚或N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
4.根据权利要求1所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述引发反应pH范围为1-2，引发反应时间为3-10min。
5.根据权利要求2所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述温度响应性单体为N-乙烯基己内酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL)，N-羟甲基丙烯酰胺(NHMAAm)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，N,N-二乙基丙烯酰胺(DEAA)，乙烯甲基醚(VME)中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述促淋巴管再生药物为9-顺式维甲酸，VEGF-C，VEGF-D中的一种或几种。
7.一种多糖基温度响应性纳米凝胶，其特征在于，通过如权利要求1至6中任意一项所述的方法制备得到，所述多糖基温度响应性纳米凝胶体具有交联结构。
8.如权利要求7所述的多糖基温度响应性纳米凝胶，其特征在于，多糖基温控释药纳米粒子的粒径可通过改变多糖、单体、交联剂的种类及比例来调节，最终，在室温条件下，使其粒径在50-300nm范围内。
9.如权利要求7所述的多糖基温度响应性纳米凝胶，其特征在于，多糖基温控释药纳米粒子的VPTT在39℃-42℃，使其在此温度范围内可以控制促淋巴管再生药物的释放。
10.如权利要求7-9中任意一项所述的多糖基温度响应性纳米凝胶的应用，其特征在于，其可用于制备促淋巴管再生靶向控释药物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190625 |
|
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