CN109923459B - 用于调准激光扫描荧光显微镜的方法和具有自动调准设备的激光扫描荧光显微镜 - Google Patents

Abstract

为了调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，在所述正确调准中激励光(6)的最大强度(1)和荧光阻止光(7)的最小强度(4)和/或布置在荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像在镜头(20)的焦点中重合，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，并且由在所述图像中所述结构的所述影像(3，30，31，32)计算和补偿在所产生的图像中所述结构的成像的位置之间的错位(8)。在此，所产生的图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度和/或所述光阑(2)的不同光阑开口。

Description

用于调准激光扫描荧光显微镜的方法和具有自动调准设备的 激光扫描荧光显微镜

技术领域

本发明涉及一种用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的方法，在所述正确调准中激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像(Abbildung)在镜头的焦点中重合。本发明尤其涉及一种以下方法：该方法为了调节调准使用以下度量(Metrik)，计算该度量并且该度量能够实现精确的自动调准。

此外，本发明涉及一种激光扫描荧光显微镜，其具有用于实施这种方法的自动调准设备。

激光扫描荧光显微镜尤其是具有布置在荧光探测器前的光阑的共焦的显微镜和/或高分辨率的激光扫描荧光显微镜，在所述高分辨率的激光扫描荧光显微镜的情况下通过具有最小强度的荧光阻止光提高分辨率。荧光阻止光尤其可以是所谓的STED光或转换光，该STED光或该转换光通过受激地发射或通过转化到黑暗状态中阻止荧光着色剂发射荧光。

背景技术

由T.J.Gould等人的《Auto-aligning stimulated emission depletionmicroscope using adaptive optics》(光学快报，第38卷，第11号(2013)1860-1862)和US2015/0226950 A1已知一种用于调准STED激光扫描荧光显微镜的传统的方法和一种用于调准STED激光扫描荧光显微镜的使用度量的方法，以便将经聚焦的STED光的最小强度对准经聚焦的激励光的中心。在传统的方法的情况下，对金颗粒的散射光进行成像，并且使STED光的和激励光的焦点的位置相对彼此地移位，直至其点分布函数彼此取向。传统的方法需要将STED激光扫描荧光显微镜切换到散射光成像模式中，并且通常基于手动地调节STED光的和激励光的焦点的位置。在使用度量的已知的方法的情况下，对于STED光的和激励光的焦点的不同相对位置由STED图像的亮度和清晰度计算出度量，并且根据以下情况确定最佳的相对位置：度量取最大值。随后可以紧接着细调准，在该细调准的情况下使用第二度量，在第二度量中仅涉及STED图像的亮度。第二度量基于以下：如果STED光的最小强度的位置对准激励光的最大强度的中心，那么STED图像最亮。为了证明使用度量的已知的方法的功能，在使用度量的调准前或在使用度量的调准后比较以相同的激光扫描荧光显微镜记录的共焦图像和STED图像。在还未经调准的显微镜的情况下，在STED图像和共焦图像中发荧光的颗粒的图像的重心彼此偏差，而在经调准的激光扫描荧光显微镜的图像中的重心除了4.3+/-2.3nm的错位以外重合。对于这个值应注意的是，该值远远低于在大多的STED显微镜的典型的局部分辨率并且该值未示出优先方向。为了使STED光的和激励光的焦点相对移位，提出在STED光的射束路径中使用空间光调制器(SLM)。

由文献DE 10 2007 011 305 A1已知用于在具有至少两个彼此独立的光源的光学射束路径中进行射束调准的一种设备和一种方法。在此，尤其涉及高分辨率的STED激光扫描荧光显微镜的射束路径。光源的射束在共同的照射射束路径中叠加。暂时将校准标本

——根据该校准标本可以检查射束的瞳孔位置和/或焦点位置——引入到照射射束路径中。具体地，可以在照射射束路径中在中间图像的位置处或在中间图像的附近引入校准标本，并且该校准标本具有表面结构。为了调准目的，设有至少一个调节元件以影响要合并的射束中的至少一个射束的瞳孔位置和/或焦点位置。已知的借助校准标本的射束调准不考虑以下光学元件的影响：所述光学元件在照射射束路径中处于校准标本的后面。换句话说，校准标本仅仅允许在中间图像的范围内进行调准，但是不允许在样品中在镜头的焦点的范围内进行调准。

由Egidijus Auksorius等人的《Stimulated emission depletion microscopywith a supercontinuum source and fluorescence lifetime imaging》(光学快报，第33卷，第2号，2008年1月1日，第113-115页)已知，如果如此选择激励脉冲与STED脉冲之间的延迟，使得在产生的STED图像的情况下实现最大的空间分辨率，那么样品的被记录的第一荧光光子未收到高分辨率的信息，而是相应于传统的共焦图像，从而才基于随后记录的荧光光子计算出高分辨率的STED图像。

在Johanna Bückers等人的《Simultaneous multi-lifetime multi-color STEDimaging for colocalization analyses》(光学速递，第19卷，第4号，2011年2月14日，3130-3143页)中，参见Auksorius等人(参见以上)阐述如下：以STED显微术记录的第一光子还包含更远离STED射束的零点的荧光体的份额

即还不包含具有最高的局部分辨率的信息。

在Monty Glass等人的《The experimental effect of detector size onconfocal lateral resolution》(Journal of Microscopy，第164卷，第2号，1991年11月1日，第153-158页)中推测出：在移过点反射器时，在理论上的探测器信号与根据实验的探测器信号之间的横向移位归因于光学系统的误对准或使用真实的、色散(aberriert)的透镜代替如理论上假设的那样的完美的薄透镜。

由JP 2002-277746 A已知，如此定位光阑，使得该光阑允许通过最大光量到探测器上。对于减小的光阑直径迭代地实施这种光阑调准。

发明内容

本发明的任务

本发明基于以下任务：提出一种用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的方法和一种相应的激光扫描显微镜，所述方法和所述激光扫描显微镜能够直接在镜头的焦点中和在激光扫描荧光显微镜的荧光成像模式下实现快速的有针对性(zielgericht)的调准。

解决方案

本发明的任务通过一种具有独立权利要求1的特征的方法和一种具有独立权利要求7的特征的方法解决。从属权利要求2至6和8至17涉及根据本发明的方法的优选的实施方式。权利要求18设置用于实施根据本发明的方法的激光扫描荧光显微镜。

本发明的描述

在用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准的根据本发明的方法的情况下，在所述正确调准中激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像在镜头的焦点中重合，其中，以激励光的最大强度扫描在样品中以荧光着色剂标记的结构，以便产生具有该结构的影像(Abbilder)的样品的图像，其中，由在图像中结构的影像计算表示与正确调准的偏差的度量，所产生的图像相应于荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口，并且该度量是在所产生的图像中结构的影像的位置之间的错位。

“所产生的图像相应于荧光阻止光的不同强度”意味着：荧光阻止光的最大强度是不同的，具体地随荧光阻止光的强度而增大，该最大强度确定荧光阻止光的最小强度的大小并且因此确定以荧光阻止光可实现的空间分辨率。荧光阻止光的相对于其最大强度归一化的空间强度分布在此通常在所有图像的情况下保持相等，该空间强度分布包括最小强度。但是一旦空间分辨率随荧光阻止光的强度而增大，这就不是一定的。

原则上由T.J.Gould(2013)已知：在未根据规定地调准的激光扫描荧光显微镜的情况下，在相同结构的共焦记录的图像与STED图像之间出现错位。在那里不可得出的是：该错位适合作为用于有针对性地调准相应的激光扫描荧光显微镜的度量。相反地，由T.J.Gould等人(2013)提出用于粗调准和紧接着的细调准的两个其他的度量，并且需要在调准时使这些度量中的两个最大化。相比之下，根据本发明的度量以所产生的图像中结构的影像的位置之间的错位的形式不仅说明激光扫描荧光显微镜的在调准时要补偿的误调准(Fehljustierung)的方向，而且说明激光扫描荧光显微镜的在调准时要补偿的误调准的程度。因此，根据本发明的方法不通过在试验式地移位的情况下使度量最大化导致所期望的最佳的调准，其中，可以产生更多的图像。替代地，现有的误调准根据本发明以两个、三个或类似少量产生的图像精确定量地进行检测并且可以如此有针对性地进行补偿。如果在该补偿后再次产生具有荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口的图像，那么这仅仅用于控制根据先前计算出的度量调节的调准。

此外，根据本发明的方法基于以下认识：以在所产生的图像中结构的影像的位置之间的错位的形式的度量也可以用于相对于激励光在那里的最大强度调准在荧光探测器前的光阑(即该光阑在镜头的焦点中的影像)。

在根据本发明的方法的情况下所产生的图像所相应的荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口尤其可以包括荧光阻止光的零强度和/或突起超过Airy单元(Airy-Einheit)的光阑开口或移除光阑。但是荧光阻止光的不同强度和/或不同光阑开口也可以全部地(即以不同程度)在空间上限制以荧光探测器检测到的荧光。无论如何，荧光阻止光的强度或不同强度的一个光阑开口或所产生的图像相应的多个光阑开口如此大或如此小，使得由此在空间上限制由荧光探测器探测到的荧光。

在根据本发明的方法的一种实施方式中，使激励光的最大强度相对于荧光阻止光的最小强度恰好在以下错位的方向上移位：在相应于荧光阻止光的较高强度的图像中结构的影像相对于在相应于荧光阻止光的较低强度的另一图像中结构的影像具有该错位。

在根据本发明的方法的一种实施方式中，激励光的最大强度相对于光阑的成像在以下错位的方向上移位：在相应于光阑的较小光阑开口的图像中结构的影像相对于在相应于光阑的较大光阑开口的另一图像中结构的影像具有该错位。

此外，光阑的成像可以相对于荧光阻止光的最小强度在以下错位的方向上移位：在相应于荧光阻止光的较高强度的图像中结构的影像相对于在相应于荧光阻止光的较低强度的另一图像中结构的影像具有该错位。

激励光的最大强度或光阑为了正确调准要移位的程度取决于通过荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口产生的不同的点成像函数的相对宽度或以此实现的空间分辨率。在两个点成像函数的宽度方面的差越大，激励光的最小强度可以移位的距离就越接近错位的一倍。当所产生的图像中的一个是共焦图像并且另一图像是高分辨率的STED图像(该STED图像具有高强度和荧光阻止光的最小强度的相应地小的大小)时，例如表明移位该错位的一倍。反之，当所产生的图像中的一个是在没有光阑和荧光阻止光的情况下的图像并且另一图像是具有光阑(该光阑的光阑开口相应于Airy单元)的共焦图像时，表明移位该错位的大约两倍。无论如何，激励光的最大强度或光阑为了正确调准可以恰好在错位的方向上移位。对于正确调准所需要的精确移位程度取决于在一个图像和另一图像中结构的空间分辨率并且可以相应地确定为分辨率的函数和/或导致该分辨率的荧光阻止光的不同强度的函数，所述一个图像和另一图像相应于所述荧光阻止光的不同强度。在此，函数的值大于或等于一，并且具体的值可以分别由描述该函数的公式计算出或从逐点地定义该函数的查阅表提取。

可以理解，在使用在此也作为度量计算的错位的一倍或多倍的情况下可以考虑激光扫描荧光显微镜的成像比例。

在以上段落中所描述的根据本发明的方法的实施方式分别使用更高分辨率的图像作为参考点。在高分辨率的激光扫描荧光显微镜的情况下，具有荧光阻止光的最高强度并且因此具有荧光阻止光的最小强度的最小大小的图像是具有最高空间分辨率的图像。相应地有意义的是，使激励光和光阑按此取向。但是因为这取决于激励光和荧光阻止光和/或光阑的相对取向，所以例如也可以使用激励光的最大强度作为参考点。在此根据本发明的度量也可以用于根据方向和范围确定荧光阻止光的最小强度的所需要的移位和/或光阑的所需要的移位。

可以不仅如此实施根据本发明的方法，使得以荧光阻止光的不同强度和/或不同的光阑开口分开地扫描以荧光着色剂标记的结构。然而也可以仅一次以激励光的最大强度扫描样品中的以荧光着色剂标记的结构，其中，产生以下原始图像：在该原始图像中样品的两个图像叠加，所述两个图像相应于荧光阻止光的不同强度，并且然后由该原始图像求取两个叠加的图像。例如可以产生在其中两个图像叠加的原始图像，其方式是：借助探测器也对于以下时间段记录样品的荧光：该时间段处在荧光阻止光起作用前和/或在荧光阻止光起作用后。因此，以探测器记录的荧光和由此产生的图像包括未受荧光阻止光影响的部分，该部分可以以原则上已知的方式从原始图像提取出。

可以通过实验获得原始图像，其方式是：例如使荧光阻止光的脉冲相对于激励光的脉冲在时间上延迟。然后在荧光阻止光起作用前的荧光发射贡献出(beitragen)低分辨率的图像分量(Bildkomponent)，在荧光阻止光起作用后的荧光发射贡献出高分辨率的图像分量。在没有时间上进行分辨的探测的情况下，在这种情况下直接获得叠加的原始图像。替代地，可以以相对于荧光阻止光的脉冲的重复率倍增的激励光脉冲重复率进行工作，由此交替地产生低分辨率和高分辨率的图像分量并且加合成叠加的原始图像。所叠加的原始图像可以经受(离散)傅里叶变换(DFT)并且高频率部分例如可以通过与高斯函数相乘而从频谱移除。通过逆变换获得低分辨率的图像，而高分辨率的图像可以通过原始图像与低分辨率图像的求差来计算。在此，将原始图像分离成低(空间)频率部分和高(空间)频率部分涉及电子图像处理的标准方法，该标准方法也在图像修饰中稳定地占主流。对于该基础可参阅图像处理的教科书(例如R.C.Gonzalez、R.E.Woods的《Digital Image Processing》，第3版，皮尔森教育出版社股份有限公司，上萨德河，纽约，2008)。

根据本发明的方法不需要特定的结构，该结构在样品中以荧光着色剂进行标记。然而，根据本发明的方法通过如下简化：在样品中以荧光着色剂标记的结构包括发荧光的纳米颗粒，所述纳米颗粒彼此以较大的间距、尤其以比在荧光波长情况下的衍射边界更大的间距布置。然后，根据本发明的方法可以基于以下：在不同地产生的图像中计算和补偿这些纳米颗粒的影像之间的错位。

如果以荧光着色剂标记的结构包括多个发荧光的纳米颗粒或者也是在样品中不专门地设置用于根据本发明的方法的结构，那么可以在计算图像之间的互相关性的情况下计算在图像中结构的影像的位置之间的错位。计算图像之间的互相关性属于在图像分析处理的情况下的标准方法。

在根据本发明的方法的情况下，也可以局部地计算并且相应地局部地补偿在不同产生的图像中结构的影像的位置之间的错位(尤其作为互相关性)。这意味着在根据本发明的方法的情况下不仅调节唯一的全局调准，并且认为该全局调准在以激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度共同地扫描样品时保持正确，而且对于样品的不同部分区域——在扫描样品的情况下移向所述不同部分区域——分开地求取和补偿在激励光的最大强度与荧光阻止光的最小强度之间和/或在荧光探测器前的光阑的影像之间可能的错位。然后，为此可以设有光学元件，从而在扫描样品时对于该补偿进行不同地操控。

根据本发明的方法也可以用于在镜头的焦点中相对于激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像将另一激励光的另一最大强度和/或另一荧光阻止光的另一最小强度和/或在另一荧光探测器前的另一光阑的成像调准到正确调准。具有另一最小强度的另一荧光阻止光可以具有与荧光阻止光不同的波长或与荧光阻止光相同的波长。即使在不同的波长的情况下可以用于如下：在与荧光阻止光不同的空间方向上和/或以与荧光阻止光不同的物理方式限制相同的荧光标记物的荧光。如果另一激励光和/或另一荧光阻止光和/或另一荧光探测器分配给另一荧光着色剂，那么为了调节正确调准，以另一激励光的最大强度扫描在该样品或另一样品中以另一荧光着色剂标记的另一结构，以便产生具有另一结构的影像的该样品或另一样品的另一图像。然后在所述其他的图像中计算另一结构的影像的位置之间的错位，所述其他的图像相应于相应的荧光阻止光的不同强度和/或相应的光阑的不同光阑开口。然后，另一激励光的最大强度可以相对于荧光阻止光的最小强度和/或光阑的成像在该错位的方向上移位并且移位该错位的至少一倍。

为了在镜头的焦点中相对于激励光的最大强度和/或布置在荧光探测器前的光阑的成像将具有与激励光的波长不同的波长的另一激励光的另一最大强度和/或在具有与荧光探测器的光谱探测范围不同的另一光谱探测范围的另一荧光探测器前的另一光阑的成像调节到正确调准，替代地也可以计算其他度量。为此以该激励光的最大强度和/或另一激励光的另一最大强度扫描以如下荧光着色剂标记的结构：该荧光着色剂是唯一的、可以不仅以该激励光而且以另一激励光激励，和/或，该荧光着色剂不仅在该荧光探测器的光谱探测范围中发射而且在另一荧光探测器的另一光谱探测范围中发射。然后，其他度量作为在以下图像中在以唯一的荧光着色剂标记的结构的影像的位置之间的光谱错位来计算：该图像相应于一次以该激励光且一次以另一激励光激励荧光着色剂和/或考虑一次以该荧光探测器记录的荧光且一次以另一荧光探测器记录的荧光。

具体地，可以如下地确定光谱错位。彼此相继地以该激励光和另一激励光扫描以唯一的荧光着色剂标记的结构，其中，以该荧光探测器和/或另一荧光探测器探测由荧光着色剂发射的荧光。在此，以下情况可以是优选的：还没有光阑布置在该荧光探测器和/或另一荧光探测器前。在一次以该激励光且一次以另一激励光产生的两个图像之间的光谱错位直接说明在该激励光与另一激励光的最小强度之间的调准中的误差。原则上，两个图像——由这两个图像计算出该光谱错位——也可以由以下原始图像产生：该原始图像通过以该激励光的最大强度和/或另一激励光的另一最大强度同时地扫描结构产生。前提条件是，荧光的光谱成分取决于该激励光或另一激励光，并且因此基于在以该荧光探测器记录的荧光与以另一荧光探测器记录的荧光之间的关系可以推断出，该荧光归因于以该激励光还是以另一激励光激励荧光着色剂。

为了相对彼此地调节在该荧光探测器与另一荧光探测器前的光阑的调准，如果在此由荧光着色剂发射的荧光不仅落到该荧光探测器的光谱范围中而且也落到另一荧光探测器的另一光谱范围中，那么以该激励光的最大强度和/或另一激励光的另一最大强度扫描结构是足够的。然后，直接表示调准的误差的光谱错位可以由以下图像计算出：所述图像一次考虑以该荧光探测器记录的荧光且一次考虑以另一荧光探测器记录的荧光。

如果出现光谱错位，那么可以通过使另一激励光的最大强度或在另一荧光探测器前的光阑在光谱错位的方向上的相应的移位来补偿该光谱错位并且补偿光谱错位的程度，以便调节正确的调准。

可以理解，在使用光谱错位的情况下，激光扫描荧光显微镜的成像比例可以考虑为用于在调准时要补偿的误差的程度。

可以以不同的方式使激励光的最大强度相对于荧光阻止光的最小强度和/或光阑的成像移位。这包括反射激励光和/或荧光阻止光和/或荧光的光学元件的移位和/或倾斜。即使当光学元件不仅反射激励光而且反射荧光阻止光而且反射荧光时，该光学元件可以例如基于不同的波长或偏振产生不同的影响并且使激励光、荧光阻止光和荧光相对彼此地移位。移位的其他可能性是对激励光和/或荧光阻止光和/或荧光进行传送和/或进行预聚焦和/或进行色散的光学元件的移位或改变。这例如包括透镜和相位板。此外，例如可以通过手动的或电动的调节驱动器(Stelltrieb)使光阑自身移位。此外，可以改变自适应的光学系统、尤其空间光调制器(SLM)、可变形的镜或MEMS元件——其作用于激励光和/或荧光阻止光和/或荧光——的操控。

根据本发明的方法也适用于调节激光扫描荧光显微镜的正确调准，在所述激光扫描荧光显微镜中以激励光的多个最大强度和荧光阻止光的多个所分配的最小强度和/或光阑的影像并行地扫描样品。因此，在使用图像——所述图像相应于荧光阻止光的不同强度和/或光阑的不同光阑开口——中结构的影像的位置之间的错位的情况下，在镜头的焦点中激励光的多个最大强度和荧光阻止光的多个最小强度和/或多个布置在多个荧光探测器前的光阑的成像可以成对地重叠(zur Deckung bringen)。

为了使激励光的多个最大强度相对于荧光阻止光的多个最小强度和/或光阑的成像移位，可以移位和/或倾斜和/或转动将激励光和/或荧光阻止光分解成部分射束和/或将部分射束彼此叠加的光学元件。此外，可以移位和/或倾斜对激励光和/或荧光阻止光和/或荧光进行传送和/或进行反射的光学元件。如果对此(例如在所谓的RESOLFT荧光显微方法的情况下)时间充足，那么也可以分别在将激励光和荧光阻止光施加到样品上之间实现移位和/或倾斜。

可以在一维、二维或三维中实施根据本发明的方法。也就是说，激励光的最大强度可以与荧光阻止光的最小强度和/或光阑的影像在每个空间方向上重叠。为此仅仅需要的是，在实施根据本发明的方法的情况下不同地产生的图像分辨相应的空间方向。因此，在x和y方向上延伸的二维图像中不可以看出在z方向上的错位。但是该错位同样如在x或y和z方向上延伸的图像中的那样处于三维图像中。

根据本发明的激光扫描荧光显微镜具有用于激励光的激励光源、用于荧光阻止光的荧光阻止光源、用于荧光的荧光探测器、镜头和自动调准设备，在该荧光探测器前布置有光阑，该镜头将激励光和荧光阻止光聚焦到样品空间中并且将光阑成像到样品空间中。自动调准设备使得激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度以及光阑的成像在根据根据本发明的方法使用根据本发明的度量的情况下重叠。

本发明的有利扩展方案由权利要求、说明书和附图得出。在说明书中所提及的特征的优点和多个特征的组合的优点仅仅是示例性的并且可以替代地或累积地产生作用，而无需强制地由根据本发明的实施方式实现所述优点。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，关于原始申请文件和专利的公开内容适用如下：其他的特征可从附图——尤其所示出的几何形状和多个构件彼此的相对尺寸以及其相对布置和有效连接——得出。本发明的不同实施方式的特征或不同权利要求的特征的组合同样可能不同于权利要求的选择的引用关系并且以此得到启示。这也涉及以下特征：所述特征在分开的附图中示出或者在所述附图的说明中提及。这些特征也可以与不同权利要求的特征组合。同样，可以对于本发明的其他的实施方式取消在权利要求中列举的特征。

在权利要求和说明书中所提及的特征在其数量方面可以理解如下：存在恰好这个数量或比所提及的数量更大的数量，而不必明确地使用副词“至少”。如果例如谈及一个光学元件，这可以理解如下：存在恰好一个光学元件、两个光学元件或更多光学元件。这些特征可以通过其他的特征补充或者是唯一的特征，相应的结果由所述特征组成。

在权利要求中包含的附图标记不是对通过权利要求保护的主题的范围的限制。这些附图标记仅仅用于使得权利要求更容易理解的目的。

附图说明

以下根据在附图中示出的优选的实施例进一步阐述和描述本发明。

图1示出根据本发明的激光扫描荧光显微镜的示意图；

图2示出根据本发明的方法的实施方式的流程图；

图3示出在根据图1的激光扫描荧光显微镜的样品空间中激励光的相对于荧光阻止光的最小强度失调的最大强度；

图4阐明基于根据图3的荧光激励光的失调的最大强度在传统图像和高分辨率的STED图像中(各自没有或具有打开的光阑的情况下记录)发荧光的纳米颗粒的影像之间的错位；

图5示出沿根据图4的传统图像和高分辨率的STED图像的水平轴线的荧光强度特性；

图6示出在相应于图3的视图中激励光的相对于荧光阻止光的最小强度调准的最大强度；

图7示出在根据图6的激励光的调准最大强度的情况下在传统图像和非共焦的高分辨率的STED图像中发荧光的纳米颗粒的影像；

图8示出沿根据图7的传统图像和高分辨率的STED图像的水平轴线的荧光强度特性；

图9示出在根据图1的激光扫描荧光显微镜的样品空间中光阑的相对于激励光的最大强度和荧光阻止光的最小强度失调的成像；

图10阐明基于根据图9的失调的光阑在共焦图像和高分辨率的STED图像中发荧光的纳米颗粒的影像之间的错位；

图11示出沿根据图10的共焦图像和高分辨率的STED图像的水平轴线的荧光强度特性；

图12在相应于图9的视图中示出在调准后激励光的最大强度、荧光阻止光的最小强度和光阑的成像；

图13如图10那样地示出在共焦图像和STED图像中荧光的纳米颗粒的影像，但是在此在调准光阑后；

图14在相应于图11的视图中示出在调准光阑后沿共焦图像和高分辨率的STED图像的水平轴线的荧光强度特性；以及

图15示出根据本发明的其他实施方式的流程图。

具体实施方式

在图1中示出的激光扫描荧光显微镜15具有用于激励光6的激励光源16。激励光6由分束器26反射至另一分束器25。分束器25用于将激励光6与荧光阻止光7叠加，该荧光阻止光来自荧光阻止光源17。在此，在荧光阻止光源17与分束器25之间的荧光阻止光7的射束路径中设有波前调制器24。与荧光阻止光7组合的激励光6通过分束器25、经由扫描仪27且通过进行聚焦的镜头20对准到样品空间21中。在样品空间21中布置有样品22，将激励光6和荧光阻止光7聚焦进入到该样品中。由样品22发射的荧光19穿过镜头20、扫描仪27和分束器25和26、经由镜29以及通过荧光过滤器33、透镜34和光阑2，其中，透镜将荧光19聚焦到光阑的光阑开口上、到荧光探测器18上。自动调准设备23扫描样品22，以便产生在样品22中以荧光着色剂标记的结构的图像，该图像相应于荧光阻止光7的不同强度和/或光阑2的不同光阑开口。在此，荧光阻止光的不同强度可以相应于接通和关断的荧光阻止光7，并且光阑的不同光阑开口可以相应于存在的和移除的或远超过Airy单元地打开的并且因此不起作用的光阑2。如果在此得出在不同产生的图像中结构的影像之间的错位，那么调准设备23通过使光阑2或镜29移位或通过匹配波前调制器24的相位模式或通过影响扫描仪27来校正该错位。在通过调准设备23对确定的错位进行补偿的情况下也能够实现其他光学元件的位置变化，所述位置变化可以包括倾斜和/或转动。此外，主动的或自适应的光学系统(例如SLM、可变形的镜或MEMS元件)可以布置在激励光6和/或荧光阻止光7和/或荧光19的射束路径中并且由调准设备23通过控制/测量线路35操控以调准激光扫描荧光显微镜15。

图2示出由根据图1的调准设备23所实施的方法的流程图，该方法用于调准、即用于调节激光扫描荧光显微镜15的正确调准。在步骤11中产生图像A并且在步骤12中产生图像B，其中，图像A和B通过荧光阻止光7的不同强度和/或光阑2的不同光阑开口进行区分。在此，如果在此获得的原始图像包含以可分离形式的两个图像A和B，那么步骤11和12也可以包括以激励光6和荧光阻止光7仅一次扫描样品22。在步骤13中计算在两个图像A和B中结构的影像之间的错位。在步骤14中补偿该错位，其方式是：使荧光阻止光7的强度分布或光阑2相对于激励光8至少移位该错位的一倍并且恰好在错位的方向上移位。用于在一个步骤中补偿错位的精确移位程度取决于两个图像A和B的空间分辨率的关系。

图3在围绕根据图1的激光扫描荧光显微镜15的镜头20的焦点的样品空间21中示出荧光阻止光7的最小值4和激励光6的最大值1，该最大值在此相对于最小值4是失调的。图4示出在以根据图1的激光扫描荧光显微镜15记录的高分辨率的、但非共焦探测的图像中发荧光的纳米颗粒的影像30相对于在以激光扫描荧光显微镜15记录的传统的同样非共焦探测的图像中相同纳米颗粒的影像3的由此引起的错位8。图5根据影像30和3的荧光强度特性描绘相同的错位。

如果现在使激励光6的最大强度1在错位8的方向上移位并且相对于荧光阻止光7的最小强度4移位仅大约超过错位8的一倍，因为在发荧光的纳米颗粒的两个图像的分辨率之间的区别在此非常大，那么得出在图6中示出的正确调准，在所述调准的情况下影像3和30同心地叠加，参见图7和8。

除了图6以外，图9示出根据图1的光阑2的成像5，该成像在此相对于荧光阻止光7的最小强度4且相对于激励光6的最大强度1失调。由此引起在图10中示出的在共焦探测的高分辨率的图像中发荧光的纳米颗粒的影像32相对于在共焦探测的传统的图像中相同的发荧光的纳米颗粒的影像31的错位，所述图像分别以根据图1的激光扫描荧光显微镜15进行记录。在根据图11的影像31和32的荧光强度特性中也再次找到该错位。与光阑的成像5相对于荧光阻止光7的最小强度4所失调的程度相比较，错位8在此比在根据图1至3的激励光6的失调的最大值1的情况下更小。这原因在于：在共焦探测的情况下，在传统的图像与高分辨率的图像之间的空间分辨率的方面的差更小。

结果，光阑2的成像5但是又需要恰好在错位8的方向上移位明显地超过错位8的一倍，其中，这个程度取决于空间分辨率的相对关系，以便消除根据图9的失调并且达到根据图12的光阑2的成像5的经调准的状态。在光阑的成像5的正确调准情况下，在分别借助共焦探测的传统的图像和高分辨率的图像中相同的纳米颗粒的影像31和32同心地重合，这如由图13和14示出的那样。

在图15中根据另一方框图阐述的根据本发明的方法的实施方式以步骤36开始，在该步骤中通过以一个波长的激励光的最大强度进行扫描来产生样品的以唯一的荧光着色剂标记的结构的图像C。在下一步骤37中产生相同结构的另一图像D，其方式是：以另一波长的另一激励光的最大强度扫描该结构，该另一波长同样激励荧光着色剂以发射荧光。随后，在步骤38中计算在图像C和D中结构的影像之间得出的光谱错位。该光谱错位相应于在该激励光的最大强度与另一激励光的最大强度之间调准的误差。如果在后续步骤39中使该激励光和另一激励光的最大强度在光谱错位的方向上彼此移位该程度，那么实现两个最大强度彼此的正确调准。

相应地，图像C可以在仅以该激励光或另一激励光激励荧光着色剂的情况下由以荧光探测器记录的荧光产生，而图像D由以另一荧光探测器记录的荧光产生，其中，但是荧光着色剂不仅在一个荧光探测器的光谱探测范围中而且在另一荧光探测器的另一光谱探测范围中发射。然后，在步骤38中计算出的光谱错位表示荧光探测器之间或在荧光探测器前的光阑与另一荧光探测器前的另一光阑之间调准的误差。对于正确调准应消除该误差，其方式是：使另一光阑相对于该光阑在光谱错位的方向上移位该光谱错位的程度。

附图标记列表：

1 最大强度

2 光阑

3 影像(传统的图像，非共焦探测)

4 最小强度

5 光阑2的成像

6 激励光

7 荧光阻止光

8 错位

11-14 步骤

15 激光扫描荧光显微镜

16 激励光源

17 荧光阻止光源

18 荧光探测器

19 荧光

20 镜头

21 样品空间

22 样品

23 调准设备

24 波前调制器

25 分束器

26 分束器

27 扫描仪

29 镜

30 影像(高分辨率图像，非共焦探测)

31 影像(传统的图像，共焦探测)

32 影像(高分辨率图像，共焦探测)

33 过滤器

34 透镜

35 控制/测量线路

36-39 步骤

A-D 图像

Claims (18)

1.一种用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，布置在所述激光扫描荧光显微镜(15)的荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像与激励光(6)的最大强度(1)和荧光阻止光(7)的最小强度(4)在镜头(20)的焦点中重合，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，其中，所产生的图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度，其中，在所产生的图像中计算所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的错位(8)，其特征在于，为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使所述光阑(2)的成像相对于所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)在所述错位(8)的方向上移位，在相应于所述荧光阻止光(7)的较高强度的图像中结构的影像(32)相对于在相应于所述荧光阻止光(7)的较低强度的另一图像中结构的影像(31)具有所述错位。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述光阑(2)的成像(5)移位以下程度：所述程度相应于F倍的错位(8)，其中，F大于或等于1，其中，F是所述荧光阻止光(7)的不同强度的函数，所述图像和所述另一图像相应于所述不同强度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以所述激励光(6)的最大强度(1)重复地扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，逐图像地改变所述荧光阻止光(7)的强度，以便产生所述样品(22)的图像，所述图像相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，一次以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，产生原始图像，在所述原始图像中所述样品(22)的两个图像叠加，所述两个图像能够分配给所述荧光阻止光(7)的不同强度，其方式是：借助所述激光扫描荧光显微镜(15)的荧光探测器(18)对于以下时间段记录所述样品(22)的荧光(19)：所述时间段处在所述荧光阻止光(7)起作用前和/或所述荧光阻止光(7)起作用后，其中，由所述原始图像求取两个叠加的图像。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在使用所述错位(8)的情况下，在所述镜头(20)的焦点中相对于所述激励光(6)的最大强度(1)和所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)将另一荧光阻止光(7)的另一最小强度(4)调节到正确调准。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在使用相应于所述荧光阻止光(7)的不同强度的图像中所述结构的影像(9、10)的位置之间的错位(8)的情况下，所述激励光(6)的多个最大强度(1)和所述荧光阻止光(7)的多个最小强度(4)或多个布置在多个荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像在所述镜头(20)的焦点中成对地重叠。

7.一种用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，激励光(6)的最大强度(1)和布置在所述荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像(5)在镜头(20)的焦点中重合，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(A、B)，所述图像具有所述结构的影像(3，30，31，32)，其特征在于，所产生的图像相应于所述光阑(2)的不同光阑开口，计算在所产生的图像中在所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的错位(8)，并且为了调节所述激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准，使所述激励光(6)的最大强度(1)相对于所述光阑(2)的成像在所述错位(8)的方向上移位，在相应于所述光阑(2)的较小的光阑开口的图像中所述结构的影像(30)相对于在相应于所述光阑(2)的较大的光阑开口的另一图像中所述结构的影像(3)具有所述错位。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使所述激励光(6)的最大强度(1)移位以下程度：所述程度相应于F倍的所述错位(8)，其中，F大于或等于1，其中，F是在所述图像和所述另一图像中所述结构的空间分辨率的函数。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，以所述激励光(6)的最大强度(1)重复地扫描所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构，其中，逐图像地改变所述光阑(2)的光阑开口，以便产生所述样品(22)的图像，所述图像相应于所述光阑(2)的不同光阑开口。

10.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品(22)中的以所述荧光着色剂标记的结构具有发荧光的纳米颗粒。

11.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，在计算出所述图像之间的互相关性的情况下计算在所述图像中所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的所述错位(8)。

12.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，局部地计算和补偿在所述图像中所述结构的影像(3，30，31，32)的位置之间的所述错位(8)。

13.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，相对于所述激励光(6)的最大强度(1)将具有与所述激励光(6)的波长不同的波长的另一激励光的另一最大强度调节到正确调准，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)和所述另一激励光的另一最大强度扫描以所述荧光着色剂标记的结构，所述荧光着色剂不仅能够以所述激励光(6)激励而且能够以所述另一激励光激励，其中，在以下图像(C、D)中计算和使用在以所述荧光着色剂标记的所述结构的影像的位置之间的光谱错位：所述图像相应于一次以所述激励光且一次以所述另一激励光激励所述荧光着色剂。

14.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，在所述镜头(20)的焦点中相对于所述激励光(6)的最大强度(1)或布置在所述荧光探测器(18)前的所述光阑(2)的成像将在具有与所述荧光探测器(18)的光谱探测区域不同的另一光谱探测区域的另一荧光探测器前的另一光阑的成像调节到正确调准，其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描以如下荧光着色剂标记的结构：所述荧光着色剂不仅在所述荧光探测器(18)的光谱探测范围中进行发射而且在所述另一荧光探测器的另一光谱探测范围中进行发射，其中，在以下图像(C、D)中计算和使用在以所述荧光着色剂标记的结构的影像的位置之间的光谱错位：所述图像相应于考虑一次以所述荧光探测器记录的荧光和一次以所述另一荧光探测器记录的荧光。

15.根据权利要求1至3和7至9中任一项所述的方法，其特征在于，在使用相应于所述光阑(2)的不同光阑开口的图像中所述结构的影像(9、10)的位置之间的错位(8)的情况下，多个布置在多个荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像在所述镜头(20)的焦点中成对地重叠。

16.根据权利要求15所述的用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，具有一波长的所述激励光(6)的最大强度(1)和具有另一波长的另一激励光的另一最大强度在所述镜头(20)的焦点中重合，

其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)和所述另一激励光的另一最大强度扫描以如下荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(C、D)，所述图像具有所述结构的影像：所述荧光着色剂不仅能够以所述激励光(6)激励而且能够以所述另一激励光激励；并且

其中，在以下图像中确定在以所述荧光着色剂标记的结构的影像的位置之间的、表示与所述正确调准的偏差的光谱错位：所述图像相应于一次以所述激励光并且一次以所述另一激励光激励所述荧光着色剂。

17.根据权利要求15所述的用于调节激光扫描荧光显微镜(15)的正确调准的方法，在所述正确调准中，布置在具有光谱探测范围的荧光探测器(18)前的光阑(2)的成像(5)与在具有另一光谱探测范围的另一荧光探测器前的另一光阑的成像在镜头(20)的焦点中重合，

其中，以所述激励光(6)的最大强度(1)扫描以如下荧光着色剂标记的结构，以便产生所述样品(22)的图像(C、D)，所述图像具有所述结构的影像：所述荧光着色剂能够以所述激励光(6)激励并且不仅在所述荧光探测器(18)的光谱探测范围中进行发射而且在所述另一荧光探测器的另一光谱探测范围中进行发射；并且

其中，在以下图像中确定在以所述荧光着色剂标记的所述结构的影像的位置之间的、表示与所述正确调准的偏差的光谱错位：所述图像相应于考虑一次以所述荧光探测器记录的荧光并且一次以所述另一荧光探测器记录的荧光。

18.一种激光扫描荧光显微镜(15)，其具有：

激励光源(16)，所述激励光源用于激励光(6)；

荧光阻止光源(17)，所述荧光阻止光源用于荧光阻止光(7)；

荧光探测器(18)，所述荧光探测器用于荧光(19)，在所述荧光探测器前布置有光阑(2)；

镜头(20)，所述镜头将所述激励光(6)和所述荧光阻止光(7)聚焦到样品空间(21)中并且将所述光阑(2)成像到所述样品空间(21)中；

自动调准设备(23)，所述自动调准设备设置用于调节正确调准，在所述正确调准中，所述激励光(6)的最大强度(1)和所述荧光阻止光(7)的最小强度(4)和所述光阑(2)的影像(9、10)在所述镜头(20)的焦点中重合，

其特征在于，所述调准设备(23)构造用于自动地实施根据以上权利要求中任一项所述的方法。

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