CN109923413A - 多级色谱分析方法及分析系统 - Google Patents

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三田真史
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Abstract

本发明的目的是提供针对包含光学异构体的试样的更准确的分析方法和系统。其特征在于，参照色谱的结果，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止，将达到与对应于其它的1个或多个成分的色谱峰的完全分离的流分分别依次分取，在未达到对单一成分完全分离的情况下，将分取流分进一步供于色谱，在达到完全分离的情况下，将分取流分供于手性色谱。

Description

多级色谱分析方法及分析系统
技术领域
本发明涉及采用色谱法对试样中的多个成分的光学异构体进行分析的分析方法、以及执行该分析方法的分析系统。
背景技术
色谱法是使用导入到分析系统内的流动相、和被保持于柱等的固定相，在分析系统内与流动相一起导入包含多个成分的试样，利用流动相内的各成分与固定相的物理、化学相互作用的差别而将多个成分进行分离、检测的方法。
然而，如果要对物理、化学性质近似的多个成分进行分析，则在没有通过与固定相的相互作用而被充分分离的情况下进行溶出，色谱峰会发生重叠。其结果，对于单一分离系统，有时不能将试样所包含的多个成分精密分离。
因此，广泛采用了将通过色谱仪进行了分离、分级的成分进一步通过包含其它流动相和固定相的另一个色谱仪进行分离的分析方法。以下，将其称为2级色谱分析方法。
作为2级色谱分析方法，一般而言，分取通过第1级色谱仪分离出的包含目标成分的色谱峰流分，导入到第2级色谱将目标成分精密分离。在该情况下，有在串联的装置中切换柱的方法(在线柱转换法)、和在分析系统外暂时分取流分并导入到其它装置系统的方法(离线柱转换法)。
这些方法中，在一个分析系列中仅可以对一个目标成分进行分离，因此在以多个成分作为对象的情况下必须根据其数量而增加分析系列、分析次数，目标成分数越多则越需要劳力和时间。此外，对于如生物体试样那样量受限的试样，分析次数也产生限度，存在不能对全部目标成分进行分析的状况。
为了解决这样的问题，开发了将2个柱、与分别保持被分离出的流分的多回路组合，能够同时·一起·自动进行多个成分的分析的2级液相色谱方法以及系统(专利文献1)。此外开发了将在通过第1级的色谱而分离出的各成分的峰的从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止期间的时间被分级的成分向保持部逐次分取，将分取完成的成分供于第2级的色谱分析的液相色谱系统(专利文献2)。
这里，专利文献1和2意图是将通过1级的色谱难以分离的光学异构体通过第2级的色谱进行分离。专利文献2中，虽然公开了将在各成分的峰的从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止期间被分级的成分向保持部逐次分取，但是其前提是分析目标的各成分与光学异构体以外的成分相互不具有峰的重叠。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4291628号公报
专利文献2：日本专利第4980740号公报
专利文献3：日本特开2015-48332号公报
发明内容
发明所要解决的课题
通过以往的2级色谱，能够将多个成分的光学异构体分离进行定量。然而，本发明人等发现下述课题：例如如生物体中的试样中包含的氨基酸那样，存在大量复杂的基质成分，并且在一种光学异构体与其它光学异构体相比存在量大不相同的情况下、由温度等条件差异引起的略微的保留时间的波动等而产生的色谱峰的重叠有时会引起相对少的光学异构体的测定值发生变动。
用于解决课题的方法
因此，本发明人等为了解决那样的课题而调查了原因，结果发现：由第1级的色谱分离出的峰的略微的重叠，会对第2级的手性色谱中的分离结果带来很大影响。因此，本发明人等对色谱的系统进一步进行了研究，结果设计出下述系统：在通过1级的色谱而获得的色谱图中，对开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻进行严格判定，在开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻包含多个峰的情况下，即观察到峰的重叠的情况下，将该包含多个成分的流分供于下一级色谱，反复进行色谱分析直到针对单一成分达到完全分离。这样，通过将与达到了目标的分离的峰对应的流分供于以逐次光学异构体的分离作为目的的色谱分析(手性色谱分析)，从而对生物体试样那样的复杂基质中的微量的光学异构体也能够精度良好地测定，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及以下发明：
[1]一种采用色谱法分析试样中的多个成分的光学异构体的分析方法，所述分析方法包含下述工序：
工序(i)，使用柱和流动相通过色谱法将包含多个成分的试样进行分离和检测，从而获得色谱图；
工序(ii)，针对1个或多个色谱峰，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
工序(iii)，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分分别逐次分取；
工序(iv)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分包含多个峰的情况下，反复进行工序(i)～工序(iv)；
工序(v)，对从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰与单一峰对应的流分，通过手性柱色谱法将各光学异构体进行分离和检测，从而获得色谱图，
其中，在反复进行工序(i)～工序(iv)的情况下，使用与到当前工序为止使用的柱和流动相不同的柱和流动相进行色谱法。
[2]根据项目1所述的分析方法，开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻是指在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的1个或多个峰、与其它峰之间达到完全分离的时刻。
[3]根据项目2所述的分析方法，完全分离基于分离度为1.5以上这样的基准来判定。
[4]根据项目1～3中任一项所述的分析方法，上述色谱为高效液相色谱。
[5]根据项目1～4中任一项所述的分析方法，在针对标准品预先取得的色谱峰中，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，在该开始从基线隆起时和回归基线结束时取得流分。
[6]根据项目1～5中任一项所述的分析方法，上述柱选自反相柱、正相柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、手性柱、和它们的混合模式柱。
[7]根据项目1～6中任一项所述的分析方法，上述分析方法进一步包含以下工序：
工序(vi)，根据各光学异构体的色谱图，对各成分中的各光学异构体进行定量。
[8]根据项目1～7中任一项所述的分析方法，试样为生物学试样。
[9]根据项目1～8中任一项所述的分析方法，被分析的成分为构成蛋白质的氨基酸及其光学异构体。
[10]一种系统，是对多个成分进行分析的系统，所述系统具备：具备柱、流动相导入部和检测部的1个或多个色谱单元；具备手性柱、流动相导入部和检测部的手性色谱单元；流路；流路切换单元；1个或多个储液部；以及控制部，
(i)控制部通过驱动色谱单元，将试样中的多个成分进行分离和检测而取得色谱图；
(ii)控制部针对色谱图中的与1个或多个成分对应的色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
(iii)控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分逐次导入到1个或多个储液部；
(iv)在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰包含多个峰的情况下，控制部通过驱动流路切换单元，将流分从1个储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，进而反复进行工序(i)～(iv)，
(v)控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的单一峰对应的流分导入到手性色谱单元；
(vi)控制部通过驱动手性色谱单元，针对达到单一成分的完全分离的流分，将光学异构体进行分离、检测，取得色谱图。
[11]根据项目10所述的分析系统，开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻是指在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰与其它峰之间达到完全分离的时刻。
[12]根据项目11所述的系统，完全分离基于分离度为1.5以上这样的基准来判定。
[13]根据项目10～12中任一项所述的分析方法，在针对标准品预先取得的色谱峰中，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，在该开始时和回归结束时取得流分。
[14]根据项目10～13中任一项所述的系统，在上述工序(ii)中，控制部驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰对应的流分导入到与工序(iii)不同的色谱单元，而不是导入到多回路的回路。
[15]根据项目10～14中任一项所述的系统，储液部为回路。
[16]根据项目10～15中任一项所述的系统，与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元具有与到当前工序为止使用的色谱单元的柱相同的柱，但具有与到当前工序为止使用的色谱单元的流动相不同的流动相。
[17]根据项目10～16中任一项所述的系统，上述色谱为高效液相色谱。
[18]根据项目10～17中任一项所述的系统，上述柱选自反相柱、正相柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、手性柱、和它们的混合模式柱。
[19]根据项目10～18中任一项所述的系统，进一步地，(viii)控制部由各光学异构体的色谱图对各光学异构体进行定量。
[20]根据项目10～19中任一项所述的系统，试样为生物学试样。
[21]根据项目10～20中任一项所述的系统，被分析的成分为构成蛋白质的氨基酸及其光学异构体。
发明的效果
通过本发明，能够将试样中的目标成分的光学异构体以良好的精度分离并定量。
附图说明
图1表示用于进行本发明的色谱分析方法的分析系统的模块图的例子。
图2表示用于进行本发明的色谱分析方法的分析系统的构成图的例子
图3为表示流动相导入部10的细节的构成图的例子。
图4为将流路切换单元4、和储液部50/多回路单元55进一步详细地表示的构成图的例子。
图5表示通过按照本发明进行的色谱分析方法而获得的色谱图。进行了3级的色谱。图5A表示第1级的色谱图。谷氨酰胺与丝氨酸在1级中，针对单一成分不能达到完全分离。图5B表示第2级的色谱图。在第2级中达到峰的完全分离。图5C表示将达到了完全分离的分取流分供于手性色谱而获得的色谱图。
图6表示通过以往的2级色谱分析方法而获得的色谱图。图6A表示1级的色谱图。谷氨酰胺与丝氨酸在第1级中，针对单一成分不能达到完全分离，但在基于高斯分布而推定的分离时间分取流分。图6B表示将被分取的流分供于手性色谱而获得的色谱图。
图7表示通过按照本发明进行的色谱分析方法而获得的色谱图。进行了3级的色谱。图7A表示第1级的色谱图。谷氨酰胺与丝氨酸在第1级中，针对单一成分不能达到完全分离。图7B表示第2级的色谱图。在第2级中达到峰的完全分离。图7C表示将达到了完全分离的分取流分供于手性色谱而获得的色谱图。
图8表示通过以往的2级色谱分析方法而获得的色谱图。(A)谷氨酰胺与丝氨酸在第1级中，不能达到峰的完全分离，但在基于高斯分布而推定的分离时间中分取流分。(B)表示将被分取的流分供于手性色谱而获得的色谱图。
图9表示以人尿作为试样通过以往的2级色谱分析而获得的色谱图。分别表示天冬酰胺(A)、丝氨酸(B)、丙氨酸(C)和脯氨酸(D)的色谱图。
图10表示以将天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸和脯氨酸进行分离作为目的，通过以人尿作为试样的3级色谱分析而获得的色谱图。图10A为第1级的色谱图，图10B为第2级的色谱图，进而图10C表示第3级的色谱图。
图11表示通过以小鼠尿作为试样的2级色谱分析而获得的色谱图。图11A为第1级的色谱图，图11B为第2级的色谱图。
图12表示通过以小鼠尿作为试样的3级色谱分析而获得的色谱图。图12A为第1级的色谱图，图12B为第2级的色谱图，进而图12C表示第3级的色谱图。
图13表示通过以大鼠尿作为试样的3级色谱分析而获得的色谱图。图13A为第1级的色谱图，图13B为第2级的色谱图，进而图13C表示第3级的色谱图。
图14表示通过以人尿作为试样的3级色谱分析而获得的色谱图。图14A为第1级的色谱图，图14B为第2级的色谱图，进而图14C表示第3级的色谱图。
具体实施方式
本发明涉及采用色谱法分析试样中的多个成分的光学异构体的分析方法。更具体而言，本发明包含下述工序：
工序(i)，使用柱和流动相通过色谱法将包含多个成分的试样进行分离和检测，从而获得色谱图，
工序(ii)，针对分析目标的1个或多个成分的色谱峰，确定除去基质成分且开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，
工序(iii)，将除基质成分且与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分分别逐次分取，
工序(iv)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入光学异构体分离的工序，在与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分包含多个峰的情况下，反复进行工序(i)～工序(iv)，
工序(v)，对除去基质成分且与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的单一峰对应的流分，通过手性色谱对各光学异构体进行分离和检测，从而获得色谱图。
其中，在反复进行工序(i)和工序(ii)的情况下，优选使用与到当前工序为止使用的柱和/或流动相的组合不同的柱和/或流动相的组合进行色谱法。
另一方案中，本发明涉及对多个成分进行分析的系统，其具备：具备柱、流动相导入部和检测部的1个或多个色谱单元；具备手性柱、流动相罐、泵和检测部的手性色谱单元；流路；流路切换单元；1个或多个储液部；以及控制部。本发明的系统执行下述工序：
工序(i)，控制部通过驱动色谱单元，将试样中的多个成分进行分离和检测而取得色谱图；
工序(ii)，控制部针对色谱图中的1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
工序(iii)，控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分逐次导入到1个或多个储液部；
工序(iv)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰包含多个峰的情况下，控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰对应的流分从包含该流分的储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，进而反复进行工序(i)～(iv)，
工序(v)，控制部通过驱动流路切换单元，从储液部将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的单一峰对应的流分导入到手性色谱单元；
工序(vi)，控制部通过驱动手性色谱单元，针对包含单一成分的流分，将光学异构体进行分离、检测，从而取得色谱图。
在本发明中色谱能够使用任意色谱、例如液相色谱、气相色谱。液相色谱为以导入到分析系统内的液体作为流动相并且以柱等作为固定相，在分析系统内导入包含多个成分的试样，利用流动相内的各成分与固定相的物理、化学相互作用的差异而将多个成分进行分离、检测的方法。
本发明的色谱分析法涉及进行多级的色谱。以下，作为N级色谱进行概述。(N是指2以上的整数，可以实现3级、4级、5级、或其以上级的色谱)。基于附图记载对用于进行N级的色谱分析的系统1进行说明。本发明的系统1包含控制部2、色谱单元3、流路切换单元4和流路5，控制部2控制这些色谱单元3和流路切换单元4。色谱单元3与流路切换单元4经由流路5连接。导入到第一色谱单元3-(1)的试样在重复色谱单元3-(n)中反复导入n次(n是指0以上的整数)，然后导入到最后的手性色谱单元3-(f)，由此来进行分析。这里重复数n由(N-2)表示。反复进行操作，直到在各色谱分析后达到仅包含光学异构体的单一成分的完全分离。在达到完全分离出仅包含光学异构体的单一成分的情况下，不进一步进行反复操作，而是供于最后的手性色谱单元3-(f)。所使用的色谱单元优选使用与该工序以前使用的柱30和/或流动相不同的色谱单元。与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元是指，使用与到当前工序为止使用的柱与流动相的组合不同的柱与流动相的组合的色谱。因此，也可以使用柱相同，另一方面，仅流动相不同的色谱单元。在该情况下，以使用之前工序使用的柱，仅流动相不同的方式实施方法。色谱单元3通常包含流动相导入部10、试样导入部20、柱30和检测器40。能够由液相色谱分析单元的检测器的测定值制作色谱图，记录于记录计45。柱30中可以安装柱温度调节器35。流动相导入部10中，连接有流动相罐11、泵12，从而导入流动相。被导入的流动相可以为2种以上溶剂的组合，在该情况下，也可以使用流动相混合单元13，以经时地变更浓度梯度的方式使用，也可以用多个泵输送流动相进行混合。由于通过泵12汲取的流动相所包含的气体对与固定相的相互作用带来影响或成为噪音的原因，因此可以进一步设置脱气装置14。由流动相导入部10导入的流动相经由试样导入部20向柱30送出。可以从试样导入部20注入试样。试样可以进行前处理，也可以直接使用试样。对于2级以后的色谱，不是从试样导入部20导入式样，而是从储液部50导入暂时储存在储液部50的试样。试样中包含的各成分通过柱等固定相、与被导入的流动相的组合而被分离，从停留时间小的成分开始依次被溶出的成分通过检测器被检测。被检测器检测到的试样的成分的信号被传输到记录计而被记录，从而可以获得与相对于停留时间的检测的试样的成分的量有关的色谱图。
在本发明的色谱分析法中，使用与当前工序之前使用的柱30和流动相方面不同的色谱单元3反复进行分离、分析，直到除去基质成分，并对于仅包含目标光学异构体的成分实现完全分离为止。因此，除了第一色谱单元3-(1)以外，仅与反复进行的次数对应地设置重复色谱单元3-(n)。进而最后与手性色谱单元3-(f)连接。流经色谱柱而被分离出的成分可以通过流路切换单元4-(n)切换流路而暂时储存在储液部50-(n)。作为一例，储液部50-(n)是由多个回路56构成的多回路单元55。
流路切换单元4例如可以通过控制图4的六通切换阀来实现。作为一例，在开关位置S1时，来自柱的溶出液与排液罐连接，在检测器45检测要分取的流分时，切换到开关位置S2。在开关位置S2时，来自柱的溶出液与储液部50/多回路单元55连接，通过储液部50/多回路单元55的切换机构57a和57b，来确定储存位置。
多回路单元55具有多个回路56和切换机构57a和57b，切换机构57a和57b将从多个回路56之中选择的1个回路与流路5a和5b连接。通过使用这样的多回路单元55，可以将被柱30分离的试样的各个成分分别单独地保持于回路56。即，如果根据检测器中的试样的成分的检测，将流路切换单元4的开关位置从S1切换成S2，进一步根据连接切换机构57a和57b的回路56进行切换，则每个各回路56都可以保持试样的各个成分。在将全部试样的成分单独保持于多个回路56后，将流路切换单元4中的开关位置再次切换成S1，同时，驱动下个柱单元的流动相导入部10，从而可以将保持分取流分的回路56导入到下个色谱单元。
即，对于该本发明涉及的液相色谱装置，通过在对第一液体的一次的试样的注入中，使用1次或多次的色谱分析单元，可以除去基质成分并将仅包含试样的光学异构体的各成分完全分离，针对全部目标成分，最后使用手性柱色谱分析单元进行光学离析将D体和L体分离，并进行定量。因此，如果使用本发明涉及的液相色谱装置，则可以在一次的试样的注入之后，在线对多个试样成分进行光学离析和检测，因此与以往的离线多次反复实施柱转换手性HPLC的方法相比，废弃的试样量少，可以使用少的试样量，此外，可以迅速进行与试样的成分中的光学异构体有关的分析。
本发明的系统所包含的控制部2可以分别控制色谱单元3、流路切换单元4。更具体而言，控制部2通过分别控制色谱单元3所具备的流动相导入部10、试样导入部20、柱30、柱温度调节部35、检测器40、和记录计45，可以驱动色谱单元。而且，控制部2可以根据记录于记录部35的色谱图，切换流路切换单元4。更具体而言，控制部2针对色谱图中的与1个或多个成分对应的色谱峰，确定除去基质成分且从开始从基线隆起的时刻到除去基质成分且回归基线的结束时刻。控制部2可以控制流路切换单元4，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分逐次导入到1个或多个储液部。控制部2判定与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分是否与来源于仅包含光学异构体的单一成分的色谱峰对应。该判定通过判定在色谱图上为单一峰、或多个峰来进行。在与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分与来源于仅包含光学异构体的单一成分的色谱峰对应的情况下，控制部2进行控制将流分导入到最后的手性色谱单元，控制部驱动手性色谱单元，从而针对达到单一成分的完全分离的流分，将光学异构体进行分离、检测，取得色谱图。在判定为与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分不与来源于仅包含光学异构体的单一成分的色谱峰对应(即，与来源于光学异构体以外的多个成分的色谱峰对应)的情况下，控制部通过驱动流路切换单元，从1个储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，进而驱动该不同的色谱单元。所谓与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，是指使用与到当前工序为止使用的柱和流动相的组合不同的柱与流动相的组合的色谱。因此，可以使用柱相同，另一方面仅流动相不同的色谱单元。在该情况下，也可以以使用之前使用过的柱，仅流动相不同的方式构成系统。
在本发明中使用的色谱柱没有特别限定，可以使用例如反相柱、正相柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、手性柱、或它们的混合模式柱等。这些柱所使用的填充剂、流动相，只要是本领域技术人员就可以适当选择。
另外，可以使用以下的株式会社资生堂社制Nano Space系列的设备而构成本发明涉及的液相色谱装置。泵12可以使用3301，作为柱3，可以使用ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)、ML-KSAAAX-00015250-003(1.5mm i.d.×250mm)，作为最终手性柱3-(f)，可以使用KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.×250mm)，试样注入部20可以使用自动进样器3033，流动相混合单元13可以使用MPV，脱气装置14可以使用3010，柱选择单元4可以使用3011。此外，多回路单元55例如可以通过对MLV连接10根内径0.8mm×长度80cm(容积400μL)的回路56而制作。其它，作为检测器40的荧光检测器可以使用3013，记录计45可以使用3750。
作为本发明涉及的液相色谱装置的一例，制作出具有3级的色谱分析单元的系统。在该系统中，如果分别适当选择流动相、柱、柱的温度、流动相的流速等参数，则能够以高精度进行20种氨基酸光学异构体和/或其衍生物的光学离析检测。实施例中，关于谷氨酰胺(Gln)与丝氨酸(Ser)的光学异构体，对光学离析的适合条件进行了研究。接着，作为生物体试样，关于血浆试样、尿试样中的氨基酸的光学异构体，研究了光学离析的适合条件。
为了进行光学离析，包含各成分的试样可以预先与光学离析用试剂反应或在手性色谱的分析前与光学离析用试剂反应。作为光学离析用试剂，可以使用包含2,5-二氧代吡咯烷-1-基(2-(6-甲氧基-4-氧代喹啉-1(4H)-基)乙基碳酸盐等化合物的试剂。关于光学离析用试剂和与该试剂的反应方法、以及手性色谱柱的分离条件，可以使用专利文献3(日本特开2015-483332号公报)所记载的方法，但并不限于使用这些试剂。
在色谱图中，如果针对各成分达到分离，则可获得与1个成分对应的1个峰。所谓开始从基线隆起的时刻，是指由于除去基质成分并存在包含目标成分的1个或多个峰的峰组，从而从基线隆起的最初时刻。同样地所谓回归基线的结束时刻，是指由于存在包含某1个或多个峰的峰组，从而隆起的峰除去基质成分并初次回归基线的时刻。因此，从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止，虽然包含1个或多个峰，但是不存在与其它目标成分的峰重合。因此，从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止所包含的由目标成分的1个或多个峰构成的峰组、与其它目标成分的峰达到完全分离。因此，开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻也可以是指在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止包含的峰、与其它峰之间达到完全分离的时刻。所谓与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分，是指与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止所包含的1个或多个峰对应的流分，但只要不包含与其它成分对应的峰，则也可以包含开始从基线隆起的时刻之前的流分、回归基线的结束时刻之后的流分。
所谓完全分离，在日本药典中是指“峰的分离度为1.5以上”。本发明中，是指优选为1.2以上，更优选为1.5以上。在本发明中，为了判定开始从基线隆起的时刻、与回归基线的结束时刻，使用完全分离的定义。因此，并不需要必定分离单一的峰。在具有重叠的包含1个以上峰的峰组、与其它峰之间达到完全分离的情况下，将与该峰组对应的分取试样供于下个色谱分析单元。反复进行柱色谱，直到在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止仅包含单一的峰为止，即直到对应的流分除去基质成分并变为单一目标成分为止。这里，色谱单元3-1和重复色谱单元3-(n)不能分离光学异构体，所得的单一峰中可能包含光学异构体。因此，本发明中所谓单一成分可以包含光学异构体。此外，本发明中，在最后的工序(v)中，包含对从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰与单一峰对应的流分，通过手性柱色谱将各光学异构体进行分离和检测，获得色谱图的工序，基于通过该工序获得的色谱图，测定特定成分的光学异构体的量或浓度。因此，只要不对特定成分的光学异构体的量或浓度的定量带来影响，也能够容许最后的工序(v)中的“单一峰”包含不希望的峰。
如果对生物体试样进行色谱，则以除了目标成分的色谱峰以外，还包含生物体试样的种类所特有的基质成分的形式取得色谱图。因此，在对生物体试样进行分析的情况下，由于由基质成分引起的背景，因此有时不能确定从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻。在那样的情况下，以包含目标的多个成分的标准品预先确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，进行生物体试样的色谱的情况下，可以在确定出的开始时和回归结束时取得流分。这些时间可以以试样导入时作为基准，也可以预先在式样中添加较早时间溶出的基准成分，以这样的基准成分的峰作为基准。所谓标准品，是指添加作为目标的成分而调制的试样。作为一例，关于20种氨基酸，在分离检测光学异构体的情况下，可以使用添加了等量的除甘氨酸以外的各氨基酸的D体和L体的试样作为标准品。
在使用标准品的色谱图的情况下，本发明的分析方法之中，工序(ii)的针对1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻的工序基于标准品的色谱图进行。进而，以与通过该工序确定的从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的时间，在工序(iii)中将流分分别逐次分取。
至少进行1次重复色谱的方案中，本发明的分析方法可以包含下述工序：
工序(i)，使用柱和流动相通过色谱法将包含多个成分的试样进行分离和检测，从而获得色谱图，
工序(ii)，针对1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，
工序(iii)，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分分别逐次分取，
工序(iv)，使用与到当前工序为止使用的柱与流动相的组合不同的柱与流动相的组合通过色谱法将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分进行分离，从而获得色谱图，
工序(v)，在工序(iv)的色谱图上针对1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，
工序(vi)，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分分别逐次分取，
工序(vii)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰包含多个峰的情况下，反复进行工序(iv)～工序(vii)，
工序(viii)，对与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的单一峰对应的流分，通过手性柱色谱将各光学异构体进行分离和检测，从而获得色谱图的工序，
其中，在反复进行工序(iv)～工序(vi)的情况下，使用与到当前工序为止使用的柱和流动相不同的柱和流动相进行色谱法。
在至少进行1次重复色谱的方案中，本发明的分析系统具备：由柱、流动相罐、泵、和检测部构成的多个色谱单元；由手性柱、流动相罐、泵、和检测部构成的手性色谱单元；流路；流路切换单元；1个或多个储液部；以及控制部，执行下述操作：
工序(i)，控制部通过驱动色谱单元，将试样中的多个成分进行分离和检测而取得色谱图；
工序(ii)，控制部针对色谱图中的1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
工序(iii)，控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分逐次导入到1个或多个储液部；
工序(iv)，控制部通过驱动流路切换单元，将流分从1个储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元；
工序(v)，控制部通过驱动该不同的色谱单元，将导入到1个储液部的流分进一步进行分离、检测而取得色谱图；
工序(vi)，控制部针对色谱图中的1个或多个色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
工序(vii)，控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分逐次导入到1个或多个储液部；
工序(viii)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰包含多个峰的情况下，控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰对应的流分从包含该流分的储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，反复进行工序(v)～(viii)，
工序(ix)，控制部通过驱动流路切换单元，将包含单一成分的流分导入到手性色谱单元；
工序(x)，控制部通过驱动手性色谱单元，针对包含单一成分的流分，将光学异构体进行分离、检测，从而取得色谱图。
第1级的色谱可以在例如下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
第2级的色谱可以在例如下述条件下进行：
柱：ML-KSAAAX-00015250-003(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：10℃
流动相：0.15％甲酸甲醇/乙腈(85/15)
第3级的手性色谱可以在例如下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.x 250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：谷氨酰胺分析用：0.5％甲酸 甲醇/乙腈(50/50)
丝氨酸分析用：0.6％甲酸 甲醇/乙腈(40/60)
本发明的分析方法也可以在通过目标的成分标准品的分析而预先获得的色谱图中，确定开始隆起的时刻、和回归基线的结束时刻。本发明的其它方案中，可以实时生成色谱图，由该色谱图确定开始隆起的时刻、和回归基线的结束时刻。
在本发明中包含多个成分的试样可以为化学试样、生物学试样等任意的试样。试样优选为生物学试样，能够包含例如血液、血浆、血清、腹水、羊水、淋巴液、唾液、精液、尿等体液、与粪便、汗、鼻涕等排泄物、与体毛、指甲、皮肤组织、内脏组织等体组织等。进一步，由培养细胞获得的培养基、细胞破碎物等也能够作为生物学试样使用。本发明的试样，为了除去不溶性流分、提高分离能力等目的，可以根据试样的种类、分离对象的成分而适当进行前处理。这样的前处理，只要是本领域技术人员就可以任意选择。作为一例，在以血液作为试样的情况下，可以进行包含下述工序的前处理：
血浆、血清分离工序；
除蛋白工序；和
荧光衍生物化工序。
在本发明中，被分析的成分可以为具有光学异构体的任意成分，例如氨基酸、乳酸、苹果酸等生物体内代谢物。1个实施方式中，为氨基酸、特别是构成蛋白质的氨基酸。作为构成蛋白质的氨基酸以外的氨基酸，作为一例，可举出瓜氨酸、鸟氨酸、犬尿氨酸、羟基脯氨酸、DOPA等。此外，构成蛋白质的氨基酸已知20种，除甘氨酸以外都存在光学异构体(L-氨基酸、D-氨基酸)。这些光学异构体之中，生物体中主要存在L-氨基酸，另一方面，少量的D-氨基酸在生物体具有功能是近年来已知的，期望准确地测定D-氨基酸量。D-氨基酸具有各种已知或未知的作用，此外具有作为生物体中的疾病标志物的功能是明确的(WO2013/140785)。这些D-氨基酸在生物体中与L-氨基酸相比存在量极其少的情况多。通过本发明能够进行其准确的定量分析，在生理功能的解析、诊断用途方面非常有用。
在本说明书中提到的全部文献的整体通过引用被引入到本说明书中。以下说明的本发明的实施例仅以例示作为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅受权利要求书的记载限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更例如本发明的构成要件的追加、删除和替换。
实施例
实施例1
本实施例中，以确认本发明的分析方法和系统的精度作为目的，作为试样，使用了包含D:L＝1:1的丝氨酸、谷氨酰胺的混合水溶液作为试样。
作为前处理，对该试样，通过NBD-F进行了荧光衍生物化处理。
将进行了前处理的试样在下述条件下供于色谱。
第1级的色谱在例如下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图5A中。
由第1级的色谱获得的色谱图中，D,L-丝氨酸与D,L-谷氨酰胺的峰重叠。其分离度小于1。因此，针对包含D,L-丝氨酸的峰与D,L-谷氨酰胺的峰的峰组，分取与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的试样。
将分取的试样供于第2级的色谱。将第2级的色谱在下述条件下进行：
柱：ML-KSAAAX-00015250-003(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：10℃
流动相：0.15％甲酸甲醇/乙腈(85/15)。
将所得的色谱图示于图5B中。
由第1级的色谱获得的色谱图中，D,L-丝氨酸与D,L-谷氨酰胺的峰可以分离。其分离度为1.5，达到了完全分离。因此，针对D,L-丝氨酸的峰与D,L-谷氨酰胺的峰，分别分取与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的试样。
第3级的手性色谱在例如下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：谷氨酰胺分析用：0.5％甲酸 甲醇/乙腈(50/50)
丝氨酸分析用：0.6％甲酸 甲醇/乙腈(40/60)
将所得的色谱图示于图5C中。
重复5次对同一试样的色谱分析。将在各色谱工序中获得的色谱图示于图6A～C中。
比较例1
作为比较例，进行了组合了反相色谱与手性色谱的2级色谱。所使用的色谱条件如下所述：
第1级的色谱在例如下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图6A中。
第2级的手性色谱在例如下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：谷氨酰胺分析用：0.5％甲酸 甲醇/乙腈(50/50)
丝氨酸分析用：0.6％甲酸 甲醇/乙腈(40/60)
将所得的色谱图示于图6B中。
重复5次对同一试样的色谱分析。将在各色谱工序中获得的色谱图示于图6中。
5次试验中的3级色谱与2级色谱中的D-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、D-丝氨酸、和L-丝氨酸的测定值如以下表所述。
[表1]
3D-HPLC
D-Gln L-Gln D-Ser L-Ser
高度1 565495 525834 674000 595160
2 567415 526816 682133 600650
3 548881 508985 647315 568152
4 547798 508451 660798 581206
5 564597 525824 688967 608206
平均值 558837.2 519182 670642.6 590674.8
S.D. 8626.356 8553.086 14967.82 14310.13
RSD 1.543626 1.647416 2.231862 2.422675
2D-HPLC
D-Gln L-Gln D-Ser L-Ser
高度1 984707 867389 874071 722803
2 923574 821318 815050 666054
3 1008433 887225 894302 736138
4 1024743 897547 894349 739509
5 1059765 926206 947024 784467
平均值 1000244 879937 884959.2 729794.2
S.D. 45452.61 34921.88 42504.93 38040.57
RSD 4.54415 3.968679 4.803038 5.212507
如图5A和6A所示那样在第1级的色谱图中，丝氨酸与谷氨酰胺的峰具有部分重叠，不能达到完全分离。如果分取这样的流分供于手性柱色谱，则如图6B所示那样，在5次试验间产生峰的偏差。这样的峰的偏差与定量精度有关，即使是使用了同一试样的分析，峰高度(试样浓度)也产生差，其相对标准偏差(RSD)大(3.9～5.2)。另一方面，将不能达到完全分离的流分供于柱和流动相不同的第2级的色谱而获得的色谱图中，如图5B所述那样达到完全分离，如果将各流分供于手性柱色谱，则如图5C所述那样在5次试验间可以抑制峰的偏差。对于3级色谱中获得的峰高度(试样浓度)，相对标准偏差(RSD)比2级色谱的相对标准偏差(RSD)小(1.5～2.4)。
实施例2
本实施例中，进行了人血浆中的D-丝氨酸和L-丝氨酸、以及D-谷氨酰胺和L-谷氨酰胺的分离分析。作为前处理，对血浆试样，进行了除蛋白和荧光衍生物化处理。
第1级的色谱在例如下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图7A中。
基于实施例1的条件针对包含D,L-丝氨酸的峰和D,L-谷氨酰胺的峰的峰组，分取与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的试样。
将分取的试样供于第2级的色谱。将第2级的色谱在下述条件下进行：
柱：ML-KSAAAX-00015250-003(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：10℃
流动相：0.15％甲酸甲醇/乙腈(85/15)。
将所得的色谱图示于图7B中。
由第2级的色谱获得的色谱图中，除去了血浆基质成分，D,L-丝氨酸与D,L-谷氨酰胺的峰可以分离。其分离度为1.5，达到了完全分离。因此，针对D,L-丝氨酸的峰、与D,L-谷氨酰胺的峰，分别分取与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的试样。
将分取的分取试样供于第3级的手性色谱。将第3级的手性色谱在下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：谷氨酰胺分析用：0.5％甲酸 甲醇/乙腈(50/50)
丝氨酸分析用：0.6％甲酸 甲醇/乙腈(40/60)
将所得的色谱图图7C示于中。
比较例2
作为比较例，进行了组合了反相色谱与手性色谱的2级色谱。所使用的色谱条件如下所述：
第1级的色谱在例如下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图8A中。
第2级的手性色谱在例如下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S15250-070(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：谷氨酰胺分析用：0.5％甲酸 甲醇/乙腈(50/50)
丝氨酸分析用：0.6％甲酸 甲醇/乙腈(40/60)
将所得的色谱图示于图8B中。得不到谷氨酰胺、丝氨酸的光学异构体的单一峰。
通过2级色谱而获得的色谱图中，推测L-谷氨酰胺溶出的时间的峰不是显示单一成分的高斯分布的形状而是包含多个成分。此外，在L-谷氨酰胺的峰的紧前面D-谷氨酰胺溶出，但D-谷氨酰胺与基质成分的分离不充分，D-谷氨酰胺的峰不能判别(图8B)。进一步对于丝氨酸，在L-丝氨酸的峰紧前面D-丝氨酸溶出，虽然判别峰，但是进一步在D-丝氨酸的峰的紧前面以未被分离的形式存在可以认为来源于基质的峰，D-丝氨酸的定量值的精度降低了。对于生物体试样，一般而言D-氨基酸的存在量极其小，因此多数情况下难以与较大量存在的L体氨基酸、基质成分的完全分离。3级色谱中，D-氨基酸的峰、与L-氨基酸和基质成分的峰可以充分分离，定量值的误差变小。
比较例3
作为比较例，以人尿作为试样，进行了组合了反相色谱与手性色谱的2级色谱。作为前处理，对尿试样，进行了除蛋白和荧光衍生物化处理。在尿试样中加入20倍量的甲醇，将由甲醇匀浆获得的10μL上清液在减压下干燥，加入20μL的200mM硼酸钠缓冲液(pH8.0)和5μL的荧光诱导试剂(40mM的4-氟-7-硝基2,1,3-苯并二唑(NBD-F)的无水MeCN溶液)，在60℃下加热2分钟。进一步加入0.1％TFA水溶液(75μL)，供于HPLC。
所使用的色谱条件如下所述：
将第1级的色谱分离在下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将第2级的手性色谱分离在下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S(1.5mm i.d.×250mm)
流速：250μL/分钟
温度：25℃
流动相：0.2％甲酸 甲醇/乙腈(90/10)
将所得的色谱图示于图9中。
图9A为表示D体和L体的天冬酰胺的分离的色谱图，图9B为表示D体和L体的丝氨酸的分离的色谱图，图9C为表示D体和L体的丙氨酸的分离的色谱图，以及图9D为表示D体和L体的脯氨酸的分离的色谱图。天冬酰胺、脯氨酸与可以认为来源于生物体试样的杂质成分的分离不充分。
实施例3
本实施例中，使用了人尿作为试样。
实施与比较例3同样的前处理，将试样供于HPLC。将第一级中获得的色谱图示于图10A中，将第2级中获得的色谱图示于图10B中，而且将第3级中获得的色谱图示于图10C中。关于脯氨酸，由于存在量少，因此一并显示将峰放大100倍后的峰。
将第1级的色谱分离在下述条件下进行：
柱：ACR-HT(1.5mm i.d.×500mm)
流速：75μL/分钟
温度：45℃
流动相：15％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图10A中。
在由第1级的色谱获得的色谱图中分取包含天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、和脯氨酸的流分。
将分取的试样供于第2级的色谱。将第2级的色谱在下述条件下进行：
柱：ML-KSAAAX-002(1.0mm i.d.×150mm)
流速：100μL/分钟
温度：25℃
流动相：0.15％甲酸 甲醇/乙腈(80/20)。
将所得的色谱图示于图10B中。
在由第2级的色谱获得的色谱图中分取包含天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、和脯氨酸的流分。
将分取的试样供于第3级的色谱。第3级的手性色谱在例如下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：25℃
流动相：0.1％甲酸 甲醇/乙腈(90/10)
将所得的色谱图示于图10C中。
比较例4
本实施例中，实施关于作为构成蛋白质的氨基酸以外的氨基酸的瓜氨酸的D体与L体的分离和分析方法。
采取小鼠(C57BL)的尿试样，实施与比较例3同样的前处理，将试样供于HPLC。所使用的色谱条件如下所述：
将第1级的色谱分离在下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5-25％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图11A中。
将第2级的手性色谱分离在下述条件下进行：
柱：KSAACSP-105S(1.5mm i.d.×250mm)
流速：250μL/分钟
温度：25℃
流动相：0.1％甲酸 甲醇/乙腈(90/10)
将所得的色谱图示于图11B中。
在D体和L体的瓜氨酸的峰附近存在杂质成分，分离不充分。
实施例5
本实施例中，实施关于作为构成蛋白质的氨基酸以外的氨基酸的瓜氨酸的D体与L体的分离和分析方法。分别采取小鼠(C57BL)的尿试样、大鼠(Wistar)尿试样、和人尿试样，实施与比较例3同样的前处理，将试样供于HPLC。所使用的色谱条件如下所述：
将第1级的色谱分离在下述条件下进行：
柱：ML-1000(0.53mm i.d.×1000mm)
流速：25μL/分钟
温度：45℃
流动相：5％MeCN，0.05％TFA水溶液
将所得的色谱图示于图12A(小鼠)、图13A(大鼠)、和图14A(人)中。
在由第1级的色谱获得的色谱图中，分取包含瓜氨酸的流分。
将分取的试样供于第2级的色谱。将第2级的色谱在下述条件下进行：
柱：KSAAAX-000(1.5mm i.d.×250mm)
流速：150μL/分钟
温度：10℃
流动相：0.05％甲酸 甲醇/乙腈(90/10)。
将所得的色谱图示于图12B(小鼠)、图13B(大鼠)、和图14B(人)中。
在由第2级的色谱获得的色谱图中，分取包含瓜氨酸的流分。
将分取的试样供于第3级的色谱。将第3级的色谱在下述条件下进行：
柱：KSAACSP-001S(1.5mm i.d.×250mm)
流速：200μL/分钟
温度：25℃
流动相：0.1％甲酸 甲醇/乙腈(90/10)
将所得的色谱图示于图12C(小鼠)、图13C(大鼠)、和图14C(人)中。在各个对象中，关于D体与L体的瓜氨酸，分离度为1.5以上，达到了完全分离。
附图标记说明
1 分析系统
2 控制部
3 色谱单元
3-(1) 第一色谱单元
3-(n) 重复色谱单元
3-(f) 最终手性色谱单元
4 流路切换单元
4-(n) 重复流路切换单元
4-(f) 最终流路切换单元
5 流路
5a，b 流路
10 流动相导入部
10-(1) 第一流动相导入部
10-(n) 重复流动相导入部
10-(f) 最终流动相导入部
11 流动相罐
12 泵
13 梯度形成单元
14 脱气装置
20 试样导入部
30 柱
30-(1) 第一柱
30-(n) 重复柱
30-(f) 最终手性柱
35 柱温度调节器
35-(1) 第一柱温度调节器
35-(n) 重复柱温度调节器
35-(f) 最终手性柱温度调节器
40 检测器
40-(1) 第一检测器
40-(n) 重复检测器
40-(f) 最终检测器
45 记录计
45-(1) 第一记录计
45-(n) 重复记录计
45-(f) 最终记录计
50 储液部
50-(n)/20-(n) 重复储液部
50-(f)/20-(f) 最终储液部
55 多回路单元
56 回路
57a，b 切换机构
S1 开关位置
S2 开关位置。

Claims (21)

1.一种采用色谱法分析试样中的多个成分的光学异构体的分析方法，其包含下述工序：
工序(i)，使用柱和流动相通过色谱法将包含多个成分的试样进行分离和检测，从而获得色谱图；
工序(ii)，针对1个或多个色谱峰，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
工序(iii)，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分分别依次分取；
工序(iv)，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分包含多个峰的情况下，反复进行工序(i)～工序(iv)；
工序(v)，对从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰与单一峰对应的流分，通过手性柱色谱法将各光学异构体进行分离和检测，从而获得色谱图，
其中，在反复进行工序(i)～工序(iv)的情况下，使用与到当前工序为止使用的柱和流动相不同的柱和流动相进行色谱法。
2.根据权利要求1所述的分析方法，开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻是指在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的1个或多个峰与其它峰之间达到完全分离的时刻。
3.根据权利要求2所述的分析方法，完全分离基于分离度为1.5以上这一基准来判定。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分析方法，所述色谱法为高效液相色谱。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的分析方法，在针对标准品预先取得的色谱峰中，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，在该开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻收取流分。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的分析方法，所述柱选自反相柱、正相柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、手性柱、和它们的混合模式柱。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的分析方法，所述分析方法进一步包含以下工序：
工序(vi)，根据各光学异构体的色谱图，对各成分中的各光学异构体进行定量。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的分析方法，试样为生物学试样。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的分析方法，被分析的成分为构成蛋白质的氨基酸及其光学异构体。
10.一种系统，其是对多个成分进行分析的系统，所述系统具备：具备柱、流动相导入部和检测部的1个或多个色谱单元；具备手性柱、流动相导入部和检测部的手性色谱单元；流路；流路切换单元；1个或多个储液部；以及控制部，
(i)控制部通过驱动色谱单元，将试样中的多个成分进行分离和检测而取得色谱图；
(ii)控制部针对色谱图中的与1个或多个成分对应的色谱峰确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻；
(iii)控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止对应的流分依次导入到1个或多个储液部；
(iv)在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰由单一峰构成的情况下，进入下个工序，在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰包含多个峰的情况下，控制部通过驱动流路切换单元，将流分从1个储液部导入到与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元，进而反复进行工序(i)～(iv)，
(v)控制部通过驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的单一峰对应的流分导入到手性色谱单元；
(vi)控制部通过驱动手性色谱单元，针对达到单一成分的完全分离的流分，进行光学异构体的分离、检测，从而取得色谱图。
11.根据权利要求10所述的分析系统，开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻是指在从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰与其它峰之间达到完全分离的时刻。
12.根据权利要求11所述的系统，完全分离基于分离度为1.5以上这一基准来判定。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的分析方法，在针对标准品预先取得的色谱峰中，确定开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻，在该开始从基线隆起的时刻和回归基线的结束时刻收取流分。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的系统，在所述工序(ii)中，控制部驱动流路切换单元，将与从开始从基线隆起的时刻到回归基线的结束时刻为止的峰对应的流分导入到与工序(iii)不同的色谱单元，而不是将其导入到多回路的回路中。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的系统，储液部为回路。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的系统，与到当前工序为止使用的色谱单元不同的色谱单元具有与到当前工序为止使用的色谱单元的柱相同的柱，但具有与到当前工序为止使用的色谱单元的流动相不同的流动相。
17.根据权利要求10～16中任一项所述的系统，所述色谱为高效液相色谱。
18.根据权利要求10～17中任一项所述的系统，所述柱选自反相柱、正相柱、阳离子交换柱、阴离子交换柱、手性柱、和它们的混合模式柱。
19.根据权利要求10～18中任一项所述的系统，进一步地，(viii)控制部根据各光学异构体的色谱图对各光学异构体进行定量。
20.根据权利要求10～19中任一项所述的系统，试样为生物学试样。
21.根据权利要求10～20中任一项所述的系统，被分析的成分为构成蛋白质的氨基酸及其光学异构体。
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