CN109922675A - 用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的方法，该方法包括以下步骤：(a)利用溶剂洗涤烟叶的表面，该溶剂至少包括非极性溶剂，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物；(b)收集来自步骤(a)的溶剂；以及(c)使所收集的溶剂经受荧光光谱法，以确定感兴趣的多环化合物的水平。

Description

用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平 的方法
技术领域
本公开内容涉及用于确定烟草中的感兴趣的多环化合物的水平的方法、以及用于确定该水平的装置。
背景技术
诸如多环芳香烃(PAH)等多环化合物是不会在烟草中自然产生的已知的致癌物，但是可以在烘烤(例如，在烘烤烟草)和/或运输期间转移至烟草，并且从烟草转移至烟雾。
因此，重要的是确定烟叶中的PAH和其他有毒物的水平。烤烟中的PAH的水平是用于评估烟叶质量的一个标准。气相色谱-质谱(GC/MS)是用于确定烟叶中的PAH的水平的行业标准试验。然而，GC/MS是个复杂过程，资源密集，并且因此相对比较昂贵。此外，GC/MS仅可以在实验室中进行，这可增加试验所需要的时间长度，因为首先必须将烟草样品从田地或使用场所(例如)运送到实验室以用于试验。
在一些实施方式中，本发明试图提供用于确定烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的改进方法和改进装置。
发明内容
在所附权利要求中限定了本发明的方面。
根据本文中描述的一些实施方式，提供了用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的方法，该方法包括以下步骤：
(a)利用溶剂洗涤烟叶的表面，该溶剂至少包括非极性溶剂，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物；
(b)收集来自步骤(a)的溶剂；以及
(c)使所收集的溶剂经受荧光光谱法以确定感兴趣的多环化合物的水平。
根据本文中描述的一些实施方式，提供了一种用于确定存在于溶剂中的感兴趣的多环化合物的水平的装置，该装置包括：
(a)用于包含感兴趣的多环化合物的溶剂的容器；
(b)用于激发感兴趣的多环化合物的荧光的激发源；
(c)用于确定荧光的传感器；以及
(d)处理器，能操作为
(i)识别所收集的溶剂的发射光谱中的至少第一峰和第二峰，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长，并且第二峰对应于感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长；
(ii)将至少两个峰的强度进行相对于彼此的比较，以便获得荧光比；并且
(iii)将荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定感兴趣的多环化合物的水平。
我们意外发现可以执行本文中描述的方法以在相对短的时间段内成功地确定烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平。换言之，已经发现可以相对迅速地执行本文中描述的方法，以便在比先前已知的方法更短的时间尺度内提供试验结果。还发现了能够小规模地执行本文中描述的方法，并且例如使用便携式装置，诸如手持式装置，使得可以在原地(即，例如，在田地、在烤房、在绿叶脱粒(GLT)环境中、在质量控制实验室、在购买点、在烟叶营销中、在质量控制供应链中、或者在吸烟制品生产现场)执行烟叶的表面上的多环化合物的水平。
为了便于参考，现在在适当的章节标题下讨论本发明的这些和更多方面。然而，在各章节下的教导不必限于各特定章节。
附图说明
参考附图仅通过实例的方式来描述本发明的实施方式，在附图中：
图1示出了苯并[a]芘的吸收光谱。
图2示出了用于溶解在甲醇中的苯并[a]芘的激发-发射矩阵。
图3示出了用于溶解在己烷中的苯并[a]芘的激发-发射矩阵。
图4示出了在255nm的固定激发波长时从激发-发射矩阵提取的甲醇和己烷中的荧光发射光谱的比较。
图5示出了利用对低苯并[a]芘水平的烟叶样品的不同的叶子区域进行四次重复的直接叶子分析的激发-发射矩阵。
图6示出了利用对中苯并[a]芘水平的烟叶样品的不同的叶子区域进行三次重复的直接叶子分析的激发-发射矩阵。
图7示出了利用对高苯并[a]芘水平的烟叶样品的不同的叶子区域进行四次重复的直接叶子分析的激发-发射矩阵。
图8示出了用于高水平的苯并[a]芘烟叶的空白(左上方)、30s(右上方)、60s(左下方)和180s(右下方)的甲醇叶子洗涤样品的激发-发射矩阵。
图9a示出了具有已经在己烷中洗涤300秒的高水平的苯并[a]芘的烟叶样品的激发-发射矩阵。
图9b示出了具有已经在甲醇中洗涤60秒的高水平的苯并[a]芘的烟叶样品的激发-发射矩阵。
图10示出了仅在己烷溶剂中洗涤30s(左上方)、60s(右上方)、180s(左下方)和300s(右下方)的空白的激发-发射矩阵。
图11示出了具有已经在己烷中洗涤30s(第一行)、60s(第二行)、180s(第三行)和300s(最后一行)的时间段内的低水平的苯并[a]芘的烟叶样品的激发-发射矩阵。
图12示出了具有已经在己烷中洗涤30s(第一行)、60s(第二行)、180s(第三行)和300s(最后一行)的时间段内的高水平的苯并[a]芘的烟叶样品的激发-发射矩阵。
图13示出了在255nm的固定激发波长时从激发-发射矩阵提取的低水平的苯并[a]芘的己烷叶子洗涤样品的发射光谱。
图14示出了在255nm的固定激发波长时从激发-发射矩阵提取的高水平的苯并[a]芘的己烷叶子洗涤样品的发射光谱。
图15示出了在变化浓度的苯并[a]芘中处于330nm的发射峰与10nm(±5nm)带通的己烷叶子洗涤样品的平均荧光。
图16示出了在变化浓度的苯并[a]芘中处于400nm的发射峰与10nm(±5nm)带通的己烷叶子洗涤样品的平均荧光。
图17示出了在变化浓度的苯并[a]芘中的己烷叶子洗涤样品的平均荧光比(400/330nm)。
图18示出了在180s的时间段内在己烷中洗涤的2个校准烟叶样品的激发-发射矩阵，其中，样品各自具有低水平的苯并[a]芘。
图19示出了在180s的时间段内在己烷中洗涤的2个校准烟叶样品的激发-发射矩阵，其中，样品各自具有中水平的苯并[a]芘。
图20示出了在180s的时间段内在己烷中洗涤的2个校准烟叶样品的激发-发射矩阵，其中，样品各自具有高水平的苯并[a]芘。
图21示出了在255nm的固定激发波长时从激发-发射矩阵提取的6个校准己烷叶子洗涤的发射光谱。
图22示出了在变化浓度的苯并[a]芘中的6个校准己烷叶子洗涤样品的平均荧光比(400/330nm)。
图23示出了在变化浓度的苯并[a]芘中的6个校准己烷叶子洗涤样品以及实例1的2个己烷叶子洗涤样品的平均荧光比(400/330nm)的增强曲线图。
图24示出了包括来自低、中和高苯并[a]芘含量的己烷叶子洗涤含量的数据点的苯并[a]芘波长的荧光响应。
图25示出了包括来自低、中和高苯并[a]芘含量的己烷叶子洗涤含量的数据点的背景荧光响应。
图26示出了包括来自低、中和高苯并[a]芘含量的己烷叶子洗涤含量的数据点的叶绿素波长的荧光响应。
图27a示出了盲烟叶样品1至6的激发-发射矩阵。
图27b示出了盲烟叶样品7至12的激发-发射矩阵。
图27c示出了盲烟叶样品13至18的激发-发射矩阵。
图28示出了在变化浓度的苯并[a]芘中的各个盲烟叶样品的平均荧光比(400/330nm)。
图29示出了在变化浓度的苯并[a]芘中的各个盲烟叶样品以及6个校准样品的荧光比(400/330nm)。
尽管本发明容许各种修改和替代形式，但是在附图中通过实例的方式示出并且在本文中详细描述了具体实施方式。然而，应当理解，具体实施方式的附图和详细说明不旨在将本发明局限于所公开的具体形式。相反，本发明覆盖落入由所附权利要求所定义的本发明范围内的所有修改、等效物和替换。
具体实施方式
如上所述，本公开内容涉及用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的方法，该方法包括以下步骤：
(a)利用溶剂洗涤烟叶的表面，该溶剂至少包括非极性溶剂，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物；
(b)收集来自步骤(a)的溶剂；以及
(c)使所收集的溶剂经受荧光光谱法以确定感兴趣的多环化合物的水平。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是其中环体系通过经由单个原子系链、稠合或者它们的组合链接的多环化合物。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括多个稠环。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括2至10个稠环。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括2至7个稠环。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括3至6个稠环。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括4至6个稠环。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物包括5个稠环。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是芳香族多环化合物。如本文中使用的，术语“芳香族多环化合物”指的是由多个芳香环组成的多环化合物。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是多环芳香烃(PAH)。如本文中使用的，术语“多环芳香烃”指的是仅包含碳和氢原子的芳香族多环化合物。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是杂芳族多环化合物。如本文中使用的，术语“杂芳族多环化合物”指的是由多个芳香环组成的多环化合物，其中，芳族环系中的至少一个包含至少一个杂原子，诸如，氮、硫或者氧。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是多核芳香烃(PNA)。如本文中使用的，术语“多核芳香烃”指的是其中芳香环被稠合在一起的PAH。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是包含2至10个碳氢化合物环的PAH(优选地，PNA)。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是包含2至7个碳氢化合物环的PAH(优选地，PNA)。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是包含3至6个碳氢化合物环的PAH(优选地，PNA)。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是包含4至6个碳氢化合物环的PAH(优选地，PNA)。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是包含5个碳氢化合物环的PAH(优选地，PNA)。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是选自由萘、蒽、菲、苊烯、苊、芴、并四苯、荧蒽、苣、三亚苯、二萘嵌苯、芘、甲基胆蒽、并五苯、碗烯、六苯并苯和间二蒽嵌四并苯组成的组的PAH。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是选自由苯基[j]醋蒽烯、苯并[b]呋喃、苣、环戊二烯并[c,d]芘、二苯蒽[a,h]芘、二苯蒽[a,1]芘、萘、苯基[a]蒽、5-甲基屈、苯并[j]荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[c]菲、苯并[a]芘、苯并[g,h,i]二萘嵌苯、甲基胆蒽、双苯基[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯蒽[a,e]芘和二苯蒽[a,i]芘组成的组的PAH。
在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是芘。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是苯并芘。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是选自苯并[a]芘(另外被称为苯并(α)芘或BaP)和苯并[e]芘的苯并芘。在一些实施方式中，感兴趣的多环化合物是苯并[a]芘(BaP)。
在一些实施方式中，该烟叶是完整或切割的烟叶。在一些实施方式中，该烟叶是完整的。在一些实施方式中，该烟叶是切割的。
如本文中所描述的，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，该溶剂至少包括非极性溶剂，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物。如本文中所描述的，在本发明的方法中使用的溶剂至少包括非极性溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂进一步包括极性溶剂，诸如，极性质子溶剂或极性非质子溶剂。
如本文中使用的，术语“极性溶剂”指的是具有大于或等于15的介电常数的任何溶剂。如本文中使用的，术语“非极性溶剂”指的是具有小于15的介电常数的任何溶剂。如本文中使用的，术语“极性质子溶剂”指的是使负离子成溶剂化物的任何极性溶剂。如本文中使用的，术语“极性非质子溶剂”指的是使阳离子成溶剂化物的任何极性溶剂。
在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括有机溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括选自由烷烃、环烷烃、卤代烷、烯烃、炔烃、芳烃、乙醇、乙醛、酮类、羧酸、酯类、醚类、胺类、酰胺、腈类、硫作物、亚砜、水和它们的混合物组成的组的溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括选自由烷烃、环烷烃、卤代烷、芳烃、醚类、胺类和它们的混合物组成的组的溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括选自甲醇、甲苯、己烷和它们的混合物的溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括至少一个非极性溶剂和甲醇。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂是甲醇和甲苯的混合物。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂是己烷。
在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂至少包括选自由戊烷、己烷、庚烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、氯仿(CHCl3)、苯、甲苯、二乙醚、1,4-二氧杂环己烷、异辛烷、癸烷、以及它们的组合组成的组的非极性溶剂。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂包括己烷、环己烷或者它们的混合物。在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的溶剂是己烷。
如本文中描述的，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约0.01至约10wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约0.1至约10wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约1至约10wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约1至约9wt.％的感兴趣的多环化合物，诸如，从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约2至约8wt.％的感兴趣的多环化合物，诸如，从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约3至约7wt.％的感兴趣的多环化合物，诸如，从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约4至约6wt.％的感兴趣的多环化合物。
本发明人已经发现从烟叶的表面去除不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物减少从叶子内的具有非常强烈的荧光光谱的其他物质(例如，香豆素)的提取，并且这可以使感兴趣的峰模糊，因此不利地影响存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的确定。如技术人员将理解的，在烟草的烤房期间由于逸散排放通常发生的烟叶的多环化合物污染的本质意味着多环化合物大量存在于叶子的表面上，而不是叶子本身内。从叶子的表面去除多环化合物因此可以以控制方式实现，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约10wt.％的感兴趣的多环化合物。
如本文中使用的，术语“wt.％的感兴趣的多环化合物”指的是感兴趣的多环化合物占烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的总重数的百分比量。
在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶(完整或切割)的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的不大于约5wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约0.01至约5wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约0.1至约5wt.％的感兴趣的多环化合物。在一些实施方式中，该方法包括步骤(a)：利用溶剂洗涤烟叶的表面，使得从烟叶的表面去除存在于烟叶的表面上的约1至约5wt.％的感兴趣的多环化合物。本发明人已经发现该溶剂洗涤可以从烟叶的表面去除其他物质，并且去除不大于5wt.％的多环化合物意味着共同提取物的信号可能不会淹没感兴趣的多环化合物的信号。
在一些实施方式中，用于洗涤烟叶的表面的溶剂的量是每1g烟叶为约10至约50ml的溶剂，诸如每1g烟叶为约15至约45ml的溶剂，诸如每1g烟叶为约20至约40ml的溶剂，诸如每1g烟叶为约20至约35ml的溶剂，诸如每1g烟叶为约20至约30ml的溶剂，诸如每1g烟叶为约25ml的溶剂。
在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂洗涤小于10分钟的时间段，诸如小于约8分钟的时间段，诸如不大于约5分钟的时间段。在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂洗涤至少约0.5分钟的时间段，诸如至少约1分钟的时间段，诸如至少约1.5分钟的时间段，诸如至少约2分钟的时间段。在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂洗涤约0.5分钟至约10分钟的时间段，诸如约1分钟至约7分钟的时间段，诸如约2分钟至约5分钟的时间段。在一些实施方式中，烟叶利用溶剂洗涤约0.5分钟至约5分钟的时间段。
在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂在约10℃至约30℃的温度下，诸如在约15℃至约25℃的温度下，诸如在约20℃至约25℃的温度下洗涤。
在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂在约50至约150kPa的压力下洗涤。在一些实施方式中，在根据本发明的方法的步骤(a)中，烟叶利用溶剂在大气压下洗涤。
如本文中所描述的，该方法包括使所收集的溶剂经受荧光光谱法以确定感兴趣的多环化合物的水平的步骤(c)。在一些实施方式中，经受荧光光谱法的所收集的溶剂包含的感兴趣的多环化合物的量约5pg/mL至约500pg/mL，诸如约10pg/mL至约500pg/mL，诸如约20pg/mL至约500pg/mL，诸如约30pg/mL至约500pg/mL，诸如约40pg/mL至约500pg/mL，诸如约50pg/mL至约500pg/mL。
在一些实施方式中，经受荧光光谱法的所收集的溶剂包含的感兴趣的多环化合物的量每g烟叶约1ng至每g烟叶约500ng，诸如每g烟叶约5ng至每g烟叶约500ng，诸如每g烟叶约10ng至每g烟叶约500ng。
如技术人员将理解的，当一些溶解的芳香族化合物吸收UV光时，它们可以重新发射一小部分该能量作为较长波长的荧光。所收集的溶剂经受的荧光光谱法因此涉及通过入射UV辐射的吸收对样品中的分子的激发，以及随着分子返回至它们的基态结构的分子的随后发射(荧光)，其中通过合适的检测器测量各个发射波长的荧光的强度。如技术人员将理解的，荧光强度与样品种类的浓度成正比。
一般地，在多环化合物的荧光光谱法中，入射的UV辐射可具有约200至约500nm的波长。在本发明的实施方式中，入射的UV辐射可以由激发源，诸如白炽钨丝灯、白炽钨卤素灯、包含氙气体和/或汞蒸气的放电灯、激光或UV发光二极管(LED)光源提供。
在一些实施方式中，使用选自光电倍增器(PMT)检测器、热电堆、光电元件、光电二极管和电荷耦合器件(CCD)检测器的检测器来检测经受荧光光谱法的所收集的溶剂的荧光。在一些实施方式中，使用PMT检测器检测经受荧光光谱法的所收集的溶剂的荧光。
在一些实施方式中，使用能够同时测量吸收光谱和发射光谱这两者以提供用于所收集的溶剂的激发-发射矩阵(EEM)的设备执行荧光光谱法，以便确定感兴趣的多环化合物的水平。
在一些实施方式中，荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的发射光谱中的至少第一峰和第二峰，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长，并且第二峰对应于感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长。
所收集的溶剂的发射光谱组成由所收集的溶剂在入射辐射的某个预定的激发波长中产生的荧光(或发射)信号。如本文中描述的，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的与矩阵背景离散的第一特定发射波长。如本文中使用的，矩阵背景指的是所收集的溶剂的发射光谱中的波长，其不是由感兴趣的多环化合物产生的发射。在一些实施方式中，选择第一峰使得它组成所收集的溶剂的发射光谱中的发射最大值，其中，通过感兴趣的多环化合物产生所述发射最大值。
在一些实施方式中，发射光谱在200至500nm，诸如200至400nm，诸如200至300nm的范围内的激发波长中获得。在一些实施方式中，发射光谱在200至280nm的范围内的激发波长中获得。在一些实施方式中，发射光谱在280nm的激发波长中获得。在一些优选的实施方式中，发射光谱在255nm的激发波长中获得。
在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有在300至370nm的范围内，诸如在310至370nm的范围内的波长的发射。在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有在310至360nm的范围内的波长的发射。在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有在320至350nm的范围内的波长的发射。在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有在320至340nm的范围内的波长的发射。在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有在325至335nm的范围内的波长的发射。在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第一峰是具有约330nm的波长的发射。如本文中使用的，术语“约330nm”指的是330nm的发射峰，包括发射峰的±5nm的带通(即，330nm±5nm)。
在一些实施方式中，在使用255nm的激发波长产生所收集的溶剂的发射光谱中，第一峰是具有320至340nm的波长的发射。在一些实施方式中，在使用255nm的激发波长产生所收集的溶剂的发射光谱中，第一峰是具有约330nm的波长的发射。
在一些实施方式中，在使用255nm的激发波长产生所收集的溶剂的发射光谱中，例如，在溶剂是非极性溶剂，例如己烷中，第一峰是具有325至335nm，诸如约330nm的范围内的波长的发射。
在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第二峰是具有385至425nm的范围内，例如在390至420nm的范围内，诸如在390至410nm的范围内的波长的发射。
在一些实施方式中(诸如，其中，激发波长是255nm)，第二峰是具有395至405nm的范围内，诸如约400nm的波长的发射。如本文中使用的，术语“约400nm”指的是400nm的发射峰，包括发射峰的±5nm的带通(即，400nm±5nm)。
在一些实施方式中，在使用255nm的激发波长产生所收集的溶剂的发射光谱中，例如，在溶剂是非极性溶剂，例如己烷中，第二峰是具有395至405nm的范围内，诸如约400nm的波长的发射。
在一些实施方式中，荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的发射光谱中的至少第一峰和第二峰，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长并且第二峰对应于感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长，其中，荧光光谱法进一步包括将第一峰和第二峰的强度相对于彼此进行比较以便获得荧光比的步骤。如本文中使用的，术语“荧光比”指的是所收集的溶剂的发射光谱中的第二峰的荧光强度与发射光谱中的第一峰的荧光强度的比值，其中，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长并且第二峰对应于感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长。
在一些实施方式中，荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的发射光谱中的两个以上峰，其中，至少两个峰对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长，并且将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的峰的强度进行比较，以便获得荧光比。在一些实施方式中，荧光光谱法包括所收集的溶剂的发射光谱中的三个峰，其中，三个峰中的一个对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长，并且将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的峰的强度相对于剩余两个峰的强度进行比较，以便获得荧光比。
在一些实施方式中，荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的发射光谱中的三个以上峰，其中，三个以上峰中的至少一个对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长，并且将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的至少一个峰的强度相对于剩余两个以上峰的强度进行比较，以便获得荧光比。在一些实施方式中，荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的发射光谱中的三个峰，其中，三个峰中的一个对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长，并且将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的峰的强度相对于剩余两个峰的强度进行比较，以便获得荧光比。
在一些实施方式中，本文中描述的方法进一步包括将荧光比与预定(或校准)荧光比进行比较以便确定烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的步骤。为具有已知水平的感兴趣的多环化合物的至少两个参考样品计算预定荧光比，其中，至少一个样品具有低水平的感兴趣的多环化合物并且至少一个样品具有高水平的感兴趣的多环化合物。低水平的感兴趣的多环化合物一般被认为是烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的量小于10ngg-1，同时高水平的感兴趣的多环化合物一般被认为是烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的量大于300ng g-1。因此将使用本发明的方法获得的荧光比与为具有已知水平的感兴趣的多环化合物的样品计算的此类荧光比进行比较促进确定从烟叶的表面洗涤的感兴趣的多环化合物的水平。
本发明还提供了用于确定存在于溶剂中的感兴趣的多环化合物的水平的装置，该装置包括：
(a)用于包含感兴趣的多环化合物的溶剂的容器；
(b)用于激发感兴趣的多环化合物的荧光的激发源；
(c)用于确定荧光的传感器；以及
(d)处理器，能操作为
(i)识别所收集的溶剂的发射光谱中的至少第一峰和第二峰，第一峰对应于感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长，并且第二峰对应于感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长；
(ii)将两个峰的强度相对于彼此进行比较，以便获得荧光比；
以及
(iii)将荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定感兴趣的多环化合物的水平。
在一些实施方式中，该装置是便携式的。如本文中使用的，术语“便携式的”意味着能够容易地携带或移动。在一些实施方式中，该装置可以具有使得它在使用期间可以保持在用户的手中而不会不舒服的尺寸。在一些实施方式中，该装置是便携式的手持装置。
在一些实施方式中，激发源是选自由白炽钨丝灯、白炽钨卤素灯、包含氙气体和/或汞蒸气的放电灯、激光或紫外线LED光源组成的组的UV辐射源。在一些实施方式中，激发源是作为单色光源的UV LED光源。
在一些实施方式中，用于确定荧光的传感器选自光电倍增器(PMT)检测器、热电堆、光电元件、光电二极管和电荷耦合器件(CCD)检测器。在一些实施方式中，用于确定荧光的传感器是PMT检测器。
在一些实施方式中，该装置是通过切尔西技术集团有限公司(ChelseaTechnologies Group Ltd)(CTG)生产的UviLux传感器。
在一些实施方式中，该处理器能操作为
(i)识别所收集的溶剂的发射光谱中的两个以上峰，其中，至少两个峰对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长；
(ii)将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的峰的强度进行比较，以便获得荧光比；并且
(iii)将荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定感兴趣的多环化合物的水平。
在一些实施方式中，该处理器能操作为
(i)识别所收集的溶剂的发射光谱中的三个峰，其中，三个峰中的一个对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长；
(ii)将对应于感兴趣的多环化合物的特定发射波长的峰的强度相对于剩余两个峰的强度进行比较，以便获得荧光比；并且
(iii)将荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定感兴趣的多环化合物的水平。
现在将参考以下非限制性实例描述本发明。
实例
实例1
评估三个不同的样品制备的能力以确定烟叶的表面上的苯并[a]芘(BaP)的水平。
样品试验
烘烤烟叶样品被选择作为具有已知含量的BaP的烟叶样品，如表1所示，该含量被定义为低、中或高水平的BaP。
表1–具有已知BaP含量的烘烤烟叶样品
样品号259被选择为具有低水平的BaP，样品号261被选择为具有中水平的BaP，并且样品号263被选择为具有高水平的BaP。
如以下(1)至(3)点中陈述的分析这些样品中的每一个。应注意，在以下(1)和(2)点中进行的分析可以被认为是比较例。
(1)通过直接测量烟叶上的激发-发射矩阵来研究具有已知的低、中和高BaP含量的烟叶样品。至于每个叶子的BaP含量，重复三四次获取叶子的不同部分中的叶子荧光，以评估具有相同的BaP含量的叶子内的变化与具有低、中和高BaP含量的叶子之间的差异相比是否明显。
(2)具有已知的低、中和高BaP含量的烟叶样品利用甲醇在周围温度和大气压力下洗涤，其中，在30、60和180秒的时间段内为每个样子样品执行叶子的洗涤。通过将约1g的每个烟叶样品放置在25mL甲醇中进行洗涤。
(3)具有已知的低和高BaP含量的烟叶样品利用己烷在周围温度和大气压力下洗涤，其中，在30、60、180和300秒的时间段内为每个样子样品执行叶子的洗涤，并且每个洗涤时间执行一式两份样品。通过将约1g的每个烟叶样品放置在25mL己烷中进行洗涤。使用的每个叶子样品的精确质量被记录在表2中并且用于使1g烟草的吸收度和荧光数据正常化(normalise)。
表2-在己烷中试验的每个叶子样品的质量
BaP的吸收光谱
用于参考的目的，使用塞西尔5000(Cecil 5000)系列双光束光谱仪在2nm的分辨率下获取5ppm BaP的吸收光谱。甲醇被提供为参考溶剂，并且溶液包含在1cm的路径长度的透明容器(Starna科技有限公司，23/Q/10，石英)中。在图1中示出了获取的BaP的吸收光谱。5ppm BaP的吸收光谱具有264nm的最大值，具有其他最大值282nm、294nm、346nm、364nm和382nm。吸收光谱表示存在具有相关的振动结构的BaP(294nm和382nm)中的两个电子带。
从图1中的吸收光谱确定255nm或280nm的激发波长将适于把BaP发射作为目标。
甲醇和己烷中的BaP的激发-发射矩阵
使用HORIBA仪器获取所有样品的激发-发射矩阵(EEM)。HORIBA包括UV增强光源、双光栅激发单色器和热冷却CCD检测器，它允许每个激发波长的全部发射光谱的同时分辨率。自动生成国家标准与技术局(NIST)-可追踪的校正荧光光谱。它包括使激发光的光谱输出能够通过参考激发光输出的信号EEM的划分说明的参考检测器。此外，使用保存的光谱校正因数为仪器的光谱响应校正信号和参考检测器信号这两者。
至于所有EEM，通过将这些区域中的数据设置为零已经去除了λ发射＝λ激发以及2λ发射＝λ激发的雷利线。此外，其中λ发射<λ激发的EEM的区域也被设置为零。只要在相同的仪器设置中获取这些EEM，就可以主要通过将空白EEM从样品的EEM减去来去除喇曼谱线(Raman line)。在本文中描述的所有实例中获取的所有EEM被示出为样品EEM-空白的EEM，其中，仅在溶剂的激发和发射之后获取空白的EEM。
在减去空白的EEM和去除雷利线之后，还为当激发或发射光的吸收度变得明显时出现的任何内滤波效应(IFE)校正各个EEM。使用以下等式执行IFE校正：
其中，Aex是激发波长处的吸收度并且Aem是发射波长处的吸收度。吸收路径长度被假定为1cm路径长度单元中的0.5cm。IFE-校正的荧光Fcorr是测量的荧光(Fmeas)与IFE校正(IFE)的乘积。
因为利用EEM同时获取样品的吸收光谱，因此利用大大简化IFE校正。
为了能够与文献荧光数据进行比较，用于使荧光数据标准化的一般方法是使荧光信号从溶解在酸中的1μg/ml(1mg/L或1ppm或1.28μM)硫酸奎宁正常化为347.5nm的激发波长以及450nm的发射波长的荧光。如本文中使用的，这种EEM强度单位被称为硫酸奎宁单位(ppm)QSU(ppm)。这能够直接比较在不同仪器上收集的数据。从Starna科技有限公司(RM-QS00，设备序列号19855，单元序列号43084，空白序列号43052，证书编码97291，证书日期08/09/14)购买了硫酸奎宁和酸空白(0.105M高氯酸)的认证的参考标准，其中，两种溶液设置在由光谱纯石英组成的1cm的路径长度荧光计中。
除溶解在甲醇中的296nM BaP的EEM之外(参见下文)，在本文中描述的每一个实例中获取的所有EEM通过将EEM划分为将从1ng/mL(1ppb)硫酸奎宁记录的347.5nm的激发波长和450nm的发射波长的荧光强度正常化。在EEM获取的每天获取347.5nm的激发波长时的1ppm硫酸奎宁发射光谱的五次重复中的最小值，并且在该天获取的EEM通过450nm的平均发射除以1000划分以从ppm转换为ppb硫酸奎宁。合成的EEM强度单位被称为硫酸奎宁单位QSU。
激发波长在范围200-500nm内增加1nm用于随着增加1.12nm收集范围250-800nm内的发射光谱。至于直接的叶子分析，使用0.05s的累加时间，但是用于其余的EEM，使用0.3s的累加时间。从该数据，Python脚本被书写为应用硫酸奎宁校正因数并且在范围240-480nm激发和250-550nm内绘制激发-发射矩阵。
在图2和图3中分别示出溶解在甲醇和己烷中的396nM BaP的EEM。在每一个EEM中，荧光强度被正常化为100nM BaP，并且以QSU的单位示出。如以上所表示的，溶解在甲醇中的396nM BaP的EEM中的荧光强度被示出为从溶解在酸中的1μg/ml(1mg/L或1ppm或1.28μM)硫酸奎宁正常化为347.5nm的激发波长和450nm的发射波长的荧光，但是不会将单位从ppm转换为ppb硫酸奎宁。换言之，图2的EEM中的荧光强度以QSU的单位(ppm)示出。在图4中示出了从255nm的固定激发波长的EEM提取的甲醇和己烷中的荧光发射光谱的比较，其中，以QSU的单位示出的甲醇和己烷中的这两个光谱的荧光强度能够进行直接比较。可以从图4中的结果看出甲醇中的荧光比己烷中的荧光强约2.9倍。与甲醇相比，峰值位置在己烷中通过小于2.5nm被转换为较短波长。从图4中清晰可见的是在甲醇中的BaP的荧光光谱中存在两个峰值发射波长：～405nm和～429nm。这些峰值在己烷中被转换为稍微较短的波长。
(1)直接叶子分析(比较分析)
通过在各个样品的烟叶的表面的不同区域中直接分析低、中和高BaP含量来获取EEM。图5、图6和图7分别示出了用于低(样品259)、中(样品261)和高(样品263)BaP含量叶子的直接的叶子分析的结果。在图5和图7中为低(样品259)和高(样品263)BaP含量叶子示出了不同叶子区域的四次重复。在图6中为中(样品261)BaP含量叶子示出了不同的叶子区域的三次重复。从这些附图中的每一个清晰可见的是，直接(即，不必首先利用溶剂洗涤它们)测量叶子的激发-发射光谱不是用于评估BaP含量的合适的方法。没有区别性的BaP荧光被记录在任一个直接的EEM中，并且存在为具有相同的额定BaP含量的叶子样品以及具有不同的BaP含量的叶子样品观察的大且变化的荧光背景。这表示叶子明显有助于记录在直接的EEM方法中的荧光，并且因此直接叶子分析不适用于评估烟叶样品中的BaP污染程度。
(2)在甲醇中洗涤的烟叶样品(比较分析)
在30s、60s和180s的洗涤时间中为在甲醇中洗涤的烟叶样品获取EEM。在图8中示出了用于高BaP含量叶子的空白(即，只有甲醇)(左上方)、30s(右上方)、60s(左下方)和180s(右下方)甲醇叶子洗涤样品的EEM。
在图8中可以看出在预期的发射波长中的没有区别性的BaP荧光，这表明由于通过甲醇溶剂对烟叶色素的提取导致相对大且变化的荧光背景。
从图8中明显的是，即使将叶子洗涤时间减少到30和180秒之间，也观察不到区别性的BaP荧光。因为将叶子洗涤时间减少到小于30秒是不切实际的，因此这些结果表示当用作唯一溶剂时甲醇不是用于洗去表面BaP污染还不提取叶子中的色素的合适的溶剂。
这可以通过在甲醇中洗涤样品263(高BaP含量)60秒或者在己烷中洗涤300秒的时间段获得的EEM的比较进一步看出。在图9a中示出了通过将该样品263在己烷中洗涤300秒获取的EEM，并且在图9b中示出了通过将该样品263在甲醇中洗涤60秒获取的EEM。可以看出，BaP信号在图9a中示出的样品的EEM中示出的白框内清晰可见，同时在图9b中没有看到BaP信号。图9b中的橙色矩形表示其中应该观察到BaP信号的区域，但是它们被来自共同提取的物质的荧光遮盖。这些结果进一步表示当用作仅有的溶剂时甲醇不是洗去表面BaP污染物且还不提取叶子中的色素的合适的溶剂。
(3)在己烷中洗涤的烟叶样品
获取为在己烷中洗涤的烟叶样品评估的四个洗涤时间(30s、60s、180s、300s)的空白的EEM(即，只有己烷)，并且在图10中示出了结果。在图10中，左上方示出了己烷洗涤30s的EEM，右上方示出了己烷洗涤60s的EEM，左下方示出了己烷洗涤180s的EEM并且右下方示出了己烷洗涤300s的EEM。没有检测到可辨别的荧光。
在评估的四个叶子洗涤时间一式两份地获取低BaP含量叶子样品(样品259)的EEM，并且在图11中呈现。在左边示出了组A(参见表2中的识别标志)中的样品的EEM并且在图11的右边示出了组B中的样品的EEM。第一行中的EEM持续30s叶子洗涤，第二行中的EEM持续60s叶子洗涤，第三行中的EEM持续180s叶子洗涤，并且最后一行中的EEM持续300s叶子洗涤。利用增加的叶子洗涤时间观察310-340nm之间的发射波长的荧光的增加水平。不存在任何BaP荧光的可辨别的证据，这将存在于400nm以上的发射波长中。
在评估的四个叶子洗涤时间一式两份地获取高BaP含量叶子样品(样品263)的EEM，并且在图12中呈现。在左边示出了组A中的样品的EEM并且在图12的右边示出了组B中的样品的EEM。第一行中的EEM持续30s叶子洗涤，第二行中的EEM持续60s叶子洗涤，第三行中的EEM持续180s叶子洗涤，并且最后一行中的EEM持续300s叶子洗涤。仅供参考，BaP区域在图12中被标记为白色矩形。至于低BaP含量样品，利用增加的叶子洗涤时间观察310-340nm之间的荧光的增加水平。然而，在图12中，如从图3与图12的比较中明显的是，可以看出还存在构成显现BaP的特征的在400nm以上观察到的荧光。图11和图12中示出的数据表示可以从EEM视觉识别在己烷中洗涤的哪个烟叶样品具有低或高BaP含量。
为了估计检测极限，从每个EEM提取255nm激发时的发射光谱并且为低和高BaP含量叶子洗涤样品分别在图13和图14中示出。
从255nm激发时的发射光谱，通过计算不同的叶子洗涤时间的一两个发射波长的平均荧光建立潜在的传感器视图。这个分析利用1、10、20、30和50nm的半最大值全宽(FWHM)带通区域在330nm和400nm的发射波长中完成。因为330nm接近在低和高BaP含量叶子洗涤样品中观察到的短波长荧光的发射最大值，因此选择这些波长，并且400nm接近BaP的发射最大值并且仅在高BaP含量叶子洗涤样品中以升高水平存在。带通是检测过低水平的荧光和/或对单个纳米在荧光中转换敏感与检测太宽的荧光区域使得背景荧光泄漏到BaP荧光检测区域中之间的折衷方案。
±5nm的发射带通被认为是最佳的并且在图15中示出了在变化的叶子洗涤时间中具有10nm(±5nm)的330nm的发射峰处的平均荧光，并且在图16中示出了在变化的叶子洗涤时间中具有10nm(±5nm)的400nm的发射峰处的平均荧光。
330nm和400nm时的荧光随着叶子洗涤时间增加，并且高BaP含量叶子洗涤样品比低BaP含量叶子洗涤样品持续更高。
然而，尤其是在300秒以下，在两个BaP含量样品的荧光强度之间不存在明显差异(参见图15和图16)。换言之，在荧光强度中没有明显差异以在300秒以下使用单个荧光峰时精确地区分高水平的BaP和低水平的BaP。
为不同的叶子洗涤时间计算400/330nm的荧光比(即，发射光谱中的400nm的峰值的荧光强度与330nm的峰值的荧光强度的比值)，并且在图17中绘制。与都在四个不同的叶子洗涤时间的单个荧光峰值处的平均荧光相比并且在每个叶子洗涤时间的两个双份样品之间，在图17中呈现的400nm与330nm的荧光比明显提供更稳定的结果。因此，荧光比(400/330nm)提供评估BaP叶子含量的提取时间独立的方法(高达测试的5分钟)。
确定低BaP含量叶子样品的平均荧光比，并且将检测极限确定为空白以上的标准偏差的三倍，经由255nm激发时的双波长荧光提供估计的10.0nM/L(2.52pg BaP/ml)的检测极限。这被认为足以确定具有未知BaP含量的叶子样品是否具有低、中或高水平的BaP。
在表3中呈现分析的带宽区域的范围的255nm激发的结果，示出了10nm带通提供用于当前数据集的最低的检测极限。
表3-用于不同的带通值的估计的检测极限
例如还通过将第二发射波长从400nm移动至430nm来评估移动至更长的波长荧光的效果。然而，这使得检测极限从估计的10.0nM劣化至21.3nM。
尽管为吸光度自动校正工作台EEM，但是单个激发波长处的比值的额外效果在于荧光比在某种程度上变得吸收度无关的，因为大部分吸光度出现在激发波长处并且两个荧光发射区域以相同的激发波长被激发。
因此本发明人发现烟叶洗涤样品的EEM与BaP含量相关，特别在己烷中洗涤的那些样品。此外，有人指出在255nm激发时的400/330nm发射的荧光比独立于高达5分钟的洗涤时间的提取时间。
实例2
选择具有已知的BaP含量的六个烟叶样品，已知的含量被定义为低、中或高水平的BaP。约1g的每个烟叶样品被放置在25mL己烷中，并且洗涤180s的时间段。如表4所示，选择六个烟草样品用于分析。制备这些样品以便用作校准样品。应注意，当在实例1中在己烷中洗涤时，研究低BaP含量样品259和高BaP含量样品263。
表4–具有已知BaP含量的烘烤烟叶样品
样品259和258被认为是具有低水平的BaP，样品262和261被认为是具有中水平的BaP，并且样品260和263被认为是具有高水平的BaP。
如以下表5中示出的，在所有情况下，样品在己烷中洗涤180s使得从烟叶的表面去除小于5wt.％的BaP。表5示出了通过使用后面是气相色谱质谱(GC/MS)分析的完全提取生成的BaP浓度水平(参见题为“GC/MS总BaP”的列3)与通过气相色谱高分辨质谱(GC/HR-MS)分析在叶子洗涤提取物中测量的浓度水平(参见题为“PCA GC/HR-MS叶子洗涤样品”的列2)的比较。在表5的列4中示出了与烟叶中的总BaP相比的来自叶子洗涤样品的BaP含量的百分比：
表5-从烟叶去除的BaP的重量百分数
如表5所示，使用己烷和180s的洗涤时间从烟叶的表面洗涤的BaP的总量在0.04至4.2wt.％的范围内。
在表6中示出了使用的每个叶子样品的精确质量。值得注意的是，这个质量数据不用作数据处理的一部分，因为正在检查的荧光比独立于使用的精确质量。生成和分析每个叶子样品的三个复制。
表6-在己烷中试验的每个叶子样品的质量
样品 质量复制1(g) 质量复制(g) 质量复制(g)
258 0.8988 0.8792 0.9932
259 0.8915 0.9024 0.8401
260 0.9054 0.8508 0.8373
261 0.8860 0.8896 0.9464
262 0.9533 0.8453 0.9162
263 1.1768 0.9813 1.2855
使用遵守实例1中描述的流程的HORIBA获取EEM。图18中示出了用于每一个低BaP含量样品的EEM，图19中示出了用于每一个中BaP含量样品的EEM，并且图20中示出了用于每一个高BaP含量样品的EEM。仅供参考，BaP荧光的粗略区域被标记为每个附图中的第一EEM上的矩形。从图18至图20可以看出，BaP荧光在高和中BaP含量样品中是可见的，并且不在低BaP含量样品中。可以看出，在约300-370nm的发射波长处观察到的背景UV荧光的水平在不同的叶子样品之间差异很大。
提取255nm激发处的每个叶子洗涤样品的平均发射光谱。图21中示出了每个叶子洗涤样品的合成的发射光谱，表明在不同的叶子洗涤样品上的叶子背景荧光中的可变性。利用图21中的箭头标记405nm(指示BaP的存在)处的峰值。可以在样品263和260(高BaP含量)中的约400nm时看到BaP的存在。
在实例1中发现255nm激发时的BaP荧光的400/330nm荧光比可以用于区分最低(样品259)和最高(样品263)的BaP叶子含量样品。因此从图18至图20中示出的EEM数据计算400/330nm荧光比。图22以变化的BaP的浓度示出了400/330nm荧光比。从图22可以看出400/330nm荧光比提供与BaP含量相对良好的线性关系(R2＝0.9052)。如图23中示出的，在实例1中为在己烷中洗涤的样品259和263产生的数据与这些结果结合以提高线性拟合。在遍及30、60、180和300s中一式两份获取该额外数据。不为用于制备每个样品的烟叶的重量校正数据。因此荧光比似乎独立于烟叶的精确重量、溶剂样品容量和提取时间。
确定检测极限作为空白以上的标准偏差的三倍(在这种情况下，259在提取时间30-300秒重复11次)提供估计的检测极限8.6nM/L。
因此示出了255nm激发下的400/330nm荧光比与没有校正烟草的质量的情况下的提取时间30-300s中的六个不同的叶子样品上的总BaP叶子含量成线性关系。
提取的BaP的比值的确定
可以从在实例2以上识别的所有烟叶样品的荧光分析产生的数据的平行因子分析(PARAFAC)得出用于BaP的荧光响应对矩阵共同提取物的比值。
每一个EEM中的数据组成3维阵列的样品(或者BaP浓度)x激发波长x发射波长。
为了构造提供BaP浓度和荧光信号之间要求的预测能力(或者高度相关)的模型，PARAFAC用于确定诸如来自共同提取的物质的信号等其他变量是否促进该模型的预测能力。具有高度相关的另一个信号将干扰该模型并且混淆其预测能力。
如果来自BaP的荧光信号可以基于视觉峰值检选或者通过检查单个发射波长或双发射波长处的荧光而不同于该背景，则这大大简化EEM数据。然而，如果来自BaP的荧光信号与背景荧光信号太接近重叠，则可以要求更复杂的EEM建模。可能地，用于EEM反卷积的大部分公用数据分析工具是PARAFAC。
EEM矩阵包括因此可以经常被分解为唯一解的三维数据阵列。在PARAFAC中，交替的最小二乘法通过使残数的平方的总和最小来解决三向数据矩阵：
其中，xijk是阵列的一个元素，发射波长j和激发波长k处的样品i的荧光强度，F是成分的总数，并且f是单一成分，其中，该成分应该理想地与单独的荧光团对应。最后一项eijk表示来自不明原因的信号(未由建模和噪声说明的变化)的残数。该模型输出参数a、b和c，它们应该表示建模的荧光团的浓度、发射光谱和激发光谱。该模型假设单个荧光团的结合是来自每个荧光团的贡献的总和，换言之，假设每个成分的EEM可以在强度而不是波长方面有变化。
HORIBA安装有用于PARAFAC本征矢量的独奏的软件包，这用于在存在大的且可变的UV荧光背景的情况下区分BaP荧光。
可以从图24至图26广泛推断以上识别的己烷洗涤叶子样品(具有已知的低、中和高BaP含量)中的矩阵共同提取物的比值。图24示出了感兴趣的BaP波长的荧光响应，并且因为它是遍及全部浓度范围的响应的曲线图，因此它包括来自所有己烷叶子洗涤样品(从低至高BaP含量)的数据点；图25示出了总背景UV荧光。图24中的信号与图25中的信号的坡度比是0.0441。作为百分比，这是4.4％。这表明BaP与荧光共同矩阵提取物的比值为BaP荧光信号的约4.4％。
为了进一步研究BaP与荧光矩阵共同提取物的处比值，选择叶绿素作为实例。选择叶绿素是因为叶绿素对BaP的荧光区域没有贡献，因为叶绿素的发射为682nm，因此它不干涉UV测量。图26示出了叶绿素的荧光响应。
图24中的信号(BaP)与图26中的信号(叶绿素)的坡度比是0.0394，即3.9％。这表明BaP与提取的叶绿素的比值为当前BaP荧光信号的约3.9％。当然，可以预期比BaP明显更高水平的叶绿素，但是它潜在地可以是告知从叶子中出现了多少过度提取的合适的标记。
实例3
从实例2中识别的叶子样品258-263制备具有未知水平的BaP的18个盲样品。约1g的每个盲烟叶样品被放置在25mL己烷中，并且洗涤180s的时间段。以下表7中列出了每个盲叶子样品的精确质量。
表7-每个盲叶子样品的质量
样品 重量(g) 样品 重量(g)
盲1 0.8382 盲10 0.8605
盲2 0.8716 盲11 0.8364
盲3 0.8446 盲12 0.8313
盲4 1.0264 盲13 1.2352
盲5 0.9146 盲14 1.0691
盲6 1.1194 盲15 1.1479
盲7 0.9845 盲16 1.1925
盲8 0.9239 盲17 0.9736
盲9 0.8917 盲18 1.3370
使用遵守实例1中描述的流程的HORIBA为每一个盲烟叶样品获取EEM。在图27a至图27c中示出了18个盲烟叶样品中的每一个的EEM。
一对独立方法应用于确定每个盲样品中的BaP水平。
首先，使用图22中示出的校准曲线，从单个EEM提取每个盲样品的255nm激发处的400/330nm荧光比并且被转换为预测的BaP浓度。图28中示出了合成的曲线图，其中低含量BaP样品被定义为具有<20nM/L的浓度的样品，中含量BaP样品被定义为具有20-60nM/L的浓度的样品，并且高含量BaP样品被定义为具有>60nM/L的浓度的样品。利用标准偏差误差线示出的数据点用于具有实例2的校准样品确定的平均荧光比。
此外，图27a至图27c中的EEM的外观检验从每个盲样品提供了每个叶子洗涤样品的身份的良好指示，特别地，背景与BaP荧光是具体特征。
使用上述方法，如表8所示，对每一个盲样品进行分配。
表8-每个盲叶子样品与每个叶子洗涤样品的分配
除了盲样品7和盲样品10之外，每一个盲样品被正确地分配至相应的叶子洗涤样品258-263。换言之，89％的样品被正确分配。值得注意的是，盲样品7和10的不正确的分配被认为是可以理解的，因为它要求中和高BaP含量叶子洗涤之间的区分。
如图29所示，在正确分配之后，利用校准样品的荧光比绘制盲样品的荧光比。校准样品和盲样品之间的极好吻合表示该荧光方法可以用于识别盲样品，并且因此确定具有未知水平的BaP的烟叶的表面上的BaP的水平。
确定检测极限作为空白以上的标准偏差的三倍(在这种情况下，样品259遍及这两个校准样品，数据来自实例1和空白样品)提供10.8nM的估计的检测极限。与仅从实例1中分析的两个样品(259和263)的预测相比，在这个实例中，在确定的检测极限之间获得良好吻合，其中，估计10.0nM的检测极限。这表示荧光比400/330nm是在提取时间30-300秒时的遍及六个不同的叶子类型的BaP含量的标志，而无需校正烟草的精确质量。
呈现本文中描述的各种实施方式仅用以帮助理解和教导所要求保护的特征。这些实施方式仅作为实施方式的代表性样品提供，并且不是穷尽的和/或排他性的。应当理解，本文中描述的优点、实施方式、实例、功能、特征、结构和/或其他方面不应当被认为是对由权利要求限定的本发明的范围的限制或对权利要求的等同物的限制，并且在不偏离要求保护的发明的范围的情况下可以使用其他实施方式并且可以进行修改。除了本文中具体描述的那些之外，本发明的各种实施方式可适当地包括所公开的元件、部件、特征、零件、步骤、装置等的适当的组合，由所公开的元件、部件、特征、零件、步骤、装置等的适当的组合组成，或者基本上由所公开的元件、部件、特征、零件、步骤、装置等的适当的组合组成。此外，本公开内容可包括当前未要求保护但其可能在未来要求保护的其他发明。

Claims (25)

1.一种用于确定存在于烟叶的表面上的感兴趣的多环化合物的水平的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)利用溶剂洗涤所述烟叶的表面，所述溶剂至少包括非极性溶剂，使得从所述烟叶的表面去除存在于所述烟叶的表面上的不大于约10wt.％的所述感兴趣的多环化合物；
(b)收集来自步骤(a)的所述溶剂；以及
(c)使所收集的溶剂经受荧光光谱法，以确定所述感兴趣的多环化合物的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述感兴趣的多环化合物是芳香族多环化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述感兴趣的多环化合物是芘。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述芘是苯并芘。
5.根据权利要求4所述的方法，所述苯并芘是苯并(α)芘。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述溶剂是己烷。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，从所述烟叶的表面去除存在于所述烟叶的表面上的约0.01至约10wt.％的所述感兴趣的多环化合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，从所述烟叶的表面去除存在于所述烟叶的表面上的约2至约8wt.％的所述感兴趣的多环化合物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，从所述烟叶的表面去除存在于所述烟叶的表面上的约4至约6wt.％的所述感兴趣的多环化合物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，经受荧光光谱法的所收集的溶剂包含约5pg/mL至约500pg/mL的量的所述感兴趣的多环化合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，经受荧光光谱法的所收集的溶剂包含每g烟叶约5ng至每g烟叶约500ng的量的所述感兴趣的多环化合物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，用于洗涤所述烟叶的溶剂的量为每1g烟叶约10至约50ml的溶剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，用于洗涤所述烟叶的溶剂的量为每1g烟叶约20至约40ml的溶剂。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，利用溶剂洗涤所述烟叶的时间段小于约10分钟。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，利用溶剂洗涤所述烟叶时间段在从约0.5至约5分钟之间。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，在约10至约30℃的温度下洗涤所述烟叶。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中，所述烟叶在大气压下洗涤。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述荧光光谱法包括识别所收集的溶剂的光谱中的至少第一峰和第二峰，所述第一峰对应于所述感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长，并且所述第二峰对应于所述感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第一峰是具有在范围310至370nm内的波长的发射。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述第二峰是具有在范围385至425nm内的波长的发射。
21.根据权利要求18、19或20所述的方法，包括以下步骤：将所述第一峰和所述第二峰的强度相对于彼此进行比较，以便获得荧光比。
22.根据权利要求21所述的方法，包括以下步骤：将所述荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定所述烟叶的表面上的所述感兴趣的多环化合物的水平。
23.一种用于确定存在于溶剂中的感兴趣的多环化合物的水平的装置，所述装置包括：
(a)用于所述溶剂的容器，所述溶剂包含所述感兴趣的多环化合物；
(b)激发源，用于激发所述感兴趣的多环化合物的荧光；
(c)传感器，用于确定荧光；以及
(d)处理器，能操作为
(i)识别所收集的溶剂的发射光谱中的至少第一峰和第二峰，所述第一峰对应于所述感兴趣的多环化合物的第一特定发射波长，并且所述第二峰对应于所述感兴趣的多环化合物的第二特定发射波长；
(ii)将这两个峰的强度进行相对于彼此的比较，以便获得荧光比；并且
(iii)将所述荧光比与预定荧光比进行比较，以便确定所述感兴趣的多环化合物的水平。
24.一种大体如参考实例在本文中限定的方法。
25.一种大体如参考实例在本文中限定的装置。
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