CN109912614A - 羌活醇提物、羌活醇、羌活酚及其用途 - Google Patents

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赵庆春
蒋晓文
刘天祎
高慧媛
吴琼
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Abstract

本发明涉及羌活醇提物及已获得的羌活醇和羌活酚以及其结构修饰后的化合物通式具有抗阿尔茨海默病的新用途。其特征是羌活醇提物、羌活醇及羌活酚以及其结构修饰后的化合物通式可以作为治疗阿尔茨海默病的应用。本发明的目的就是发掘了传统中药材羌活，以及羌活中的特有成分羌活醇和羌活酚以及其结构修饰后的化合物通式的抗阿尔茨海默病前景，开拓了一个新的药用领域。

Description

羌活醇提物、羌活醇、羌活酚及其用途
技术领域：本发明涉及羌活提取物，羌活醇和羌活酚以及其结构修饰后的化合物通式的抗阿尔茨海默病的新用途。
背景技术：随着中国老龄人口比重不断上升，人口老龄化程度加深，阿尔茨海默病成为了人口老龄化带来的重要问题之一。阿尔茨海默病发生后，患者的语言、思维、记忆、定向、计算、理解、认知和判断等高级神经功能发生紊乱，导致工作能力、日常生活、社会交往能力日渐减退，生活不能自理，一般在60-70岁老年人中发病，并随年龄增长呈指数增长趋势。该病目前尚缺乏有效的药物治疗方法，在临床使用的只有多派奈齐和美金刚等4个药物，而且并不能延缓老年痴呆的发展进程，近10年没有一个药物上市。因此，阿尔茨海默病的防治已经成为当今医药学领域研究的焦点问题。
羌活(Notopterygiumincisum Ting ex H.T.Chang)为我国特有的伞形科草本植物，其根茎及根为羌活药材的主要来源，具有解表散寒、祛风除湿、止痛的功效，主要用于治疗风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛、肩背酸痛等症。近代药理学研究表明，羌活药材具有明显的镇痛、抗炎、改善血液循环及增强肌体免疫功能的作用，其主要活性成分是以羌活醇、紫花前胡苷、异欧前胡素为代表的香豆素类化合物。羌活醇和羌活酚结构如图1所示，均是呋喃香豆素类化合物。目前已报道该化合物由羌活中分离得到。
通过对阿尔茨海默病的动物模型APP/PS1双转基因小鼠和细胞模型的研究，我们发现羌活的粗提物和羌活醇以及羌活酚具有较好的改善认知的效果，具体表现在：水迷宫实验显示，给予上述药物后的转基因动物认知能力改善。
发明内容：
发明目的：本发明提供了羌活醇提物、羌活醇、羌活酚在抗阿尔茨海默病的作用，旨在将羌活醇提、羌活醇、羌活酚在研究开发得到较好治疗阿尔茨海默病的新型药物。
技术方案：
一种羌活醇化合物，通式为：
一种羌活酚化合物，通式为：
一种羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，
通式为：
上述的羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
一种羌活醇提物，含有羌活醇、羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物中的一种或多种；
所述羌活醇通式为：
所述羌活酚通式为：
所述羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物通式为：
所述羌活醇提物，通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
所述的羌活醇提物的制备方法，取羌活药材，用8倍体积百分比浓度95％乙醇50-70℃回流提取3次，每次2小时，回收乙醇，得浸膏，所述浸膏即为羌活醇提物。
所述羌活醇、羌活酚的制备方法，羌活醇及羌活酚是从羌活粗提物中通过HPLC分离手段得到。
上述化合物或醇提物用于制备抗阿尔茨海默病药物的用途。
优点及效果：
本发明发掘了羌活醇提物，羌活醇和羌活酚的抗阿尔茨海默病的新用途，对中药材以及天然产物的应用开拓了一个新的药用领域。
本发明利用体内动物模型和体外细胞模型在行为学以及生化指标上全面考察了并且证明了羌活醇提物，羌活醇和羌活酚对认知减退及阿尔茨海默病具有确切的改善作用。
附图说明：
1、附图1为本发明羌活醇、羌活酚的结构式；图中左侧为羌活醇结构式，右侧为羌活酚的结构式；
2、附图2为羌活醇提物对APP/PS1双转基因小鼠水迷宫的认知改善结果示意图；
3、附图3为羌活醇和羌活酚对APP过表达的APPswe293T细胞株分泌Aβ40和Aβ42淀粉样蛋白的抑制结果示意图。
具体实施方式：
本发明采用Morris水迷宫实验检测羌活醇提物对APP/PS1小鼠的认知能力的改善情况；采用ELISA检测给予羌活醇和羌活酚后的APPswe293T细胞的Aβ生成的抑制作用。结果表明羌活醇提物能提高阿尔茨海默症模型动物的认知能力，羌活醇和羌活酚能显著抑制APPswe293T细胞的Aβ生成，因此羌活醇提物和羌活醇以及羌活酚可以用于研究开发治疗阿尔茨海默病药物。
一种羌活醇化合物，通式为：
一种羌活酚化合物，通式为：
一种羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，
通式为：
上述的羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
一种羌活醇提物，含有羌活醇、羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物中的一种或多种；
所述羌活醇通式为：
所述羌活酚通式为：
所述羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物通式为：
所述羌活醇提物，通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2CH2N2、-CH2CH2CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
所述的羌活醇提物的制备方法，取羌活药材，用8倍体积百分比浓度95％乙醇50-70℃回流提取3次，每次2小时，回收乙醇，得浸膏，所述浸膏即为羌活醇提物。
所述羌活醇、羌活酚的制备方法，羌活醇及羌活酚是从羌活粗提物中通过HPLC分离手段得到。
上述化合物或醇提物用于制备抗阿尔茨海默病药物的用途。
本发明典型的化合物包括，但不限于：
采用口服灌胃的方法，给予6月龄APP/PS1小鼠2个月后，其记忆能力得到显著改善；采用ELISA检测给予羌活醇和羌活酚后的APPswe293T细胞的Aβ生成情况，发现羌活醇和羌活酚能显著抑制APPswe293T细胞的Aβ40和Aβ42的生成。
本发明采用Morris水迷宫实验检测羌活醇提物对APP/PS1小鼠的认知能力的改善情况；采用ELISA检测给予羌活醇和羌活酚后的APPswe293T细胞的Aβ生成的抑制作用。结果表明羌活醇提物能提高阿尔茨海默症模型动物的认知能力，羌活醇和羌活酚能显著抑制APPswe293T细胞的Aβ生成，因此羌活醇提物和羌活醇以及羌活酚可以用于研究开发治疗阿尔茨海默病药物。
本申请是通过以下实施例进一步详细说明本发明。
实施例1：羌活醇提物水迷宫实验。
实验动物：将6月龄APP/PS1模型小鼠(共20只)随机分为2组：羌活醇给药组，用0.5％CMC-Na水溶液做溶媒，配置剂量为1g/kg的羌活醇提物，口服灌胃给药；模型对照组，口服灌胃0.5％CMC-Na水溶液。另外，设置同龄C57/B6野生型小鼠作为野生对照组。给药周期为两个月。
Morris水迷宫实验：
Morris水迷宫检测鼠的学习记忆功能定位航行试验(place navigation test)一共进行5天训练，每天训练4次。将小鼠面向池壁，分别从4个入水点放入水中，记录从入水到找到平台并站立其上的时间，即潜伏期。如小鼠在60s仍未找到平台，则由实验者将其引向平台，其潜伏期记为60s。第六天进行隐藏平台训练，将平台隐藏于水下1cm，实验方法同上。根据小鼠在水中搜索平台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略，以此判断其学习能力。
实施例2：羌活醇和羌活酚体外抗APPswe293T细胞的Aβ淀粉样蛋白生成。
采用ELISA法测定羌活醇和羌活酚对APPswe293T细胞的Aβ40和Aβ42淀粉样蛋白生成的抑制活性。
(1)仪器与试剂：DMEM培养基购自Hyclone公司，胎牛血清为Hyclone产品；IX71型倒置显微镜(奥林巴斯公司)；恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；5810R型台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；全自动酶标仪(美国Biotek公司)。
(2)细胞培养：将复苏后的细胞转移至培养瓶中，37℃培养箱中培养(5％CO2，相对湿度90％)，隔天更换培养液。待细胞长满瓶壁的80-90％左右时，进行传代或下步试验，控制细胞密度在1×105cells/mL左右。
(4)MTT法测定羌活醇及羌活羌活酚生物活性：取指数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于96孔培养板中，细胞数密度为1×105个/mL，每孔加入100μL，置37℃，5％CO2孵箱中培养24h，分别加入不同浓度(1.25umol/L，2.5umol/L，5umol/L，10umol/L，20umol/L)的含药物的培养液100ul，每个浓度设3个复孔，置37℃、5％CO2孵箱中培养24h。24h后吸取上清液用ELISA测试Aβ水平。按照一下进行ELSIA测试：
1.按照说明准备所有试剂，工作液标准液和样品。
2.参考分析布置表确定要使用的孔数，并将剩余的孔和干燥剂放回袋中并密封，将未使用的孔储存在4℃。
3.每孔加入100μl标准品和样品。用提供的粘合带覆盖。在37℃孵育2小时。提供印版布局以记录测定的标准品和样品。
4.取出每个孔的液体，不要洗。
5.每孔加入100μl生物素-抗体(1x)。盖上新的胶条。在37℃孵育1小时。(生物素-抗体(1x)可能会出现混浊。温热至室温并轻轻混合直至溶液看起来均匀。)
6.吸出每个孔并洗涤，重复该过程两次，总共洗涤三次。使用喷射瓶，多通道移液器，歧管分配器或自动洗涤器，用洗涤缓冲液(200μl)填充每个孔进行清洗，并使其静置2分钟，在每个步骤完全去除液体对于良好的性能是必不可少的。最后一次洗涤后，取出剩余的剩余物通过抽吸或倾析洗涤缓冲液。翻转平板并用干净的纸巾擦干。
7.每孔加入100μl HRP-抗生物素蛋白(1x)。用新的粘合带覆盖微量滴定板。在37℃孵育1小时。
8.如步骤6中那样重复抽吸/清洗过程五次。
9.每孔加入90μL TMB底物。在37℃孵育15-30分钟。避光。
10.每孔加入50μL终止液，轻轻敲打板，确保充分混合。
11.使用设置为450nm的酶标仪，在5分钟内确定每个孔的光密度。
结果显示：羌活醇及羌活酚均对于APP/PS1细胞分泌Aβ具有较强的抑制能力，实验结果如下图3所示。
实施例3：
采用FRET法测定化合物通式(1)中典型的化合物对BACE1酶的抑制活性。
表1、化合物1-8对BACE1酶的抑制活性
上述结果表明：羌活醇提物、羌活醇及羌活酚以及其结构修饰后的化合物通式(1)均具有较好的体内外抗阿尔茨海默病的作用。

Claims (9)

1.一种羌活醇化合物，通式为：
2.一种羌活酚化合物，通式为：
3.一种羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，其特征在于：
通式为：
4.根据权利要求3所述的羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物，其特征在于：
通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2 CH2N2、-CH2 CH2 CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2 CH2N2、-CH2 CH2 CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
5.一种羌活醇提物，其特征在于：含有羌活醇、羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物中的一种或多种；
所述羌活醇通式为：
所述羌活酚通式为：
所述羌活酚或羌活醇、羌活酚的结构修饰化合物通式为：
6.根据权利要求5所述羌活醇提物，其特征在于：
通式中：
为单键或者双键；
R1为各自独立的氮原子或者是氧原子；
R2选自氧原子、氮原子、磺酸基、酰胺键；
R3选自含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2 CH2N2、-CH2 CH2 CH2N2，其中含氮杂环、杂芳基、-NH2、-CH2N2、-CH2 CH2N2、-CH2 CH2 CH2N2可以进一步被烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-CH2NH2、-CH2CH2NH2、-CH2CH2CH2NH2、-NHCH2NH2、-NHCH2CH2NH2取代。
7.一种如权利要求5所述的羌活醇提物的制备方法，其特征在于：取羌活药材，用8倍体积百分比浓度95％乙醇50-70℃回流提取3次，每次2小时，回收乙醇，得浸膏，所述浸膏即为羌活醇提物。
8.如权利要求1或2所述羌活醇、羌活酚的制备方法，其特征在于：羌活醇及羌活酚是从羌活粗提物中通过HPLC分离手段得到。
9.如权利要求1、2、3、5任一项所述化合物或醇提物用于制备抗阿尔茨海默病药物的用途。
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