CN109890838A - 新的pdl2化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PDL2的肽化合物，其选自肽片段、功能性同源物和功能性类似物，并且涉及编码所述肽化合物的核酸例如DNA或RNA，载体例如病毒载体，和包含所述载体的宿主细胞例如哺乳动物细胞。本发明的肽化合物、核酸、载体和宿主细胞尤其是用于治疗或预防以表达PDL2为特征的癌症。

Description

新的PDL2化合物

技术领域

本发明涉及新的肽化合物，例如PDL2的片段，以及包含这些肽化合物的组合物、用途和试剂盒。此外，本发明涉及表达所述肽化合物的核酸、载体和宿主细胞，其单独或与其他癌症治疗法同时或依序给予时用于治疗或预防癌症的方法。

背景技术

B7-CD28家族的分子在T细胞活化和耐受中起重要作用。这些路径不仅负责提供正向共刺激信号以维持T细胞活性，而且还提供调节T细胞反应幅度的抑制信号。B7/CD28家族的抑制分子在肿瘤微环境中诱导免疫耐受方面起关键作用。程序性死亡-1受体(PD-1，CD279)及其配体PD-L1(CD274，B7-H1)和PD-L2(CD273，B7-DC)组成了一种这样的抑制路径。已经广泛研究了PD-1/PD-L1路径在癌症中的相关性，并且已经开发出靶向PD-1(例如nivolumab或pembrolizumab)和PD-L1(例如avelumab或atezolizumab)的治疗方法，并且获批用于癌症的几种不同的适应症中。然而，PD-L2并没有受到如此多的关注，并且其在调节肿瘤免疫中的作用尚不清楚。已知PD-L2是抑制性分子，其不仅由抗原呈递细胞表达，而且由其他免疫细胞和非免疫细胞以可诱导的方式表达，主要通过Th2相关细胞因子表达。因此，PD-L1和PD-L2的表达模式非常不同。PD-L1通过多种免疫细胞和非免疫细胞组成性地表达，并且大多数正常组织细胞似乎能够上调PD-L1。PD-L2表达最初被认为局限于抗原呈递细胞，例如巨噬细胞和树突细胞(DC)。然而，近年来，几个研究小组已经表明，PD-L2表达可以在多种其他免疫细胞和非免疫细胞中诱导，这取决于微环境的刺激。重要地，已报道了在患有癌症的患者中的PD-L2表达。此外，PD-L2可以在PD-L1缺失的情况下在人的肿瘤内表达。即便在缺乏PD-L1表达的情况下，这也有可能会影响对不同靶向疗法对抗PD-1治疗的有效性的理解。因此，已记载了PD-L2在数种肿瘤类型中的表达，包括肾细胞癌、膀胱癌、黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、三阴性乳腺癌(TNBC)和胃癌。即使在缺乏PD-L1的情况下，PD-L2也可以在个体肿瘤样品中表达(http：//www.esmo.org/Conferences/Past-Conferences/European-Cancer-Congress-2015/News/Novel-Assay-Developed-to-Determine-PD-L2-Expression-in-Tumour-Samples)。

Ohigashi等研究了PD-L1和PD-L2在人食管癌中的表达，以确定其在术后的患者预后中的临床意义。使用RT-qPCR和免疫组织化学法，作者表明在食管癌患者的冷冻组织样本中均表达了PD-L1和PD-L2，而PD-L2阳性患者的预后比阴性患者更差，PD-L1也是如此。

有趣的是，PD-L2表达与CD8TIL之间而不是与CD4TIL之间存在明显的负相关性。在涉及51名胰腺癌患者的回顾性研究中，27％的所分析的肿瘤表达PD-L2，而39％表达PD-L1。

同样重要的是在此需要注意，可能不仅肿瘤细胞本身的PD-L2表达，而且基质细胞的PD-L2表达也很重要。Nazareth及其同事发现，在由人非小细胞肺癌培养的成纤维细胞中，PD-L1和2的组成性地高表达。该表达似乎是功能性的，因为体外阻断研究证明成纤维细胞以PD-L1和2依赖性方式抑制自体T细胞产生IFNγ。因此，今后的研究不仅应关注肿瘤细胞的PD-L表达，还应关注肿瘤基质的PD-L表达。

发明内容

本发明人已鉴定了来自延长的PDL2(人PDL2包含由本文SEQ ID NO 1表示的信号序列，参考NCBI登录号Q9BQ51，版本Q9BQ51.2)的新的免疫原性表位。基于与组织型HLA-A2的结合亲和力，选择几种PD-L2衍生的肽，通过ELISPOT作进一步分析以在这些衍生的肽中进行更小的选择，因为这些肽的序列的至少一部分在PD-L2序列的信号肽部分或在PD-L2蛋白序列的跨膜结构域中。本发明人使用IFN ELISPOT分泌测定法，仔细检查了来自9名癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)，以确认是否存在针对PD-L2衍生肽的特异性T细胞应答。已检测到针对某些肽的强烈应答，特别是针对一种此外还在健康个体(HD)中容易检测到的肽的应答。

在一个方面，本发明涉及SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐，该片段的长度为至多100个氨基酸，并且其中所述肽片段包含SEQ ID NO：1中的8至100个氨基酸的连续序列或由其组成。

本发明还涉及SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐，该片段的长度为至多100个氨基酸，并且其中所述肽片段由SEQ ID NO：1中的8至100个氨基酸的连续序列组成。

在一个实施方案中，所述肽片段的长度为至多60个氨基酸，例如至多50个氨基酸，至多40个氨基酸，或至多30个氨基酸。因此，连续序列中相应的上限是SEQ ID NO：1的60、50、40或30个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述肽的长度为至多21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在另一个实施方案中，所述肽片段包含10至100个氨基酸的连续序列或由其组成，例如10至17个氨基酸、20至30个氨基酸、30至40个氨基酸或40至50个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述肽片段由10至100个氨基酸的连续序列组成，例如10至17个氨基酸，20至30个氨基酸，30至40个氨基酸或40至50个氨基酸。通常为10至17个氨基酸或20至100个氨基酸。

在另一个实施方案中，所述肽片段不包含SEQ ID NO 1的第1-3个氨基酸，即MIF。PDL2的研究并未表明这3个氨基酸的任何显著的作用，并且它们不参与T细胞的激活。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2-12中的任一个(例如SEQ ID NO 2、4、11和12中的任一个)的一个或更多个序列。

在一个实施方案中，所述连续序列包含SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4。例如，肽片段SEQ ID NO：12包含SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4两者。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 11的序列，其中所述肽片段的长度为至多21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。优选地，所述连续序列由SEQ ID NO11组成。

在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 12的序列，其中所述肽片段长度为至多25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 4的序列，其中所述肽片段的长度为至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2的序列，其中所述肽片段的长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述肽片段能够激活T细胞，例如CD4和CD8T-细胞。通常，通过ELISPOT测定法(例如本文所述的ELISPOT测定法)测定所述激活。

C-末端氨基酸可以是酸或酰胺的形式，这两者均可被看作是本发明的肽片段的单独的实施方案。

通常，所述肽片段是分离的免疫原性肽片段。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的肽片段的组合物，任选地与药学上可接受的添加剂(例如载体或佐剂)一起。

当存在佐剂时，这种佐剂优选选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline、Montanide ISA佐剂。

在另一方面，本发明涉及本发明的肽片段，其用于治疗癌症，例如以表达PDL2为特征的癌症。

在又另一方面，本发明涉及治疗或预防患者的癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效量的本发明的肽片段。在一个实施方案中，该方法还包括同时或依序给予其他癌症疗法，例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。在另一个实施方案中，其他癌症疗法选自以下的一种或更多种：辅酶B12(Actimide)、阿扎胞苷(Azacitidine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、博来霉素(Bleomycin)、卡铂(Carboplatin)、卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(Cisplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、柔红霉素(Daunorubicin)、多西他赛(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifiuridine)、多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊苷(Etoposide)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、吉西他滨(Gemcitabine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、伊立替康(Irinotecan)、来那度胺(Lenalidomide)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、Nivolumab、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、Pembrolizumab、培美曲塞(Pemetrexed)、瑞复美(Revlimid)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、戊柔比星(Valrubicin)、长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、长春地辛(Vindesine)和长春瑞滨(Vinorelbine)。

在另一方面，本发明涉及编码本发明的肽片段的核酸，例如DNA或RNA。

在又另一方面，本发明涉及载体，例如病毒载体，其包含本发明的核酸。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的载体的宿主细胞，例如哺乳动物细胞。

在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含：

a)本发明的组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素如IL-2和/或IL-21，抗癌剂，例如化学治疗剂，如辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

在进一步的实施方案中，所提供的组合物同时或依序给予。

在另一方面，本发明涉及治疗以表达PDL2(SEQ ID NO 1)为特征的临床病症的方法，该方法包括给予患有所述临床病症的个体有效量的本发明的肽化合物或肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞。

在又另一方面，本发明涉及治疗或预防患者的癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效量的本发明的肽化合物或肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞。

在另一方面，本发明涉及本发明的肽化合物或肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞的用途，其用于制备药物，例如组合物或疫苗，用于治疗或预防癌症，例如以表达PDL2为特征的癌症。

在又另一方面，本发明涉及本发明的肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞，其与其他癌症疗法同时或依序给予时用于治疗或预防癌症的方法中，所述其他癌症疗法为例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。

在一个实施方案中，其他癌症疗法选自检查点阻断抗体。

在另一个实施方案中，其他癌症疗法选自以下的一种或更多种：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

另一方面是：

1.PDL2的肽化合物，其选自：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至272个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中的至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

并且其中a)、b)或c)中任一个的C-末端氨基酸还包括酰胺；或其药学上可接受的盐。

2.第1方面的肽化合物，其选自a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至272个氨基酸的连续序列组成，其中C-末端氨基酸还包括酰胺；

或其药学上可接受的盐。

3.第2方面的肽化合物，其中所述肽片段由8至250个氨基酸、8至200个氨基酸、8至150个氨基酸、8至120个氨基酸，例如10至100个氨基酸、20至80个氨基酸、30至60个氨基酸、40至50个氨基酸的连续序列组成。

4.第2-3方面中任一个的肽化合物，其中SEQ ID NO I的肽片段选自PDL2(1-25)、PDL2(1-50)、PDL2(200-273)和PDL2(210-250)。

5.第2-4方面中任一个的肽化合物，其中所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2-12中任一个的一个或更多个序列，例如选自SEQ ID NO 7的一个序列或选自SEQ ID NO 2和4的两个序列。

6.第1-5方面中任一个的肽化合物，其中a)中的肽片段、b)中的功能性同源物或c)中的功能性类似物能够激活T细胞，例如CD4和CD8T细胞。

7.第6方面的肽化合物，其中通过本文所述的ELISPOT测定法测定所述激活。

8.编码前述方面中任一个的肽化合物的核酸，例如DNA或RNA其。

9.载体，例如病毒载体，其包含第8方面的核酸。

10.宿主细胞，例如哺乳动物细胞，其包含第9方面的载体。

11.一种组合物，其包含第1-7方面中任一个的肽化合物或第8方面的核酸或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞，任选地与药学上可接受的添加剂例如载体或佐剂一起。

12.免疫治疗组合物，其包含

a)第1-7方面中任一个的肽化合物或第8方面的核酸或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞；和

b)佐剂；

其用作药物。

13.第12方面的免疫治疗组合物，其用于治疗或预防选自癌症的疾病、障碍或病症的方法中，所述癌症例如形成肿瘤的癌症疾病。

14.第11-13方面中任一个的免疫治疗组合物，其中所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline、MontanideISA佐剂。

15.一种试剂盒，其包括：

a)第12-14方面中任一个的免疫治疗组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素如IL-2和/或IL-21，抗癌剂，例如化学治疗剂如辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

16.根据第15方面的试剂盒，其中所提供的组合物同时或依序给予。

17.一种治疗以SEQ ID NO 1的PDL2表达为特征的临床病症的方法，该方法包括给予患有所述临床病症的个体有效量的第1-7方面中任一个的肽化合物、或第8方面的核酸、或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞。

18.一种治疗或预防患者的癌症的方法，该方法包括给予癌症患者有效量的第1-7方面中任一个的肽化合物、或第8方面的核酸、或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞。

19.第1-7方面中任一项的肽化合物、或第8方面的核酸、或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞用于制备药物的用途，所述药物例如免疫治疗组合物或疫苗，用于治疗或预防以表达PDL2为特征的癌症。

20.第1-7方面中任一个的肽化合物、或第8方面的核酸、或第9方面的载体或第10方面的宿主细胞，其与其他癌症疗法同时或依序给予时用于治疗或预防癌症的方法中，所述其他癌症疗法为例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。

21.第20方面的肽片段、核酸、载体或宿主细胞，其中检查点阻断抗体选自：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

附图说明

图1.天然T细胞对PD-L2的应答。(A)从恶性黑素瘤(AA和MM)患者中分离的PBMC针对PD-L201(PD-L2(4-12)；LLLMLSLEL)和PD-L205(PD-L2(16-25)；QIAALFTVTV)的应答的ELISPOT结果的实例。(B)体外IFN-γ ELISPOT结果。将来自9名癌症患者的PBMC在体外用每一种肽刺激一次。然后，使PBMC暴露于肽中，并利用ELISPOT测量IFN-γ分泌。应答按照以下方法计算：肽特异性斑点的数目减去对无关肽(HrWHLA-A2；pol476-484；ILKEPVHGV)反应的斑点数目，以每5每应的⁵个PBMC计。

图2.在来自癌症患者的T细胞和来自健康供体的T细胞中PD-L2引发的应答。(A)在来自恶性黑素瘤(AA和MM)患者的PBMC中，针对PD-L201(PD-L2(4-12))和PD-L205(PD-L2(16-25))(黑色条)或无关肽(灰色条)的IFN-γ应答的实例。所有实验平行三份地进行，＊＊表示根据DFR和DFRx2具有显著性。(B)来自恶性黑素瘤(AA和MM)患者的PBMC中针对PD-L201(PD-L2(4-12))和PD-L205(PD-L2(16-25))(黑色条)或无关肽(灰色条)的TNF-α应答的实例，＊＊根据DFR和DFR×2具有显著性；＊仅根据DFR具有显著性。(C)体外IFN-γELISPOT结果。将来自9名癌症患者和9名健康供体的PBMC在体外用PD-L201(PD-L2(4-12))或PD-L205(PD-L2(16-25))刺激。然后，使PBMC暴露于肽中，并用ELISPOT测量IFN-γ分泌。计算每2-5-PO⁵个PBMC中的肽特异性斑点的平均数目(在减去没有添加肽的条件下的斑点数目之后)。(D)离体IFN-γELISPOT结果。在来自两名恶性黑素瘤患者(AA)和来自两名健康供体(HD)的PBMC中，PD-L205(PD-L2(16-25))(黑色条)或无关肽(灰色条)引发的应答。

图3：针对跨越PD-L2序列的信号肽部分的长PD-L2肽的反应性。(A)体外IFN-γELISPOT结果。将来自11名恶性黑素瘤患者和11名健康供体的PBMC用PD-L210ngl(PD-L2(9-29)；SLEL-QLHQIAALFTVTVPKEL)或PD-L21ong2(PD-L2(1-25)；MIFLLLLELSLELQLHQI-AALFTVTV)刺激，并且通过在体外ELISPOT测定中测量IFNγ释放来筛选IFNγ应答。(B)在体外ELISPOT测定中，筛选来自四名非霍奇金淋巴瘤患者(WM)的PBMC针对PD-L21ong2(PD-L2(1-25))所作的IFNγ应答。所有测定平行三份地以每孔3×10⁶个细胞进行，除了一例平行两份地进行(WM-2)。＊＊根据DFR和DFR×2具有显著性；＊表示仅根据DFR具有显著性。C)在针对PD-L21ong2的应答中，WM-5患者的ELISPOT孔图像的实例。(D)来自两名黑素瘤患者(TIL2，黑色条和TIL6，白色条)的肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)的细胞内细胞因子染色表明在暴露于PD-L205(PD-L2(16-25))、PD-L21ongl(PD-L2(9-29))、PD-L21ong2(PD-L2(1-25))和对照HIV肽(HIV-1pol476-484)后，CD4+T细胞释放的IFN-Y。

图4：PD-L2特异性T细胞是效应T细胞。(A)细胞内细胞因子染色表明在PD-L2T细胞-A(左)和PD-L2T细胞-B(右)的培养物中，CD4+和CD8+T细胞响应于无关的对照肽HIV肽(HIV-1pol476-484)或PD-L205(PD-L2(16-25))而释放TNF-α。(B)PD-L2T细胞培养物-A(左)和PD-L2T细胞培养物-B(右)响应于自体DC刺激5小时的细胞内TNF-α和IFN-γ细胞因子染色。(C)根据ELISPOT测定法的测量，PD-L2T-细胞培养物-A(上图)和PD-L2T-细胞培养物-B(下图)针对PD-L205(PD-L2(16-25))肽(黑色条)和以1∶5的比例培养的自体DC(灰色条)所分泌的IFNγ和TNF-α。(D)在标准的51Cr-释放测定中，如通过PD-L2T细胞培养物-A(左)和PD-L2T细胞培养物-B(右)所识别的，被PD-L205(PD-L2(16-25))或对照HIV肽(HIV-1pol476-484)致敏的T2细胞。

图5：针对DC的PD-L2依赖性反应性。

(A)流式细胞术分析表明在电穿孔后48小时，用PD-L2siRNA或阴性对照siRNA转染的自体DC条件下，PD-L2表面表达的情况。(B)对于PD-L2T细胞培养物-A(上)和PD-L2T细胞培养物-B(下)，采用经PD-L2siRNA或阴性对照siRNA转染的自体DC(以1∶5比例的DC∶T细胞)刺激5小时。使用细胞内细胞因子染色测量CD4+T细胞(左)和CD8+T细胞(右)释放的细胞因子的百分比。(C)使用ELISPOT测定法，在电穿孔后48小时测量的，PD-L2培养物中响应于转染了阴性对照siRNA(黑色条)或PD-L2siRNA(灰色条)的自体DC而释放TNF-α的T细胞的数目数目。该测定平行三份地进行，＊表示根据DFR具有显著性。

图6.PD-L1特异性T细胞和PD-L2特异性T细胞之间没有交叉反应性。(A)用粗体标出PD-L1和PD-L2的前30个氨基酸序列和在蛋白质的信号肽部分中的肽PD-L101(PDL1(15-23)；LLNAFTVTV)和PD-L205(PD-L2(16-25)；QIAALFTVTV)。(B)体外IFN-γELISPOT结果表明来自5名癌症患者的T细胞针对PD-L101(PDL1(15-23))和PD-L205(PD-L2(16-25))肽的应答。(C)51Cr-释放测定结果表明，当以不同的效-靶比暴露于PD-L101特异性T细胞(CTL)时，被PD-L101(PDL1(15-23))、PD-L205(PD-L2(16-25))或不相关的HIV肽(HIV-1pol476-484)致敏的T2细胞的裂解百分比。(D)所培养的PD-L101特异性T细胞的细胞内细胞因子染色表明，在暴露于PD-L101(PDL1(15-23))、PDL205(PD-L2(16-25)或无关的HIV肽(HIV-1p0l476-484)时，CD8+T细胞释放的TNF-α。(D)在暴露于PD-L2T细胞培养物A(左)或PD-L2T细胞培养物B(右)后，被PDL205(PD-L2(16-25))、PD-L101肽(PDL1(15-23))或不相关的HIV肽(HIV-1p0l476-484)致敏的T2细胞的裂解百分比。

具体实施方式

除了来自PDL2(SEQ ID NO 1)的新的免疫原性表位，以及针对新的免疫原性表位的强免疫应答以及所检测到的针对SEQ ID NO 1的若干肽片段的频繁免疫应答之外，本发明人考察了可能引发T细胞反应性的不同的PD-L2衍生表位，并且测试了在来自健康供体和患有不同癌症的患者的样品中，自发性T细胞介导的针对PD-L2的反应性。最后，确定PD-L2特异性T细胞是否能识别表达PD-L2的靶细胞。

调节反馈机制，例如PD-L1和PD-L2的上调，在限制免疫应答的强度和幅度方面是必不可少，如果不限制则可能会对宿主造成伤害。然而，在癌症免疫疗法的框架中免疫逃避是有害的。

=一个方面，本发明涉及选自以下的PDL2的肽化合物或其药学上可接受的盐：

a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至272个氨基酸的连续序列组成，

b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，和

c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中的至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，

并且其中a)、b)或c)中任一个的C-末端氨基酸还包括酰胺。

在上述背景下，“功能性”意指“能够刺激针对具有SEQ ID NO：1的PDL2的免疫应答”。

在另一方面，本发明涉及SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐，该片段长度为至多100个氨基酸，并且其中所述肽片段包含SEQ ID NO：1的8至100个氨基酸的连续序列或者由其组成。

在一个实施方案中，所述肽片段包含10至100个氨基酸，例如10至17个氨基酸、20至30个氨基酸、30至40个氨基酸或40至50个氨基酸的连续序列或由其组成。

在另一个实施方案中，所述肽片段由10至100个氨基酸，例如10至17个氨基酸、20至30个氨基酸、30至40个氨基酸或40至50个氨基酸的连续序列组成。在一个实施方案中，所述肽片段长度为至多60个氨基酸，例如长度为至多50个氨基酸、至多40个氨基酸或至多30个氨基酸。因此，所述连续序列中相应的上限范围是SEQ ID NO：1的60、50、40或30个氨基酸。

在另一个实施方案中，所述肽片段的长度为至多21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2、4、11和12中任一个的一个或更多个序列。在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含序列SEQ ID NO 4。在进一步的实施方案中，所述连续序列由序列SEQ ID NO 4组成。在另一个实施方案中，所述连续序列包含序列SEQ ID NO 11。在进一步的实施方案中，所述连续序列由序列SEQ ID NO11组成。在另一个实施方案中，所述连续序列包含序列SEQ ID NO 12。在进一步的实施方案中，所述连续序列由序列SEQ ID NO 12组成。在进一步的实施方案中，所述连续序列包含序列SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4两者。

在另一个实施方案中，所述肽片段不包含SEQ ID NO 1的第1-3个氨基酸，即MIF。因此，在一个实施方案中，所述肽片段包含LLLMLSLELQLHQIAALFTVTV(SEQ ID NO：25)或由其组成。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2-12中任一个的一个或更多个序列，例如SEQ ID NO 2、4、11和12中的任一个。

在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4两者。例如，肽片段SEQ ID NO：12包含SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4两者。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 11的序列，其中所述肽片段的长度为至多21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。通常，长度为21个氨基酸。

因此，在一个优选的方面，本发明涉及SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐，所述肽片段的长度为至多21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸，并且其中所述肽片段包含选自SEQ ID NO 11的序列或由其组成。

在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 12的序列，其中所述肽片段的长度为至多25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 4的序列，其中所述肽片段的长度为至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在又进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2的序列，其中所述肽片段的长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

在一个实施方案中，所述肽化合物或其药学上可接受的盐选自b)与SEQ ID NO 1或a)的肽片段具有至少70％、80％、90％或95％同一性的功能性同源物，其中C-末端氨基酸还包括酰胺。在一个实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少80％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少90％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与SEQ ID NO 1具有至少95％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少70％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少80％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少90％的同一性。在进一步的实施方案中，所述功能性同源物与a)的肽片段具有至少95％的同一性。

在另一个实施方案中，所述肽化合物或其药学上可接受的盐选自c)功能性类似物，其中SEQ ID NO 1或a)的肽片段中至少一个氨基酸被缺失、插入和/或置换，其中C-末端氨基酸还包括酰胺。

在进一步的实施方案中，所述肽化合物是选自以下的肽化合物：a)SEQ ID NO 1的肽片段，其由8至272个氨基酸的连续序列组成，其中C-末端氨基酸还包括酰胺；或其药学上可接受的盐。在进一步的实施方案中，所述肽片段由8至250个氨基酸的连续序列组成。在又进一步的实施方案中，所述肽片段由8至200个氨基酸的连续序列组成。在进一步的实施方案中，所述肽片段由8至150个氨基酸的连续序列组成。在又进一步的实施方案中，所述肽片段由8至120个氨基酸的连续序列组成。在进一步的实施方案中，所述肽片段由10至100个氨基酸的连续序列组成。在又进一步的实施方案中，所述肽片段由20至80个氨基酸的连续序列组成。在进一步的实施方案中，所述肽片段由30至60个氨基酸的连续序列组成。在又进一步的实施方案中，所述肽片段由40至50个氨基酸的连续序列组成。在进一步的实施方案中，所述肽片段由8至30个氨基酸的连续序列组成。在又进一步的实施方案中，所述肽片段由10至25个氨基酸的连续序列组成。在进一步的实施方案中，所述肽片段由8至25个氨基酸的连续序列组成。

在又进一步的实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自PDL2(1-25)，PDL2(1-50)、PDL2(1-150)、PDL2(1-200)、PDL2(50-100)、PDL2(50-150)、PDL2(50-200)、PDL2(60-100)、PDL2(60-150)、PDL2(60-200)、PDL2(70-100)、PDL2(70-150)、PDL2(70-200)、PDL2(200-273)和PDL2(210-250)。在优选的实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自PDL2(1-25)。在另一个优选的实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自PDL2(1-50)。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自PDL2(200-273)。在优选的实施方案中，SEQ ID NO 1的肽片段选自PDL2(210-250)。

在进一步的实施方案中，所述连续序列包含选自SEQ ID NO 2-24中任一个的一个或更多个序列，例如选自SEQ ID NO 7的一个序列或选自SEQ ID NO 2和4的两个序列。在优选的实施方案中，所述连续序列选自SEQ ID NO 4。在优选的实施方案中，所述连续序列选自SEQ ID NO 2。在优选的实施方案中，所述连续序列选自SEQ ID NO 7。

应当理解，当肽片段由8至120的连续序列组成时，它可以在例如PDL2(1-150)的序列内进行同时选择，然而对于由8至272的连续序列组成的肽片段，其不可能在例如PDL2(1-150)的序列中进行同时选择，这是本领域技术人员所知晓的。否则，所有的组合均在本发明的范围内。

还应理解，本文所用的PDL2(x-y)，其中x和y为选自1-273的整数，意指具有如本文所定义的SEQ ID NO 1的人延长的PDL2的肽片段，其中x是N-末端氨基酸且y是C-末端氨基酸，例如PDL2(16-25)表示从SEQ ID NO 1的第16个氨基酸到SEQ ID NO 1的第25个氨基酸的肽片段，其中第16个氨基酸是Q和第25个氨基酸是V。

在本文所述的任何肽片段中，C末端氨基酸可任选地被相应的酰胺替换，以改善溶解性和/或有助于制备/分离。类似地，多肽可以在N和/或C末端连接至少一个额外的部分以改善溶解性和/或有助于制备/分离。合适的部分包括亲水性氨基酸。例如，氨基酸KR可添加在N末端和/或氨基酸RK可依序添加在C末端。

在另一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐的组合物，所述片段长度为至多100个氨基酸，并且其中所述肽片段包含SEQ IDNO：1的8至100个氨基酸的连续序列或由其组成；其任选地与药学上可接受的添加剂(例如载体或佐剂)一起。

本文使用的术语“同一性”指两个或更多个肽的(例如多肽)序列之间的关系，如通过比较序列而确定。在本领域中，“同一性”还意指蛋白或多肽之间序列相关的程度，如通过两个或更多个氨基酸残基串(string)之间的匹配数目来确定。“同一性”测量具有空位比对(如果存在)的两个或更多个序列的较小序列之间的相同匹配百分比，这通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来进行。相关蛋白或肽的同一性可容易地通过已知方法来计算。这类方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Pro-jects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，HumanaPress，New Jersey，1994；Se-quence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M.Stockton Press，New York，1991；和Carillo et al.，SIAM J.Applied Math.，48，1073，(1988)。

设计确定同一性的优选方法以得出测试序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在可公开获得的计算机程序中有描述。优选的确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux et al.，Nucl.Acid.Res.，12，387，(1984)；GeneticsComputer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Altschul et al.，J.Mol.Biol.，215，403-410，(1990))。BLASTX程序可公开地获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Manual，Altschul et al.NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894；Altschul et al.，见上文)。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison，Wis.)，比对待确定序列同一性百分比的两个蛋白，以实现它们各自氨基酸的最佳匹配(通过算法确定的“匹配跨度(matched span)”)。空位缺口罚分(gapopening penalty)(其计算为3倍平均对角线，“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线平均值；“对角线”是特定的比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的得分或数目)和空位延伸罚分(gap extension penalty)(其通常为空位缺口罚分的倍数{分数(1/10)})，以及比较矩阵如PAM 250或BLOSUM 62与算法结合使用。算法还使用标准的比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff et al.，Atlas of Protein Sequence and Structure，vol.5，supp.3(1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵，Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89，10915-10919，(1992))。蛋白或肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman et al.，J.Mol.Biol，48，443-453，(1970)；比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，10915-10919，(1992)；空位罚分：12；空位长度罚分：4；相似性临界值：0。以上参数适用于GAP程序。使用GAP算法进行蛋白质比较时，前述参数是默认参数(以及末端空位没有罚分)。

在另一个实施方案中，a)的肽片段、b)的功能性同源物或c)的功能性类似物能够激活T细胞，例如CD4和CD8T细胞。通常，通过本文所述的ELISPOT测定法确定所述激活。

在进一步的实施方案中，a)的肽片段能够激活T细胞，如通过本文所述的ELISPOT测定所确定的。

在另一方面，本发明涉及编码本发明的肽化合物的核酸。本发明的肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述核酸选自DNA和RNA。

在又另一方面，本发明涉及包含本发明核酸的载体。本发明的核酸选自上述实施方案中的任一个，并且本发明的肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述载体选自病毒载体。

在另一方面，本发明涉及包含本发明的载体的宿主细胞。本发明的载体选自上述实施方案中的任一个，本发明的核酸选自上述实施方案中的任一个，并且本发明的肽化合物选自上述实施方案中的任一个。在一个实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。

在又另一方面，本发明涉及包含本发明的肽化合物或肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞的组合物，任选地与药学上可接受的添加剂(例如载体或佐剂)一起。

在又另一方面，本发明涉及组合物，其包含a)本发明的肽化合物或肽片段、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞，和b)佐剂，其用作药物。

在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防选自癌症的疾病、障碍或病症的方法中。在一个实施方案中，癌症是形成肿瘤的癌症疾病。在进一步的实施方案中，癌症选自黑素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和卵巢癌中的任意一种。在进一步的实施方案中，所述佐剂选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline和Montanide ISA佐剂。

在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括：

a)本发明的组合物，和

b)包含至少一种第二活性成分的组合物，所述第二活性成分选自免疫刺激化合物，例如白细胞介素如IL-2和/或IL-21，抗癌剂，例如化学治疗剂如辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

在试剂盒的实施方案中，所提供的组合物同时或依序给予。

在另一方面，本发明涉及治疗以表达SEQ ID NO 1的PDL2为特征的临床病症的方法，该方法包括给予患有所述临床病症的个体有效量的本发明的肽化合物、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的载体或本发明的宿主细胞。

在又另一方面，本发明涉及本发明的肽化合物、或本发明的核酸、或本发明的载体、或本发明的宿主细胞的用途，其用于制备药物，例如组合物或疫苗，用于治疗或预防以表达PDL2为特征的癌症。

在另一方面，本发明涉及本发明的肽化合物、或本发明的核酸、或本发明的载体或本发明的宿主细胞，其与其他癌症疗法同时或相继给予时用于治疗或预防癌症的方法中。

在一个实施方案中，所述其他癌症疗法选自细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。在一个实施方案中，所述其他癌症疗法选自免疫系统检查点抑制剂。在一个具体实施方案中，免疫系统检查点抑制剂是检查点阻断抗体。在进一步的实施方案中，所述其他癌症疗法选自辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

如本文使用，所示的任何氨基酸序列可在C-末端氨基酸处修饰成酰胺形式(-CONH₂)，或可以是酸形式(-COOH)，因此它们中的任意一个都是优选的实施方案，并且除非指定为-NH₂或-OH，否则任何C-末端氨基酸(例如I、L、V)均包括酰胺和酸形式。

本文公开的PDL2肽片段通过标准的肽合成法制备，例如固相肽合成(SPPS)。SPPS是实验室中合成肽的标准方法。SPPS允许合成难以在细菌中表达的天然肽，掺入非天然氨基酸、肽/蛋白骨架修饰和合成由D氨基酸组成的D蛋白。用可在其上搭建肽链的功能单元(“接头”)处理小孔珠。肽将与珠保持共价连接，直至通过试剂(例如无水氟化氢或三氟乙酸)从珠上裂解。因此，肽“固定”在固相上并在过滤过程中被保留，而液相试剂和合成副产物被冲走。SPPS的一般原理是脱保护-清洗-偶联-清洗的重复循环之一。固相连接的肽的游离N末端胺偶联至单一的N脱保护的氨基酸单位。该单位之后被脱保护，暴露出新的N末端胺，其上可连接其他氨基酸。这种技术的优势部分在于能够在每次反应之后进行清洗循环，除去过量的试剂，所有生长中的目的肽保持与不溶性树脂的共价连接。主要使用两种形式的SPPS——Fmoc和Boc。不同于核糖体蛋白质合成，固相肽合成以C末端至N末端的方式进行。氨基酸单体的N末端被这两组中任一组保护并被添加到脱保护的氨基酸链中。对于这两种技术而言，皆可获得自动合成仪，尽管许多研究组继续手动进行SPPS。此外，本领域技术人员理解，在上文和下文所述的方法中，中间化合物的功能基团可能需要被保护基团保护。

当本文公开的肽化合物、核酸、载体、宿主细胞和药物组合物用于上述治疗时，将治疗有效量的至少一种化合物给予需要所述治疗的哺乳动物。

本文使用的氨基酸通过本领域技术人员已知的单字母或三字母代码来识别，为方便起见，示于以下表格中：

氨基酸，单字母和三字母代码

氨基酸	三字母代码	一单字母代码
			丙氨酸	ala	A
精氨酸	arg	R
			天冬酰胺	asn	N
天冬氨酸	asp	D
			天冬酰胺或天冬氨酸	asx	B
半胱氨酸	cys	C
			谷氨酸	glu	E
谷氨酰胺	gln	Q
			谷氨酰胺或谷氨酸	glx	Z
甘氨酸	gly	G
			组氨酸	his	H
异亮氨酸	ile	I
			亮氨酸	leu	L
赖氨酸	lys	K
			甲硫氨酸	met	M
苯丙氨酸	phe	F
			脯氨酸	pro	P
丝氨酸	ser	S
			苏氨酸	thr	T
色氨酸	trp	W
			酪氨酸	tyr	Y
缬氨酸	val	V

本文所用的术语“免疫原性”意指在将肽片段给予个体后，在至少一个所述个体中，该肽片段能够引发免疫应答，优选T细胞应答。可以使用任何合适的方法，包括体外方法，来鉴定多肽为免疫原性的。例如，如果肽具有至少一种以下特征，则可以将其鉴定为免疫原性的：

(i)能够在至少一名癌症患者的PBL群体中引发产IFN-γ的细胞，如通过ELISPOT测定法确定的；和/或

(ii)能够在与相应的PDL2发生反应的CTL的肿瘤组织样品中进行原位检测；和/或

(iii)能够诱导特异性T细胞的体外生长。

在下面的实施例部分中也提供了适用于确定多肽是否具有免疫原性活性的方法。

本文所用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”意指为了对抗病症如疾病或障碍而对患者进行管理和护理。该术语旨在包括对于患有特定病症的患者进行的全方位治疗，例如给予活性化合物以缓解症状或并发症，延迟疾病、障碍或病症的发展，缓解或者减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为，为了对抗疾病、障碍或病症而对患者进行管理和护理，包括给予活性化合物以预防症状或并发症的发作。治疗可以以急性或慢性方式进行。优选待治疗的患者为哺乳动物；特别是人类，但也可包括动物，如狗、猫、牛、猴、猿、绵羊和猪。

如本文所用，本发明的肽化合物或本文公开的肽片段的“本发明的肽化意指足以治愈、缓解或部分阻止给定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以实现此目的的量定义为“以疗有效量”。为每一目的而使用的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状态。应当理解，可以使用常规实验、通过构建值的矩阵并且测试矩阵中的不同点来确定合适的剂量，这都在受过训练的医生或兽医的普通技能范围内。

在又另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的肽化合物例如肽片段，和任选的药学上可接受的添加剂例如载体或赋形剂。

如本文所用，“本文所用，的药学上可接旨在但不限于包括本领域技术人员在配制本发明化合物以制备药物组合物时，将会考虑使用的载体、赋形剂、稀释剂、佐剂、着色剂、芳香剂、防腐剂等。

本发明组合物中使用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体在与所述药物组合物的肽化合物、肽片段、核酸、载体、或宿主细胞和其他成分相容的意义上必须是可药用的，并且对其接受者无毒。优选组合物应当不含有任何可能引起不良反应(例如过敏反应)的物质。可用于本发明的药物组合物中的佐剂、稀释剂、赋形剂和载体为本领域技术人员所知晓。

佐剂是任何这样的物质，即其混合到组合物中将增加或以其他方式改变所述组合物引起的免疫应答。广义上的佐剂是促进免疫应答的物质。佐剂还可优选具有储库效应，即它们还使活性剂从给药位置缓慢持续地释放。佐剂的一般性讨论在Goding，MonoclonalAntibodies：Principles&Practice(第二版，1986)61-63页中有描述。

佐剂可选自AlK(SO₄)₂，AlNa(SO₄)₂，AlNH₄(SO₄)，二氧化硅，明矶，Al(OH)₃，Ca₃(PO₄)₂，高岭土，碳，氢氧化铝，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰-去甲胞壁酰(nornuramyl)-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11687，还称为nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′2′-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷氧基)-乙胺(CGP 19835A，还称为MTP-PE)，于2％鲨烯/吐温-80.RTM.乳液中的RIBI(MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其多种衍生物，包括脂质A、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂、Merck佐剂65，多核苷酸(例如多IC和多AU酸)，来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蜡D，存在于短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)成员中的物质，Titermax，ISCOMS，Quil A，ALUN(参见US 58767和5,554,372)，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质或GMDP，白细胞介素1，白细胞介素2，Montanide ISA-51和QS-21。也表明多种皂素(saponin)提取物适于作为免疫原性组合物中的佐剂。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可用作佐剂。

用于本发明的优选佐剂包括基于油/表面活性剂的佐剂，例如Montanide佐剂(可获自比利时Seppic)，优选Montanide ISA-51。其他优选佐剂为基于细菌DNA的佐剂，例如包含CpG寡核苷酸序列的佐剂。其他优选佐剂为基于病毒dsRNA的佐剂，例如poly I：C。GM-CSF和Imidazochiniline也是优选佐剂的实例。

佐剂最优选Montanide ISA佐剂。Montanide ISA佐剂优选Montanide ISA 51或Montanide ISA 720。

在Goding，Monoclonal Antibodies：Principles&Practice(第二版，1986)，61-63页中，还记载了，当目的抗原分子量小或免疫原性差时，推荐偶联至免疫原性载体(carrier)。本发明的免疫治疗组合物的肽化合物、肽片段、核酸、载体(vector)或宿主细胞可偶联至载体。载体可独立于佐剂存在。载体的功能可以是，例如，增加肽化合物、肽片段、核酸、载体或宿主细胞的分子量以增强活性或免疫原性，赋予稳定性，提高生物活性，或延长血清半衰期。此外，载体可辅助将多肽或其片段呈递到T细胞。因此，在免疫原性组合物中，多肽或其片段可与载体(例如下文所述的那些)联合。

载体可以是本领域技术人员已知的任何适合的载体，例如蛋白或抗原呈递细胞，例如树突细胞(DC)。载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)，血清蛋白如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白，免疫球蛋白，或激素如胰岛素或棕榈酸。或者，载体蛋白可以是破伤风类毒素或白喉类毒素。或者，载体可以是右旋糖苷如琼脂糖。载体必须是人生理上可接受的及安全的。

该组合物可任选地包含药学上可接受的赋形剂。赋形剂在与所述组合物的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”并且对其接受者无毒。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于赋形剂中。这些赋形剂和辅助物质通常是药剂，其在接受组合物的个体中不引起免疫应答并且可在不产生过度毒性的情况下给予。可药用的赋形剂包括但不限于液体剂，例如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、甘油和乙醇。其中还可包含可药用的盐，例如无机酸盐类，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐类，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。可药用的赋形剂、载体和辅助物质的充分讨论参见Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。

可以以适于推注给药或适于连续给药的形式制备、包装或销售该组合物。可以以单位剂量形式(例如以安瓿瓶)或以包含防腐剂的多剂量容器来制备、包装或销售可注射组合物。组合物包括但不限于悬浮剂、溶液剂、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入缓释或生物可降解制剂。在组合物的一个实施方案中，以干燥形式(例如粉末或颗粒)提供活性成分，使用适合的媒介物(例如无菌无热原的水)来复原，之后给予经复原的组合物。可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式来制备、包装或销售组合物。该悬浮液或溶液可以根据已知的现有技术来配制，除活性成分以外可包含其他成分，例如本文所述的佐剂、赋形剂和辅助物质。可以使用无毒、肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如水或1，3-丁二醇)来制备这类无菌可注射制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于Ringer′s溶液、等渗氯化钠溶液和不易挥发的油类(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)。

其他适用的组合物包括这样的组合物，其包含微晶形式、以脂质体制剂、或作为生物可降解聚合物体系的组分的活性成分。用于缓释或植入的组合物可包括可药用的聚合材料或疏水材料，例如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。或者，组合物的活性成分可被封装、吸收至微粒载体或与微粒载体交联。适合的微粒载体包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物，以及衍生自聚(丙交酯)和聚(丙交酯-乙醇酸交酯)的PLG微粒。参见，例如Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10：362-368。还可使用其他微粒体系和聚合物，例如，聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，以及这些分子的缀合物。

如上文所提及的，本文公开的组合物特别是免疫治疗组合物，除本文公开的化合物以外还包含至少一种可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方案中，药物组合物包含1至99重量％的所述至少一种可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体和1至99重量％的本文公开的化合物。活性成分和可药用的佐剂、稀释剂、赋形剂和/或载体的组合的量可组成不超过组合物(特别是药物组合物)的100重量％。

在一些实施方案中，仅一种本文公开的化合物或肽用于上述目的。

在一些实施方案中，两种或更多种本文公开的化合物用于组合用于上述目的。

包含本文所述的化合物的组合物，特别是免疫治疗组合物，可适用于口服、静脉内、局部、腹膜内、鼻、口腔、舌下或皮下给药，或适用于以例如气雾剂或气悬细粉的形式经呼吸道给药。因此，药物组合物可以是例如片剂、胶囊、粉末、纳米颗粒、晶体、无定型物质、溶液、透皮贴剂或栓剂的形式。

所述方法的其他实施方案在本文实验部分描述，每种单独的方法以及每种起始物质构成实施方案，其可组成实施方案的一部分。

上述实施方案应当被视为提及本文所述的任一方面(例如“治疗方法”、“免疫治疗组合物”、“用作药物的肽化合物”或“用于方法中的肽化合物”)以及本文所述的任一实施方案，除非具体说明实施方案涉及本发明的某一方面或某些方面。

本文引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利以引用的方式纳入本文，其引用程度等同于单独且具体指明各参考文献以引用的方式纳入本文并且被全文阐述。

本文使用的所有标题和副标题仅为方便起见，不应当理解为以任何方式限制本发明。

除非本文另有说明或者明显地与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以所有可能的变型方式的任何组合。

除非在本文中另有说明或者明显地与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中使用的术语“一”和“一个”和“该”以及类似的指代词应被解释为包括单数和复数。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作分别指出落在该范围内的各个离散数值的简写方法，并且每一个离散数值均被包含在本说明书中，就如同单独地被引用于本文中。除非另有说明，否则本文提供的所有精确值均代表相应的近似值(例如，关于特定因子或测量中所提供的所有示例性的精确数值也可被视为提供相应的近似测量，在适当情况下，由“约”修饰)。

除非本文另有说明或者明显地与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。

除非另有说明，否则本文提供的任何及所有的实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用，仅仅旨在更好地阐述本发明，而不构成对本发明范围的限制。除非明确说明，否则说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何元素是实施本发明所必需的。

本文中引用且纳入的专利文献仅是为了方便，并不反映这些专利文件的任何有效性、专利性和/或可实施性的观点。

本发明的任何方面或实施方案中，对于一种要素或多种要素使用术语例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”，旨在为本发明“由……组成”、“基本上由……组成”或“主要包含”该特定要素或多种要素的本发明的类似方面或实施方案提供支持(例如除非本文另有说明或者明显地与上下文相矛盾，否则本文所述的包含特定成分的组合物也应理解为由该特定成分组成的组合物)。

本发明包括由可适用法律最大限度允许的、在本文的各个方面或权利要求中所述的发明主题的所有修改和等同物。

通过以下实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例不应被解释为对保护范围进行限制。在上文描述和下文实施例中所公开的特征无论是单独地还是以其任意组合的方式，均是用于实现多种形式的本发明的材料。

实验

患者、方案、方法和讨论

患者材料

我们收集了来自黑素瘤患者、肾细胞癌患者、非霍奇金淋巴瘤患者和卵巢癌患者以及健康人的血液样本。在任何类型的抗癌疗法终止后最少四周收集样本。使用Lymphoprep^TM(Alere AS，cat.1114547)分离法分离外周血单核细胞(PBMC)，进行HLA分型并在含有10％DMSO的FCS(Sigma-Aldrich，目录号D5879-100ML)中冷冻。将来自两名黑素瘤患者的病变的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)使用高剂量IL-2(6000单位/ml)进行扩充。该方案获得丹麦首都地区科学伦理委员会的批准，并按照赫尔辛基宣言的规定实施。进入研究之前，获得患者的书面知情同意书。

肽

使用在线表位预测数据库SYFPEITHI(www.sy中eithi.de)，我们鉴定了人PD-L2蛋白中的22种HLA-A2限制性、9-10个氨基酸长的肽。在这22种肽中，我们从PD-L2的信号序列或跨膜结构域中选择了9种，并且通过TAG Copenhagen(哥本哈根，丹麦)合成它们。这些肽是：PD-L201(PD-L2(4-12)；LLLMLSLEL)，PD-L204(PD-L2(231-240)；IIAFIFIATV)，PD-L205(PD-L2(16-25)；QIAALFTVTV)，PD-L208(PD-L2(6-14)；LMLSLELQL)，PD-L209(PD-L2(9-17)；SLELQLHQI)，PD-L215(PD-L2(234-243)；FIFIATVIAL)，PD-L216(PD-L2(11-20)；ELQLHQIAAL)，PD-L220(PD-L2(1-10)；MIFLLLMLSL)和PD-L222(PD-L2(226-235)；FIPFCIIAFI)。我们还分析了具有21-25个氨基酸的两种肽：PD-L21ongl(PD-L2(9-29)；SLELQLHQIAALFTVTVPKEL)和PD-L21ong2(PD-L2(1-25)；MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTV)。将HLA-A2高亲和力结合表位，HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV；SEQ ID NO 26)用作无关对照。将先前所述的被称作PD-L101(PDL1(15-23)；LLNAFTVTV；SEQ ID NO 27)的PD-L1肽用于交叉反应性实验(1)中。在实验之前，将所有的肽溶解于DMSO或无菌水中。

ELISPOT试验

如前所述(3)进行IFN-γ和TNF-αELISPOT技术。我们根据癌症免疫疗法免疫治疗项目(CIP；http：//cimt.eu/cimt/files/dl/cip_guidelines.pdf)提供的指南进行了检测。除非另有说明，否则在分析之前在体外用肽刺激PBMC一次以增大测定的灵敏度。为了测量T细胞反应性，将硝酸纤维素铺底的96孔板(MultiScreen MSIPN4W；Millipore)用相关抗体涂覆，在室温下过夜或在4℃下持续两天。将孔洗涤并用X-vivo介质封闭2小时。在平行三份的含有PD-L2肽或对照肽的孔中，添加不同浓度的PBMC，并且培育过夜。第二天，洗涤孔，加入相关的生物素化的第二抗体(Mabtech)，然后加入抗生物素蛋白-酶缀合物(AP-抗生物素蛋白；Calbiochem/Invitrogen Life Technologies)；最后，为了可视化，我们添加酶底物NBT/BCIP(Invitrogen Life Technologies)。在具有Immunospot软件v5.1的CTLImmunoSpot S6Ultimate-V分析仪上分析已显影的ELISPOT平板上的斑点。

PD-L2-特异性T细胞培养物的产生

将来自黑素瘤患者的PBMC用经辐照(30Gy)的自体DC刺激，所述自体DC已经用PD-L205(PD-L2(16-25))肽(PBL∶DC比例为10∶1)致敏处理并且加入了IL-7(40U/ml)(PeproTech，London，UK)。第二天，加入IL-12(20U/ml)(PeproTech，London，UK)。每周一次，我们采用负载PDL205(PD-L2(16-25))的经辐照的自体DC进行三次相同的刺激，并且第二天加入加入IL-12(20U/ml)。然后，每周一次，我们采用负载PDL205(PD-L2(16-25))的经辐照的自体PBL(培养物∶PBL比例为1∶1)刺激培养物三次，而且第二天，我们加入IL-2(120U/ml；Proleukin，Novartis)。

通过用抗CD137-PE抗体(BD-Biosciences)染色或通过使用TNF-α富集和检测试剂盒(根据Miltenyi Biotec的方法)富集培养物中的特异性T细胞。接下来，我们用MACs微珠柱进行磁性细胞分离(根据Miltenyi Biotec的方法)。通过与0.6μg抗CD3抗体(eBioscience，克隆OKT3)和高剂量IL-2(Proleukin，Novartis)一起温育，快速扩增分选的细胞。

细胞内细胞因子染色

为了检测产生细胞因子的细胞亚群，我们用5μg/ml相关或不相关的肽对PD-L1特异性T细胞培养物(先前描述的(1))和PD-L2特异性T细胞培养物进行刺激，并且将细胞在37℃下用5％CO₂温育5h。温育1h后，我们加入以1∶200稀释的GolgiPlug(BD)。4h后，将细胞用PBS洗涤两次，用对表面标记物具有特异性的荧光染料缀合的抗体染色(CD3-APC-H7，CD4-PerCP/FITC，CD8-Pacific Blue/PerCP和Horizon Fixable Viability Stain 510，均来自BD)。按照制造商的说明书，将细胞进行洗涤、固定并且用固定/透化和透化缓冲液(eBioscience)进行透化。随后用荧光染料缀合的抗体对细胞进行染色以显现细胞内细胞因子。使用以下抗体-荧光染料结合物：IFNγ-PE-CY7/APC(eBioscience)和TNFα-APC/BV421(eBioscience)。使用相关的同型对照以实现正确的补偿并且确认抗体特异性。用BDFACSCanto II流式细胞仪分析染色细胞。用BD FACSDiva软件进行分析。

细胞毒性测定

如前所述(4)，用常规的51铬释放测定法测量PD-L1特异性和PD-L2特异性T细胞介导的细胞毒性。靶细胞是TAP缺陷型T2细胞，用HIV-1pol476-484(ILKEPVHGV)、PD-L101(PD-L1(15-23))或PD-L205(PD-L2(16-25))致敏。

siRNA介导的DC的PD-L2沉默

所有的使PD-L2靶向沉默的 Select siRNA双链体以及用于中等GC含量的 Select siRNA阴性对照双链体均获自Life Technology的

PD-L2 siRNA双链体由三个转录物组成：1.(正义)5-CAUCCU-AAAGGUUCCAGAAtt-3′(SEQ ID NO 28)，(反义)5-UUCUGGAACCUUUAG-GAUGtg3′(SEQ ID NO 29)-(siRNA ID#s37285)，2.(正义)5′-CCUAAGGAACUGUACAUAAtt-3′(SEQ ID NO 30)，(反义)5′-UUAUGUA-CAGUUCCUUAGGga 3′(SEQ ID NO 31)-(siRNAID#s37286)和3.(正义)5′-GAAAACAACUCUGUCAAAAtt-3′(SEQ ID NO 32)，(反义)5-UUUU-GACAGAGUUGUUUUCUC 3′(SEQID NO 33)-(siRNA ID#s37287)。将siRNA双链体溶解在不含RNase的水中至终浓度为100μM，随后在-80℃下储存。

使用MACS CD14 MicroBeads(Mil-tenyi Biotech)富集自体CD14+单核细胞。将富集的单核细胞用CellGro(CellGenix)培养，并补充GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(250U/ml)(均为PeproTech)。第二天，收集细胞并用PD-L2 siRNA或阴性对照siRNA转染。采用的转染过程和电穿孔参数如前所述(13)。对于电穿孔，将细胞以每200 μl Opti-MEM培养基(Invitrogen)中2×10⁶的浓度重悬浮。细胞保持在冰上并加入0.25 nmol的每一种PD-L2siRNA双链体。随后，将细胞转移到2mm的吸收池中，并使用BTX 830方波电穿孔仪(HarvardApparatus，Holliston MA，USA)以250伏特单脉冲电穿孔2毫秒。

电穿孔后立即将单核细胞转移到含有DC成熟混合物的预加温的CellGro培养基，所述DC成熟混合物如下：IL-β(1,000U/mL)、IL-6(1,000U/mL)、TNF-α(1,000U/mL)和PGE2(1mg/mL)(均来自PeproTech)。温育48小时后，将转染的成熟DC用于实验分析。使用抗人PD-L2-PE(BD biosciences)分析用PD-L2 siRNA和阴性对照siRNA转染的DC上的PD-L2表面表达。使用如上所述的ICS和ELISPOT测定法分析PD-L2特异性T细胞培养物对于经转染的自体DC的功能。对于ICS，利用经PD-L2 siRNA或阴性对照转染的DC对T细胞培养物刺激5小时。在EliSpot测定法中，用DC刺激T细胞培养物(比例为1∶5)24小时。

统计分析

根据CIP和Moodie等人提供的指南和建议(5)定义ELISPOT应答。将非参数无分布重采样(DFR)和更保守的DFR×2统计检验用于抗原刺激的孔和阴性对照孔之间的正式比较。ELISPOT测定至少平行测定三次。

结果

天然T细胞针对PD-L2的反应性

用“SYFPEITHI”数据库(15)筛选PD-L2蛋白的氨基酸序列，以预测最佳的HLA-A2肽表位。该算法以22-29范围内的预测分数为基础，确定了22种最佳的候选肽。基于它们在PD-L2蛋白中的位置，我们选择了9种肽用于合成和进一步研究。肽的至少一部分必须位于信号肽或跨膜结构域中。在体外测试中，对9种肽进行IFN-γELISPOT测定，以测试来自不同HLA-A2+癌症患者的PBMC中存在特异性T细胞应答。我们检测到针对PD-L215(PD-L2(234-243))的免疫应答，特别是针对PD-L201(PD-L2(4-12))和PD-L205(PD-L2(16-25))的免疫应答)(图1)。

接下来，我们利用IFN-γ和TNF-α ELISPOT测定来检查5种所选出的PBMC针对PD-L201(PD-L2(4-12))和PD-L205(PD-L2(16-25))的免疫应答(图2A和2B)。根据DFR试验，所有IFN-γ和TNF-α反应均具有统计学上的显著性(图2A和2B)。此外，根据DFR×2规则，IFN-γ应答和一种TNF-α应答具有统计学上的显著性(图2A和2B)。然后，我们使用IFN-γ ELISPOT测定以测试来自健康供体的PBMC针对PD-L2衍生表位的免疫应答。我们检测到在健康个体中，针对PD-L205(PD-L2(16-25))的强的免疫应答，以及针对PD-L201(PD-L2(4-12))的较弱的应答(图2C)。通常，PD-L205(PD-L2(16-25))似乎是引发免疫应答的显性表位。随后，我们使用IFN-γ ELISPOT测定法直接离体(预先不进行体外肽刺激)测试来自四个供体的PBMC针对PD-L205(PD-L2(16-25))的应答(图2D)。根据DFR规则，来自这些供体中的一个供体的PBMC显示出具有统计学上显著性的离体IFN-γ应答(图2D)。

最后，为了测试自发的、PD-L2特异性的、CD4+T细胞应答，我们合成了两条更长的PD-L2肽。其中一条为PD-L21ongl(PD-L2(9-29)；SLELQLHQI-AALFTVTVPKEL)，其包含PD-L205(PD-L2(16-25))表位；另一条为PD-L21ong2(PD-L2(1-25)；MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTV)，其包含PD-L201(PD-L2(4-12))和PD-L205(PD-L2(16-25))表位。我们使用IFN-γELISPOT测定法，对于来自11名癌症患者和11名健康供体的PBMC进行测试，以确定是否存在针对这些长肽的CD4+T细胞应答。我们检测到频繁且中等程度的应答(图3A)。接着，我们从四名非霍奇金淋巴瘤患者中分离PBMC，并在体外ELISPOT测定中筛选针对PD-L21ong2(PD-L2(1-25))的IFN-γ应答。根据DFR规则，这四名患者全部都具有统计学上显著性的应答(图3B和3C)。还通过使用细胞内细胞因子染色，测量了来自两名黑素瘤患者的肿瘤浸润性T淋巴细胞所引发的针对PD-L21ong2(PD-L2(1-25))的IFN-γCD4+T细胞应答(图3D)。

PD-L2特异性T细胞是释放促炎细胞因子的效应细胞

为了表征由PD-L2引发的免疫应答，我们分离了PD-L205特异性T细胞。简言之，将从黑素瘤患者(AA26)中分离的PBMC在体外扩增。然后，使用已经用PD-L205致敏的经辐照的自体DC刺激PBMC。通过用抗CD137抗体(PD-L2T细胞培养物-A)染色或用TNF-α富集方法(PD-L2T细胞培养物-B)分离特异性T细胞。将这些特异性T细胞用高剂量IL-2培养和扩增，然后用细胞内细胞因子染色(图4A和4B)、ELISPOT(图4C)和细胞毒性测定法(图4D)分析针对PD-L205(PD-L2(16-25))的特异性。我们从PD-L2T细胞培养物-A中分别在4.5％和1％的CD4+和CD8+T细胞中检测到响应于PD-L205(PD-L2(16-25))的TNF-α释放；从PD-L2T细胞培养物-B中分别在约7％和2％的CD4+和CD8+T细胞中检测到(图4A)。此外，我们从PD-L2T细胞培养物-A和-B中分别在约3％和2.8％的CD4+T细胞中检测到响应于自体DC的TNF-α释放(图4B)。此外，观察到在这两种PD-L2特异性培养物中，针对PD-L205(PD-L2(16-25))肽和自体DC的IFN-Y和TNF-α T细胞应答(图4C)。在常规51铬释放测定法中，这两种扩增的培养物还识别并裂解了经受PDL205(PD-L2(16-25))致敏的T2细胞，但它们不识别用不相关的HIV肽(HlV-1pol476-484)致敏的T2细胞(图4D)。

响应于表达PD-L2的DC的PD-L2依赖性反应性

可以在免疫细胞中诱导PD-L2。因此，作为下一个也是非常重要的步骤，我们要解决表达PD-L2的DC是否也会被PD-L2反应性T细胞识别的问题。为了检验这一观点，我们制备了自体DC；并且利用PD-L2siRNA对它们进行转染。我们首先检查了在成熟的siRNA转染的DC上的PD-L2蛋白表达(图5A)。在电穿孔后48小时，与用阴性对照siRNA转染的DC相比，在用PD-L2siRNA转染的DC上的PD-L2表达被下调(图5A)。然后，我们使用细胞内细胞因子染色(图5B)和ELISPOT测定法(图5C)，检查了PD-L2T细胞培养物响应于经过转染的DC的反应性。与用阴性对照siRNA转染的DC相比，这两种PD-L2T细胞培养物均显示出对经PD-L2siRNA转染的DC降低的CD4+和CD8+T细胞细胞因子应答(图5B)。类似地，在TNF-α ELISPOT测定法中，与阴性对照siRNA相比，这两种培养物中响应于经PD-L2siRNA转染的DC而释放TNF-α的T细胞的数目明显减少(图5C)。这些结果证实靶细胞的反应性依赖于PD-L2表达。

PD-L1特异性和PD-L2特异性T细胞不交叉反应

引发T细胞应答的显性PD-L2表位是PD-L205(PD-L2(16-25)；QIAALFTVTV)。有趣的是，我们先前描述了PD-L1中的另一种HLA-A2限制性表位(称为PD-L101(PDL1(15-23)；LLNAFTVTV)(1)、(2)、(6)，其引发强烈的T细胞应答。这两种显性T细胞表位位于PD-L1和PD-L2蛋白中几乎相同的位置(图6A)。此外，由于PD-L1和PD-L2之间的序列相似性，这两个显性表位共享五个氨基酸(FTVTV；SEQ ID NO 34)(图6A)。因此，我们测试了PD-L205(PD-L2(16-25))特异性和PD-L101(PDL1(15-23))特异性T细胞之间的潜在交叉反应性。

首先，我们分离了对PD-L205(PD-L2(16-25))产生应答的癌症患者的PBMC。在我们检查这些PBMC是否具有针对PD-L101(PDL1(15-23))的自发性T细胞应答时，我们采用IFN-γELISPOT测定法并未检测到任何免疫应答(图6B)。接着，我们检查了PD-L101特异性T细胞培养物的潜在交叉反应性(1)。我们使用标准的51Cr释放测定法，采用TAP缺陷型T2细胞作为靶细胞。使靶细胞负载PD-L101(PDL1(15-23))，PD-L205(PD-L2(16-25))或来自HIV的无关对照肽(HIV-1pol476-484)。图6C说明PD-L101特异性T细胞仅裂解用PD-L101(PDL1(15-23))致敏的T2-细胞，并且没有观察到针对用PD-L205(PD-L2(16-25)))或不相关的HIV肽致敏的T2细胞的细胞毒性。然后，我们进行细胞内细胞因子染色测定，用于分析PD-L101特异性CD8+T细胞响应于PD-L101(PDL1(15-23))、PD-L205(PD-L2(16-25))或对照HIV肽的细胞因子释放(IFN-γ和TNF-α)(图5C)。再一次地，我们发现PD-L101特异性T细胞仅响应于PD-L101(PDL1(15-23))释放细胞因子，不响应于PD-L205(PD-L2(16-25))或不相关的HIV肽释放细胞因子(图6D)。

最后，我们检查了PD-L205反应性T细胞是否能够特异性识别PD-L205(PD-L2(16-25))，而并不是PD-L101(PDL1(15-23))。我们用标准的51Cr释放测定法检测了这两种已建立的PD-L205反应性T细胞培养物，采用TAP缺陷型T2细胞作为靶细胞。使靶细胞负载PD-L205(PD-L2(16-25))、PD-L101(PDL1(15-23))或对照HIV肽(HIV-1pol476-484)。PD-L205特异性T细胞确实可以识别用PD-L205(PD-L2(16-25))致敏的T2细胞，但它们不能杀死用PD-L101(PDL1(15-23))或用对照HIV肽致敏的T2细胞(图6E)。

讨论

在本研究中，将PD-L2作为特异性T细胞的靶标进行检查，并且确定了PD-L2特异性T细胞是自发地存在于患有不同癌症(包括NHL)的患者中。通常，由肽PD-L205(SEQ ID NO4)引发的应答最强。令人惊讶的是，我们观察到特异性识别PD-L205(PD-L2(16-25))中的最小表位的CD8+和CD4+两种T细胞，对于其HLA-A2肽结合基序具有选择性。有趣的是，PD-L205(PD-L2(16-25))表位与先前在PD-L1中鉴定的HLA-A2限制性表位类似。重要的是，PD-L1-和PD-L2-特异性T细胞不发生交叉反应；因此，它们应被视为不同的T-细胞抗原。结果进一步表明PD-L2-特异性T细胞特异性识别PD-L2+靶细胞。因此，PD-L2特异性T细胞响应于它们的PD-L2表达水平来识别靶细胞。因此，我们认为诱导/增强针对PD-L2的T细胞应答(例如，通过疫苗接种)代表了一种用于治疗血液恶性肿瘤(包括NHL)的引人注目的策略。这些发现证明了需要临床试验以评估基于PD-L2的疫苗接种的功效。因此，申请人目前正在Herlev医院(丹麦)开展第一项人类PD-L2疫苗研究。在该研究中，将本研究所述的长PD-L2表位给予处于二线化疗后的缓解中的NHL高风险患者。该方法代表了与使用靶向PD1/PDL途径的单克隆抗体的主要区别。实际上，除了降低PD-L2的直接免疫调节作用外，这些PD-L2特异性T细胞还可能抑制由PD-L2+靶细胞介导的其他免疫抑制途径(7)。

已证实PD-L2特异性T细胞释放IFN-γ和TNF-α两者。值得注意的是，研究发现PD-L2特异性T细胞应答在离体情况下直接表明了这种抗原的免疫原性(8)。因此，基于PD-L2的疫苗应被视为其他形式的免疫疗法的补充而非不与其他形式的免疫疗法竞争。例如，认为将PD-L2疫苗接种与检查点阻断剂结合是有效的疗法。检查点阻断可以通过阻止它们在肿瘤部位的抑制来增强疫苗激活的PD-L2特异性T细胞。同样，由于促炎细胞因子的释放，疫苗诱导的检查点分子的上调也将被检查点抑制剂阻断。最后，发现T细胞与位于PD-L2的信号肽区域中的PD-L2衍生的表位自发性地反应。因此，被T细胞识别的PD-L2表位因而不同于被抗PDL2阻断抗体识别的任何表位。一般而言，癌症疫苗代表了一种消除微小残留疾病而不会引起明显毒性和继发性恶性肿瘤的方法。然而，到目前为止，他们在很大程度上并不能证明可显著地改善患者的预后(9)。这种失败可能反映了恶性细胞能够抑制诱导的免疫细胞的功能。将PD-L2表位加入到当前的癌症疫苗策略中可能是非常有益的，并且它易于实施。此外，与肿瘤细胞不同，肿瘤微环境中的基质细胞类型在遗传上是稳定的，因此，它们代表具有降低的抗性和肿瘤复发风险的引人注目的治疗靶标。

总之，本研究描述了在癌症患者中天然存在的PD-L2特异性T细胞。因此，PD-L2可以作为免疫治疗策略中的高度可及的靶标。

说明书中使用的序列：

延长的PDL2(1-273)：

PDL2(4-12)：

LLLMLSLEL(SEQ ID NO.2)

PDL2(231-240)：

IIAFIFIATV(SEQ ID NO.3)

PDL2(16-25)：

QTAALFTVTV(SEQ ID NO.4)

PDL2(6-14)：

LMLSLELQL(SEQ ID NO.5)

PDL2(9-17)：

SLELQLHQI(SEQ ID NO.6)

PDL2(234-243)：

FIFIATVIAL(SEQ ID NO.7)

PDL2(11-20)：

ELQLHQIAAL(SEQ ID NO.8)

PDL2(I-10)：

MIFLLLMLSL(SEQ ID NO.9)

PDL2(226-235)：

FIPFCIIAFI(SEQ ID NO.10)

PDL2(9-29)

SLELQLHQIAALFTVTVPKEL(SEQ ID NO.11)

PDL2(1-25)

MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTV(SEQ ID NO.12)

PDL2(125-143)

KINTHILKV(SEQ ID NO.13)

PDL2(51-59)

NLGAITASL(SEQ ID NO.14)

PDL2(54-62)

AITASLQKV(SEQ ID NO.15)

PDL2(74-82)

TLLEEQLPL(SEQ ID NO.16)

PDL2(30-38)

YIIEHGSNV(SEQ ID NO.17)

PDL2(145-153)

ATGYPLAEV(SEQ ID NO.18)

PDL2(172-180)

GLYQVTSVL(SEQ ID NO.19)

PDL2(168-176)

RTPEGLYQV(SEQ ID NO.20)

PDL2(242-251)

ALRKQLCQKL(SEQ ID NO.21)

PDL2(31-40)

IIEHGSNVTL(SEQ ID NO.22)

PDL2(130-139)

ILKVPETDEV(SEQ ID NO.23)

PDL2(149-158)

PLAEVSWPNV(SEQ ID NO.24)

PDL2(4-25)

LLLMLSLELQLHQIAALFTVTV(SEQ ID NO：25)

HIV-1po1476-484

ILKEPVHGV(SEQ ID NO：26)

PDL1(15-23)

LLNAFTVTV(SEQ ID NO：27)

PD-L2siRNA双链体

5′-CAUCCUAAAGGUUCCAGAAtt-3′(SEQ ID NO 28)

5′-UUCUGGAACCUUUAGGAUGtg3′(SEQ ID NO 29)

5′-CCUAAGGAACUGUACAUAAtt-3′(SEQ ID NO 30)

5′-UUAUGUACAGUUCCUUAGGga 3′(SEQ ID NO 31)

5′-GAAAACAACUCUGU(AAAAtt-3′(SEQ ID NO 32)

5′-UUUUGACAGAGUUGUUUUCtt 3′(SEQ ID NO 33)

PDL1和PDL2表位共有的五个氨基酸

FTVTV(SEQ ID NO 34)

参考文献

1.Munir S，Andersen GH，Met O，Donia M，Frosig TM，Larsen SK et al.HLA-restricted cytotoxic T cells that are specific for the immune checkpointligand PD-L1 occur with high frequency in cancer patients.Cancer Research2013：73：1674-1776.

2.Munir S，Andersen GH，Woetmann A，Odum N，Becker JC，AndersenMH.Cutaneous T cell lymphoma cells are targets for immune checkpoint ligandPD-L1-specific，cytotoxic T cells.Leukemia 2013；27：2251-2253.

3.Larsen SK，Munir S，Woetmann A，Froesig TM，Odum N，Svane IM etal.Functional characterization of Foxp3-specific spontaneous immuneresponses.LeHkemia 2013；27：2332-2340.

4.Martinenaite E，Ahmad SM，Hansen M，Met O，Westergaard MW，Larsen SK etal.CCL22-specific T cells：Modulating the Immunosuppressive TumorMicroenvironment.Oncoimmunology 2016；5：e1238541

5.Moodie Z，Price L，Janetzki S，Britten CM.Response determinationcriteria for ELISPOT：toward a standard that can be applied acrosslaboratories.Methods Mol Biol 2012；792：185-196.

6.Ahmad SM，Larsen SK，Svane IM，Andersen MH.Harnessing PD-L1-specificcytotoxic T cells for anti-leukemia immunotherapy to defeat mechanisms ofimmune escape mediated by the PD-1pathway.Leukemia 2014；28：236-238.

7.Andersen MH.Immune Regulation by Self-Recognition：NovelPossibilities for Anticancer Immunotherapy.J Natl Cancer Inst 2015；107：154

8.Keilholz U，Weber J，Finke JH，Gabrilovich DI，Kast WM，Disis ML etal.Immunologic monitoring of cancer vaccine therapy：results of a workshopsponsored by the Society for Biological Therapy.J Immunother 2002；25：97-138.

9.Rhee F.Idiotype vaccination strategies in myeloma：how to overcome adysfunctional immune system.Clin Cancer Res 2007；13：1353-1355.

序列表

<110> XXXX

<120> XXX

<130> 10065PC00

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile

20 25 30

Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser

35 40 45

His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

50 55 60

Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65 70 75 80

Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp

85 90 95

Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr

100 105 110

Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr

115 120 125

His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln

130 135 140

Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val

145 150 155 160

Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

165 170 175

Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys

180 185 190

Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp

195 200 205

Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His

210 215 220

Ile Phe Ile Pro Phe Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val

225 230 235 240

Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

245 250 255

Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

260 265 270

Ile

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Gln Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val

1 5 10

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln Ile

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val Ile Ala Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Glu Leu Gln Leu His Gln Ile Ala Ala Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Phe Ile Pro Phe Cys Ile Ile Ala Phe Ile

1 5 10

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr

1 5 10 15

Val Pro Lys Glu Leu

20

<210> 12

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val

20 25

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

Lys Ile Asn Thr His Ile Leu Lys Val

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

Tyr Ile Ile Glu His Gly Ser Asn Val

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val Leu

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 22

Ile Ile Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 23

Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 24

Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val

1 5 10

<210> 25

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 25

Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln Ile Ala Ala

1 5 10 15

Leu Phe Thr Val Thr Val

20

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 26

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 27

Leu Leu Asn Ala Phe Thr Val Thr Val

1 5

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 28

cauccuaaag guuccagaat t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 29

uucuggaacc uuuaggaugt g 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 30

ccuaaggaac uguacauaat t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 31

uuauguacag uuccuuaggg a 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 32

gaaaacaacu cugucaaaat t 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 33

uuuugacaga guuguuuuct t 21

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 34

Phe Thr Val Thr Val

1 5

Claims (15)

1.SEQ ID NO：1的人PDL2蛋白的肽片段或其药学上可接受的盐，该片段长度为至多100个氨基酸，并且其中所述肽片段包含SEQ ID NO：1的8至100个氨基酸的连续序列或由其组成。

2.权利要求1所述的肽片段，其中所述肽片段包含10至100个氨基酸，例如10至17个氨基酸、20至30个氨基酸、30至40个氨基酸或40至50个氨基酸的连续序列或由其组成。

3.权利要求1-2中任一项所述的肽片段，其中所述片段不包含SEQ ID NO 1中的第1-3个氨基酸。

4.权利要求1-3中任一项所述的肽片段，其中所述连续序列包含选自SEQ ID NO 11、2、4和12中的任一个的一个或更多个序列。

5.权利要求1-4中任一项所述的肽片段，其中所述连续序列包含SEQ ID NO 11。

6.权利要求1-4中任一项所述的肽片段，其中所述连续序列包含SEQ ID NO 4。

7.权利要求1-6中任一项所述的肽片段，其中所述肽片段的长度为至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。

8.权利要求1-7中任一项所述的肽片段，其中所述肽片段为分离的免疫原性肽片段。

9.一种组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的肽片段，任选地与药学上可接受的添加剂一起，所述添加剂为例如载体或佐剂。

10.权利要求9所述的组合物，其中存在佐剂且其选自基于细菌DNA的佐剂、基于油/表面活性剂的佐剂、基于病毒dsRNA的佐剂、imidazochiniline、Montanide ISA佐剂。

11.权利要求1-8中任一项所述的肽片段，其用于治疗癌症例如黑素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤和卵巢癌。

12.权利要求11所述的肽片段，其中所述癌症的特征在于表达PDL2。

13.一种治疗或预防患者的癌症的方法，所述方法包括给予癌症患者治疗有效量的权利要求1-8中任一项的肽片段。

14.权利要求13的方法，其中所述方法还包括同时或依序给予其他癌症疗法，例如细胞因子疗法、T细胞疗法、NK疗法、免疫系统检查点抑制剂、化学疗法、放射疗法、免疫刺激物质、基因疗法、抗体和树突细胞。

15.权利要求14的方法，其中其他癌症疗法选自以下中的一种或更多种：辅酶B12、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊立替康、来那度胺、甲酰四氢叶酸、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、Nivolumab、奥沙利铂、紫杉醇、Pembrolizumab、培美曲塞、瑞复美、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。