CN109880821A - 一种提取超长环状dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明针对长片段DNA提取过程存在的DNA易水解、质量差、数量少、成本高的问题，提供一种提取超长环状DNA的方法，属于分子细胞生物学领域。包括以下步骤：将转化的细菌初始培养并制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入含有相应抗生素的培养液中，培养至生长平台前期；将培养液转移至离心管中离心去上清，收集细菌沉淀，再经过TE缓冲液悬浮、离心，彻底弃去上清；加入蔗糖TE缓冲液后，加热至98℃，2‑3分钟后迅速冷却；以转速21K x g离心10分钟后，小心收取上清于新试管内，向新试管内加入预冷的异丙醇和醋酸钠，离心后沉淀出初期DNA收获物，用70％乙醇洗去盐分和杂质后室温晾干。本发明操作简便，成本低，环境友好，可获取大量、超长的高质量DNA。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和分子遗传学及细胞生物学领域，具体涉及一种提取超长环状DNA的方法。
背景技术
随着分子生物学和细胞遗传学技术的迅速发展，不同生物物种的DNA测序、克隆、功能分析及鉴定技术已经得到广泛深入的应用。但针对长片断环状DNA，特别是超长质粒、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，简称BAC)克隆DNA的扩增和纯化步骤一直是一个重复率高、效率低下、劳力密集的过程。纯化过程常常应用到昂贵的纯化柱或者磁珠，效费比很低且失败率很高。BAC是基于大肠杆菌F因子质粒的克隆载体，能够插入DNA的片段高达300kb，为有效研究基因功能提供了强有力的工具。但BAC克隆DNA的制备过程一直相当具有挑战性，成功率在很大程度上取决于实验能获取的DNA纯度和数量。虽然人们已经开发了一些方法来分离和纯化BAC重组体，但这些纯化方法与从高拷贝数的质粒中提取DNA是完全不同的，直接从菌落和培养物中提取BAC DNA是极为低效的。因为现有的方法在裂解大肠杆菌细胞的同时，既释放出了BAC DNA，也释放了细菌染色体DNA，造成最终产物的污染。传统中使用的提取试剂盒试剂中往往含有高浓度的有机溶剂和难以去除的盐分，对最终产物形成一定程度的污染。而纯化柱对于分离大于50kb以上的双链DNA有相当的难度。此外，BAC是以单拷贝的形式存在于宿主细胞中，拷贝数远低于其他质粒。产量不足与纯度不够是超长DNA提取的主要瓶颈。超长质粒或BAC克隆技术，或者独立的超长DNA扩增纯化技术，由于不可或缺的应用要求，特别在基因组与染色体分析的相关的分析实验中，发明一种稳定好、操作简洁、效费比高的扩增与纯化技术，或基于此技术的应用试剂盒，是亟需解决的一个问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述长片段DNA提取过程存在的DNA易水解、质量差、数量少、易污染、成本高的问题，提供一种提取超长环状DNA的方法，该方法能够从小体积细菌培养液中获取质量高、数量充分超长的DNA，并且操作简易，成本低、环境友好。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种提取超长环状DNA的方法，包括以下步骤：
(1)将转化的细菌初始培养并制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入含有相应抗生素的培养液中，培养至生长平台前期；
(2)将培养液转移至离心管中离心去上清，收集细菌沉淀，细菌沉淀再经过TE缓冲液悬浮、离心，彻底弃去上清；
(3)加入蔗糖TE缓冲液后，加热至98℃，2-3分钟后迅速冷却；
(4)以转速21K x g离心10分钟后，小心收取上清于新试管内，向新试管内加入预冷的异丙醇和醋酸钠，离心后沉淀出初期DNA收获物，用70％乙醇洗去盐分和杂质后室温晾干。
本发明的技术核心是通过增加细菌细胞壁的渗透压差、物理改变细胞壁结构与抑制菌体内源性或外源性DNA酶活性的方法获取超长DNA。蔗糖的作用是改变细胞壁内外渗透压，TE缓冲液是为了保护DNA被水解。物理加热大肠杆菌是为了增加细菌内压力，增大细菌壁的孔径，使蛋白变性特别是附着于载体DNA的蛋白变性，改变载体DNA结构，有利于载体DNA释放到缓冲液中，同时，尽量保持细菌自身染色体留在细菌内，避免污染载体DNA。
进一步地，所述步骤(1)转化的细菌包括但不限于含超长DNA的质粒或BAC克隆大肠杆菌。所述超长DNA的长度为10K bp-70K bp。
进一步地，所述超长DNA的长度为50K bp-70K bp。
进一步地，所述步骤(1)培养至平台前期的细菌OD值，每毫升107-109个细胞。
进一步地，还包括对权利要求1提取的DNA采用滚环扩增法扩增。
进一步地，所述扩增方法具体步骤为：
(1)将提取的DNA加入到含有退火缓冲液的反应体系中，随后加入抗外切随机引物，于PCR仪中95℃加热5分钟后保持于4℃，顺序加入水、酶反应缓冲液、四种核苷及高保真phi29DNA聚合酶，于30℃反应16至18个小时，最后65℃加热反应体系失活聚合酶；
(2)将反应体系转入盛有等体积异丙醇的试管中，轻弹混匀，至DNA絮状物出现后，以转速600K x g离心，去上清后加入70％乙醇，轻轻混匀并离心、去上清，重复70％乙醇洗去沉淀中的盐分和杂质。
由于本发明采用的Phi29DNA聚合酶具有很强的链置换活性，可实现对DNA复杂结构的解链与复制。同时此酶具有高效的DNA合成能力，可连续合成多达70kb的DNA片段。Phi29DNA聚合酶具有很强的3’至5’外切酶活性，其聚合保真度(＜10-6)高于绝大多数高保真酶,超过Taq DNA聚合酶200倍以上(参见NEB,DNA Polymerase Selection Chart)，因此Phi29DNA聚合酶特别适合用于全基因组DNA扩增、基因结构与序列分析、功能化研究。
有益效果：
本发明采用简洁的物理与酶处理法，过程简单，操作简便，节约时间。本发明避免使用昂贵的磁珠与纯化柱试剂盒，大幅度降低了成本，提高了DNA质量与获取量。本发明避免使用传统的碱裂解法或苯、氯仿等有害、有毒溶剂提取技术，对实验人员和环境友好；通过对获取的环状DNA应用高保真、高效率扩增酶扩增，获取大量、长度达70kb的DNA。本发明对于大片断DNA，特别是基因组DNA的提取最为有效。
本发明所产生的DNA产量稳定，纯度高，质量可靠，可为下游的测序、探针标志、DNA结构与功能化分析提供有力的基础材料支持。本发明提供了核酸提取纯化产业化规模化生产的潜力，具备优良的扩展性，可以实现标准化试剂盒套装系列产品和全自动化操作。
附图说明
图1为实施例1提取到的DNA产物的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
主要试剂材料：
细菌培养基2x YT medium(Sigma-Aldrich，Y2377-250G)；
氯酶素(Sigma-Aldrich，C0378-25g)；
蔗糖(Sigma-Aldrich，84097-250g)；
UltraPure 1M Tris-HCI,pH 8.0(Thermo Fisher Scientific，15568025)；
0.5M EDTA,pH 8.0(Thermo Fisher Scientific，AM9261)；
抗外切随机六聚物Exo-Resistant Random Hexamer(Thermo FisherScientific，SO181)
DNA聚合酶phi29DNA Polymerase(NEB,M026S,10U/ul)
RNase A,DNase and protease-free((Thermo Fisher Scientific，EN0531)
核苷混合物(dNTP)Solution Set(NEB,N0446S)
去离子水UltraPureTMDNase/RNase-Free Distilled Water(Thermo FisherScientific，10977015)
醋酸钠3M Sodium Acetate,pH 5.5(Thermo Fisher Scientific,AM9740)
异丙醇(Sigma-Aldrich，278475-2L)
糖原Glycogen(Thermo Fisher Scientific,R0561)
试剂准备：
100毫升蔗糖TE缓冲液(1x STE):8％(w/v)Sucrose,50mM Tris-HCl(pH 8.0),50mM EDTA(pH 8.0)。高温消毒后置于4℃备用。
2x退火缓冲液(2X Annealing buffer):80mM Tris-HCL,pH 8.0；20mM MgCl2。
1000毫升细菌培养液：将31g 2x YT培养基粉充分与1升去离子水涡旋混匀，121℃高温高压消毒15分钟后，置于室温冷却备用。
实施例1
实验步骤：
(1)培养基的准备
将31g 2xYT培养基混入1升去离子水中，加入涡旋磁棒在涡旋器中混合充分，于121℃高压高压灭菌15分钟。取2-5毫升室温2xYT培养液加入到细菌培养管中，按说明加入相应浓度的抗生素，氯酶素一般加入量为12.5ug/ml。
(2)细菌培养
用移液枪加样头点取少量BAC克隆大肠杆菌于培养管中，置于37℃/220rpm的摇床培养4至6小时。按1：10，1：50梯度稀释培养物，并划平盘，平盘含有规定浓度的相应抗生素。将划好的平盘置于37℃温育箱中培养一夜，培养16至20小时至产生分离清晰的克隆。挑取单个克隆加入到步骤(1)准备好的细菌培养管中，置于37℃/220rpm的摇床培养14至16小时。检查培养液的OD600值，按1.0OD600＝8x 10^8cells/ml计算培养细菌的浓度，最佳浓度为OD600＝2.0，即每毫升培养液中含有109个细菌。
(3)环状DNA的提取
将1毫升培养物转至1.5毫升无菌离心管，6000x g离心1分钟，弃上清。重悬于1毫升蔗糖TE缓冲液中，6000x g离心1分钟，弃上清。将离心管置于98℃加热器中加热3分钟，为防止离心管盖松开，可用parafilm封好管口。立即置于水冰中冷却2分钟以上。21k x g离心10分钟后小心将上清液350微升转移至一新的1.5毫升离心管中。加入350微升预冷的异丙醇，70微升3摩尔醋酸钠(pH5.2),1微升糖元(20mg/ul),涡旋混匀后放于-20℃冰箱1个小时。于21k x g离心10分钟，小心去上清，用1毫升70％酒精洗涤2次，离心弃上清。沉淀温室干燥10分钟以上。
(4)环状DNA提取量测定
向DNA中加入10微升低浓度TE缓冲液(10mM Tris-HCL,pH8.0,0.1mM EDTA)后充分混匀。然后加入RNase A至至终浓度为0.02微克每微升，用手指轻弹混匀，于室温下静置反应5分钟。使用Nanodrop、Agilent Bioanalyzer2100或1％agarose琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量。如图1所示，3和5为本实施例的提取到的环状DNA产物，片段长度为50K bp-70K bp，获得量达到2.1微克每微升。而采用现有的方法，通常从低拷贝的BAC中可收获300-600纳克环状DNA每微升。因此，本发明的提取效率明显高于其他方法。
实施例2
顺序加入下述试剂成分于200微升PCR反应管中：6微升PCR用水，10微升2x退火缓冲液，2微升50微摩尔抗外切随机六聚物，1微升实施例1获取的环状DNA(约10至30微克)，混匀后置于PCR机中。启动PCR反应：95℃3分钟后立即保持于4℃，准备加入主反应混合试剂。
于冰上准备好主反应混合试剂：54微升PCR水，10微升10x反应缓冲液，14微升dNTP(每种2.5毫摩尔)，2微升phi.29DNA聚合酶，用上样枪充分混好后仔细加入到已经退火完成的PCR反应管中，每个PCR反应管终体积为100微升，用加样枪混匀，瞬时离心后启动PCR反应：30℃共18小时，然后65℃共10分钟，最后保持于4℃。
将上述100微升反应物转到1.5毫升离心管中，内含100微升冰上预冷的异丙醇中，垂直翻转3至5次后，DNA絮状物将会呈现出来。15000x g离心2分钟，弃去上清。用500微升70％酒精洗涤DNA，离心弃上清。重复一次酒精洗涤，离心弃上清。最后，15000x g离心1分钟，彻底弃去残余酒精，于室温下干燥DNA沉淀物15分钟。不要过度干燥或用纯酒精脱水，以免DNA难于溶解。
用50微升PCR水或低浓度TE缓冲液(10mM Tris-HCL,pH8.0,0.1mM EDTA)溶解DNA。用Nanodrop、Agilent Bioanalyzer2100测定终产物的产量、质量与纯度。长度超过AgilentBioanalyzer2100的测定范围时，宜采用聚脂糖凝胶电泳法进行电泳，用1kb DNA标准品作为对照。
本发明方法与以往大规模细菌培养、抽提方法相比，过程简单，不需要进行100毫升以上大体积细菌培养、抽提，避免重复繁重的实验操作；该发明方法能进行标准化控制，可进行工业化级大量生产BAC DNA及环状质粒DNA的能力，与柱式抽提试剂盒相比，成本较低。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种提取超长环状DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将转化的细菌初始培养并制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入含有相应抗生素的培养液中，培养至生长平台前期；
(2)将培养液转移至离心管中离心去上清，收集细菌沉淀，细菌沉淀再经过TE缓冲液悬浮、离心，彻底弃去上清；
(3)加入蔗糖TE缓冲液后，加热至98℃，2-3分钟后迅速冷却；
(4)以转速21Kxg离心10分钟后，小心收取上清于新试管内，向新试管内加入预冷的异丙醇和醋酸钠，离心后沉淀出初期DNA收获物，用70％乙醇洗去盐分和杂质后室温晾干。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)转化的细菌为含超长DNA的质粒或BAC克隆大肠杆菌，所述超长DNA的长度为10K bp-70K bp。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超长DNA的长度为50K bp-70K bp。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)培养至平台前期的细菌OD值为每毫升107-109个细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对权利要求1提取的DNA采用滚环扩增法扩增。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述扩增方法具体步骤为：
(1)将提取的DNA加入到含有退火缓冲液的反应体系中，随后加入抗外切随机引物，于PCR仪中95℃加热5分钟后保持于4℃，顺序加入水、酶反应缓冲液、四种核苷及高保真phi29DNA聚合酶，于30℃反应16至18个小时，最后65℃加热反应体系失活聚合酶；
(2)将反应体系转入盛有等体积异丙醇的试管中，轻弹混匀，至DNA絮状物出现后，以转速600Kxg离心，去上清后加入70％乙醇，轻轻混匀并离心、去上清，重复70％乙醇洗去沉淀中的盐分和杂质。
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