CN109880799B - 一种肝性脑病细胞模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，公开了一种肝性脑病细胞模型及其构建方法，大鼠星形胶质细胞、神经元细胞的分离、纯化及细胞培养小室里共培养，加入不同浓度氯化铵后形成肝性脑病细胞模型；解决了目前肝性脑病主要采用动物模型，其成本高，耗费时间长，及过于复杂的体内环境对实验结果易产生偏差；而现有的有关肝性脑病的细胞模型均过于粗糙、简单，不能很好的模拟疾病过程的问题。本发明一种肝性脑病细胞模型的建立，尤其是以星形胶质细胞、神经元细胞共培养及不同浓度高氨为设计对象的模型，对肝性脑病的研究及治疗十分重要。
Description
技术领域
本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，尤其涉及一种肝性脑病细胞模型及其构建方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：肝性脑病模型主要采用各种动物模型，包括外科方法和肝毒性药物法，或两者结合。近来有部分实验将氯化铵加入单一的神经系统细胞用于研究肝性脑病，但涉及的细胞均十分单一，忽略了该疾病重要靶细胞间的相互作用，本发明首次将肝性脑病两种最重要的细胞相结合用于构建肝性脑病细胞模型，首次提出采用不同氨浓度构建不同程度肝性脑病细胞模型。
肝性脑病是由严重肝病或广泛性门-体静脉分流引起的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的综合征，是严重危害人类生命与健康的重大医学问题。迄今肝性脑病的发病机理与病理生理仍未完全阐明，临床上用于预防和治疗肝性脑病的方法非常有限。
氨中毒学说被认为是肝性脑病的主要原因，肝性脑病时，机体内氨生成过多而肝脏对氨的清除能力下降，致使血氨浓度显著升高，高浓度的血氨通过血脑屏障进入脑组织，从而引起脑功能障碍。氨的毒性作用主要有：(1)谷氨酰胺合成消耗大量ATP，干扰脑细胞的能量代谢；(2)致脑内神经递质失衡；(3)影响神经元膜上Na+-K+-ATP酶。因脑内不表达与鸟氨酸循环相关的酶，所以主要依靠谷氨酰胺合成途径清除氨，谷氨酰氨合成酶(glutaminesynthetase，GS)主要存在于星形胶质细胞，因而星形胶质细胞成为氨神经毒性的最主要的靶细胞。而神经元细胞作为脑内最基本的信息传感器细胞其结构功能的维持很大程度上依靠星形胶质细胞支持和指导，且氨能直接干扰神经元细胞膜上Na+-K+-ATP酶。因此以高氨、星形胶质细胞、神经元细胞为主要内容而建立起来的肝性脑病细胞模型对此疾病的研究十分有用。
目前对肝性脑病的研究主要采用动物模型，包括外科法和肝毒性药物法。前者虽时限不长(数日至数周)，但模型死亡率较高，尤其对需进行较长时间干预的实验，常不能顺利进行。而肝毒性药物法造模则需要时间过长(数周至数月)，且由于个体差异，部分模型虽已到达肝衰、肝硬化失代偿期阶段，但仍未能发生肝性脑病，或肝性脑病状态时间过短(数小时即死亡)。所以一方面动物模型成本高，耗费时间长，而细胞模型成本低(数只新生鼠便可满足基本实验所需)，成功率高，总造模时间一般10天左右，细胞可传代，甚至可冻存，便于重复实验及后续的进一步研究。另一方面，如果不进行体外实验，直接进入体内动物实验，虽然能完整地保留系统的各种特征，但是过于复杂的体内环境和大量不可控因素以及动物之间的个体差异等因素将导致相关的实验结果产生偏差，例如处于同一分期肝性脑病的模型，其肝脏在合成、代谢等功能方面却千差万别，必将影响干预措施疗效的评判，这将对研究造成很大的障碍。而细胞模型不可控因素少，更加便于通路水平层面研究肝性脑病。另细胞模型可以选择人源细胞进行实验，这是动物模型无法克服的障碍。但目前对于肝性脑病的细胞模型，仅部分实验简单涉及高氨状态下某一细胞的研究，不能很好模拟肝性脑病脑内实质细胞的状态及作用，因此一种能较完善模拟肝性脑病的细胞模型的建立十分重要。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)目前对肝性脑病的采用动物模型，成本高，耗费时间长。
(2)目前对肝性脑病的体内实验，因直接进入体内动物实验，过于复杂的体内环境和大量不可控因素以及动物之间的个体差异等因素将导致相关的实验结果产生偏差，造成很大的障碍。
(3)目前对肝性脑病的采用细胞模型，过于简单，忽略其重要靶细胞间的相互作用以及机能与结构和形态间的相互关系。
解决上述技术问题的难度：肝性脑病病理生理机制复杂，理想的细胞模型不仅需涉及到高氨对星形胶质细胞的毒性作用(主要)，对神经元细胞的毒性作用(次之)，还需考虑星形胶质细胞和神经元细胞之间的作用。但体外，神经元细胞对氨的敏感浓度和耐受浓度明显低于星形胶质细胞，因此建立一种能客观模拟肝性脑病的细胞模型十分困难。
解决上述技术问题的意义：
解决了神经元细胞对氨的敏感浓度、耐受浓度明显低于星形胶质细胞的问题，也符合实际肝性脑病其清除氨的主要靶细胞为星形胶质细胞。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肝性脑病细胞模型及其构建方法。
本发明是这样实现的，一种肝性脑病细胞模型的构建方法，所述肝性脑病细胞模型的构建方法包括：
步骤一，出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9-12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞；
步骤二，-20℃冷冻麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO2培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞；
步骤三，无菌条件下，密度为1*105/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH4Cl，于37℃，5％CO2培养箱孵育24h；
步骤四，无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1*105/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO2培养箱继续孵育24h-48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系。
进一步，所述步骤一中恒温小床37℃，250r/min。
进一步，所述步骤二中培养细胞的培养基为不含血清的NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺。
进一步，所述步骤三中NH4Cl浓度为1-10mM不等，随浓度加大代表模型肝性脑病程度加剧，以模拟不同程度的肝性脑病。
进一步，所述步骤四中将神经元细胞与处于高氨状态的星形胶质细胞培养小室共培养。
本发明的另一目的在于提供一种由所述肝性脑病细胞模型的构建方法构建的肝性脑病细胞模型。
本发明的另一目的在于提供一种所述肝性脑病细胞模型包含星形胶质细胞、神经元细胞及不同浓度高氨。
本发明的另一目的在于提供一种所述肝性脑病细胞模型在肝性脑病药物中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明为一种肝性脑病细胞模型的建立，不仅考虑到肝性脑病最重要两种细胞间的相互作用以及机能与结构等的相互关系，包含了高氨分别对星形胶质细胞、神经元细胞的毒性作用，星形胶质细胞和神经元细胞之间的作用，而且巧妙的将星形胶质细胞先单独添加氯化铵培养24小时，随后再与神经元细胞共培养，这样解决了神经元细胞对氨的敏感浓度和耐受浓度明显低于星形胶质细胞的问题，也符合实际肝性脑病其清除氨的主要靶细胞为星形胶质细胞。并且本发明运用添加不同浓度的氯化铵模拟不同程度的肝性脑病。所以此发明能较完善模拟肝性脑病体内过程。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肝性脑病细胞模型的构建方法流程图。
图2是星形胶质细胞和神经元细胞免疫荧光鉴定图
其中a是星形胶质细胞GFAP荧光鉴定图，b是神经元细胞MAP2荧光鉴定图
图3是星形胶质细胞图
其中a是造模前，b是造模后(氯化铵浓度5mM)
图4是神经元细胞图
其中a是造模前，b是造模后(氯化铵浓度5mM)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对目前对肝性脑病的采用动物模型，成本高，耗费时间长；而体外实验，直接进入体内动物实验，过于复杂的体内环境和大量不可控因素以及动物之间的个体差异等因素将导致相关的实验结果产生偏差，而现有的有关肝性脑病的细胞模型均过于粗糙、单一，不能很好的模拟脑内实质细胞的状态及作用问题。本发明建立了一种处于不同浓度高氨环境下的星形胶质细胞同神经元细胞培养小室共培养体系，从而模拟肝性脑病。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的肝性脑病细胞模型，首次建立了一种处于不同浓度高氨环境下的星形胶质细胞同神经元细胞共培养体系，其主要技术特征有：氨浓度可调节，从而达到能模拟不同程度的肝性脑病；体内同一浓度的高氨环境下，星形胶质细胞作为主要的靶细胞，其受影响程度远大于神经元细胞。但若体外实验，将两种细胞置于同一浓度氨环境下，神经元细胞的耐受程度远低于星形胶质细胞，所以在体外能成功模拟这一病理过程是此模型的难点。所以将星形胶质细胞先独立置于高氨环境下一段时间(因其可以清除部分氨，故氨浓度会较前下降)，随后再添加神经元细胞，这样能更合理模拟体内高血氨环境细胞的状态。主要应用于肝性脑病体外研究，包括发病机制、干预疗效评价及内在机制等。
如图1所示，本发明实施例提供的肝性脑病细胞模型的构建方法包括以下步骤：
S101：出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9-12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞；
S102：-20℃冷冻麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO2培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞；
S103：无菌条件下，密度为1*105/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH4Cl，于37℃，5％CO2培养箱孵育24h；
S104：无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1*105/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO2培养箱继续孵育24h-48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
以大鼠为例
1.出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9-12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞。
结果如图2a所示：星形胶质细胞GFAP荧光鉴定图；如图3a所示：星形胶质细胞光镜图
2.胎鼠神经元细胞的分离及纯化培养：-20℃冷冻麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO2培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞。
结果如图2b所示：神经元细胞MAP2荧光鉴定图；如图4a所示：神经元细胞光镜图
3.简易肝性脑病模型建立：无菌条件下，密度为1*105/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH4Cl，于37℃，5％CO2培养箱孵育24h。星形胶质细胞增殖变慢，可出现细胞体积变大、变圆，甚至核皱缩，细胞核与胞体的比例缩小，突起变短、断裂、消失等现象。
结果如图3b所示：造模后星形胶质细胞图(氯化铵浓度5mM)
4.共培养体系肝性脑病模型建立：无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1*105/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO2培养箱继续孵育24h-48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系。神经元细胞增殖变慢，可出现不同程度细胞核皱缩、破裂,突起僵硬曲张、断裂、消失，甚至细胞大量凋亡。
结果如图4b所示：造模后神经元细胞图(氯化铵浓度5mM)
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述肝性脑病细胞模型的构建方法包括：
步骤一，出生24小时内的SD大鼠用75％酒精消毒，超净台里取两侧大脑皮层组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入含10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于37℃，5％CO2培养箱孵育24h后换液，后每培养3天换一次液；约9-12d，细胞铺满瓶底后，培养瓶内保持无菌于恒温摇床震荡18h，舍弃脱落细胞悬液后，进行GFAP免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为原代星形胶质细胞；
步骤二，-20℃冷冻麻醉E16-E18母鼠15min后用75％酒精消毒，超净台里取胚胎鼠两侧海马组织，37℃条件下加入0.125％胰蛋白酶消化15min后加入10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，洗涤两次后加NB+B27培养基成初细胞悬液，经200目筛网滤过后接种至多聚赖氨酸包被培养瓶中；于NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基，37℃，5％CO2培养箱孵育，贴壁4h换液，后每培养3天换一次液，每一次换半液，约5d，进行MAP2免疫荧光鉴定，鉴定成功的细胞即为神经元细胞；
步骤三，无菌条件下，密度为1*105/ml的星形胶质细胞接种在带有Transwell培养小室的下层培养板上于含10％胎牛血清DMEM培养基中过夜，后换成NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺培养基加入不同浓度NH4Cl，于37℃，5％CO2培养箱孵育24h；
步骤四，无菌条件下，上述带Transwell培养小室的培养板的微孔膜上接种密度为1*105/ml的神经元细胞，于37℃，5％CO2培养箱继续孵育24h-48h，形成神经元细胞和星形胶质细胞共培养体系；
所述步骤一中恒温小床37℃，250r/min。
2.如权利要求1所述的肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中培养细胞的培养基为不含血清的NB+B27+0.5mmol/L现配谷氨酰胺。
3.如权利要求1所述的肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤三中NH4Cl浓度为1-10mM不等，随浓度加大代表模型肝性脑病程度加剧，以模拟不同程度的肝性脑病。
4.如权利要求1所述的肝性脑病细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤四中将神经元细胞与处于高氨状态的星形胶质细胞培养小室共培养。
5.一种由权利要求1所述肝性脑病细胞模型的构建方法构建的肝性脑病细胞模型。
6.一种如权利要求5所述的肝性脑病细胞模型，其特征在于，所述肝性脑病细胞模型包含星形胶质细胞、神经元细胞及不同浓度高氨。
7.一种如权利要求5所述肝性脑病细胞模型在筛选肝性脑病药物中的应用。
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