CN109879960A

CN109879960A - 黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN109879960A
Application number: CN201910142344.9A
Authority: CN
Inventors: 梁俊; 甘国勇; 覃建友; 黄飞; 冯莉婷; 杨振媚; 蔡艳虹; 黄雪花; 韦炳结; 彭博林
Original assignee: Guangxi Spectrum Detection Technology Co Ltd; Guangxi Thailand Technology Co Ltd; Guangxi Ai Rui Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Guangxi Spectrum Detection Technology Co Ltd; Guangxi Thailand Technology Co Ltd; Guangxi Ai Rui Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-06-14

Abstract

本发明公开了黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，包含下列操作步骤：(1)从感染柑橘黄龙病原体的柑橘总DNA中克隆获得柑橘黄龙病毒的表面抗原基因序列，然后对表面抗原基因序列进行氨基酸预分析；(2)抗原制备；(3)抗原蛋白纯化；(4)抗体的制备。本发明制成黄龙病胶体金多克隆抗体操作简单，方便使用，操作人员对技术要求不高，无需进行特殊培训；制成胶体金检测工序简单，短时间内能得出结果；制成胶体金后所用试剂毒性低，对环境污染小。

Description

黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法。

背景技术

柑橘黄龙病是由一种仅在柑橘韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起的病，早期表现为叶产生1～2条黄梢，而后黄梢越来越多，至病株枯死。而目前未有有效的对黄龙病的防护和控制方法，若发现病株则需尽早对患病植株进行移除处理，因此黄龙病早期检测技术的研发具有重大意义。目前黄龙病的快速诊断与检测方法有6种，分别为田间症状诊断、指示植物鉴别、淀粉-碘反应诊断、高光谱成像无损检测、免疫学检测、分子检测。田间症状诊断主要是通过观察柑橘植株的叶子是否出现斑驳型黄化、红鼻子果实等症状判断柑橘是否患黄龙病，此判断方法准确度不高，易与其他病症混淆；指示植物鉴别即利用嫁接的方法把黄龙病病菌转移到对黄龙病病菌极其敏感的植物检测，此过程所需时间长，不能做到快速和早期检测；淀粉-碘反应诊断则是根据黄龙病致病特点(会引起植株韧皮部组织坏死和筛管堵死导致淀粉代谢异常，叶片大量积累淀粉)，直接观察叶片样品染色反应判断植株是否感染黄龙病病菌，此方法易因健康叶片上有淀粉干扰出现假阳性，灵敏度低；高光谱成像无损检测通过检测叶片表面及内部化学成分的变化诊断，但易造成误判；其他免疫学检测技术通过制备黄龙病病菌抗体，观察抗原抗体反应显色判断植株是否感染，此前的技术因孵育抗体费时，成本高而无法推广；分子检测技术主要为对样品进行核酸检测，利用PCR技术对核酸进行扩增检测，但此技术需要前期DNA模板的制备，费时、对人员技术有要求。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对目前现有免疫学检测技术成本高、操作复杂，不能做到高灵敏度的早期检测、不能做定量分析；分子检测技术需要前期DNA模板的制备，费时、对操作人员有技术要求，DNA提取所用溶剂对人体和环境有毒害的问题，发明一种黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，通过利用抗原抗体特异性结合这一特性检测黄龙病。胶体金——银标记免疫检测法，即用胶体金标记免疫血清或单克隆抗体，以硝酸银作染色剂，将柑桔叶子的叶脉徒手切片作材料，做定性分析，在6小时内完成检测。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，包含下列操作步骤：

(1)从感染柑橘黄龙病原体的柑橘总DNA中克隆获得柑橘黄龙病毒的表面抗原基因序列，然后对表面抗原基因序列进行氨基酸预分析：

(a)序列Blast比对，获得氨基酸信息；

(b)进行跨膜域分析；

(c)信号肽序列分析；

(d)无序序列分析；

(e)抗原性分析；

(f)同源性分析；

(2)抗原制备：根据上述分析得到的抗原序列，设计引物，构建大肠杆菌PET-28a的表达载体，构建完成后，诱导的实现分泌表达，破菌分离上清沉淀，取上清液；

(3)抗原蛋白纯化：首先采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA纯化介质把螯合剂(氮川三乙酸或NTA)共价偶联到琼脂糖介质(4％交联)上，然后再与上清液螯合Ni²⁺进行纯化；螯合剂能够通过四个位点牢固的螯合Ni²⁺从而减少纯化过程中Ni²⁺泄露到蛋白样品中，纯化后的蛋白在金开瑞验证平台，浓度在1mg/ml的情况下，SDS验证纯度在85％以上；

(4)抗体的制备：纯化后的抗原蛋白注射到两只免疫动物体内，加强免疫多次后，检测血清效价，血清效价达到要求后常规提取抗清血，将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗黄龙病抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上黄龙病特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得黄龙病胶体金多克隆抗体；抗血清效价均超过1:50K，与重组抗原WB检测中，在约84KD处有特异性识别，条带单一、信号强烈。

作为优选，步骤(4)中所述的免疫动物为日本大耳兔。

作为优选，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(a)取2g赖氨酸溶于10mL 0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

(b)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

(c)先用50mL 50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL 75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL 100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(d)取现配的150mg NHS-碘乙酸活性酯，边振荡边加入至步骤(3)得到的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温避光反应60min；

(e)去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用100mL 100％丙酮洗1次，当溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/L HCL的50mL 75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/L HCL的50mL 50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

(f)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(g)取1/2体积的活性黄龙病组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基琼脂糖珠填料室温反应过夜；

(h)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明制成黄龙病胶体金多克隆抗体操作简单，方便使用，操作人员对技术要求不高，无需进行特殊培训；制成胶体金检测工序简单，短时间内能得出结果；制成胶体金后所用试剂毒性低，对环境污染小。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(f)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(h)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料，备用。

黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，操作步骤如下：

(a)序列Blast比对，获得氨基酸信息，如SEQ ID NO:1所示，其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(b)进行跨膜域分析；

(c)信号肽序列分析；

(d)无序序列分析；

(e)抗原性分析；

(f)同源性分析；

结果表明：uniport以及软件预测均有1跨膜结构，跨膜区预测为21-41AA，无信号肽序列，亲水性好，抗原性较好，截去跨膜区段，截短表达制备抗原；

(2)抗原制备：根据上述分析得到的抗原序列，设计引物SEQ ID NO:3OMPN5：5′-AGCGGATCCCAATTGAAGATGATAGTTCGCT-3′和SEQ ID NO:4OMPN3：5′-AGCAAGCTTTTACACATAATCGGATACATCAT-3′，构建大肠杆菌PET-28a的表达载体，构建完成后，将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主，挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(含抗生素)中，37℃震荡培养至OD600约0.6，取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度0.5mM)诱导的实现分泌表达，37℃震荡培养3h，分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL 1×loading buffer重悬裂解，SDS-PAGE检测；

2.2蛋白大量表达及破菌检测

A取保存于-20℃的菌种100μL接种于100mL LB液体培养基(含抗生素)中震荡培养过夜；

B取100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃；

C加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，30℃继续震荡培养3-4h；

D8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min；

E超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、时间25-30min；

F16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；

G取上清进行SDS-PAGE检测；

(4)抗体的制备：纯化后的抗原蛋白注射到两只免疫日本大耳兔体内，加强免疫多次后，检测血清效价，血清效价达到要求后常规提取抗清血，将所得抗血清流过上述备用的抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗黄龙病抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上黄龙病特异吸附，依次用10倍填料体积的PBSt、10倍填料体积的1mol/L氯化钠清洗掉杂质后，柱上的特异性黄龙病抗体用1.5％乙酸洗脱，洗掉杂质，即得黄龙病胶体金多克隆抗体；抗血清效价均超过1:50K，与重组抗原WB检测中，在约84KD处有特异性识别，条带单一、信号强烈。

实施例2

黄龙病胶体金多克隆抗体的检测

效价检测

用间接ELISA法对抗体进行检测。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBSt溶液。以阴性OD值不大于0.15，以最大OD值的一半对应的抗体浓度为抗体效价，检测结果见表1。

表1间接ELISA黄龙病胶体金多克隆抗体效价结果

从表1检测结果可以看出，本发明的方法制备的抗黄龙病胶体金多克隆抗体效价较高，达到72ng/mL。

2.2抗体敏感度测定

用间接竞争ELISA法对抗体敏感度进行测定。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，用黄龙病标准品浓度从低到高去竞争酶标孔中的抗体，其OD值与所加入的黄龙病标准品浓度呈负相关。以OD信号抑制率为50％所对应的标准品浓度为敏感度的判断依据，检测数据如表2。

表2间接竞争ELISA检测抗黄龙病抗体敏感度结果

从表2可以看出，本发明的方法制备的抗黄龙病胶体多克隆抗体敏感性很好，达到29.73ng/mL。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西益谱检测技术有限公司，广西泰格瑞科技有限公司

<120> 黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法

<130> 北京中誉威圣知识产权代理有限公司

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 737

<212> PRT

<213> Candidatus Liberibacter spp

<400> 1

Thr Ser Ile Val Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Ala Thr Asn Val Gly

1 5 10 15

Lys Glu Val Ile Leu Ser Arg Ile Pro Val Val Val Gly Gln Ser Ile

20 25 30

Ser Asp Ala Asp Leu Asp His Ala Val Lys Asn Ile Tyr Ala Met Gly

35 40 45

Tyr Phe Ser Asn Val Lys Ile Lys Ile Val Asp Ser Val Leu Ile Ile

50 55 60

Asp Leu Ile Glu Arg Lys Ile Ile Asn His Leu Phe Phe Ser Gly Asn

65 70 75 80

Asn Asn Leu Lys Asp Asp Gln Leu Lys Met Ile Val Arg Ser Arg Ser

85 90 95

Ala Ala Ala Tyr Asp Glu Asp Thr Val Asn Ala Asp Val His Asn Ile

100 105 110

Lys Gln Ala Tyr Ala Ser Ile Gly Tyr Leu Asn Val Met Val Lys Val

115 120 125

Gln His His Ser Ile Ser Pro Thr Thr Leu Asn Ile Thr Tyr Val Ile

130 135 140

Glu Glu Gly Val Lys Ala Lys Ile Asn Thr Ile Arg Phe Val Gly Asn

145 150 155 160

Lys Asn Tyr Ser His Ala Arg Leu Glu Arg Val Ile Ser Ile Arg Thr

165 170 175

Ser Gly Tyr Phe Ser Phe Gly Lys Thr Asp Val Tyr Ser Lys Glu Arg

180 185 190

Met Ser Phe Asp Glu Glu Ala Ile Arg Ala Phe Tyr His Asp Arg Gly

195 200 205

Tyr Ala Ala Val Lys Val Ser Ser Gln Val Leu Phe Asp Lys Gln Lys

210 215 220

Ser Gly Tyr Val Leu Ile Phe Gln Ile Asp Glu Gly Glu Ile Tyr Thr

225 230 235 240

Val Gly Asn Ile Ser Ile Gln Ser Thr Leu Gln Glu Ile Gln Lys Lys

245 250 255

Thr Leu Leu Ser Leu Ile Arg Ile Arg Ser Gly Asn Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Gln Glu Ile Lys Glu Ser Ser Glu Lys Ile Ser Lys Tyr Phe Phe Ser

275 280 285

Gly Glu Arg Pro Phe Val Arg Val Lys Thr Arg Ile Asn Arg Asp Phe

290 295 300

Ala Lys Arg Ile Val Asp Ile Glu Tyr Leu Ile Asp Gln Gly Ser Pro

305 310 315 320

Leu Tyr Val Lys Arg Ile Glu Ile Glu Gly Asn Asp Gln Ser Tyr Asp

325 330 335

Ser Val Ile Arg Arg Glu Leu Glu Leu Ser Glu Gly Asp Pro Ile Asn

340 345 350

Tyr Ser Met Ile Glu Arg Ala Lys Arg Arg Ile Met Ala Thr Gly Tyr

355 360 365

Phe Ser Glu Val Asn Ile Ser Gln Leu Pro Ala Asn Asp Val Ser Asp

370 375 380

Tyr Val Ile Leu Arg Val Ser Val Lys Gln Leu Ser Ala Gly Ser Val

385 390 395 400

Gly Ile Ala Thr Asn Tyr Glu Val Asp Lys Gly Met Gly Val Glu Gly

405 410 415

His Ile Asp Asp Asn Asn Phe Phe Gly Gln Gly Tyr Arg Ala Arg Leu

420 425 430

Ala Ala Gly Phe Gly Arg His Ala Val Gln Asn Tyr Thr Phe Ser Val

435 440 445

Glu Asp Pro Tyr Phe Leu Gly Ser Pro Ile Ser Ala Gly Phe Asp Leu

450 455 460

Gln Lys Thr His Leu Glu Asp Gly Ser Leu Asp Ile Asn Asp Glu Ser

465 470 475 480

Ala Ala Val Arg Met Ile Val Pro Ile Thr Glu Ser Ile Ser Thr Ser

485 490 495

Phe Lys Tyr Asp Leu Arg Phe Leu Gln Tyr Gly Ala Ile Ser Glu Lys

500 505 510

Glu Lys Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Thr Leu Ile Glu His Gly Lys Phe

515 520 525

Ser Ser His Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ile Tyr Asn Thr Leu Asp Asn

530 535 540

Pro Ile Val Pro Arg Lys Gly Met Leu Ile Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr

545 550 555 560

Ala Gly Phe Gly Gly Asp Ser Gln Tyr His Arg Ile Gly Ser Arg Ala

565 570 575

Ser Tyr Phe Tyr Leu Leu Ser Asp Asp Ser Asp Ile Val Gly Ser Leu

580 585 590

Arg Phe Gly Tyr Gly Cys Val Ile Pro Ser Asn Lys Asn Leu Gln Leu

595 600 605

Phe Asp Gln Phe Ser Val Ser Ser Asn Tyr Tyr Leu Arg Gly Phe Ala

610 615 620

Tyr Lys Gly Ile Gly Pro Arg Val Asp Lys Lys Tyr Ala Ile Gly Gly

625 630 635 640

Lys Ile Tyr Ser Ser Ala Ser Ala Ala Val Ser Phe Pro Met Pro Leu

645 650 655

Val Pro Glu Arg Ala Gly Leu Arg Gly Ala Phe Phe Val Asp Ser Ala

660 665 670

Asn Leu Tyr Ala Asn His Val Ala Leu Gly Ala Asp Lys Leu Glu Gly

675 680 685

Asn Asp Ser Phe Trp Arg Val Ser Thr Gly Val Glu Ile Met Trp Asn

690 695 700

Ser Pro Leu Gly Met Met Gly Val Tyr Tyr Gly Ile Pro Leu Arg His

705 710 715 720

Arg Glu Gly Asp Lys Ile Gln Gln Phe Gly Phe Arg Ile Gly Asn Arg

725 730 735

Met

<210> 2

<211> 2214

<212> DNA

<213> Candidatus Liberibacter spp

<400> 2

acatctattg ttcgccggat tgagattcga ggtgccacga atgtaggtaa agaggtaatt 60

ttgtctcgta ttcctgtagt agtaggacaa tctatttctg atgcagattt ggatcatgcc 120

gtgaaaaata tttacgctat gggatatttt tctaatgtaa aaatcaaaat tgtagattct 180

gttcttatta tagatttaat agaaagaaag attatcaatc atcttttttt tagtgggaat 240

aataatctca aagatgatca attgaagatg atagttcgct ctcgatctgc ggctgcatac 300

gatgaagata ccgtcaatgc tgatgtgcat aacatcaagc aagcatacgc atccatagga 360

tatttaaatg tcatggtgaa agtacaacac cattctattt ctccgacaac gcttaatatt 420

acttatgtga ttgaagaagg tgtcaaagca aaaataaata cgattagatt cgtgggtaat 480

aaaaattatt cgcatgctag attagaaaga gttatttcta taagaacatc gggttatttt 540

tcatttggta aaacagatgt ttatagtaaa gaacgaatga gttttgatga agaagctata 600

cgggcgtttt atcatgatag gggttatgct gccgttaaag tgtcttcgca agttttattt 660

gataaacaaa agagtggtta cgttctgatt tttcagattg atgaaggtga aatttataca 720

gtggggaata tttctattca atctacttta caagaaatcc agaagaaaac gttgctttca 780

ttgattcgaa ttcgatctgg taatctctat aacccacagg agattaaaga atctagtgaa 840

aagatttcaa aatatttctt ttctggtgaa aggccttttg ttcgggtaaa gacgagaatt 900

aatcgagatt ttgcaaagag gatagtggat attgagtatc tgattgatca aggttctcct 960

ttatatgtaa agcggataga aattgagggg aatgatcaat cgtatgattc tgtaattcgg 1020

cgtgaacttg aattgagtga gggagatcca attaattatt ccatgattga gcgtgctaag 1080

cgtcgtatca tggccacggg ttatttttct gaagtcaata tttcgcaatt gccagcaaat 1140

gatgtatccg attatgtgat tctgagggtg agcgtaaaac aactgagcgc tggttctgta 1200

ggtatagcta ctaattacga agttgataag ggtatgggcg tagaagggca tattgatgat 1260

aataactttt ttggtcaggg gtatagagct cgtttagcgg cagggtttgg acgtcatgca 1320

gtacaaaact atacttttag tgttgaggat ccatattttt tagggagtcc tatatccgcg 1380

ggttttgatc tccaaaaaac ccatcttgaa gatggctctc ttgacataaa tgatgaatct 1440

gctgctgtac gtatgatagt tcctattact gaaagcatat cgacaagttt taagtatgat 1500

cttaggtttt tacaatatgg tgctatatca gaaaaagaaa agatcccttc gatatataca 1560

acgttaatag aacatggaaa attcagcagc cattctattt cccaaagtat catctataat 1620

acactagata acccaattgt gccacgtaaa ggcatgttga tatcatcttc ttatgattat 1680

gcaggttttg gaggagattc tcaatatcat cggattggat ctcgagcatc gtatttttat 1740

cttctatcag atgattctga tattgtcggt tctttacgat ttggatatgg atgtgtcatt 1800

cctagcaata aaaatttgca attgtttgat cagttctcag tgagttcgaa ttattatctg 1860

aggggatttg catataaggg tataggtccg cgtgtggata agaaatatgc gattggaggt 1920

aagatttatt cgtctgcaag tgcagcagtg agttttccca tgcctcttgt tcctgaaagg 1980

gctggtttgc gtggtgcttt ttttgttgat tctgcgaatc tttatgcaaa tcatgttgct 2040

ctcggtgccg ataagctgga agggaatgat tctttctggc gtgtttctac tggagtagaa 2100

ataatgtgga attctccact cgggatgatg ggtgtctatt atggtatacc attgcgtcac 2160

cgagagggtg ataaaattca gcagtttggt tttcgtatag gtaatcgcat gtag 2214

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造序列(黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法)

<400> 3

agcggatccc aattgaagat gatagttcgc t 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人造序列(黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法)

<400> 4

agcaagcttt tacacataat cggatacatc at 32

Claims

1.黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含下列操作步骤：

(a)序列Blast比对，获得氨基酸信息；

(b)进行跨膜域分析；

(c)信号肽序列分析；

(d)无序序列分析；

(e)抗原性分析；

(f)同源性分析；

(2)抗原制备：根据上述分析得到的抗原序列，设计引物，构建大肠杆菌PET-28a的表达载体，构建完成后，诱导的实现分泌表达，破菌分离上清沉淀，取上清液；,

(3)抗原蛋白纯化：首先采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA纯化介质把螯合剂共价偶联到琼脂糖介质(4％交联)上，然后再与上清液螯合Ni²⁺进行纯化；

(4)抗体的制备：纯化后的抗原蛋白注射到两只免疫动物体内，加强免疫多次后，检测血清效价，血清效价达到要求后常规提取抗清血，将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗黄龙病抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上黄龙病特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得黄龙病胶体金多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的免疫动物为日本大耳兔。

3.根据权利要求1所述的黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(c)先用50mL 50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL 75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(f)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；