CN109874811A - 一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种菊花根腐病的天然抑制剂及其制备方法，属于植物源制剂杀菌领域。它是利用常用中药材艾叶打粉后用乙醇溶液为提取剂，经两次加热醇提、浓缩、冷冻干燥，得到粉末状提取物，稀释适当倍数后进行灌根或者喷施。本发明技术方案可以有效防治菊花的根腐病，具有成本低，安全高效，无农残和无重金属污染的优点，对土壤和生态环境友好，生态环保等特点，给菊花的绿色生态栽培提供了有效途径。

Description

一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于植物源制剂杀菌领域，特别涉及一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂及其制备方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

菊花为我国常用中药和观赏花卉，在全国有着广泛的种植，经济和社会效益显著。菊花种植生产上，根腐病为其主要的田间病害，主要危害菊花根部，造成根部腐烂，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，整株叶片发黄、枯萎，最后全株死亡。菊花根腐病多发生于高温多雨季节，在开花前后，尤其是在雨水较多的年份，会造成菊花植株大面积染病死亡，田间减产，甚至绝收，给菊花种植户带来严重的经济损失。目前，根腐病已成为菊花减产的关键因素，也是制约农户种植积极性、菊花产业良性发展的重要因素。

田间生产上，农户往往使用大量的化学农药加以防治，而发明人发现：长期的使用化学农药，不仅造成土壤和菊花农药残留超标、生态环境破坏，而且没有专门针对菊花这一作物进行登记注册防治根腐病的农药，田间化学农药防治较差。

植物源杀菌剂是利用植物的某些部位或提取其有效成分，以及分离纯化的单体物质加工而成，能够杀死或抑制病原菌的生长，用于植物病害的防治。具有高效、易降解、低毒或无毒、选择性高、不产生抗药性等合成抑菌剂无法比拟的优点，在农业领域有着重要的应用价值。植物源杀菌剂作为生物合理性农药的一个重要组成部分，对提高菊花品质、倡导保护生态环境的生态种植具有重大意义。

艾粉为菊科植物蕲艾(Artemisia argyi Levl.et Van)的叶子艾叶在制绒后所产生的废料，艾灸所采用的艾条均为艾绒制成，而艾粉则未被充分利用。将艾粉制成一种安全有效、生态环保的天然植物源杀菌剂，原料来源广泛、经济实惠，不仅有利于生态环境的保护，而且能变废为宝，充分利用自然资源，实现中药材种植的可持续发展，有利于建成资源节约型社会。

专利CN201410585610.2公布了一种有效成分为咯菌腈和大蒜素，助剂为脂肪醇聚氧乙烯基醚、拉开粉BX、癸酸、硅酸铝镁、乙二醇的悬浮剂来防治菊花根腐病。该组合物能减轻植物病原菌对咯菌腈的潜在抗药性风险，同时又减少了用药量；但是依旧存在潜在抗药性风险以及菊花农药残留等问题。在艾叶提取物的利用方面，未检索到与之相关的发明专利。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供一种绿色环保、杀菌效果好的防治菊花根腐病的天然抑菌剂，同时提供一种工艺简单、操作简便的艾粉提取物制备方法。本申请的艾粉提取物不对致病菌产生抗药性、生产成本低，有望在菊花的农业生产上大面积推广，保证菊花的产量和品质。

本发明研究发现：菊花根腐病病菌的病原类型主要为含茄病镰刀菌、齐整小核菌等真菌，与其他植物的根腐的病原菌存在较大不同。

因此，本发明的目的之一是提供一种杀菌效果好的防治菊花根腐病的天然抑制剂。

本发明的目的之二是提供一种可有效抑制镰刀菌、齐整小核菌等真菌的天然抑制剂。

本发明的目的之三是提供天然抑制剂在高效抑制镰刀菌、齐整小核菌等真菌中的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂，所述天然抑制剂为艾叶的提取物。本申请的艾叶的提取溶液可以为水、乙醇、乙酸乙酯或石油醚。

在一些实施例中，所述天然抑制剂为艾叶的醇提物，采用醇溶液作为艾叶的提取溶液，对镰刀菌、齐整小核菌等真菌的抑制率更高。

由于植物艾的不同部位的提取物的组成不同，不同提取方法获得的提取物组成也不同。因此，本申请经过系统分析和大规模实验摸索发现：在一些实施例中，采用体积浓度为50％的乙醇对艾叶进行提取，获得的有效成分对含茄病镰刀菌、齐整小核菌的抑制效果较好，可达到田间抑制根腐病的使用要求。

本发明研究发现：50％乙醇提取物对含茄病镰刀菌的抑制程度最强，证明艾粉对菊花根腐病的抑制性成分主要为醇溶性部分。

在一些实施例中，所述醇提的具体步骤为：

将艾叶的粉末先在醇溶液中浸泡提取、再超声提取、过滤，收集一次滤液和滤渣；

将滤渣在醇溶液中进行超声提取、过滤，收集二次滤液；

将一次滤液和二次滤液混合，抽滤、浓缩、冻干，即得。

本发明还提供了一种有效防治菊花根腐病的杀菌剂，所述杀菌剂中包括：任一上述的天然抑制剂。

本发明还提供了一种防治齐整小核菌的天然抑制剂，所述天然抑制剂为艾叶的提取物。

在一些实施例中，所述天然抑制剂为艾叶的醇提物。

在一些实施例中，所述醇提的具体步骤为：

将艾叶的粉末先在醇溶液中浸泡提取、再超声提取、过滤，收集一次滤液和滤渣；

将滤渣在醇溶液中进行超声提取、过滤，收集二次滤液；

将一次滤液和二次滤液混合，抽滤、浓缩、冻干，即得。

本发明还提供了一种防治齐整小核菌的杀菌剂，包括：任一上述的天然抑制剂。

本发明还提供了艾叶的醇提物在抑制茄病镰刀菌(F.solani)或齐整小核菌(Sclerotinia rolfsii)中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明在得到上述天然物质以及提取物后，采用田间试验和平板抑菌实验相结合的方法，测试本发明对菊花根腐病的防治效果。田间实验结果表明，提取物溶于水中后喷施，高浓度下对菊花根腐病的抑制率可达100％；在从菊花根腐病病株的根部分离出的真菌中，本发明的提取物对镰刀菌的抑制达67％、对齐整小核菌的抑制率达100％；

(2)本发明的有效成分为天然物质，因此，施用后较易分解为无毒物质，对环境无污染，不易对生态环境造成破坏。

(3)对植物群落生态无较大影响，对于群落中的有益昆虫等生物相对安全，尽量避免菊花的重金属残留，提高菊花药材的品质。

(4)本发明的一种天然物质及其提取物在抗菊花根腐病的实验中，对菊花根腐病的防治效果明显。

(5)本发明的原料为在艾绒加工中产生的废弃物——艾粉，原料来源广泛且价格低廉，制备提取方法简便易行，具有良好的应用前景。且变废为宝，充分利用资源，有利于打造资源节约型社会，适于大面积推广。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是应用实例1的2种致病菌的显微结构；

图2是应用实例1的艾粉提取物对不同真菌的抑制；

图3是应用实例2的艾粉不同提取部位对镰刀菌的抑制；

图4是应用实例3的田间实验发病情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对目前长期的使用化学农药，造成土壤和菊花农药残留超标、生态环境破坏，田间化学农药防治较差的问题。因此，本发明提出一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂及其制备方法，就在是将中药艾叶打粉过筛，将过筛后的艾粉制成提取物后喷施。

上述艾叶打粉，优选的，将当年采收的干燥艾叶，在中草药粉碎机中粉碎，转速5000r/min以上。

上述艾粉过筛，优选的，打粉后过40目筛，剔除筛上叶绒部分，留取叶粉部分。

上述将艾粉制成提取物，其制备方法包括步骤如下：

(1)称取艾粉为原料，将原料和乙醇溶液置于提取容器中；

(2)浸泡提取24小时；

(3)将浸泡液超声提取30min；

(4)将超声后的浸泡液过滤；

(5)将滤渣和乙醇溶液再加入提取容器中超声30min；

(6)将二次浸泡液过滤，滤液与一次滤液合并；

(7)将浸泡液放入抽滤装置中抽滤；

(8)将抽滤液在浓缩设备上减压浓缩得到膏状的艾粉提取物；

(9)将浓缩后的膏状提取物冷冻干燥；

上述步骤(1)中，优选的，原料与乙醇的料液比控制在1:(4-6)；

上述步骤(2)中，优选的，浸泡过程中每隔6小时充分摇匀一次；

上述步骤(3)中，优选的，超声仪的工作功率为240W，温度25℃；

上述步骤(4)中，优选的，浸泡液使用滤药袋过滤；

上述步骤(5)中，优选的，原料与乙醇的料液比控制在1:(2-4)；

上述步骤(7)中，优选的，抽滤过程中使用0.45μm的聚乙二醇滤膜；

上述步骤(8)中，优选的，所述浓缩设备为旋转蒸发仪，减压浓缩时的转速为60-75r/min；制冷温度为-2℃—5℃；加热温度50℃；

上述步骤(9)中，优选的，冷冻干燥-80℃预冷2小时后，压强1pa、温度-110℃冷冻干燥48h；

上述的喷施，优选的，其中灌根浓度、喷施浓度为含药量0.1％-1％。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与详细说明本发明的技术方案。

实施例1：

A.将当年采收的干燥艾叶，在中草药粉碎机中粉碎，转速5000r/min；打粉后过40目筛，剔除筛上叶绒部分，留取叶粉部分，即：艾粉。

B.上述将艾粉制成提取物，步骤如下：

(1)称取艾粉为原料，将原料和乙醇溶液(体积浓度50％)置于提取容器中,原料与乙醇的料液比为1:5；

(2)浸泡提取24小时，浸泡过程中每隔6小时充分摇匀一次；

(3)将浸泡液超声提取30min，超声仪的工作功率为240W，温度25℃；

(4)将超声后的浸泡液过滤，浸泡液使用滤药袋过滤；

(5)将滤渣和乙醇溶液(体积浓度50％)再加入提取容器中超声30min，原料与乙醇的料液比控制在1:3，超声仪的工作功率为240W，温度25℃；

(6)将二次浸泡液过滤，滤液与一次滤液合并；

(7)将浸泡液放入抽滤装置中抽滤，抽滤过程中使用0.45μm的聚乙二醇滤膜；

(8)将抽滤液在浓缩设备上减压浓缩得到膏状的艾粉提取物，浓缩设备为旋转蒸发仪，减压浓缩时的转速为70r/min；制冷温度为3℃；加热温度50℃；

(9)将浓缩后的膏状提取物冷冻干燥，冷冻干燥-80℃预冷2小时后，压强1pa、温度-110℃冷冻干燥48h；

C.采用上述的艾叶提取物对菊花进行灌根或喷施，其中，灌根浓度、喷施浓度为含药量0.1％。

应用实例1：平板抑菌实验

采用菌丝生长速率法对根腐病菊花病株的根部真菌进行测定

首先从湖北省武汉市湖北中医药大学药用植物园实验地取得患根腐病的菊花病株，将病株根部表面洗净消毒后加水轻轻研磨，吸取研磨液于马铃薯培养基上。待不同菌落生长出来后，靠近各真菌菌落边缘挑取菌丝采用划线平板稀释法接种到新培养基上，直至分离出纯菌落，保存备用。共分离得到18种真菌。通过形态鉴定、显微鉴定、DNA测序等手段，鉴定出根腐病菊花病株根部含有茄病镰刀菌(F.solani)和齐整小核菌(Sclerotiniarolfsii)等致病菌，显微鉴定图如图1。

先将上述实施例1中得到的艾粉提取物按照1％的比例配制培养基，并同时配制空白对照培养基。之后用打孔器在从菊花根腐病病株中分离培养的纯菌落上打孔切取菌柄，分别接种于空白对照培养基(CK组)、1％提取物培养基(实验组)；根据真菌的生长速率，选取CK组接近长满培养基时，采用十字交叉法对菌落直径进行测量。实验结果如下表1，真菌抑制情况图如图2。

表1：所述艾粉提取物对菊花根腐病病株根部真菌的抑制

以上结果表明，艾粉提取物对镰刀菌和齐整小核菌的抑制分别达到67％和100％，对一半真菌的抑制率达到60％以上，这表明艾粉提取物对菊花根腐病病株的根部真菌有明显的抑制作用。

应用实例2：艾粉不同提取部位抑菌实验

量取适量艾粉加入锥形瓶中，分别加入500ml水、50％乙醇(体积浓度)、100％乙醇、乙酸乙酯、石油醚，静置过夜后超声半小时，将提取物倒入滤药袋中，充分挤出滤液，将粗滤液抽滤，得一次提取液，继续加入溶剂提取得到二次提取液，合并提取液后置于水浴锅上挥干溶剂，冷冻干燥，得到五种不同溶剂的提取物粉末。取各提取物粉末1g，加1ml乙醇溶解，后置于100ml培养基中，配制出有效含量为1％的培养基，以含有1％乙醇的培养基为空白对照(CK组)，接种镰刀菌。根据镰刀菌的生长速率，选取CK组接近长满培养基时，采用十字交叉法对菌落直径进行测量。实验结果如下表2、图3。

表2：艾粉不同提取部位对镰刀菌的抑制

提取溶剂	抑菌率
		50％乙醇	67.13％
100％乙醇	64.34％
		乙酸乙酯	65.03％
水	46.15％
		石油醚	30.07％

以上结果表明，50％乙醇提取物对镰刀菌的抑制程度最强，100％乙醇提取物和乙酸乙酯提取物也具有较好的抑制作用。证明艾粉对菊花根腐病的抑制性成分主要为醇溶性部分。

应用实例3：田间试验

在田间菊花种植活苗后20天，对田间菊花进行不同处理，将实施例1的提取物溶于水中后喷施，喷施量分别为6g/m²(实验组1)，12g/m²(实验组2)，0g/m²(空白对照CK组)，观察菊花喷施艾粉提取物后与空白组的发病情况，实验结果如表3、图4。

表3：不同种植期菊花喷撒艾粉提取物后的根腐病发病情况

以上结果表明，喷施艾粉提取物对菊花根腐病有明显的防治作用。喷施艾粉后，实验组1菊花根腐病发病率降低17.85％，对根腐病的抑制率达41.7％；实验组2对菊花根腐病的抑制基本达100％，能完全控制和预防菊花根腐病的发生。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种有效防治菊花根腐病的天然抑制剂，其特征在于，所述天然抑制剂为艾叶的提取物。

2.如权利要求1所述的天然抑制剂，其特征在于，所述天然抑制剂为艾叶的醇提物。

3.如权利要求1所述的天然抑制剂，其特征在于，采用体积浓度为50％的乙醇对艾叶进行提取。

4.如权利要求2所述的天然抑制剂，其特征在于，所述醇提的具体步骤为：

将艾叶的粉末先在醇溶液中浸泡提取、再超声提取、过滤，收集一次滤液和滤渣；

将滤渣在醇溶液中进行超声提取、过滤，收集二次滤液；

将一次滤液和二次滤液混合，抽滤、浓缩、冻干，即得。

5.一种有效防治菊花根腐病的杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂中包括：权利要求1-4任一项所述的天然抑制剂。

6.一种防治齐整小核菌的天然抑制剂，其特征在于，所述天然抑制剂为艾叶的提取物。

7.如权利要求6所述的天然抑制剂，其特征在于，所述天然抑制剂为艾叶的醇提物。

8.如权利要求6所述的天然抑制剂，其特征在于，所述醇提的具体步骤为：

将艾叶的粉末先在醇溶液中浸泡提取、再超声提取、过滤，收集一次滤液和滤渣；

将滤渣在醇溶液中进行超声提取、过滤，收集二次滤液；

将一次滤液和二次滤液混合，抽滤、浓缩、冻干，即得。

9.一种防治齐整小核菌的杀菌剂，其特征在于，包括：权利要求6-8任一项所述的天然抑制剂。

10.艾叶的醇提物在抑制茄病镰刀菌(F.solani)或齐整小核菌(Sclerotiniarolfsii)中的应用。