CN109843330A - 用于治疗脓毒症的西司他丁 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脓毒症和脓毒症相关急性肾损伤(SA‑AKI)的治疗。更具体地，本发明涉及西司他丁，其用于治疗哺乳动物对象脓毒症和/或SA‑AKI并降低其相关死亡率的方法。本发明还涉及治疗脓毒症和/或SA‑AKI的方法；和用于本发明方法的药物组合物。

Description

用于治疗脓毒症的西司他丁

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及治疗脓毒症和脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)的新药的研发领域。更具体地，本发明涉及用于治疗哺乳动物对象脓毒症和/或SA-AKI并降低其相关死亡率的方法的西司他丁。本发明还涉及用于治疗脓毒症和/或SA-AKI的方法；和涉及用于本发明方法的药物组合物。

背景技术

脓毒症是针对感染的有害性全身性炎症反应。从脓毒症到严重脓毒症(继发于有记载感染或疑似感染的急性器官功能障碍)和脓毒性休克(不能通过液体复苏逆转的严重脓毒症加低血压)存在严重程度的连续性。脓毒症是世界上主要的发病和死亡原因(AngusDC et al,N Engl J Med.2013；369(21):2063,Jawad I et al,J.Glob.Health,2012；2(1),10404,Fleischmann C et al,Am J Respir Crit Care Med.2016；193(3):259-72)。在美国，脓毒症是第十大致死原因，每年约250,000人死亡，导致显著的经济成本(Angus DCet al,Crit Care Med.2001；29(7):1303-10)。

及时识别脓毒症患者是至关重要的，并且尽早在脓毒症疾病谱(即脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克)上定位有助于确定早期管理目标。任何患有严重脓毒症或脓毒性休克的患者的首要任务是稳定呼吸。接下来，应恢复对外周组织的灌注并进行抗生素给药(拯救脓毒症活动指南2012：http://www.sccm.org/Documents/SSC-Guidelines.pdf)。

在严重脓毒症和/或脓毒性休克的情况下，已经证明延迟抗生素给药明显与死亡率增加相关。因此，严重脓毒症和脓毒性休克国际管理指南确定以在确认的第一个小时内进行有效的静脉注射抗生素给药作为治疗目标，并进一步推荐用一种或多种药物进行初步经验性抗感染治疗，所述一种或多种药物对所有可能的病原体(细菌和/或真菌和/或病毒)具有活性，并且以足够的浓度渗透到被推测是脓毒症来源的组织中(拯救脓毒症活动指南2012，Tupchong et al.African Journal of Emergency Medicine 2015,5,127-13)。

目前的脓毒的治疗着重于抗生素以及根除感染源、支持血压、器官血流和通气，这种治疗已经显示在降低与脓毒症相关的死亡率上不是非常有效，如上所述，死亡率仍然非常高。因此，迫切需要开发创新且有效的用于治疗脓毒症的疗法。

脓毒症反应通常以微生物感染开始。通过Toll样受体(TLRs)识别微生物成分(例如脂多糖(LPS)、肽聚糖、脂磷壁酸和未甲基化的CpG DNA)(Takeuchi and Akira,2001)，导致快速激活固有免疫反应并释放各种体液介质，包括糖皮质激素、儿茶酚胺和近端促炎细胞因子(例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)和IL-6)。这种促炎状态已被定义为全身性炎症反应综合征(SIRS)。

内皮细胞变化和促凝血状态的诱导涉及促炎性细胞因子的过度产生和更多远端介质(例如一氧化氮、血小板活化因子和前列腺素)的诱导，导致低血压、器官灌注不足和与多器官功能障碍综合征(MODS)相关的坏死性细胞死亡。然而，大多数患者在最初的SIRS事件中存活，并且最终促炎状态消退。之后，患者经常进入最近被称为代偿性抗炎反应综合征(CARS)的免疫状态(参见图1和Oberholzer et al.2001；FASEB J.15(6):879-92)。

多器官功能障碍综合征(MODS)已被确定为脓毒症最致命的并发症之一。多年来已经开发出许多靶向全身性炎症反应的各种步骤的药剂，但是这些药剂中的大多数在临床试验中显示出很少效果或没有效果(Zarjou et al.,2011,J Am Soc Nephrol 22:999–1006；Swaminathan S.,et al.Seminars in nephrology 2015,35(1):38-54)。

事实上，只有一种治疗药剂即活化型drotrecogin alfa(也称为重组人活化蛋白C)显示改善严重脓毒症和脓毒性休克患者的生存率(Zarjou et al.,2011,J Am SocNephrol 22:999–1006)。在2002年，欧盟授权在特殊情况下将含有活化型drotrecoginalfa作为活性成分的Xigris^TM用于除最佳标准护理以外的多器官衰竭的成年患者的严重脓毒症的治疗。2011年10月25日，在一项重大研究显示对脓毒症的治疗无效后，Eli Lilly&Co.将Xigris撤出市场(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Press_release/2011/10/WC500116970.pdf)。

在多器官功能衰竭的背景下，急性肾损伤(AKI)被报告为严重脓毒症患者特别严重的并发症，这是危重病人主要的死亡原因(Emlet DR et al,Semin Nephrol.2015；35(1):85-95,Zarbock A et al,Curr Opin Crit Care.2014；20(6):588-95,Schrier RW etal,N Engl J Med.2004；351(2):159-69)，具有50％至80％的高死亡率。据称有AKI的脓毒症患者的死亡率为约75％，而没有AKI的严重脓毒症患者的死亡率范围在27％至32％之间(Hoste EA et al,Crit Care.2006；10(3):R73)。

脓毒性AKI(SA-AKI)已经被描述为不同于没有脓毒症的AKI。值得注意的是，据报道，SA-AKI由许多特征性病理生理机制推动，具有独特的时间特征(起始、持续时间)，并且与非脓毒性AKI相比，与不同的短期和长期结果相关联(Alobaidi et al.,Seminars innephrology2015,35(1),2-11；Zarjou et al.,2011,J Am Soc Nephrol 22:999–1006)。脓毒症中的AKI的病理生理学是复杂且多因素的。它包括肾内血液动力学改变、内皮功能障碍、肾实质炎症细胞浸润、肾小球内血栓形成、以及坏死细胞和碎片阻塞小管，见图1(Zarjou et al.,2011,J Am Soc Nephrol 22:999–1006；Wan et al.,Crit Care Med2008,36:S198–S203)。

此外，已有关于与非脓毒性AKI相比，SA-AKI与疾病的更急性进展和严重性以及预后较差并且死亡率增加相关的描述(Alobaidi et al.,Seminars in nephrology 2015,35(1),2-11；and Godin et al.,Seminars in nephrology 2015,35(1),12-22；Bagshaw etal.Crit.Care 2008,12:R47；White et al.J Trauma Acute Care Surg.2013,75:432-8)。

Godin等人(Seminars in nephrology 2015,35(1),12-22)特别指出这样的事实：在脓毒症患者中，当脓毒症不受控制时，由于损伤机制持续存在，因此肾恢复的可能性极小。即使解决了脓毒症，在临床实践中，肾脏通常是脓毒症引起的多器官衰竭患者最后恢复的器官之一，肾脏恢复的可能性取决于许多因素，例如患者的潜在特征、潜在损伤的严重程度(例如，血液动力学变化、感染严重程度和多器官衰竭)、以及与护理过程(例如肾毒性抗生素和造影剂)相关的医源性损伤。

与此一致的事实是：迄今为止，通过肾病保护药物(例如利尿剂、多巴胺、血管紧张素转换酶抑制剂、半胱天冬酶抑制剂等)获得的结果令人沮丧(Ronco et al.,Clin J AmSoc Nephrol 2008,3:531-544)。

已经提出了几种用于治疗脓毒症和脓毒性AKI的新治疗方法，包括靶向早期炎症、晚期免疫抑制、氧化应激和细胞恢复的分子机制(参见例如Swaminathan S.,etal.Seminars in nephrology 2015,35(1):38-54)。据报道，一些具有全身抗炎作用的新药具有多器官保护作用(包括肝、肺和/或肾)并降低动物脓毒症模型死亡率，例如CKD-712(Park et al.Arch Pharm Res Vol 34,No 3,485-494,2011)和人激肽释放酶结合蛋白(Kallistatin)(Li et al.,Critical Care2015,19:200)。

西司他丁首先被描述为脱氢肽酶I(DHP-1)的竞争性抑制剂，西司他丁阻止肽键的水解和内酰胺环的开环。在西司他丁的存在下，脱氢肽酶I不打开亚胺培南的内酰胺环，阻止亚胺培南的吸收，并增加了亚胺培南的尿排泄，从而降低了亚胺培南在肾小管细胞中的浓度(Clissold,Drugs 1987；33(3):183-241,Birnbaum,Am J Med.1985；78(6A):3-21)。

因此，西司他丁传统上与亚胺培南(β-内酰胺抗生素)组合使用以保护亚胺培南免受DHP-1的影响并延长亚胺培南的抗菌作用。然而，西司他丁内部及其本身并不具有任何抗菌活性。例如，西司他丁在西班牙已作为静脉内给药制剂商业化，商品名为该制剂含有剂量为500mg的亚胺培南/西司他丁(1:1)。已被批准用于治疗成人和1岁及以上儿童的感染，包括：复杂性腹腔内感染；严重肺炎，包括医院和呼吸机相关性肺炎；产时和产后感染；复杂性尿路感染；以及复杂性皮肤和软组织感染。它还被批准用于治疗与任何所述感染关联或被怀疑与任何所述感染关联出现的细菌性败血症患者(http://www.aemps.gob.es/cima/pdfs/es/ft/57329/FT_57329.pdf)。在美国，它由Merck&Co.，Inc以商品名(例如已被批准用于细菌性败血症的药物形式Primaxin IV 250和Primaxin IV 500)出售(http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/050587s065,050630s028lbl.pdf)。最后，Del Valle J等人(Scand J Infect DisSuppl 1987,52:20-5)和Kuo BI等人(Zhonghua Yi Xue Za Zhi(Taipei)2000,63(5):361-7)也报道了亚胺培南/西司他丁在脓毒症治疗中的应用。因此，西司他汀/亚胺培南先前已用于治疗脓毒症。然而，西司他汀/亚胺培南尚未用于治疗脓毒性AKI，实际上在出现肾衰竭迹象时，推荐减少西司他丁/亚胺培南的剂量。最近，Kabbara W.K.等人(Infection andDrug resistance 2015(8),31-38)发表了一项研究，该研究评估在黎巴嫩三级护理医院亚胺培南/西司他丁的使用是否与现有指南和文献一致。

而且，Nagano等人(Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1997,41(10),2278-2281)报道了西司他丁与另一种碳青霉烯抗生素(即二硫代氨基甲酸酯碳青霉烯(BO-3482))组合治疗脓毒症的体内试验。

西司他丁随后被描述为减少除β-内酰胺之外的肾毒性药物的肾损伤(WO 97/37649)。更具体地，发明人已经报道了西司他丁在不降低人体临床环境中常用的肾毒性药物(例如顺铂、环孢菌素A或万古霉素)治疗活性的情况下针对该肾毒性药物的体外和体内的有益效果(Humanes B et al,Kidney International.2012；82(6):652–663,Moreno-Gordaliza E et al,Analytical Chemistry.2011；83(20):7933–7940,Camano S etal.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.2010；334(2):419–429,Pérez M et al,Nephrology Dialysis Transplantation.2004；19(10):2445–2455,Lazaro A et al,Pharmacology,edited by Gallelli L,chapter 18.Rijeka,Croatia:InTech；2012.pp.381–396,Humanes B et al,Biomed Res Int.2015；2015:704382,US2011/0165264)。实际上，在先前的工作中，发明人描述了西司他丁是存在于近端肾小管上皮细胞(PTEC)的刷状缘的胆固醇筏中的DHP-1的抑制剂(Camano S et al.Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics.2010；334(2):419–429)并且报道了在PTEC的刷状缘中西司他丁与DHP-1的结合引起脂筏自由运动的中断，导致外源性凋亡途径关键步骤减少或取消，具有针对肾毒性药剂诱导的凋亡的氧化应激和细胞死亡的保护作用(Humanes B et al,Kidney International.2012；82(6):652–663,Camano S etal.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.2010；334(2):419–429,Humanes B et al,Biomed Res Int.2015；2015:704382)。

发明内容

西司他丁先前已经被描述为通过与位于肾脏的近端肾小管上皮细胞(RPTEC)的刷状缘中的DHP-1结合而获得对药物诱导的肾毒性的保护作用。DHP-I尚未报告在通常在参与以多器官衰竭为特征的严重脓毒症和脓毒性休克的任何其他器官(如肺、心脏或肝脏)中表达(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000015413-DPEP1/tissue)。

目前本发明人惊奇地发现，西司他丁成功治疗SA-AKI并降低脓毒症相关的死亡率，这与已确定的假设相反，该假设即，在没有首先解决肾脏损伤的潜在机制(例如长期低血压、微生物感染和存在的多器官衰竭)的情况下，在脓毒症的复杂病理生理环境中很难获得肾脏恢复。

在这个意义上，本发明人已经证明用西司他丁作为单一药剂进行治疗对由盲肠结扎穿刺模型(CLP)诱导的脓毒症引起的多微生物感染具有显著的保护作用，从而在大鼠中防止致死并改善脓毒症诱导的肾损伤。这通过死亡率降低30％得以证明(图13)。获得的实验数据还显示，先前由脓毒症引起升高的肾功能参数(例如肌酐或血尿素氮水平(BUN))得到改善(图2)，部分恢复了AKI的新型早期生物标志物KIM-1的水平(图3)，并且肾组织中的损伤减少(图4)。此外，西司他丁已显示SA-AKI中出现的肾细胞凋亡减少(图5至7)，肾细胞的抗氧化能力增加(图8)，并且脂质过氧化减少(图9)。另外，西司他丁在治疗脓毒症诱发的炎症中显示出效果。特别是，西司他丁减少了单核细胞/巨噬细胞向肾脏的募集和浸润(图10)，并降低了介导白细胞与血管内皮粘附的VCAM-1和ICAM-1分子的表达(图11)。西司他丁进一步显示出显著降低脓毒症动物促纤维化TGF-β细胞因子的水平(图12)。

这些发现支持西司他丁作为治疗脓毒症和脓毒症诱导的肾损伤的预防剂或治疗剂的用途。特别相关地注意到，通过作为单一疗法给药西司他丁，即没有与抗微生物疗法共同给药来治疗潜在感染，脓毒症诱导的动物模型的死亡率得到显著降低。因此，发明人已将西司他丁鉴定为治疗脓毒症患者的新治疗策略。

本发明的第一方面涉及用于治疗哺乳动物对象脓毒症的预防性或救治性方法的西司他丁，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。

此外，本发明提供了治疗脓毒症的方法，该方法包括将防范或治疗有效量的西司他丁给药至需要这种治疗的对象，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。

进一步提供西司他丁在制备用于预防性或救治性治疗脓毒症的药剂中的用途，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。

在任何上述的具体实施方式中，当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

在第二方面，本发明涉及用于治疗哺乳动物对象脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)的预防性或救治性方法的西司他丁。

此外，本发明提供治疗SA-AKI的方法，该方法包括将防范或治疗有效量的西司他丁给药至需要这种治疗的对象。

进一步提供了西司他丁在制备用于预防性或救治性治疗SA-AKI的药物中的用途。

在第三方面，本发明涉及用于降低哺乳动物受试者的死亡率的治疗方法的西司他丁，哺乳动物受试者患有脓毒症或处于患脓毒症风险中，优选患有脓毒症并患有SA-AKI或处于患SA-AKI风险中。

此外，本发明提供降低哺乳动物受试者的死亡率的方法，所述哺乳动物受试者患有脓毒症或处于患脓毒症风险中，优选患有脓毒症并患有SA-AKI或处于患SA-AKI风险中，所述方法包括将防范或治疗有效量的西司他丁给药至需要这种治疗的受试者。

本发明进一步提供西司他丁在制备用于降低哺乳动物受试者的死亡率的药剂中的用途，所述哺乳动物受试者患有脓毒症或处于患脓毒症风险中，优选患有脓毒症并患有SA-AKI或处于患SA-AKI风险中的。

在任何上述的具体实施方式中，当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含用于根据任何上述方面的治疗方法的西司他丁，并且还包含药学上可接受的载体、添加剂和/或辅料。在具体实施方式中，当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

附图说明

图1.脓毒症临床病程中涉及的关键致病途径也对脓毒性AKI的病理生理学有影响。来自Zarjou et al.,2011,J Am Soc Nephrol 22:999–1006。

图2.西司他丁对脓毒症诱导的大鼠肾毒性的影响。诱导脓毒症后48小时时肾功能参数。(A)血清肌酐(SHAM：0.45±0.01；SHAM+cil：0.46±0.01；脓毒症：0.54±0.04；脓毒症+cil：0.38±0.02)，(B)血尿素氮(SHAM：81±3；SHAM+cil：81±4；脓毒症：106±12；脓毒症+cil：75±7)，(C)肾小球滤过率(SHAM：0.44±0.03；SHAM+cil：0.38±0.06；脓毒症：0.21±0.03；脓毒症+cil：0.45±0.07)，(D)尿蛋白(SHAM：1920±420；1983±226；3316±682；1889±347)。与假手术组相比，脓毒症增加尿液中的血清肌酐、血尿素氮和蛋白质排泄，并降低肾小球滤过率。西司他丁显著改善了所有参数。结果表示为平均值±s.e.m.；n＝每组8至10只动物。与所有组相比，*p<0.035，#p<0.05。Cil＝西司他丁。

图3.西司他丁对肾衰竭生物标志物KIM-1的肾组织水平的影响。KIM-1在肾切片中的定位：(A)假手术，(B)脓毒症，(C)假手术+西司他丁，(D)脓毒症+西司他丁(放大倍数20X)，比例尺＝100μm。西司他丁显著降低由CLP诱导的脓毒症引起的KIM-1的增加；(E)肾细胞KIM-1免疫染色的半定量。(F)肾皮质KIM-1的代表性蛋白质印迹和(G)KIM-1的蛋白质印迹的密度计分析。西司他丁显著降低了由CLP诱导的脓毒症引起的KIM-1的增加。结果表示为平均值±s.e.m.；n＝每组8至10只动物。与所有组相比，*p<0.001。KIM-1(肾损伤分子-1)；Cil，(西司他丁)；a.u.(任意单位)。

图4.组织病理学脓毒症相关的肾损伤。CLP手术诱导脓毒症后第2天的肾病理学(苏木精-伊红染色，放大倍数X20)的代表性图像。A)假手术大鼠，B)假手术+西司他丁，C)脓毒症组，和D)脓毒症+西司他丁。对照组显示肾结构正常；CLP诱导的脓毒症肾脏显示明显的损伤、白细胞浸润(星号)、刷状缘丧失、肾小管扩张和小管内管型形成(箭头)。用西司他丁治疗显著降低了这些变化。E-H)假手术组(E)、假手术+西司他丁(F)、脓毒症组(G)和脓毒症+西司他丁(H)的肾小球细节。在脓毒症组中可观察到较多的肾小球毛细血管充血。西司他丁降低了损害。A至D图像，柱＝100μm；E至H图像，柱＝50μm。I)半定量化肾损伤评分。结果表示为平均值±s.e.m；n＝每组8至10只动物。与所有组相比，*p<0.01。Cil，西司他丁。

图5.西司他丁对脓毒症诱导的半胱天冬酶-3表达的影响。剪切的活性半胱天冬酶3(在肾切片中的定位。A)假手术；B和C)脓毒症组；D)假手术+西司他丁；和E)脓毒症+西司他丁。注意，肾小管中的细胞核是脓毒症动物中半胱天冬酶-3活化的主要部位(放大倍数，X20)。西司他丁显著降低脓毒症诱导的活性半胱天冬酶-3的表达(箭头)。柱100μm。F)剪切的肾脏样品半胱天冬酶-3免疫染色的半定量。G)剪切的肾皮质半胱天冬酶-3的代表性蛋白质印迹。H)剪切的活性半胱天冬酶-3的蛋白质印迹的光密度分析。数据表示为平均值±s.e.m.，n＝每组8至10只动物。与所有其它组相比，*P≤0.005。Cil，西司他丁；a.u.，任意单位。

图6.西司他丁对脓毒症诱导的半胱天冬酶-8表达的影响。A)不同组的肾皮质中FasL的代表性蛋白质印迹。B)FasL的蛋白质印迹的密度计分析。C)不同组的肾皮质中剪切的半胱天冬酶-8的代表性蛋白质印迹。B)剪切的活性半胱天冬酶-8的蛋白质印迹的密度计分析。数据表示为平均值±s.e.m.，n＝每组8至10只动物。与所有其它组相比，*P≤0.005； Cil，西司他丁；a.u.，任意单位。

图7.西司他丁减少脓毒症大鼠肾脏中的肾小管细胞凋亡。A)各组肾脏中TUNEL染色的显微照片。绿色荧光染色指示TUNEL阳性细胞核，蓝色染色(DAPI)代表样品中的所有细胞核(放大倍数20X)。B)TUNEL阳性细胞的定量分析。结果表示为平均值±SEM；n＝每组8至10只动物。与所有其它组相比，*P≤0.05。

图8.西司他丁降低脓毒症诱导的氧化应激，从而强化抗氧化防御。Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)在肾脏切片中的定位。A)假手术；B脓毒症组；C)假手术+西司他丁；和D)脓毒症+西司他丁。西司他丁显著增加先前由脓毒症减少的Cu/Zn SOD的表达(放大倍数，X20)。E)肾脏样品中Cu/Zn SOD免疫染色的半定量。F)不同组肾皮质中Cu/Zn SOD的代表性蛋白质印迹。G)通过特异性ELISA试剂盒测量尿液中的抗氧化能力。脓毒症大鼠的抗氧化能力浓度低于用西司他丁治疗的脓毒症大鼠和对照大鼠。所有结果均表示为平均值±SEM；n＝每组8至10只动物。与所有其它组相比，*P≤0.001，相比Sham组，柱，100微米。

图9.西司他丁减少脓毒症诱导的脂质过氧化。4-HNE在A)假手术，B)脓毒症组，C)假手术+西司他丁，和D)脓毒症+西司他丁的肾脏切片中的定位。注意与脓毒症+西司他丁和假手术大鼠相比，脓毒症大鼠的肾小管染色增加(放大倍数，X20)。E)肾细胞中4-HNE免疫染色的半定量。所有结果均表示为平均值±SEM；n＝每组8至10只动物。与所有其他组相比，*P<0.0001。柱，100微米。

图10.西司他丁对脓毒症诱导的单核细胞/巨噬细胞过滤的影响。CD68(单核细胞/巨噬细胞)在(A)假大鼠，(B)脓毒症，(C)假手术+西司他丁，和(D)脓毒症+西司他丁的肾脏切片中的定位。注意与脓毒症+西司他丁和假手术大鼠相比，脓毒症大鼠的染色增加(箭头；放大倍数，20X)；柱＝100μm。(E)肾细胞CD68免疫染色的定量。所有结果均表示为平均值±s.e.m.；n＝每组8至10只动物。与所有组相比，*p<0.001。Cil，西司他丁。

图11.脓毒症和西司他丁在肾ICAM-1和VCAM-1中的影响。A)对肾脏切片VCAM-1和ICAM-1分别定位。注意与脓毒症+西司他丁和对照组相比，脓毒症大鼠中对两种分子的肾脏染色增加(放大倍数，20X)。B和C)分别对肾细胞中VCAM-1和ICAM-1免疫染色进行半定量化。所有结果均表示为平均值±s.e.m.；n＝每组8至10只动物。与假手术和假手术+西司他丁组相比，*p≤0.01；与脓毒症组相比，与所有其他组相比，Cil，西司他丁。

图12.西司他丁对脓毒症诱导的TGFβ增加的影响。A)TGFβ和纤维化(通过用天狼星红染色)在肾切片中分别定位。注意与脓毒症+西司他丁和假手术大鼠(放大倍数，20X)相比，脓毒症大鼠(箭头)中肾小管TGFβ染色增加；柱＝100μm。所有组中的胶原纤维相似(放大倍数，10X，柱，100微米)。B和C)分别在肾细胞中TGFβ和天狼星红免疫染色的半定量。所有结果均表示为平均值±s.e.m.；n＝每组8至10只动物。与所有组相比，*p<0.05。Cil，西司他丁。

图13.盲肠结扎和穿刺(CLP)后的大鼠死亡率。西司他丁治疗改善了经受CLP诱导的脓毒症的大鼠的存活。在CLP程序后监测死亡率48小时。结果表示为每组中死亡率的百分比：死亡率(％)：脓毒症：83％；脓毒症+cil：50％。每组有6只大鼠。

具体实施方式

定义

本文使用的术语“脓毒症”是指针对感染的有害性全身性炎症反应，正式定义为(可能或有记载地)存在感染以及感染的全身性表现(参见来自“严重脓毒症和脓毒性休克国际管理指南2012”的下表1)。本文使用的术语脓毒症包括其并发症，例如“严重脓毒症”和“脓毒性休克”。

表1.脓毒症的诊断标准

WBC＝白细胞；SBP＝收缩压；MAP＝平均动脉压；INR＝国际标准化比率；aPTT＝活化部分促凝血酶原激酶时间。

儿童群体的脓毒症诊断标准是炎症的症状和体征加上感染，伴随体温过高或过低(直肠温度>38.5°或<35℃)、心动过速(低温患者可能不存在)，以及以下器官功能变化指示的至少一种：精神状态改变、血氧不足、血清乳酸水平升高或跳脉(bounding pulses)。

改编自Levy MM,Fink MP,Marshall JC,et al:2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SISInternational Sepsis Definitions Conference.Grit Care Med 2003；31:1250-1256。

本文使用的术语“严重脓毒症”定义为脓毒症加脓毒症诱导的器官功能障碍或组织灌注不足(参见来自“严重脓毒症和脓毒性休克国际管理指南2012”的下表2)。

表2.严重脓毒症

改编自Levy MM,Fink MP,Marshall JC,et al:2001SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SISInternational Sepsis Definitions Conference.Grit Care Med 2003；31:1250-1256。

脓毒症诱导的低血压定义为在不存在其它低血压的原因的情况下，收缩压(SBP)<90mm Hg或平均动脉压(MAP)<70mm Hg或SBP降低>40mm Hg或在年龄正常值之下低2个标准偏差。脓毒性休克被定义为尽管有足够的液体复苏，但脓毒症引起的低血压持续存在。

脓毒症诱导的组织低灌注定义为感染诱导的低血压、乳酸升高或少尿。

本文使用的术语“脓毒症相关的急性肾损伤”(SA-AKI)或“脓毒性AKI”是指在脓毒症存在下的急性肾损伤(AKI)。

本文使用的术语“治疗”是指防范性和/或救治性治疗。

本文使用的术语“救治性治疗”是指使身体从病理状态或疾病恢复到其正常的健康状态。具体地，除非另有说明，否则包括改善、治愈和/或维持疾病或病症痊愈(即，防止或延迟复发)。病症开始后的治疗旨在减少、缓解、改善或完全消除病症和/或其相关症状，以防止该病症恶化，减缓进展速度，或一旦病症被初步消除则防止该病症再次发生(即防止复发)。应注意，本文使用的该术语不应理解为包括如本文所定义的术语“防范性治疗”。

本文使用的术语“防范性治疗”或“预防性治疗”是指防止病理状态。应注意，本文使用的该术语不应理解为包括如本文所定义的术语“救治性治疗”。

如本文使用的术语“有效量”是指在对疾病、病症或病理状况的预防性或救治性治疗中，对对象(例如人类患者)单次剂量或多次剂量给药时有效的量。

如本文使用的术语“对象”是指哺乳动物对象。优选地，对象选自人、伴侣动物、非家畜或动物园动物。例如，对象可选自人、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、猪、绵羊、马、熊等。在优选的实施方式中，所述哺乳动物对象是人类对象。

在整个说明书中使用的术语“组合”或“组合疗法”旨在包括，将所提及的治疗剂在同一时间或在不同时间以相同或分开的药物制剂给药至患有疾病、病症或病理状况的对象。如果治疗剂在不同时间给药，则应在足够接近的时间内给药，以使增强或协同反应发生。在这种情况下，预期通常在彼此间隔约12至24小时内给药两种治疗剂，更优选地在彼此间隔约6至12小时内给药。然而，在某些情况下，可能希望显著延长治疗的时间段，其中在各次给药之间要经过若干天(2、3、4、5、6或7)至若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)。在其他情况下，可能需要减少给药之间的时间，在几秒或几分钟至几小时内，优选彼此间隔约6小时内，更优选在约1或3小时内，给予两种治疗剂。

本文使用的术语“单一药剂”涉及在时间上与另一种活性成分充分分离以防止发生增强或协同反应的活性成分的使用。更具体地，作为“单一药剂”使用不包括作为“组合疗法”使用。

本文使用的术语“活性成分”是指提供药理学活性的任何组分。

本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指本文所述化合物的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中来原位制备，或者通过使纯化的化合物以其游离碱形式与合适的有机酸或无机酸分别反应并分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘基甲磺酸盐(naphthylate mesylate)、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐(lactobsonate)和月桂基磺酸盐等。这些可包括基于碱金属和碱土金属(例如钠、锂、钾、钙、镁等)的阳离子，以及无毒的铵，季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(参见例如，Berge S.M,et al,"Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.,1977；66:1-19，其并入本文供参考)。

本文使用的术语“前药”是指如本文所述的化合物的无活性的生物可逆性衍生物。通常，这些必须在体内经历酶促和/或化学转化以释放活性母体化合物，然后所述活性母体化合物可在体内引发其所需的药理学作用。前药通常设计用于克服配制、递送和毒性问题。在T.Higuchi and V.Stella,"Pro-drugs as Novel Delivery Systems,"Vol.14of theA.C.S.Symposium Series中，在Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.EdwardB.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中，和在Rautio et al.,Nature Reviews Drug Discovery 2008,7,255-270中提供了对前体药物的深入讨论。

术语“药剂”和“药物”在本文中可互换使用。

详细描述

本发明的第一方面涉及用于治疗哺乳动物对象脓毒症的预防性或救治性方法的西司他丁，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。在优选的实施方式中，本发明涉及西司他丁在救治性治疗脓毒症的方法中的用途。

此外，本发明提供治疗脓毒症的方法，该方法包括将防范或治疗有效量的西司他丁给药至需要这种治疗的对象，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。

进一步提供西司他丁在制备用于预防性或救治性治疗脓毒症的药物中的用途，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是亚胺培南(即西司他丁不与亚胺培南组合给药)。

在任何上述的具体实施方式中，当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

本文使用的术语“西司他丁”是指(Z)-7-[(2R)-2-氨基-3-羟基-3-氧代丙基]硫基-2-{[(1S)-2,2-二甲基环丙烷羰基]氨基}庚-2-烯酸，其具有下式：

西司他丁包括结晶形式和其任何药用盐、溶剂化物或前药。通常，西司他丁以钠盐形式使用。西司他丁和相关的脱氢肽酶-I(DHP-1)抑制剂公开于例如US 4,668,504中，其并入本文供参考。

本文使用的术语“亚胺培南”是指β-内酰胺抗生素(5R,6S)-6-[(1R)-1-羟乙基]-3-({2-[(亚氨基甲基)氨基]乙基}硫代)-7-氧代-1-氮杂双环[3.2.0]庚-2-烯-2-羧酸，其具有下式：

亚胺培南包括结晶形式和其任何药用盐或溶剂化物。通常，亚胺培南已经以亚胺培南一水合物的形式使用。例如，500mg含有与500mg亚胺培南对应的亚胺培南一水合物和与500mg西司他丁对应的西司他丁钠盐。

上文已经描述了被称为“严重脓毒症”和“脓毒性休克”的脓毒症及其并发症。在本发明治疗方法的具体实施方式中，所述对象患有严重脓毒症和/或脓毒性休克或处在患有严重脓毒症和/或脓毒性休克的风险。优选地，所述对象患有严重的脓毒症(例如伴有多器官衰竭的严重脓毒症)和/或脓毒性休克。

无论严重程度如何，所述脓毒症或败血症可具有细菌、真菌和/或病毒起源。此外，败血症可由单一微生物物种或多于一种微生物物种所引起，后者被称为多微生物败血症，例如多微生物菌血症。在优选的实施方式中，所述脓毒症是多微生物败血症。

如上所述，脓毒症的特征是死亡率高，尤其是在脓毒症已经演变成严重脓毒症和/或脓毒症休克的情况下，而在严重脓毒症发展后迅速实施治疗的适宜性已被描述为对于阳性结果是必不可少的。西司他汀已显示在盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症模型中显著降低与脓毒症相关的死亡率(参见实施例3和图13)。

无论脓毒症的严重程度如何(优选在严重脓毒症和/或脓毒性休克的背景下)，在本发明的治疗脓毒症的方法的具体实施方式中，西司他丁能够预防或减少脓毒症引起的死亡。在优选的实施方式中，西司他丁能够在盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症动物模型中预防或减少脓毒症引起的死亡。CLP模型包括盲肠穿孔，从而使粪便物质释放到动物的腹膜腔中，以产生由多微生物感染诱导的加剧的免疫应答。之前，CLP模型被描述为用于研究人脓毒症的优选动物模型。事实上，据报道，该模型比脂多糖单一给药更接近地重现人脓毒症，并且诱导以外周血管阻力降低和心输出量增加为特征的早期高动力期(Ronco et al.,Clin J Am Soc Nephrol 2008,3:531-544；Toscano M.G,et al.,J.Vis.Exp.2011,51,e2860)。

如上所述，发明人已经显示西司他丁在盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症模型中治疗脓毒性AKI的积极作用。特别地，相对于假手术对照大鼠，用赋形剂治疗的脓毒症模型在诱导脓毒症后48小时显示血清肌酐、BUN和尿蛋白水平增加，并且肾小球滤过率降低。相反，西司他丁显示降低肾功能标志物，例如先前因脓毒症升高的肌酐或BUN(图2)，以及在脓毒症患者中水平升高的新的AKI早期生物标志物KIM-1(Tu Y et al,Ren Fail.2014；36(10):1559-63)(图3)。此外，西司他丁显著降低肾组织的组织学损伤(图4)。西司他丁进一步显示出减少凋亡(图5至7)、改善肾细胞抗氧化能力(图8至9)、降低炎症(图10至11)和纤维化(图12)的作用。

在本发明的治疗方法的具体实施方式中，将西司他丁给药至患有脓毒性AKI或处于患脓毒性AKI的风险中的对象。在脓毒症背景下的急性肾损伤(AKI)在本文中称为“脓毒性AKI”或脓毒症相关性AKI(SA-AKI)。在更具体的实施方式中，将西司他丁给药至患有脓毒症或处于患脓毒性AKI风险中的对象。

在优选的实施方式中，西司他丁能够预防或减少脓毒性AKI。在更优选的实施方式中，西司他丁能够在盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症动物模型中防止或减少脓毒性AKI。

本发明还涉及用于治疗哺乳动物对象脓毒症相关急性肾损伤的预防性或救治性方法的西司他丁。优选地，本发明涉及治疗脓毒性AKI的方法，其中所述方法的特征在于降低死亡率。优选的特征和实施方式如本文对本发明的其他方面所定义。

本发明还涉及用于降低患有脓毒症或处于患脓毒症的风险中，优选患有SA-AKI或处于患SA-AKI的风险中的哺乳动物对象的死亡率的方法的西司他丁。优选的特征和实施方式如本文对本发明的其他方面所定义。

本发明涉及对哺乳动物对象的治疗。优选地，所述哺乳动物对象是人类对象。该人类对象可以是成人对象或儿童。儿童群体通常被定义为18岁以下的患者。在具体实施方式中，所述患者为0至15岁，更优选为2至12岁。患有脓毒症的老年患者已被确定为SA-AKI的高风险人群(Alobaidi et al.,Seminars in nephrology 2015,35(1),2-11)。在本发明的治疗方法的具体实施方式中，对象是人类成人，优选大于60岁，更优选大于65岁。

患有其他疾病的脓毒症患者，特别是患有慢性肾病、糖尿病、高血压、心力衰竭、恶性肿瘤和肝病的脓毒症患者，也被描述为对脓毒性AKI的易感性增加(Bagshaw etal.Crit.Care2008,12:R47；Bagshaw et al.,Clin J Am Soc Nephrol.2007；2:431-9)。因此，在本发明的治疗方法的具体实施方式中，将西司他丁给药至患有或已经患过合并症的对象，优选患有或已经患过选自由慢性肾病、糖尿病、高血压、心脏病、癌症和肝病组成的组中的疾病的对象。

脓毒症的主要感染源可能不同。患有脓毒性AKI的风险增加也与主要感染源有关。特别是血流感染、腹部和泌尿生殖脓毒症和感染性心内膜炎与较高的AKI发生概率有关(Godin et al.,Seminars in nephrology 2015,35(1),12-22；Bagshaw et al.,Intensive Care Med.2009；35:871-81)。在本发明的治疗方法的具体实施方式中，脓毒症的特征在于主要感染部位选自由血液、腹腔、泌尿生殖道或心脏组成的组。优选地，所述主要感染部位是腹腔和/或胃肠道。

用于本发明的治疗方法的药物组合物

本发明还提供了用于如本文定义的治疗方法的药物组合物，所述药物组合物包含西司他丁和药学上可接受的辅料。在具体实施方式中，所述药物组合物包含西司他丁作为单一活性成分。

在另一具体实施方式中，所述药物组合物包含西司他汀和另一种药物，所述另一种药物优选是除亚胺培南以外的另一种药物。可以在药物组合物中与西司他丁组合的药物表单没有特别限制。以下提供药物组合的说明性非限制性实例。

在优选的实施方式中，所述其他药物是抗微生物剂，优选是除亚胺培南外的抗微生物剂。所述抗微生物剂可以是或可以不是肾毒性的。

在更优选的实施方式中，所述抗微生物剂(优选除亚胺培南外)是一种肾毒性抗微生物剂，条件是所述肾毒性抗微生物剂不是选自由多粘菌素、β-内酰胺、氨基糖苷、糖肽和多烯组成的组中的肾毒性抗微生物剂。在更优选的实施方式中，所述肾毒性抗微生物剂不是β-内酰胺抗生素。术语“β-内酰胺肾毒性抗微生物剂”和“β-内酰胺抗生素”在本文中可互换使用。

在另一更优选的实施方式中，所述抗微生物剂(优选除亚胺培南外)是一种肾毒性抗微生物剂，条件是所述肾毒性抗微生物剂不是选自由以下组成的组中的肾毒性抗微生物剂：庆大霉素；卡那霉素；妥布霉素；丁胺卡那霉素；奈替米星；杆菌肽；新霉素；甲硝唑；多粘菌素B；多粘菌素E(粘菌素)，甲氧苄氨嘧啶；磺胺异噁唑；磺胺甲噁唑；乌洛托品；万古霉素；大观霉素；氯霉素；两性霉素B，喷他脒，依西酸喷他脒；阿托伐醌；利福平；对氨基水杨酸；异烟肼；卷曲霉素；阿昔洛韦；AZT；3TC；阿糖腺苷；西多福韦；拉米夫定；沙奎那韦和伐昔洛韦。

以下提供组合治疗的其他实施方式。

药学上可接受的辅料包括但不限于载体或稀释剂，例如树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物；粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)；崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐)；和添加剂，例如用于防止吸附到表面的白蛋白或明胶；洗涤剂(例如吐温20、吐温80、普朗尼克F68、胆汁酸盐)；蛋白酶抑制剂；表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)；渗透增强剂；增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)；抗氧化剂(如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基茴香醚)；稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)；增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)；甜味剂(如阿斯巴甜、柠檬酸)；防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)；润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)；流动助剂(例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)；乳化剂(如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)；聚合物涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙姆胺(poioxamines))；涂料和成膜剂(如乙基纤维素，丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯)；用于液体制剂的药学上可接受的载体，例如水性(水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质)或非水性(例如丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)溶液、悬浮液、乳液或油；以及肠胃外赋形剂(例如，用于皮下、静脉内、动脉内或肌肉内注射)，包括但不限于水、油、盐溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖水溶液和其他糖溶液。药学上可接受的辅料还包括用于纳米包封目的的辅料，例如阳离子聚电解质(例如明胶)和阴离子聚电解质(例如阿拉伯树胶)。

在具体实施方式中，所述制剂包含西司他丁和作为缓冲剂的碳酸氢钠或由西司他丁和作为缓冲剂的碳酸氢钠组成。

给药途径

用于本发明的治疗方法的西司他丁通常被配制成与其预期的给药途径相容的药物组合物。完成给药的方法是本领域普通技术人员已知的。这包括，例如，通过肠胃外途径(例如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、心室内、硬膜外或其他)以及口服、舌下、鼻、眼、直肠、透皮或局部注射或输注。还特别考虑了持续释放给药，例如，长效注射或易蚀植入物。特别考虑局部递送，例如，经导管递送至一条或多条动脉(例如肾动脉)或经血管供给感兴趣的局部部位。

在具体实施方式中，西司他丁通过口服、舌下、透皮或肠胃外途径给药。优选地，西司他丁通过肌肉内、腹膜内或血管内(例如通过静脉内途径)给药途径来给药。通过血管内途径给药使用本领域熟知的装置进行，所述装置用于通过插入静脉的针或导管将流体从容器给药到患者的血管系统。该装置可包括针或导管、管道、流量调节器、滴注室、输注管线过滤器、I.V.设置旋塞、流体输送管、套件的部件之间的连接器、用作注射部的具有帽的侧管、以及用于穿透和将管与I.V.袋或其他输注液容器连接的空心钉。

优选地，所述组合物是适于血管内给药的形式。在优选的实施方式中，所述组合物是含水组合物，更优选是稳定的含水组合物。如本文所用，“稳定组合物”可以指其中活性成分在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。

通常，西司他丁，优选作为单一药剂或单一活性成分，在pH范围调节为6.5至8.5的缓冲溶液中配制。合适的稀释剂包括但不限于0.9％氯化钠注射液；葡萄糖注射液5％或10％；5％葡萄糖和0.9％氯化钠注射液；含0.225％或0.45％盐水溶液的5％葡萄糖注射液；含0.15％氯化钾溶液的5％葡萄糖注射液；甘露醇5％和10％。在优选的实施方式中，所述稀释剂是0.9％氯化钠注射液；或5％葡萄糖注射液。

这种组合物的一些实施方式可以通过冻干制剂提供。可以将所述冻干制剂复原并稀释，得到溶液形式的本发明组合物以备血管内注射。作为说明而非限制，根据本发明的冻干制剂的实施方式用如上所述的一定体积的稀释剂复原。优选地，所述冻干制剂以单一剂量(通常250mg或500mg西司他丁)容器而存在。容器内容物可以稀释于5mL至5000mL稀释剂中，优选10mL至1000mL稀释剂中，更优选50mL至500mL稀释剂中，甚至更优选20mL至200mL稀释剂中，最优选约100mL稀释剂中。

如果需要，可以进一步稀释复原的本发明的实施方式。该进一步稀释优选用本文所述的水性稀释剂进行。根据复原溶液中的浓度和稀释溶液的所需浓度来稀释复原溶液。

在具体实施方式中，将冻干制剂(优选250mg或500mg西司他丁)在约10mL的水性稀释剂体积中复原，并进一步稀释至终体积100mL。在另一具体实施方式中，将冻干制剂直接在约100mL的水性稀释剂体积中复原。

通常，配制的西司他丁的浓度为0.5mg/mL至25mg/mL，优选为0.75mg/mL至10mg/mL，最优选为约2.5mg/mL或约5mg/mL。

给药方案和剂量

西司他丁可以单次给药。西司他丁也可以在治疗方法的整个过程中定期给药，例如，一天一次、两次、三次、四次或更多次、隔天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。在具体实施方式中，从诊断出脓毒症或疑似脓毒症直至脓毒症恢复，每天进行西司他丁给药，优选按每天三次或四次进行西司他丁给药。西司他丁也可以连续给药至对象(例如，静脉内或通过从植入物、泵、持续释放制剂等中释放)。

待给药的剂量可取决于多种因素，包括疾病的类型和严重程度和/或对象的特征(例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性)，并且如果需要，待给药的剂量应该根据个人需要和专业判断进行调整。剂量也可以根据例如给药途径、治疗方案、靶位点或实施的其他疗法的因素而变化。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。预防或治疗有效量可包括但不限于约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重，优选约10mg/kg体重至约50mg/kg体重，更优选约20mg/kg体重至约40mg/kg体重的剂量范围。

在具体实施方式中，西司他丁通过肠胃外给药途径(优选静脉内)来给药，剂量为约10mg/kg体重至约50mg/kg体重，优选约20mg/kg体重至约40mg/kg体重，更优选地，对于人类成人，剂量为约22mg/kg体重至约26mg/kg体重，对于人类儿童，剂量为约34mg/kg体重至约38mg/kg体重。

人类成人的优选剂量和给药方案为通过肠胃外途径(优选静脉内)每日用量为1gr至4gr，例如每6小时给予250mg，每6小时或8小时给予500mg，或者每6小时或8小时给予1gr。

西司他丁可以单独给药(作为单一药剂)或与除亚胺培南以外的其他药物组合给药。

用于本发明治疗方法的组合疗法

本发明还涉及用于本发明的治疗方法的西司他丁或包含其的药物组合物，其中与另一种药物，优选与除亚胺培南以外的另一种药物组合进行给药。

西司他丁通常与抗微生物疗法组合使用。其他药物通常用作患有严重脓毒症和/或脓毒性休克的患者的辅助治疗，并且也可用于本发明，例如：i)用于使平均动脉压超过65mmHg的血管加压剂，例如去甲肾上腺素、肾上腺素、血管加压素和/或多巴胺；ii)存在心肌功能障碍或灌注不足的迹象时的离子移变剂，例如多巴酚丁胺；iii)在液体复苏和血管加压剂治疗无法恢复血液动力学稳定的情况下的皮质类固醇，例如氢化可的松(拯救脓毒症活动指南2012)。

在具体实施方式中，西司他丁与本文所述的抗微生物治疗或药物组合给药。如本文使用的术语“抗微生物疗法”是指用于治疗活性感染的药物，例如抗病毒、抗细菌和抗真菌药物。这些是本领域技术人员公知的(参见例如“Gideon Guide to antimicrobialagents”Berger S.,2015Gideon Informatics,Inc.；“Sepsis,new strategies formanagement”,Rello J.and Restrepo M.,2008Springer-Verlag)。

抗生素治疗，优选静脉内治疗，通常开始于获得适当的培养物后的前6小时内或更早(例如，在1小时内)，因为较早地开始抗生素治疗与较低的死亡率相关。抗生素的选择可能很复杂，应考虑患者的病史(例如，最近接受的抗生素)、合并症、临床情况(例如社区或医院获得性的)、革兰氏染色数据和局部耐药模式。可以考虑的其他参数是初始感染的部位和原因、受影响的器官和任何损害的程度(www.nhs.uk/conditions/blood-poisoning/Pages/Treatment.aspx)。

当潜在的病原体或感染源不是随即明确时，通常基于每个患者呈现疾病和局部感染模式，可以使用针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的广谱抗生素覆盖。当在脓毒症患者中凭经验使用时，一旦知道细菌易感性特征，则建议降级为最合适的抗生素治疗(拯救脓毒症活动指南2012)。

用于本发明的治疗方法的组合疗法可包括使用各种类型的抗生素，通常使用至少两种不同类型的抗生素。这包括同时给予的两种或三种抗生素的组合。通常用于治疗脓毒症的抗生素包括氨基糖苷、大环内酯、β-内酰胺(例如青霉素；第一代、第二代、第三代和第四代头孢菌素和碳青霉烯)、糖肽、林可酰胺和/或氟喹诺酮。例如，具有大环内酯、氟喹或氨基糖苷的β-内酰胺剂(例如，第三代或第四代头孢菌素)通常用于广谱覆盖。此外，组合还可包括万古霉素以治疗许多MRSA感染。一些常用的抗生素和抗生素组合是：

·头孢曲松，

·美罗培南，

·头孢他啶，

·头孢噻肟

·头孢吡肟

·哌拉西林和他唑巴坦，

·氨苄青霉素和舒巴坦，

·左氧氟沙星，

·克林霉素。

拯救脓毒症活动指南2012建议了针对患有严重脓毒症的中性粒细胞减少患者(2B级)以及针对带难治性耐多药细菌病原体(例如不动杆菌属(Acinetobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.))的患者(2B级)的经验性组合疗法。对于选定的患有与呼吸衰竭和脓毒性休克相关的严重感染的患者，建议针对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)菌血症(2B级)与超广谱β-内酰胺和氨基糖苷或氟喹诺酮组合进行治疗。同样，对于因菌血症性肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)感染而起的脓毒性休克患者(2B级)，建议更为复杂的β-内酰胺和大环内酯的药物组合。

抗生素治疗通常持续7至10天。在中性粒细胞减少患者中，抗生素治疗通常持续至中性粒细胞减少症已解决或计划的抗生素疗程完成，取其较长者，而在排除感染的非中性粒细胞减少患者中，通常停用抗生素以避免产生抗生素耐药性。

据报道，肾毒性β-内酰胺抗生素可引起急性近端肾小管坏死。使用青霉素时稀有肾毒性，使用头孢菌素时罕见肾毒性，然而使用青霉烯时发病率较高。特别是第一代头孢菌素头孢噻啶和头孢来星；碳青霉烯亚胺培南和帕尼培南被描述为具有肾毒性。实际上，亚胺培南和帕尼培南分别与肾保护性肾转运抑制剂即西司他丁和倍他米隆组合销售(Tune B.,Pediatric Nephrology 1997,11(6),768-772)。西司他丁可以与任何这些药剂组合使用。

在具体实施方式中，西司他丁不与亚胺培南或帕尼培南组合给药。在另一具体实施方式中，西司他丁不与选自由亚胺培南、帕尼培南、头孢噻啶和头孢来星组成的表单中的抗生素组合给药。优选地，西司他丁不与碳青霉烯抗生素和/或第一代头孢菌素组合给药。在更具体的实施方式中，西司他丁不与β-内酰胺肾毒性抗微生物剂组合给药。

在另一具体实施方式中，当西司他丁组合给药时，西司他丁不与β-内酰胺肾毒性抗微生物剂和/或选自选自由以下组成的组中的非β-内酰胺肾毒性抗微生物剂组合给药：庆大霉素；卡那霉素；妥布霉素；丁胺卡那霉素；奈替米星；杆菌肽；新霉素；甲硝唑；多粘菌素B；多粘菌素E(粘菌素)，甲氧苄氨嘧啶；磺胺异噁唑；磺胺甲噁唑；乌洛托品；万古霉素；大观霉素；氯霉素；两性霉素B，喷他脒，依西酸喷他脒；阿托伐醌；利福平；对氨基水杨酸；异烟肼；卷曲霉素；阿昔洛韦；AZT；3TC；阿糖腺苷；西多福韦；拉米夫定；沙奎那韦和伐昔洛韦。

优选地，西司他丁不与选自由β-内酰胺、多粘菌素、氨基糖苷、糖肽、磺胺、硝基咪唑和多烯组成的组中的肾毒性抗微生物剂组合给药。更优选地，西司他丁不与肾毒性抗微生物剂(例如肾毒性抗生素)组合给药。

如本文使用的术语“肾毒性抗微生物剂”是指具有肾毒性副作用的杀死微生物或减缓微生物生长的药物、化学物质或其他物质。抗微生物剂中，有抗菌药物(例如万古霉素、庆大霉素、多粘菌素E)、抗病毒剂(例如膦甲酸钠、阿德福韦和替诺福韦以及双膦酸盐帕米膦酸盐)、抗真菌剂(例如两性霉素B)和抗寄生虫药物(例如磺胺嘧啶)。

在进一步的具体实施方式中，西司他汀与抗微生物剂组合给药，优选与除亚胺培南以外的抗微生物剂组合给药，更优选其中所述抗微生物剂不是肾毒性抗微生物剂。

在另外的进一步的具体实施方式中，西司他丁与肾毒性抗微生物剂组合给药，更优选所述肾毒性抗微生物剂是除亚胺培南以外的肾毒性抗微生物剂。

西司他丁和所述其他药物(优选除亚胺培南以外的另一种药物)可以以相同或分开的药物组合物来给药，并且在同一时间(同时)或在不同时间给药(在所述其他药物之前或之后进行西司他丁给药)。上文提供了关于组合疗法的给药方案的进一步细节。

在具体实施方式中，作为相同或分开的组合物的一部分，西司他丁的给药与所述其他药物的给药同时进行。在另一具体实施方式中，西司他丁的给药与所述其他药物的给药是相继的(在所述其他药物的给药之前或之后)。

预期本说明书中讨论的任何实施方式可以相对于本发明的任何医学用途、药物组合物、治疗方法、制备药剂的方法和组合治疗而实施，反之亦然。应当理解，本文所述的特定实施方式是通过说明而不是对本发明的限制的方式给出的。在不脱离本发明范围的情况下，可以在各种实施方式中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到或能够在常规实验内确定本文所述具体方法的许多等同物。这些等同物被认为是在本发明的范围内，并且由权利要求覆盖。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请均并入本文供参考，其程度如同具体和单独地指明将每个单独的出版物或专利申请并入以供参考。

词语“一/一个(a/an)”的使用可以表示“一个(one)”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。术语“另一个”的使用也可以指一个或多个。除非明确指出仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的，否则权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”。

如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包括/包含(comprising)”(和任何形式的包括/包含，例如“包括/包含(comprise/comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have/has)”)、“包括/包含(including)”(和任何形式的包括/包含，例如“包括/包含(include/includes)”)、“包括/包含(containing)”(和任何形式的包括/包含，例如“包括/包含(contain/contains)”)都是包含性或开放式的，并且不排除其他未提及的元素或方法步骤。术语“包括”还包括并明确地公开术语“由......组成(consistsof)”和“基本上由......组成(consists essentially of)”。如本文使用的，短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，并且不实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。如本文所用，短语“由......组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分，除了例如通常与该要素或限制相关的杂质。

这里使用的术语“或其组合”是指在该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A，B，C或其组合”旨在包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果在特定环境中顺序很重要，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续针对该示例，含有一个或多个项目或术语的重复的组合明确包括，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，除非从上下文中另外明显表明，否则对任何组合中的项目或术语的数量通常没有限制。

如本文所使用的，近似值的措辞，例如但不限于“约/大约/接近(about/around/approximately)”指的是当如此的修饰被理解为不必须是绝对的或完美的，但是如此的修改被认为对于本领域普通技术人员来说足够接近以保证设计的条件存在时的条件。描述可以变化的程度将取决于可以进行多大的改变并且仍然使本领域普通技术人员认识到经修饰的特征仍然具有未经修饰的特征的所需特性和能力。一般情况下，但根据前面的讨论，本文中由近似词如“约”修饰的数值可能与所述值相差±1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％。优选地，术语“约”意指确切地指示值(±0％)。

以下实施例用于说明本发明，不应解释为限制其范围。

实施例

实施例1.材料和方法

药物

结晶西司他丁由ACS Dobfar(意大利米兰)提供，并溶于正常的0.9％盐水(赋形剂)中。

动物

在体重为320-370g的8-9周龄雄性斯普拉格-杜勒大鼠(Charles RiverLaboratories,MA,USA)上进行研究。使动物容纳于受控光线(12小时亮-暗循环)、温度和湿度下，且可随意自由获得食物和水，并隔日在代谢笼中预调节一周。该研究得到了动物实验机构委员会的批准。始终根据皇家法令53/2013和指令2010/63/UE中关于保护用于实验和其他科学目的的动物的适用法律规定并在负责的兽医的直接监督下处理动物。

脓毒症的诱导：盲肠结扎穿刺模型

通过如几篇论文(Li G et al,Clin Exp Pharmacol Physiol.2014；41(7):459-68,Seija M et al,Shock.2012；38(4):403-10)中所述的盲肠结扎穿刺模型(CLP)而发展脓毒症。用氯胺酮(Ketolar50mg/ml)90mg/kg经腹膜内(ip)和地西泮(安定10mg/2mL)5mg/kg经腹膜内麻醉动物。在无菌条件下，进行3cm中线剖腹手术以使盲肠暴露，并将4-0丝线结扎线置于距盲肠尖端0.75cm处。用14号针穿刺一次。将第二根结扎线放置在靠近第一根结扎线并且远离回盲瓣的1.5cm的位置以避免肠梗阻。用16号针在两个结扎线之间的盲肠中进行三次穿刺。轻轻挤压盲肠，直到取出1mm的粪便物质柱。然后使肠返回腹部并分层封闭切口。进行假手术(剖腹术和盲肠暴露，没有任何其他操作)作为对照。在手术结束时，所有大鼠以单一剂量皮下注射生理盐水(50ml/kg体重)复苏，并在手术后立即每12小时用丁丙诺啡(buprex 0.3mg/ml)0.1mg/kg进行镇痛治疗，直到处死当日。

选择CLP诱导的脓毒症的大鼠模型是因为它模拟了人类疾病的许多病理特征和临床过程。CLP诱导的脓毒症增血清肌酐、BUN，并降低肾小球滤过率(Cadirci E et al,ClinExp Immunol.2011；166(3):374-84,Li P et at,Critical Care(2015)19:200)，因此，它已被广泛用于研究防止和治疗脓毒症损伤作用的新药理学方法(Hubbard WJ et al,Shock2005；24(Suppl.1):52–7,Doi K et al,J.Clin.Invest.2009；119:2868–78)。

肾功能监测

使用Dimension RxL自动分析仪(Dade-Behring，Siemens，德国埃施波恩)测量血清肌酐、血尿素氮水平(BUN)、蛋白质和其他参数。使用肌酐清除率计算肾小球滤过率。

肾脏组织病理学研究

对于光学显微镜检查，用苏木精-伊红(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)使石蜡包埋的肾切片(4mm厚)染色。使用先前描述的如下半定量指数(Humanes B et al,KidneyInternational.2012；82(6):652–663)计算肾损伤评分：0，无变化；1，病灶变化涉及25％的样品；2，变化影响>25至50％；3，变化涉及>50％至75％；4，病变影响>75％。通过肾小球损伤(肾小球膜细胞增殖和基质扩张)、肾小管间质损伤(肾小管扩张和/或萎缩)、间质纤维化和炎性细胞浸润的半定量评估的总和来计算损伤评分。两位独立的病理学家以盲法方式对肾脏损伤进行了评分。

免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学(Humanes B et al,Kidney International.2012；82(6):652–663)。使用的一抗是多克隆山羊抗大鼠TIM-1/KIM-1/HAVCR(1:20；R&D系统)；抗剪切的半胱天冬酶-3(Asp175)(1:50；Cell Signaling Technology,Inc.,Beverly,MA)小鼠单克隆抗-4-HNE(1:75；Oxis International Inc.,Foster City,CA)；多克隆兔抗Cu/ZnSOD(1:1000；Assay Designs,Stressgen,Ann Arbor,MI,USA)；单克隆小鼠抗CD68(单核细胞/巨噬细胞,1:125,Abd Serotec,Oxford,UK)；多克隆山羊抗VCAM-1(1:100；Santa CruzBiotechology,Inc.,Beverly,MA,USA)；多克隆兔抗TGFβ1抗体(1:100；Santa CruzBiotechnology)；单克隆小鼠抗ICAM-1(1：100；Santa Cruz)。通过缺少一抗的对照验证抗体的特异性，不产生背景。如前所述(Lazaro A.et al.Antiox Redox Signal.2005；7:1285-1293)，通过图像定量分析来评估抗体标记的表面积。简而言之，根据合适的二元阈值图像与总区域面积的比率计算染色区域的百分比。对于每个样品，通过分析整个样品获得平均染色面积。

蛋白质印迹分析

如前所述进行蛋白质印迹(Humanes B et al,Kidney International.2012；82(6):652–663)。一抗如下：山羊抗肾损伤分子-1(KIM-1)多克隆抗体(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA；稀释度1:2000)，剪切的兔抗半胱天冬酶-3多克隆抗体(Asp175)(Cell Signaling Technology,Inc.,Beverly,MA,稀释度1:1000)；小鼠抗FasL单克隆抗体(Santa Cruz Biotechology,Inc.,Beverly,MA,USA,稀释度1:200)，剪切的兔抗啮齿动物半胱天冬酶-8(Asp387)(Cell Signaling Technology，稀释度1:1000)；兔抗Cu/Zn SOD多克隆抗体(Assay Designs,Stressgen,Ann Arbor,MI,USA,稀释度1:2500)。作为内标，用小鼠单克隆抗β-肌动蛋白(Sigma)对膜再探测，以验证每行中蛋白等量上样。所有信号用Alliance 4.7(Uvitec,Cambridge,UK)可视化，并通过密度计扫描(ImageJ；http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html)进行分析。结果以任意单位(a.u.)表示。

凋亡的原位检测

使用荧光素FragEL DNA片段化检测试剂盒(Calbiochem,San Diego,CA)按照制造商的方案，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记来在石蜡包埋的肾组织切片中检测DNA片段化以作为凋亡指数。用Leica-SP2共聚焦显微镜(Leica Microsystems,Heidelberg,Germany)显现TUNEL阳性细胞。对于每个肾切片，通过对在20X放大倍数下观察的30个非重叠随机视野中的所有阳性凋亡细胞计数，以盲法方式对经历凋亡的细胞进行定量。

尿液抗氧化能力水平

根据制造商的方案(https://www.caymanchem.com/product/709001)，使用市售的抗氧化剂测定试剂盒(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)来测量尿液抗氧化能力水平。与通过测量单个组分获得的抗氧化能力相比，总体抗氧化能力可以提供更相关的生物信息，因为它考虑了血浆和体液中存在的所有抗氧化剂的累积效应。Cayman化学抗氧化剂测定试剂盒测量生物样品的总抗氧化能力。该试验依赖于样品中抗氧化剂抑制高铁肌红蛋白将(2,2'-连氮二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐])氧化成+的能力(Miller,N.J.,Rice-Evans,C.,Davies,M.J.,et al.,Clinical Science 1993,84,407-412；Miller,N.J.,and Rice-Evans,C.Free Radical Research1997,26,195-199)。比较样品中抗氧化剂防止ABTS氧化的能力与Trolox(一种水溶性生育酚类似物)的能力，并定量为摩尔Trolox当量。

天狼星红染色

根据先前所述(Lazaro A.et al.Biomed Res Int.2016；2016:2518626.)，通过用天狼星红(Sigma-Aldrich)染色来测量胶原纤维以作为纤维化的指标。使用以下半定量尺度盲法计算染色评分：0，无；1，染色在0和25％之间；2，染色在25％至50％之间；3，染色在50％和75％之间；4，染色>75％。

统计分析

定量变量总结为平均值±s.e.m.。用列文检验来检验方差的相等性。通过方差分析来分析具有相等方差的正态分布连续变量。如果方差不相等，则进行Kruskal–Wallis检验。对于双侧α值<0.05，差异被认为是统计学显著的。使用SPSS11.5软件包(SPSS,Chicago,IL)进行测试。

实施例2.-西司他丁对脓毒症相关肾损伤的作用

实验设计

将动物随机分成四组(每组n＝10)：

i.假手术组，

ii.CLP组，

iii.假手术组+西司他丁，和

iv.CLP组+西司他丁。

在治疗组中，在诱导脓毒症或假手术后立即以及在24小时时用西司他丁150mg/kg腹膜内注射治疗大鼠。在非处理组中，西司他丁被赋形剂(0.5mL/100g)取代。西司他丁的剂量基于表明西司他丁减少了顺铂诱导的肾毒性的先前经验来选择(Humanes B et al,Kidney International.2012；82(6):652–663,Moreno-Gordaliza E et al,AnalyticalChemistry.2011；83(20):7933–7940)。然后将所有动物置于代谢笼中收集24小时的尿液。

在脓毒症诱导/假手术后48小时，所有大鼠用氯胺酮(10mg/kg)和地西泮(4mg/kg)麻醉并处死。通过将套管插入腹主动脉收集血液样品，并通过Z Serum SepClot Activator管(Greiner bio-one)在4℃下以2000rpm离心15小时来分离血清，然后储存在-80℃下直到使用。用冷盐水灌注肾脏并迅速取出。将肾脏样品在液氮中快速冷冻并保持在-80℃下或在4％多聚甲醛中固定(24小时)并石蜡包埋以用于不同的研究。

结果

脓毒症和西司他丁对经典肾功能指标的影响

与假手术组相比，脓毒症增加血清BUN和肌酐水平，并降低肾小球滤过率(图2)。然而，通过西司他丁在脓毒症动物中完全防止了这些功能障碍。CLP组中蛋白质排泄也增加，但西司他丁显著降低了蛋白质排泄(图2D)。与假手术组相比，单独的西司他丁对这些参数没有影响。

脓毒症和西司他丁对急性肾损伤生物标志物KIM-1的影响

通过免疫组织化学(图3A至E)和蛋白质印迹(图3F至G)测定急性肾损伤生物标志物KIM-1在蛋白质水平上的增加，证实了脓毒症的肾脏效应。西司他丁(脓毒症+cil)将蛋白质部分恢复到对照(SHAM)水平。如图3E和3G所示，相对于未经治疗的脓毒性动物组，KIM-1蛋白水平的降低具有统计学显著性。另一方面，单独的西司他丁(SHAM+cil)对肾KIM-1没有影响。

西司他丁改善了组织病理学脓毒症相关的肾损伤

来自假手术组的肾脏显示正常的肾小球和肾小管组织学(图4A和4E)。相反，脓毒症组的肾脏显示出以轻度白细胞浸润、肾小管细胞肿胀、间质充血和刷状缘丧失以及肾小管管型透明为特征的结构性损伤(图4C)。此外，在脓毒症动物的肾脏中观察到毛细血管充血和肾小球簇状塌陷，鲍曼氏囊增大(图4C和4G)。与假手术组相比，单独的西司他丁对肾脏形态没有影响(图4B和4F)，但在脓毒症组中使用西司他丁可以减少许多肾损伤的症状(图4D和4H)。脓毒症诱导的大鼠的半定量组织学损伤评分显著高于对照组。单独的西司他丁对假手术组的肾脏形态没有影响，但在败血症诱导的大鼠中降低了肾损伤评分(图4I)。

西司他丁减少脓毒症诱导的凋亡

在线粒体和外在凋亡途径中分子水平的表达

与未治疗的肾和仅用西司他丁治疗的肾相比，来自脓毒症组的肾切片显示肾小管中剪切的活性半胱天冬酶-3染色增加(图5)。通过肾皮质的免疫组织化学(图5E和5F)和蛋白质印迹(图5G和5H)评估，西司他丁使升高的半胱天冬酶-3水平显著降低。另一方面，由于脓毒症，肾皮质FasL和剪切的半胱天冬酶-8也显著增加；两者都通过西司他丁治疗而减弱(图6)。

原位检测细胞凋亡

使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定来评估肾脏中的细胞凋亡。与对照组和对照加西司他丁组相比，脓毒症增加了凋亡细胞核的数量(图7A)。西司他丁使TUNEL阳性细胞的数量显著降低(图7A和7B)。

西司他丁对脓毒症诱导的氧化应激的影响

西司他丁强化抗氧化防御

为了评估西司他丁在对抗脓毒症诱导的氧化应激中的作用，我们测量了尿液中的抗氧化能力。与对照组相比，来自脓毒症大鼠的尿液显示出抗氧化能力降低，而这可以通过西司他丁来改善(图8G)。参与这种抗氧化防御的酶中的一种是Cu/Zn SOD。在脓毒症大鼠的肾皮质中Cu/Zn SOD表达降低，而西司他丁能够恢复Cu/Zn SOD的表达，如免疫组织化学和蛋白质印迹所示(图8A至F)。

西司他丁减少脂质过氧化

4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)是脂肪酸氧化的产物。与对照相比，脓毒症使肾脏中的4-HNE染色增强(图9A至C)。这通过西司他丁能完全防止(图9D和9E)。与对照组相比，单独的西司他丁没有改变该变量。

西司他丁对脓毒症诱发的炎症的影响

西司他丁改善肾脏炎性细胞浸润

在免疫组织化学研究中，相比对照组，脓毒症大鼠的肾脏样品观察到更多的单核细胞/巨噬细胞募集(通过用CD68标记所证明)(图10A至C)。与脓毒症组相比，经西司他汀治疗的大鼠具有更少的CD68阳性细胞(图10D和E)。

粘附分子对白细胞粘附到血管内皮的调节是极其重要的。图10显示通过免疫组织化学进行VCAM-1和ICAM-1肾脏染色。与对照组相比，脓毒症增加ICAM-1和VCAM-1的表达。用西司他丁治疗显著减少脓毒症诱导的变化。单独的西司他丁对存在于肾组织的ICAM-1和VCAM-1没有影响(图11)。

西司他丁降低TGFβ的表达

TGFβ是一种促使肾损伤恶化的促纤维化细胞因子。通过免疫组织化学，在脓毒症大鼠的肾组织中观察到比对照组更高水平的TGFβ。西司他丁治疗显著降低脓毒症动物中的TGFβ1水平(图12A和12B)。

另一方面，我们通过天狼星红染色分析了相同动物中纤维化的表现，以及该表现与TGFβ水平的相关性。如图12A和12C所示，尽管在脓毒症动物中存在较高纤维化表达的趋势，但它没有达到统计学显著性。这可以由在手术后48小时处死动物的事实来解释，但是观察到促纤维化机制已经开始。

实施例3.-西司他丁对CLP诱导的脓毒症死亡率的影响

实验设计

进行另一个实验模型以确定48小时脓毒症过程中的死亡率和西司他丁治疗后获得的存活率。脓毒症的诱导与上述相同，区别在于两个结扎线之间的盲肠中的三个穿孔是用14号针进行的，另一个穿孔(在盲肠尖端中)是用16号针进行的。这导致了更具侵袭性的脓毒症模型。

使用总共12只动物，将其随机分成2组，样品大小为每组n＝6只动物。因此，研究组及其治疗方法如下：

-CLP(脓毒症)组：通过CLP手术诱导侵袭性脓毒症并且以与CLP+西司他丁组相同方式和体积给药西司他丁的赋形剂的动物。

-CLP+西司他丁组：通过CLP诱导侵袭性脓毒症，并且在诱导脓毒症后立即以及在24小时时以150mg/kg/体重的剂量进行西司他丁(溶于盐水血清)给药的动物。

在诱导脓毒症后48小时，对两组中存活的动物进行定量。

结果

脓毒症死亡率是一个非常普遍的事实。在脓毒症的侵袭性模型中，6只动物中的5只在CLP手术后48小时死亡。用西司他丁治疗使死亡率降低33％(图13)。

Claims (15)

1.用于治疗哺乳动物对象脓毒症的预防性或救治性方法中的西司他丁，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

2.用于治疗哺乳动物对象脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)的救治性方法中的西司他丁。

3.用于治疗哺乳动物对象SA-AKI的预防性或救治性方法中的西司他丁，条件是当西司他丁与另一种药物组合给药时，所述其他药物不是β-内酰胺抗生素。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述对象患有严重脓毒症和/或脓毒性休克。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述对象是人对象。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁通过口服、舌下、透皮或肠胃外途径给药；优选通过肌肉内、腹膜内或血管内途径给药；更优选通过静脉内途径给药。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁通过肠胃外途径以10mg/kg体重至50mg/kg体重，优选20mg/kg体重至40mg/kg体重的剂量给药，更优选地，对于人类成人，以22mg/kg体重至26mg/kg体重的剂量给药，对于人类儿童，以34mg/kg体重至38mg/kg体重的剂量给药。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁与另一种药物组合给药。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁与抗微生物药物组合给药。

10.根据权利要求9所述的用于治疗方法的西司他丁，前提条件是所述抗微生物药物不是选自由以下组成的组中的肾毒性抗微生物药物：β-内酰胺抗生素，庆大霉素；卡那霉素；妥布霉素；丁胺卡那霉素；奈替米星；杆菌肽；新霉素；甲硝唑；多粘菌素B；多粘菌素E(粘菌素)，甲氧苄氨嘧啶；磺胺异噁唑；磺胺甲噁唑；乌洛托品；万古霉素；大观霉素；氯霉素；两性霉素B，喷他脒，依西酸喷他脒；阿托伐醌；利福平；对氨基水杨酸；异烟肼；卷曲霉素；阿昔洛韦；AZT；3TC；阿糖腺苷；西多福韦；拉米夫定；沙奎那韦和伐昔洛韦。

11.根据权利要求9或10所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述抗微生物药物不是肾毒性抗微生物药物。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁和所述其他药物是相同药物组合物的一部分。

13.根据权利要求8至11中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁和所述其他药物是不同药物组合物的一部分。

14.根据权利要求1至7中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁，其特征在于，所述西司他丁作为单一药剂来给药。

15.一种包含根据权利要求1至14中任一项所述的用于治疗方法的西司他丁的药物组合物，并且所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。