CN109836534B

CN109836534B - 一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法

Info

Publication number: CN109836534B
Application number: CN201910056050.4A
Authority: CN
Inventors: 王杨; 常柏松; 顾准; 刘尚莲; 朱少晖; 周帅康
Original assignee: Suzhou Chien Shiung Institute of Technology
Current assignee: Suzhou Chien Shiung Institute of Technology
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2039-01-22
Also published as: CN109836534A

Abstract

一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，以异丙基丙烯酰胺或乙烯基己内酰胺和羟甲基丙烯酰胺为主要单体，采用回流沉淀聚合，用简单的回流冷凝管代替复杂的蒸馏装置和溶剂收集装置，使得溶剂在体系内回流的同时还增加了磁力搅拌改进分散性，其效率更高，操作更简单，更适用于纳米微球的制备。接着使用五氧化二磷对复合微球进行磷酸酯化，再与Fe²⁺离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的纳米催化微球，反应操作简单，得到的粒子粒径小且均匀，比表面积大，催化活性高。

Description

一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，涉及一种高分子纳米酶制备方法，具体地，涉及一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法。

背景技术

纳米酶是一类具有类似天然酶催化活性的纳米材料，自2007 年以来，迄今已有超过50 种不同纳米酶被发现，并用于生物、医学、农业、环境治理、国防安全等多个领域的研究．近年来，纳米酶的应用研究已从体外检测发展到体内治疗，展示出其对现代生物医学技术的重要影响及广阔的应用潜力。

过氧化氢酶可以将过氧化氢分解为水与氧气，人体内许多重大疾病都与体内氧化还原反应失衡有关，有关学者发现病灶处过氧化氢的含量都比较高，主要是产生了大量的活性氧自由基，这些氧自由基对细胞的杀伤性很大而且很难失活，人体内SOD与过氧化氢酶是细胞对付活性氧的利器，前者将超氧化物还原为过氧化物，后者将过氧化氢还原为水，从而解除氧自由基对细胞的威胁，但是很多情况下当人体机体受损后，无法产生足够的生物酶来解决这些氧自由基，这时我们就需要从外部输入人工酶。人工酶比起生物酶有着产量高，造价低，易获得的优势，在生物医疗方面有着巨大的前景。

传统上制备高分子微球的方法主要有乳液聚合，微乳液聚合，细乳液聚合，悬浮聚合等，不同的方法可以制备尺寸不同的微球。但是传统的制备方法存在许多缺点，比如乳液聚合法和悬浮聚合法方法需要在聚合过程中添加稳定剂或乳化剂来稳定聚合物相，防止产物聚集沉淀,但稳定剂的存在对微球的分离纯化造成了困难，这些稳定剂在人体内还会产生不良反应。为了使产物更加纯净，国外学者开发出了蒸馏沉淀法。产物链增长到一定长度后会不溶于溶剂而单独沉淀出来，这样得到的产物表面纯净，用时较短仅仅需要1 h~2 h并且粒径均匀，但是问题在于只适合用于温敏性单体，很难适用于更常见的亲水单体制备纳米微球，而且装置复杂操作麻烦，反应时还要控制溶剂的蒸出量以确保反应体系的稳定和微球分散性良好。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法。

技术方案：本发明提供了一种利用回流沉淀聚合法制备温度响应性铁基纳米酶的方法，包括以下步骤：

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.0303~0.202 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.113~0.417 g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.022~0.264 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.0044~0.0220 g的偶氮二异丁腈(AIBN)以及10-30 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，进行加热磁力搅拌，搅拌速度200~600 r/min，升温至80~90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物干燥得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入2~4 g的纳米微球，加入20~40 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，每批0.15~0.18 g，每批加料间隔3~5 min；升温到70~80 ℃反应3~4 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入10~30 ml的无水乙醇和0.5~2 g氯化亚铁，超声分散均匀后，进行加热回流磁力搅拌，升温至50~70℃后以200~600 r/min的速度搅拌，恒温反应1~3 h后出料；去除乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续去除乙醇，干燥后得所述铁基过氧化氢纳米酶。

本发明所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，方法合理，以异丙基丙烯酰胺和羟甲基丙烯酰胺为主要单体，采用回流沉淀聚合，用简单的回流冷凝管代替复杂的蒸馏装置和溶剂收集装置，使得溶剂在体系内回流的同时还增加了磁力搅拌改进分散性，其效率更高，操作更简单，更适用于纳米微球的制备。接着使用五氧化二磷对复合纳米微球进行磷酸酯化，再与Fe²⁺离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的纳米催化微球。亚铁基的纳米粒子既可以催化过氧化氢同时还有超顺磁活性，纳米粒子表面的Fe²⁺/Fe³⁺ 之间的转换效率高，铁基过氧化氢纳米酶催化活性高。此外，本发明采用的制备方法为有机相乙腈、并且可以回收利用、乙腈可以完全清洗除掉，更加环保，并且不需要加入表面活性剂，不需要通氮气保护，反应时间只需2 h，反应操作非常简单，得到的粒子粒径小且均匀，比表面积大，催化活性高。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，所述步骤1）中的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)可以使用等物质的量的N-乙烯基己内酰胺(VCL)替换。作为本发明的一种改进，还可以使用N-羟甲基丙烯酰胺和N-乙烯基己内酰胺制备纳米微球，采用N-乙烯基己内酰胺(VCL)为温度敏感单体，相比于(NIPAM)，所得到的纳米微球不仅具有很好的温度响应性，而且具有更好的生物相容性，可用于生物医药方面。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，所述步骤1）中的N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）可以使用等物质的量的N,N'-双(丙稀酰)胱胺(BAC)替换。交联剂使用BAC为交联剂，则制备得到的微球具有还原降解性，因为BAC内部还有二硫键，在还原介质中，二硫键被还原成巯基断裂，因此聚合物发生降解。例如细胞内存在浓度较高的谷胱甘肽，可以将二硫键还原降解，具有更好的生物相容性。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，所述步骤1）中的干燥包括自然干燥、冷冻干燥；所述步骤2）和步骤3）中的干燥为真空干燥。不同步骤采用不同的干燥方式，干燥效果好，干燥效率高。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，步骤2）中分三批加入五氧化二磷。作为本发明的一种优选，分三批加入五氧化二磷即保证了磷酸酯化的效果，即更容易获得双酯，同时也提高了磷酸酯化的工作效率。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，步骤3）中用旋转蒸发仪蒸去乙醇。蒸发效果好，可以有效去除乙醇。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，所述加热采用油浴装置加热。油浴加热传热均匀，传热性能好，性能稳定。

进一步的，上述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，所述溶剂为乙腈。乙腈不仅能够溶解单体、使聚合物成球，而且沸点较低、容易去除，成本低、绿色环保。

上述技术方案可以看出，本发明具有如下有益效果：本发明所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，以异丙基丙烯酰胺或乙烯基己内酰胺和羟甲基丙烯酰胺为主要单体，用回流冷凝管取代传统工艺中复杂的蒸馏装置与溶剂收集装置，使得溶剂在体系内回流，从而切实提高生产效率，简化生产过程，同时还利用磁力搅拌装置来减少体系中产物的沉降，以期获得制备形态可控、尺寸均一、分散性良好的聚合物纳米微球。接着使用五氧化二磷对复合微球进行磷酸酯化，再与Fe²⁺离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的纳米催化微球。同时用各种仪器如扫描电子显微镜(SEM)，傅氏转换红外线光谱分析仪(FT-IR)，动态光散射(DLS)等方法对各步骤产物进行表征，确认制备的纳米酶催化活性高，催化效率佳。

附图说明

图1为本发明实施例中纳米微球的红外图谱；

图2为本发明实施例中制备微球的SEM图；

图3为本发明实施例中纳米微球的温度响应性与微球粒径的关系图；

图4为本发明实施例中反应时间与微球粒径的关系图；

图5为本发明实施例中磷酸酯化纳米微球的红外图谱；

图6为本发明实施例中纳米酶催化效果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

实施例1

一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，包括以下步骤：

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.0303 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.113g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.022 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、0.0044 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及10 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度200 r/min，升温至85 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物自然干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入2 g的纳米微球，加入20 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.15 g，每批加料间隔3 min；升温到75 ℃反应3.5 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入10 ml的无水乙醇和0.5 g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至50℃后以200 r/min的速度搅拌，恒温反应1 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

实施例2

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.202 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.417 g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.264 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、0.0220 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及30 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度600 r/min，升温至90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物冷冻干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入4 g的纳米微球，加入40 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.18 g，每批加料间隔5 min；升温到80 ℃反应4 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入30 ml的无水乙醇和2g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至70℃后以600 r/min的速度搅拌，恒温反应3 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

实施例3

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.1010 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.3396 g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.1321 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、0.0110 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及20 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度300 r/min，升温至90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物冷冻干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入3 g的纳米微球，加入30 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.165 g，每批加料间隔3 min；升温到70 ℃反应4 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入20 ml的无水乙醇和1g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至60℃后以400 r/min的速度搅拌，恒温反应2 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

实施例4

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.0303 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.139 g的N-乙烯基己内酰胺(VCL)、0.037 g的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、0.0044 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及10 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度200 r/min，升温至80 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物自然干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入2 g的纳米微球，加入20 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.15 g，每批加料间隔3 min；升温到70 ℃反应3 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

实施例5

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.202 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.513g的N-乙烯基己内酰胺(VCL)、0.446 g的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、0.0220 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及30 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度600 r/min，升温至90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物自然干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入4 g的纳米微球，加入40 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.18 g，每批加料间隔5 min；升温到80 ℃反应3~4 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

实施例6

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.102 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.157 g的N-乙烯基己内酰胺(VCL)、0.164 g的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、0.00620 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及15 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度500 r/min，升温至88 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物冷冻干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入3 g的纳米微球，加入30 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.16 g，每批加料间隔4 min；升温到75 ℃反应3.5 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入15 ml的无水乙醇和0.8 g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至60℃后以300 r/min的速度搅拌，恒温反应2 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

实施例7

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.0303 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.417 g的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、0.186 g的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、0.0150 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及30 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度200 r/min，升温至90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物自然干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入3 g的纳米微球，加入25 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.17 g，每批加料间隔5 min；升温到75 ℃反应3 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入20 ml的无水乙醇和1g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至70℃后以400 r/min的速度搅拌，恒温反应2 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

实施例8

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.202 g的N-羟甲基丙烯酰胺(NHMA)、0.417 g的N-乙烯基己内酰胺(VCL)、0.022 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、0.0044 g的偶氮二异丁腈（AIBN）以及20 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装油浴装置，打开磁力搅拌，进行加热磁力搅拌，搅拌速度400 r/min，升温至85 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物冷冻干燥，得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

在50 ml的单口烧瓶中加入3 g的纳米微球，加入20 ml的四氢呋喃，超声分散均匀后，装好回流装置，进行加热回流磁力搅拌，转速为600 r/min，加热到50 ℃后分批加入五氧化二磷，本实施例中，选择分三批加五氧化二磷，每批0.18 g，每批加料间隔5 min；升温到70 ℃反应3~4 h后出料，用高速离心机以6000 r/min离心10 min，弃去上清液，真空干燥得磷酸酯化纳米微球；

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

在50 ml的圆底烧瓶里加入1g的磷酸酯化纳米微球，再加入20 ml的无水乙醇和0.5 g氯化亚铁，超声分散均匀后，装好回流加热装置，进行加热回流磁力搅拌，升温至60℃后以500 r/min的速度搅拌，恒温反应3 h后出料；用旋转蒸发仪蒸去乙醇，再用无水乙醇清洗一次后继续用旋转蒸发仪蒸去乙醇，放入真空干燥箱真空干燥后，得所述铁基过氧化氢纳米酶。

其中，实施例3作为本发明的最佳实施方式，如图1-6所示，用扫描电子显微镜(SEM)，傅氏转换红外线光谱分析仪(FT-IR)，动态光散射(DLS)等方法对各步骤产物进行表征。

通过动态光散射（DLS）测试结果如图4，可以看到在出现乳液后的20 min时，纳米微球的粒径大概在150 nm左右，但是纳米微球的粒径随时间而增长，到反应终点2 h后纳米微球粒径已经达到400 nm左右，在反应过程中可以看出纳米微球的粒径比较均一。

如图2所示，纳米微球的SEM图显示了纳米微球的微观结构，纳米微球呈规则球形，粒径均匀，约为300 nm。

此外，所制备的共聚纳米微球具有对温度变化敏感的特性，具体可以表现在不同温度下微球的粒径有所改变。用DLS对不同温度下的微球进行表征，如图3所示，我们可以发现微球从27 ℃开始测试在温度达到33 ℃时粒径最大，随后又开始下降。

如图1所示，在3300 cm^-1位置有个宽峰应该是O-H的伸缩振动峰，应该是NMAM中的羟基；在3000 cm^-1附近有个窄峰，推测是N-H 的伸缩振动峰；这个峰恰好与NIPAM中的酰胺中的氮相对应，在1600 cm^-1附近有个强峰推测是羰基C=O的伸缩振动峰，这个峰又刚刚好与NIPAM中酰胺的羰基相对应，所以综上分析，我们可以确定产物确实是NIPAM-NMAM纳米微球。

如图5所示，将酯化产物的红外表征图与第一步纳米微球的红外表征图相比较，可以发现对于酯化产物原先在3300cm^-1处的O-H振动吸收峰强度比微球的有所减弱，这可以说明微球中的羟基已经被五氧化二磷反应，在1000cm^-1附近又出现新的吸收峰而且吸收峰的强度较强，据分析应该是磷酸酯基中P=O的伸缩振动峰，这说明纳米微球已经成功的和五氧化二磷进行反应。

如图6所示，1，2，3，4，分别代表H₂O₂浓度分别为2，4，6，8 μM时所对应的荧光强度；5，6是指纳米酶样品分别为0.5和1 mg/ml 时所对应的荧光强度；使用荧光光度法测试制备的纳米酶对过氧化氢催化效果进行检测其原理是：苯甲酸有很微弱的荧光，但在Fe²⁺离子的催化以及过氧化氢的氧化下可以发出较强的荧光，在一定范围内荧光强度随过氧化氢浓度上升而增强，据此原理可以用催化荧光法测试络合了二价铁离子的纳米酶对过氧化氢的催化效率。从图6中可以看出：当纳米酶的浓度增大时，荧光强度增大，说明制备出的纳米酶可以有效地催化过氧化氢分解，且催化效率随加入量的提升而上升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）纳米微球的制备：

在50 ml的圆底烧瓶中加入0.0303~0.202 g的N-羟甲基丙烯酰胺、0.113~0.417 g的N-异丙基丙烯酰胺、0.022~0.264 g的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.0044~0.0220 g的偶氮二异丁腈以及10-30 ml的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，进行加热磁力搅拌，搅拌速度200~600 r/min，升温至80~90 ℃开始反应，恒温回流反应2 h结束；将白色乳液倒出，用高速离心机以4000 r/min速度离心10 min，弃去上层溶液，用无水乙醇洗涤沉淀物后再进行超声分散、离心弃去上层溶液，反复3次；沉淀物干燥得所述纳米微球；

2）纳米微球的磷酸酯化：

3）铁基过氧化氢纳米酶的制备：

2.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：所述步骤1）中的N-异丙基丙烯酰胺可以使用等物质的量的N-乙烯基己内酰胺替换。

3.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：所述步骤1）中的N,N-亚甲基双丙烯酰胺可以使用等物质的量的N,N'-双(丙烯酰)胱胺替换。

4.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：所述步骤1）中的干燥包括自然干燥、冷冻干燥；所述步骤2）和步骤3）中的干燥为真空干燥。

5.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：步骤2）中分三批加入五氧化二磷。

6.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：步骤3）中用旋转蒸发仪蒸去乙醇。

7.根据权利要求1所述的利用回流沉淀聚合制备温度响应性铁基纳米酶的方法，其特征在于：所述加热采用油浴装置加热。