CN109833319B - 化合物在防治代谢性疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种化合物在防治代谢性疾病中的应用。所述化合物的结构式如式Ⅰ所示，式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药可用于预防和/或治疗高脂血症、II型糖尿病等代谢性疾病，并能用于抑制SREBP信号通路、抑制基因SREBP的表达、阻止饮食诱导肥胖小鼠体重和脂肪的增加，改善小鼠血液和肝脏中胆固醇和甘油三酯水平并且可以显著提高饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性。本发明化合物通过抑制SREBP基因的活性可显著阻止饮食诱导肥胖小鼠体重和脂肪的增加，改善小鼠血液和肝脏中胆固醇和甘油三酯水平并且提高饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性，其在动物水平的效果要显著优于市售药物洛伐他汀。

Description

化合物在防治代谢性疾病中的应用
技术领域
本发明涉及一种化合物的新用途，具体涉及化合物在防治代谢性疾病中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化、2型糖尿病和肥胖症等代谢性疾病已经成为中国乃至全世界越来越严重的健康难题。已知这些代谢性疾病的发生与高脂血症有着密切的关系。脂质代 谢异常如高胆固醇血症是动脉粥样硬化的病变基础。动脉粥样硬化又是许多心血管疾 病的主要诱因，如冠心病、脑梗死、外周血管病等。血液中脂肪酸和甘油三酯过高是 胰岛素抵抗及2型糖尿病的主要诱因。因此，在代谢性疾病的治疗和预防中都将降脂 作为重要指标。
已知哺乳动物调控胆固醇和脂肪酸合成的关键因子是一类转录因子蛋白甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)(Goldstein,J.L.等(2006)·Protein Sensors FormembraneSterols. Cell 124，35-46)。这一类蛋白质的前体首先在内质网(ER)上合成，前体通过SREBP 切割激活蛋白(SCAP)转运到高尔基体，然后经过两种蛋白酶(Site-1protease(S1P)和 Site-2protease(S2P))酶切，释放其N端的活性结构域，进入细胞核发挥转录因子作用，与靶基因启动子区的SREBP反应元件(SRE)结合，启动下游基因的表达。SREBP蛋白 的剪切成熟严格受细胞内甾醇(胆固醇或氧化型甾醇如25-羟胆固醇)水平的调控。 细胞内甾醇水平过高时，SCAP与内质网上的Insig蛋白结合将SREBP前体滞留在ER， 降低细胞脂质合成基因表达。反之，核内活性形式的SREBP增多，促进细胞脂质合成。 已知哺乳动物细胞有三种不同形式的SREBP：SREBP-1a、-1c和SREBP-2(Horton,J.D. 等(2002)·SREBPs:ActivatorsOf The Complete Program Of Cholesterol And Fatty Acid Synthesis In TheLiver.J.Clin.Invest 109，1125-1131)，它们具有相同的剪切入核调控特 征，其成熟过程均如上所述。三种亚型的区别在于它们靶基因不同，SREBP-1a、-1c 主要调控脂肪酸合成途径的基因的表达，SREBP-2主要调控胆固醇合成途径的基因的 表达以及低密度脂蛋白受体基因表达。肝脏特异性敲除SCAP或者S1P基因的小鼠， 其SREBP剪切成熟过程受到抑制，进而表现为其脂质合成显著下调，血液胆固醇和甘 油三酯水平明显降低。提示SERBP途径特异性抑制剂可作为一种潜在的降血脂物质。 LXR是另一类受甾醇调控的核受体因子，其内源性激动剂主要包括24，25-环氧胆固 醇和25-羟胆固醇(Repa,J.J.等(2000)·The RoleOf Orphan Nuclear Receptors In The Regulation Of CholesterolHomeostasis.Annu.Rev.Cell Dev.Biol.16,459-481)。它能够活 化细胞内包括ABCA1、ABCG5/8及Cyp7al在内的参与胆固醇外排的基因的表达，这 一优点使其具有促进血液脂质水平下降的功能。因此，采用药理学配体活化LXR能够 有效降低血清胆固醇水平起到良好的抗动脉粥样硬化作用。然而另一方面，LXR还具 有激活SREBP-1c的作用，最终将导致脂肪肝引起的肝坏死及高甘油三酯血症(Khultz, J.R.等(2000).Role Of LXRs In ControlOf Lipogenesis.Genes Dev.14,2831-2838)。白桦 酯醇是SREBP途径的特异性抑制剂，它通过与SCAP结合阻断SREBP途径，减少胆 固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂质合成(Tang，J等(2011)Inhibition of SREBP by a small molecule,betulin,improves hyperlipidemiaand insulin resistance and reduces atherosclerotic plaques.Cell Metabolism,13,44-56)。寻找新的高活性的SERBP途径的 特异性抑制剂，使其特异性抑制SERBP-1、SREBP-2活化，同时不激活LXR信号通 路，这将为高脂血症、动脉粥样硬化症和II型糖尿病等代谢性疾病的预防和治疗提供 新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种化合物在防治代谢性疾病中的新用途。
本发明首先提供了式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、 氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药在制备预防和/ 或治疗高脂血症、II型糖尿病等代谢性疾病的产品中的应用；
Figure BDA0001487078810000021
式Ⅰ中，3号碳原子与R1之间为单键或双键，当为单键时，R1选自如下基团中任 一种：
Figure BDA0001487078810000022
式中R为烷基或取代的烷基；
当为双键时，R1选自如下基团中任一种：
Figure BDA0001487078810000023
R2为-OH、-F或-H；
R3选自如下基团中任一种：
Figure BDA0001487078810000031
5号碳原子和6号碳原子之间为单键或双键，或5号碳原子和6号碳原子与氧原 子形成三元环氧结构；
7号碳原子、8号碳原子、9号碳原子和11号碳原子相邻碳原子之间为单键或双 键；
R4和R5选自-OH、羰基、-F和-H；
当8号碳原子和9号碳原子之间为单键时，R6和R7均为-H或-OH，或R6和R7共同与8号碳原子和9号碳原子形成三元环氧结构；
R8为-H或甲基；
22号碳原子和23号碳原子之间为单键或双键，当为单键时存在环氧结构；
R9为取代的烷基、醇、酮、环氧、磷酸或磺酸，具体选自如下基团中任一种：
Figure BDA0001487078810000032
各式中，n均为0～4之间的数；X为-F、-Cl、-Br或-I；
R'和R”均为碳原子数为1～4的烷基。
本发明所涉及的式Ⅰ所示化合物具体为下述35个化合物中任一种：
Figure BDA0001487078810000033
Figure BDA0001487078810000041
Figure BDA0001487078810000051
Figure BDA0001487078810000061
式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、 溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药用于抑制SREBP信号通路。本发明验 证了化合物对SREBP报告基因活性的抑制作用，在Huh-7/SRE-Luc细胞系(通过在 人肝癌细胞系Huh-7细胞中稳定转染表达了2个报告基因)中进行测定，并测定了各 化合物对SREBP通路抑制的IC50值：化合物1G为0.22μM、化合物13A为0.44μM、 化合物12C为0.86μM、化合物14A为0.94μM、化合物13C为1.05μM、化合物14C 为1.11μM、化合物5A为1.23μM、化合物1C为1.72μM、化合物4A为2.07μM、化 合物8A为4.90μM，证明本发明化合物对SREBP报告基因均具有显著的抑制效果。
式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、 溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药能够抑制基因SREBP的表达。本发明 验证了所述化合物对Huh-7细胞中基因SREBP的表达，经荧光实时定量PCR，本发 明化合物1G能显著抑制SREBP靶基因：SREBP-2(NM_004599.35)、HMGCR (NM_000859.2)、HMGCS(NM_001098272.2)和SS(NM_004462)的表达。化合 物1G在1μM时，SREBP-2下调了约40％，HMGCR、HMGCS和SS下调了约80％。 同时试验证明本发明化合物不激活LXR靶基因的表达，对参与脂肪酸合成的 SREBP-1c(NM_001321096.2)、FASN(NM_004104.4)和SCD1(NM_005063)有显 著下调作用。本发明验证了所述化合物对小鼠肝原代细胞中基因SREBP的表达，经荧 光实时定量PCR，本发明化合物1G能显著抑制SREBP靶基因：SREBP-2(AF374267)、 HMGCR(BF464069)、HMGCS(BI143807)和SS(D29016)。化合物1G在1μM时， SREBP-2下调了约40％，HMGCR、HMGCS和SS下调了约50％。同时试验证明本发 明化合物不激活LXR靶基因的表达，对参与脂肪酸合成的SREBP-1c、FASN和SCD1 有显著下调作用。而已知的LXR激活剂TO901317能成倍地激活上述脂肪酸合成相关 的基因，将导致脂肪肝的形成。
式Ⅰ所示化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、 溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药能够阻止饮食诱导肥胖小鼠体重和脂 肪的增加，改善小鼠血液和肝脏中胆固醇和甘油三酯水平并且可以显著提高饮食诱导 肥胖小鼠的胰岛素敏感性。
1、本发明化合物有很强的SREBP基因抑制活性，如化合物1G，其抑制SREBP 基因通路的IC50值为0.22μM。在原代肝细胞中，利用荧光实时定量PCR检测发现1G 对SREBP靶基因有显著的的表达抑制作用，并且不会激活LXR。
2、本发明化合物通过抑制SREBP基因的活性可以显著阻止饮食诱导肥胖小鼠体重和脂肪的增加，改善小鼠血液和肝脏中胆固醇和甘油三酯水平并且提高饮食诱导肥 胖小鼠的胰岛素敏感性，其在动物水平的效果要显著优于市售药物洛伐他汀。
附图说明
图1为利用SRE-Luc/GFP报告基因系统对本发明化合物进行活性分析的示意图，其中，图1(A)为SRE-Luc/GFP双报告基因系统的示意图，图1(B)为本发明化合 物对SREBP通路的抑制活性。
图2为本发明化合物1G抑制SREBP的剪切入核和SREBP靶基因的表达，其中 图2(A)为蛋白质印迹WB检测1G对SREBP蛋白剪切加工的抑制作用，n-SREBP 为剪切加工后的激活形式SREBP，pre-SREBP为全长形式的SREBP，CHC为内参蛋 白；图2(B)为图2(A)中的SREBP条带进行定量分析，并以n-SREBP/pre-SREBP 的比值代表SREBP加工的程度；图2(C)为在Huh7细胞中，利用荧光实时定量PCR 检测分析1G对SREBP靶基因(SREBP-2，HMGCR，HMGCS，SS)表达的抑制作用； 图2(D)为在原代肝细胞中，利用荧光实时定量PCR检测分析1G对SREBP靶基因 表达的抑制作用。
图3为本发明化合物1G不激活LXR靶基因的表达的示意图，其中，图3(A) 为在Huh7细胞中，荧光实时定量PCR分析1G对LXR靶基因(SREBP-1c，ABCA1， ABCG8，FASN，SCD1)表达的影响；图3(B)为在肝原代细胞中，荧光实时定量 PCR分析1G对LXR靶基因表达的影响。
图4为本发明化合物1G显著抑制小鼠高脂高胆固醇饲料诱导的体重和脂肪的增加的示意图，图4(A)为抑制小鼠体重的增加的示意图，图4(B)为抑制小鼠脂肪 体重比的示意图。
图5为本发明化合物1G显著降低高胆固醇高脂肪酸饲养条件下的小鼠血液和肝脏的脂质水平的示意图，其中，图5(A)为血液中总胆固醇(TC)水平的变化示意 图，图5(B)为血液中总甘油三酯(TG)水平的变化示意图，图5(C)为肝脏中总 胆固醇(TC)水平的变化示意图，图5(D)为肝脏中总甘油三酯(TC)水平的变化 示意图。
图6为本发明化合物1G显著提高小鼠的胰岛素敏感性的示意图，其中，图6(A) 为葡萄糖耐受示意图，图6(B)为葡萄糖耐受实验的定量分析示意图，图6(C)为 胰岛素耐受示意图，图6(D)为胰岛素耐受试验的定量分析示意图，图6(E)为血 液中葡萄糖水平的变化示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
“立体异构体”是指具有相同化学构造，但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几 何异构体(顺/反)异构体、阻转异构体，等等。
“手性”是具有与其镜像不能重叠性质的分子；而“非手性”是指与其镜像可以 重叠的分子。
“对映异构体”是指一个化合物的两个不能重叠但互成镜像关系的异构体。
“非对映异构体”是指有两个或多个手性中心并且其分子不互为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，如熔点、沸点、光谱性质和反应性。非对映 异构体混合物可通过高分辨分析操作如电泳和色谱，例如HPLC来分离。
本发明所使用的立体化学定义和规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；andEliel,E. and Wilen,S.,"Stereochemistry of Organic Compounds",John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。
许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有使平面偏振光的平面发生旋转的能力。在描述光学活性化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示分子关于其一个 或多个手性中心的绝对构型。前缀D和L或(+)和(-)是用于指定化合物所致平面偏振光 旋转的符号，其中(-)或L表示化合物是左旋的。前缀为(+)或D的化合物是右旋的。一 种具体的立体异构体是对映异构体，这种异构体的混合物称作对映异构体混合物。对 映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或过程中没有 立体选择性或立体特异性时，可出现这种情况。
本发明公开化合物的任何不对称原子(例如，碳等)都可以以外消旋或对映体富集的形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-构型形式存在。在某些实施方案中，各不对称 原子在(R)-或(S)-构型方面具有至少50％对映体过量，至少60％对映体过量，至少70％ 对映体过量，至少80％对映体过量，至少90％对映体过量，至少95％对映体过量，或 至少99％对映体过量。
依据起始物料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物，例如外消旋体和非对应异构体混合物(这取决于不对称碳原子的数量)的 形式存在。光学活性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常 规技术拆分。如果化合物含有一个双键，取代基可能为E或Z构型；如果化合物中含 有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能有顺式或反式构型。
所得的任何立体异构体的混合物可以依据组分物理化学性质上的差异被分离成纯 的或基本纯的几何异构体，对映异构体，非对映异构体，例如，通过色谱法和/或分步 结晶法。
可以用已知的方法将任何所得终产物或中间体的外消旋体通过本领域技术人员熟 悉的方法拆分成光学对映体，如，通过对获得的其非对映异构的盐进行分离。外消旋 的产物也可以通过手性色谱来分离，如，使用手性吸附剂的高效液相色谱(HPLC)。特 别地，对映异构体可以通过不对称合成制备，例如，可参考Jacques,et al.,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Principles ofAsymmetric Synthesis(2nd Ed.Robert E.Gawley,Jeffrey Aubé,Elsevier,Oxford,UK,2012)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen, S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)；Chiral SeparationTechniques:A Practical Approach(Subramanian,G.Ed.,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,Weinheim, Germany,2007)。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(lowenergy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可 以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子 转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化，如酮- 烯醇异构化和亚胺-烯胺异构化。价键互变异构体(valence tautomer)包括通过一些成键 电子的重组来进行的互相转化。酮-烯醇互变异构的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基 戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构的另一个实例是酚-酮互变异构。酚-酮互变 异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。除非另外指出， 本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。
本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式(I)所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。 本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类， 脂肪族(C1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。例如 本发明里的一个化合物包含羟基，即可以将其酰化得到前体药物形式的化合物。其他 的前体药物形式包括磷酸酯，如这些磷酸酯类化合物是经母体上的羟基磷酸化得到的。 关于前体药物完整的讨论可以参考以下文献：T.Higuchi and V.Stella,Pro-drugs as Novel DeliverySystems,Vol.14of the A.C.S.Symposium Series,Edward B.Roche,ed., BioreversibleCarriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association and PergamonPress,1987,J.Rautio et al.,Prodrugs:Design and Clinical Applications,NatureReview Drug Discovery,2008,7,255-270,and S.J.Hecker et al.,Prodrugs ofPhosphates and Phosphonates,Journal of Medicinal Chemistry,2008,51,2328-2345。
“代谢产物”是指具体的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发 明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧 化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相 应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一 段时间所产生的代谢产物。
本发明所使用的“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的有机盐或无机盐。药学上可接受的盐在所属领域是为我们所熟知的，如文献：S.M.Berge et al.,describepharmaceutically acceptable salts in detail in J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1-19.所 记载的。药学上可接受的无毒的酸形成的盐包括，但并不限于，与氨基基团反应形成 的无机酸盐有盐酸盐，氢溴酸盐，磷酸盐，硫酸盐，高氯酸盐，和有机酸盐如乙酸盐， 草酸盐，马来酸盐，酒石酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，丙二酸盐，或通过书籍文献上 所记载的其他方法如离子交换法来得到这些盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐， 藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，重硫酸盐，硼酸盐，丁酸 盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊基丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺 酸盐，甲酸盐，反丁烯二酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐， 庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖醛酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月 桂基硫酸盐，苹果酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸 盐，棕榈酸盐，扑酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，特戊酸盐， 丙酸盐，硬脂酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐，等等。通过适当 的碱得到的盐包括碱金属，碱土金属，铵和N+(C1-4烷基)4的盐。本发明也拟构思了 任何所包含N的基团的化合物所形成的季铵盐。水溶性或油溶性或分散产物可以通过 季铵化作用得到。碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁，等等。药学上可接 受的盐进一步包括适当的、无毒的铵，季铵盐和抗平衡离子形成的胺阳离子，如卤化 物，氢氧化物，羧化物，硫酸化物，磷酸化物，硝酸化物，C1-8磺酸化物和芳香磺酸 化物。
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜， 乙酸乙酯，乙酸和氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，在其中一些实施方案中，“治疗”指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一 些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的 身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生 理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中， “治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。
可药用的酸加成盐可与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、 氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸 盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、 月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、 萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑 酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、 磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以由其衍生得到盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、草酸、马来酸、 丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对 甲苯磺酸、磺基水杨酸等。
可药用碱加成盐可与无机碱和有机碱形成。
可以由其衍生得到盐的无机碱包括，例如铵盐和周期表的I族至XII族的金属。 在某些实施方案中，该盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的 盐包括铵、钾、钠、钙和镁盐。
可以由其衍生得到盐的有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺、环状胺、碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括，例如，异丙胺、苄星青 霉素(benzathine)、胆碱盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺(meglumine)、 哌嗪和氨丁三醇。
本发明的可药用盐可以用常规化学方法由母体化合物、碱性或酸性部分来合成。一般而言，该类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计量的适宜碱(如Na、 Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或者通过使这些化合物的游 离碱形式与化学计量的适宜酸反应来进行制备。该类反应通常在水或有机溶剂或二者 的混合物中进行。一般地，在适当的情况中，需要使用非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、 乙醇、异丙醇或乙腈。在例如"Remington′s Pharmaceutical Sciences"，第20版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985；和“药用盐手册：性质、选择和应用(Handbook of PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,and Use)",Stahl and Wermuth(Wiley-VCH, Weinheim,Germany,2002)中可找到另外一些适宜盐的列表。
另外，本发明公开的化合物、包括它们的盐，也可以以它们的水合物形式或包含其溶剂(例如乙醇、DMSO，等等)的形式得到，用于它们的结晶。本发明公开化合 物可以与药学上可接受的溶剂(包括水)固有地或通过设计形成溶剂化物；因此，本 发明旨在包括溶剂化的和未溶剂化的形式。
本发明给出的任何结构式也意欲表示这些化合物未被同位素富集的形式以及同位 素富集的形式。同位素富集的化合物具有本发明给出的通式描绘的结构，除了一个或多个原子被具有所选择原子量或质量数的原子替换。可引入本发明化合物中的示例性 同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，如2H，3H，11C，13C，14C， 15N，17O，18O，18F，31P，32P，35S，36Cl和125I。
另一方面，本发明所述化合物包括同位素富集的本发明所定义的化合物，例如，其中存在放射性同位素，如3H、14C和18F的那些化合物，或者其中存在非放射性同 位素，如2H和13C。该类同位素富集的化合物可用于代谢研究(使用14C)、反应动 力学研究(使用例如2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描术(PET)或 包括药物或底物组织分布测定的单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，或可用于患 者的放疗中。18F富集的化合物对PET或SPECT研究而言是特别理想的。同位素富 集的式(I)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)或式(IIc)所示化合物可以通过本领域技术人员熟悉 的常规技术或本发明中的实施例和制备过程所描述使用合适的同位素标记试剂替代原 来使用过的未标记试剂来制备。
此外，较重同位素特别是氘(即，2H或D)的取代可提供某些治疗优点，这些优点 是由代谢稳定性更高带来的。例如，体内半衰期增加或剂量需求降低或治疗指数得到 改善带来的。应当理解，本发明中的氘被看做式(I)、式(II)、式(IIa)、式(IIb)或式(IIc) 化合物的取代基。可以用同位素富集因子来定义该类较重同位素特别是氘的浓度。本 发明所使用的术语“同位素富集因子”是指所指定同位素的同位素丰度和天然丰度之间 的比例。如果本发明化合物的取代基被指定为氘，该化合物对各指定的氘原子而言具 有至少3500(各指定氘原子处52.5％的氘掺入)、至少4000(60％的氘掺入)、至少4500 (67.5％的氘掺入)，至少5000(75％的氘掺入)，至少5500(82.5％的氘掺入)、至少6000 (90％的氘掺入)、至少6333.3(95％的氘掺入)、至少6466.7(97％的氘掺入)、至少6600 (99％的氘掺入)或至少6633.3(99.5％的氘掺入)的同位素富集因子。本发明可药用的溶 剂化物包括其中结晶溶剂可以是同位素取代的例如D2O、丙酮-d6、DMSO-d6的那些 溶剂化物。
一、化合物的合成
实施例1、化合物1C的合成
羊毛甾醇(50％，购于TCI，100mg)溶于二氯甲烷(30mL)，在冰浴下，m-CPBA (85％，28mg)和NaHCO3(14mg)间隔3h分两批加入到上述溶液中，室温搅拌过夜。 反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水碳酸钠干燥，然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所 得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯10：1)，得化合物1C(45mg)和化合物 1A(40mg)。
化合物1C：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.21(d,J＝8.0Hz,1H),2.69-2.67 (m,1H),0.68(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.6,134.4,79.0,77.5,77.2, 76.8,65.0,64.9,58.5,58.2,50.51,50.48,50.4,49.9,44.6,39.0,37.1,36.4,36.3,35.7,32.9,32.7,31.10.31.08,30.9,28.4,28.3,28.1,28.0,26.6,26.0,25.7,25.06,25.05,24.4,21.1, 19.3,18.9,18.79,18.76,18.7.
实施例2、化合物1F的合成
羊毛甾醇(50％，购于TCI，220mg)溶于THF/H2O(20mL/5mL)，NBS(54mg) 加入到反应液中，反应液在室温下搅拌2h。反应液加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得 有机相采用无水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分 离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物1F(110mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.13-3.94(m,1H),3.25-3.21(m,1H),0.69(s, 3H).
实施例3、化合物1G的合成
化合物1F(80mg)溶于无水THF(10mL)中，LiAlH4(38mg)加入到反应液中， 反应液加热回流2h。冷却到室温，加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水 硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙 酸乙酯5：1)，得化合物1G(40mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.25-3.22(m,1H),2.03-1.89(m,5H),0.69(s, 3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.58,134.56,79.1,77.5,77.2,76.8,71.3,50.7, 50.6,50.0,44.7,44.6,39.0,37.2,36.9,36.6,35.8,31.2,31.0,29.5,29.4,28.4,28.1,28.0,26.7,24.4,21.3,21.2,19.3,18.8,18.4,15.9,15.6.
实施例4、化合物1H的合成
1C(80mg)，醋酸酐(300uL)，DMAP(2mg)，吡啶(1ml)和二氯甲烷(10ml) 加入到反应瓶中。室温搅拌6h。加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫 酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸 乙酯20：1)，得化合物1H(80mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.51-4.47(m,1H),2.68(t,J＝6.4Hz,1H),0.69 (s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)171.2,134.5,134.4,81.0,77.5,77.2,76.8, 65.1,64.9,58.5,58.3,50.6,50.5,50.4,49.9,44.6,37.9,37.0,36.5,36.3,35.4,32.9,32.7,31.07,31.05,30.9,28.4,28.3,28.0,26.5,26.1,25.7,25.09,25.07,24.4,24.3,21.5,21.1, 19.3,18.9,18.8,18.7,18.2,16.7.
实施例5、化合物2F的合成
1D(80mg)，醋酸酐(300uL)，DMAP(2mg)，吡啶(1ml)和二氯甲烷(10ml) 加入到反应瓶中。室温搅拌6h。加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫 酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸 乙酯20：1)，得化合物2F(80mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.51-4.47(m,1H),3.36-3.27(m,1H),0.68(s, 3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)171.2,134.6,134.4,81.1,79.8,78.9,73.4,73.3, 50.7,50.6,49.9,44.6,37.9,37.0,36.9,36.4,35.4,33.7,33.2,31.1,30.9,28.8,28.5,28.4,28.3,28.0,26.7,26.5,24.4,24.3,23.4,23.3,21.5,21.1,19.3,19.0,18.7,18.2,16.7,15.9.
实施例6、化合物3G的合成
1G(100mg)，PCC(100mg)和NaOAc(10mg)溶解到二氯甲烷中，室温搅拌 1h。加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸 发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯20：1)，得化合物3G (90mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)2.56-2.40(m,2H),0.88(s,6H),0.70(s,3H)； 13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)217.9,135.47,133.28,71.17,51.4,50.6,50.0,47.5, 44.6,44.5,37.0,36.9,36.6,36.2,34.7,31.1,31.0,29.5,29.4,28.3,26.5,26.3,24.4,21.4,21.2,19.6,18.8,16.0.
实施例7、化合物4A的合成
1G(50mg)溶于二氯甲烷(30mL)，在冰浴下，m-CPBA(85％，28mg)和 NaHCO3(14mg)间隔3h分两批加入到上述溶液中，室温搅拌过夜。反应液用饱和碳酸 氢钠溶液洗涤，无水碳酸钠干燥，然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱 分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物4A(45mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.21-3.19(m,1H),0.76-0.75(m,6H)13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)78.6,71.2,70.8,68.3,49.0,48.5,44.5,43.7,41.9,38.6,38.0,36.7,36.4,33.0,29.42,29.36,28.6,28.4,27.3,27.0,23.6,21.6,21.2,20.1,19.1,17.1,16.6, 16.4,15.2.
实施例8、化合物4G的合成
将50mg化合物1E溶于无水5ml THF中。加入4ml 4M异丙基溴化镁的四氢呋 喃溶液。TLC检测反应完成后，加水终止反应，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无 水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚： 乙酸乙酯5：1)，得化合物4G 17mg。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.33-3.32(m,1H),3.23(dd,J＝11.6Hz,J＝4.8 Hz,1H),0.81(s,3H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.54,134.51, 79.1,50.6,50.5,44.6,39.0,37.2,35.7,31.1,31.0,28.1,28.0,27.0,26.6,24.4,22.8,21.1, 19.3,19.2,19.0,18.4,16.8,15.9,15.6,14.3.
实施例9、化合物4H的合成
将37mg化合物4A溶于3ml二氯甲烷，加入37mg PCC和4mg NaOAc。室温 下搅拌2h。TLC检测反应完成后水洗，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫酸 钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离。将分离产物溶于 乙醇，加入12mg盐酸羟胺和20mg醋酸钠。60℃搅拌2h。TLC检测反应完成后水 洗，先用旋转蒸发仪蒸发除去大部分溶剂后，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水 硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱(乙酸乙酯：石油 醚5：1)分离得到21mg化合物4H。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.14-3.10(m,1H),1.00(d,J＝6Hz,3H),0.85(s,3H),0.70(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)166.4,71.3,70.7,68.3,49.0,48.5,44.5,43.7,43.1,40.0,38.1,36.7,36.4,32.9,32.1,29.44,29.38,28.6,27.6,26.9,23.9,22.8, 21.7,21.2,20.1,19.1,17.4,17.2,17.0,16.4.
实施例10、化合物5A的合成
将40mg化合物1G溶于4ml吡啶中，加入12mg丁二酸酐和11mg DMAP。置 于80℃下搅拌3h。TLC检测反应完成后用10％的盐酸洗去吡啶，并用乙酸乙酯萃取。 所得有机相采用无水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶 柱(二氯甲烷：甲醇20：1)分离得到31mg化合物5A。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.52(dd,J＝11.6Hz,J＝4.8Hz,1H), 2.69-2.63(m,4H),0.68(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)172.0,170.7,134.6, 134.3,81.6,71.4,60.6,50.6,49.9,44.6,44.5,38.0,37.0,36.8,36.6,35.3,31.1,30.9,29.5, 29.4,29.3,29.1,28.5,28.4,28.0,26.5,24.4,24.2,21.3.21.2,21.1,19.3,18.8,18.2,16.7.
实施例11、化合物5H的合成
1G(80mg)，醋酸酐(300uL)，DMAP(2mg)，吡啶(1ml)和二氯甲烷(10ml) 加入到反应瓶中。室温搅拌6h。加水稀释，用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫 酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸 乙酯20：1)，得化合物5H(80mg)。
实施例12、化合物6C的合成
5H(30mg)，RuCl3·3H2O(1mg)和TBHP(in decane，5-6M)加入到2mL的环己 烷中。室温反应6h。旋转蒸发仪旋干，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯 5：1)，得到的化合物溶于10％KOH的乙醇溶液中，回流3h，冷却至室温，加水稀释， 用二氯甲烷萃取。所得有机相采用无水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂， 所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯3：1)，得化合物6C(10mg)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.29-3.25(m,1H),2.89(d,J＝14.0Hz,1H), 2.75(d,J＝14.0Hz,1H),2.60(d,J＝14.0Hz,1H),2.50-2.44(m,2H),0.80(s,3H)； 13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)202.6,202.4,151.9,150.8,77.8,71.2,51.8,50.3, 49.3,49.1,47.5,44.4,39.9,39.0,36.6,36.3,34.2,32.3,29.5,29.4,28.0,27.8,27.5,26.0, 21.1,18.7,17.7,17.0,15.6.
实施例12、化合物7A的合成
将30mg化合物4A溶于3ml THF中，加入100ul 40％的氢氟酸溶液，室温下搅 拌4天。TLC检测反应完成后用饱和碳酸氢钠溶液洗，用二氯甲烷萃取。所得有机相 采用无水硫酸钠干燥，然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱(乙酸乙 酯：石油醚1：3)分离得到27mg化合物7A。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.47(s,br,1H),5.32(s,br,1H),3.24(dd,J＝11.2Hz,J＝4.4Hz,1H),0.56(s,3H)13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)146.0,142.8,120.3, 116.5,79.1,71.2,51.2,50.5,49.2,44.5,43.9,38.8,38.0,37.5,36.8,36.4,35.8,31.6,29.5,29.4,28.3,28.1,27.9,25.7,23.1,22.9,21.3,18.6,15.9,15.8.
实施例13、化合物14A和14B的合成
Figure BDA0001487078810000161
化合物(a)140mg溶于无水DCM(20mL)中，在冰浴条件下，氮气保护加入 TBDMSOTf(291uL，4.0eq)，2，6-lutidine(187uL，5.0eq)。反应液在室温下搅拌， TLC检测反应至原料消失(2h)。旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石 油醚：乙酸乙酯200：1)，得化合物(b)(190mg)，产率90％。
化合物(b)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.62-4.60(m,1H),1.19(s,3H),1.18(s,3H),1.05(s,3H),1.00(s,3H),0.95(s,12H),0.86(s,12H),0.73(s,3H),0.17(s,3H),0.15(s,3H),0.07(s,6H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)156.5,156.5,135.2,133.1,98.9,73.7,50.6,50.2,49.5,45.7,44.6,38.5,37.0,36.7,36.4,31.3,31.2,30.3,29.8,28.6,28.4, 27.1,26.7,26.1,26.0,24.4,21.0,20.8,19.8,19.6,18.9,18.6,18.5,18.3,16.1,-1.88,-3.9, -4.5.
化合物(b)(100mg)溶于3ml的DCM和2ml的DMF的混合溶液，在冰浴条件 下加入selectfluor(50mg，1.0eq)，反应液在室温下搅拌1h。反应液用饱和碳酸氢钠 溶液洗涤，无水碳酸钠干燥，然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离 (石油醚：乙酸乙酯50：1)，得化合物(c)(60mg)，产率71％。
化合物(c)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.34(ddd,J＝48.0Hz,J＝13.0Hz,J＝6.2Hz,1H),2.53-2.74(m,1H),1.31(s,3H),1.177(s,3H),1.170(s,3H),1.15(s,3H),1.11(s,3H),0.91(d,J＝6.4Hz,3H),0.89(s,3H),0.87(s,9H),0.71(s,3H),0.05(s,6H)； 13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)210.2(d,J＝11.8Hz,1C),135.75,133.0,89.3(d,J＝ 184.9Hz,1C),73.6,52.1,50.4,49.9,48.5,45.6,44.6,43.7,43.6,38.1,38.0,36.9,36.5, 30.8,30.2,29.8,28.3,26.1,26.0,24.6,24.4,21.6,21.4,20.9,20.1,19.0,18.8,18.2,15.8, -1.9.
化合物(c)(57mg)溶于DCM/MeOH(1mL/3mL)，室温下硼氢化钠(20mg，5eq) 加入到反应液中，室温搅拌1h。反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水碳酸钠干燥， 然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯50：1)， 得化合物(d)(30mg)，产率70％；化合物(e)(9mg)，产率20％。
化合物(d)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.69-4.53(m,1H),3.29(t,J＝12.0 Hz,1H),1.18(s,3H),1.17(s,3H),1.08(s,3H),1.06(s,3H),0.87(d,J＝6.4Hz,3H),0.88 (s,3H),0.87(s,3H),0.85(s,9H),0.69(s,3H),0.06(s,6H).
化合物(e)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.00-4.85(m,1H),3.67(d,J＝6.8Hz,1H),1.18(s,3H),1.17(s,3H),1.06(s,3H),1.04(s,3H),0.90(d,J＝6.4Hz,3H),0.897(s,3H),0.88(s,3H),0.85(s,9H),0.69(s,3H),0.06(s,6H).
化合物(d)(30mg)溶于乙腈/THF(1ml/1mL)，40％HF水溶液加入到反应液， 50摄氏度搅拌过夜。反应液残留HF用氯化钙溶液中和，化合物用DCM萃取，无水 碳酸钠干燥，然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸 乙酯10：1)，得化合物(14A)(18mg)，产率75％。
化合物(14A)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.66-4.49(m,1H),3.28(dd,J＝13.0Hz,J＝9.6Hz,1H),1.21(s,6H),1.07(s,3H),1.05(s,3H),0.90(d,J＝6.3Hz,3H),0.88(s,3H),0.86(s,3H),0.68(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.9,133.5, 93.4(d,J＝165.6Hz,1C),81.0(d,J＝15.4Hz,1C),71.1,50.4,50.2,50.1,49.8,44.5,44.4,41.1,40.9,39.5,39.4,38.7,38.5,36.7,36.5,30.8,30.76,29.7,29.3,29.2,28.4,28.2,26.2, 24.3,21.3,21.1,20.2,18.7,18.0,16.6,15.7.
化合物(d)(20mg)溶于乙腈/THF(1ml/1mL)，40％HF水溶液加入到反应液， 50摄氏度搅拌过夜。反应液残留HF用氯化钙溶液中和，化合物用DCM萃取，无水 碳酸钠干燥，然后再旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸 乙酯10：1)，得化合物(14B)(14mg)，产率85％。
化合物(14B)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.01-4.85(m,1H),3.67(d,J＝7.7 Hz,1H),1.21(s,6H),1.05(s,3H),1.03(s,3H),0.92-0.88(m,9H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.7,133.9,91.5(d,J＝167.1Hz,1C),76.7,71.2,50.5,50.0,44.6,44.5,43.5,38.8,38.7,38.6,38.5,36.8,36.6,35.8,35.6,31.0,30.9,29.8,29.5,29.4, 28.3,28.2,26.1,24.4,21.9,21.3,21.26,20.3,18.8,17.9,15.8.
实施例14、化合物15A的合成
Figure BDA0001487078810000181
化合物(b)(380mg，0.56mmol)溶于DCM中，在冰浴条件下，将m-CPBA(1.0eq) 与NaCO3(0.7eq)的DCM混悬液缓慢加入反应液中，搅拌20min，TLC检测反应完 成，反应液中加入饱和碳酸氢钠溶液停止反应，用水洗涤，DCM萃取，无水硫酸钠干 燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯80：1)，得化 合物(f)(290mg)，产率90％。
化合物(f)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.65-4.60(q,J1＝6Hz,J2＝12Hz,1H),1.17-1.16(d,6H),1.11(s,3H),1.08(s,3H),0.90(s,6H),0.71(s,3H),0.14(s,3H),0.02(s, 3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)214.08,135.16,133.69,73.64,71.62,52.11,50.45,49.86,48.19,46.85,45.62,44.60,37.87,36.87,36.52,32.02,30.91,30.84,30.18, 29.74,29.45,28.29,26.21,25.96,25.94,24.97,24.34,22.78,21.84,21.55,20.92,20.07, 19.31,19.17,18.81,18.71,18.19,15.82,14.50,-1.98,-4.50,-5.45.
化合物(f)(290mg，0.51mmol)溶于MeOH/DCM中，将NaBH4(10.0eq)缓慢 加入反应液中，室温下搅拌过夜，TLC检测反应完成，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产 品用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯40：1)，得化合物(g)，全部用于下一步反应。
化合物(g)溶于乙腈/THF(1ml/1mL)，40％HF水溶液(100ul)加入到反应液， 50摄氏度搅拌过夜。反应液残留HF用氯化钙溶液中和，化合物用DCM萃取，无水 硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(DCM：MeOH 50：1)， 得化合物(15A)(36mg)，两步产率15％。
化合物(15A)1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm)3.66-3.60(m,1H),2.93-2.91(d, J＝9.6Hz,1H),1.05(s,3H),1.01(s,3H),0.93-0.91(d,3H),0.89(s,3H),0.82(s,3H),0.92(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm)135.48,135.14,83.97,71.26,69.66,51.49,51.41,50.61,45.38,44.98,44.75,40.02,38.91,37.70,37.39,31.88,31.57,29.11,28.99, 28.95,28.91,27.18,24.55,21.97,21.84,20.58,19.12,19.09,17.07,16.18.
实施例15、化合物13A、13D、13F和13G的合成
Figure BDA0001487078810000191
化合物(a)16g(40％，13.7mmol)溶于DCM中，前3h在室温下加入一半m-CPBA 与NaHCO3，后3h在冰浴条件下加入剩下的m-CPBA，TLC检测反应完，反应液用饱 和碳酸氢钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱 分离(石油醚：乙酸乙酯80：1)，得化合物(b)，产率80％。
化合物(b)1.1g(2.4mmol)溶于乙醚中，HIO4加入反应液中，室温下搅拌20min，TLC检测反应完全，反应液用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得 产品即化合物(c)可直接用于下一步反应。
化合物(c)200mg(0.4mmol)溶于DCM中，将前处理后的叶立徳试剂加入反 应液中，氮气保护室温下搅拌4h，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石 油醚：乙酸乙酯50：1)，得化合物(d)(190mg)，产率90％。
化合物(d)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.01-4.85(m,1H),3.67(d,J＝7.7Hz,1H),1.21(s,6H),1.05(s,3H),1.03(s,3H),0.92-0.88(m,9H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.7,133.9,91.5(d,J＝167.1Hz,1C),76.7,71.2,50.5,50.0,44.6,44.5,43.5,38.8,38.7,38.6,38.5,36.8,36.6,35.8,35.6,31.0,30.9,29.8,29.5,29.4,28.3, 28.2,26.1,24.4,21.9,21.3,21.26,20.3,18.8,17.9,15.8.
化合物(d)100mg(0.2mmol)溶于乙醇/水(4ml/2ml)中，加入KOH(3.0eq)， 120℃加热过夜，TLC检测反应完全，反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，水相中滴加浓 盐酸调至pH<7，过滤所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物 13G(30mg)，产率33％。
化合物(13G)1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)12.09(s,1H),6.63(s,1H), 4.31-4.32(d,1H),3.00-2.97(dd,1H),1.98(s,3H),1.12(s,3H),0.96-0.90(m,9H),0.83(s, 3H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,DMSO)δ(ppm)168.81,141.99,134.30,133.48, 127.38,76.72,50.01,49.75,49.34,44.02,38.50,36.52,35.74,35.16,34.50,30.48,30.37,28.07,27.65,27.54,25.97,24.94,23.99,20.47,18.96,18.30,17.85,15.79,15.52,12.10.
化合物(d)80mg(0.15mmol)溶于甲醇中，加入20％钯碳，在氢气中室温下搅 拌过夜，TLC检测反应完全，反应液用硅藻土过滤，旋转蒸发仪蒸干后所得产品溶于 乙醇/水(3ml/1.5ml)，加入KOH(3.0eq)，120℃加热过夜，TLC检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，水相中滴加浓盐酸调至PH<7，过滤所得产品采用硅 胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物13F(20mg)，总产率29％。
化合物(13F)1H-NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)3.02-2.98(dd,1H),2.31-2.28(t,1H),1.98(s,3H),1.03-1.02(d,3H),0.91-0.89(d,3H),0.85-0.83(m,3H),0.69(s,3H)；
化合物(d)100mg(0.19mmol)溶于无水DCM，在冰浴中缓慢滴加DIBAL(5.0 eq),在氮气条件下反应3h，反应液中缓慢滴加甲醇中和剩余DIBAL，旋转蒸发仪蒸 干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯10：1)，得化合物(68mg)， 产率85％。
化合物(13F)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.41-5.38(t,1H),4.00(s,2H), 3.25-3.21(dd,1H),1.06-0.98(m,9H),0.93-0.92(d,3H),0.87(s,3H),0.80(s,3H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.52,134.47,134.41,127.19,79.10,69.22, 50.51,50.48,49.92,44.61,39.00,37.13,36.40,36.09,35.69,31.10,30.94,29.81,28.33,28.07,27.95,26.61,24.62,26.36,21.11,19.25,18.72,18.36,15.87,15.53,13.75.
化合物(13A)
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.52-3.48(m,1H),3.44-3.39(m,1H),3.25-3.21(m,1H),0.68(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.5,79.1,68.7,68.5,50.6, 50.5,49.9,44.6,39.0,37.2,36.7,36.6,36.5,36.0,35.7,33.8,33.7,31.1,31.0,29.8,28.4,28.1,28.0,26.6,24.4,21.1,19.3,18.9,18.8,18.4,16.9,16.6,15.9,15.6
实施例16、化合物13D和13E的合成
Figure BDA0001487078810000211
化合物(d)400mg(0.8mmol)溶于DCM中，将前处理后的叶立徳试剂加入反 应液中，氮气保护室温下搅拌4h，旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石 油醚：乙酸乙酯30：1)，得化合物(e)(436mg)，产率95％。
化合物(b)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.01-4.85(m,1H),3.67(d,J＝7.7Hz,1H),1.21(s,6H),1.05(s,3H),1.03(s,3H),0.92-0.88(m,9H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.7,133.9,91.5(d,J＝167.1Hz,1C),76.7,71.2,50.5,50.0,44.6,44.5,43.5,38.8,38.7,38.6,38.5,36.8,36.6,35.8,35.6,31.0,30.9,29.8,29.5,29.4,28.3, 28.2,26.1,24.4,21.9,21.3,21.26,20.3,18.8,17.9,15.8.
化合物(e)140mg(0.25mmol)溶于乙醇/水(4ml/2ml)中，加入KOH(3.0eq)， 120℃加热过夜，TLC检测反应完全，反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，水相中滴加浓 盐酸调至pH<7，过滤所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物 13E(E型，24.4mg)，产率22％。
化合物(13E)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.83-6.76(td,1H),5.77-5.73(d, 1H,J＝15.2Hz),4.33-4.31(d,1H),3.02-2.97(dd,1H),1.15-1.11(t,3H),0.97-0.88(m,9H),0.84(s,3H),0.70(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)167.12,149.37,134.29, 133.47,121.64,76.71,66.97,50.00,49.77,49.33,44.02,38.49,36.50,35.58,35.15,34.09,30.35,28.30,28.07,27,59,27.53,25.96,23.99,20.46,18.95,18.23,17.84,15.79,15.52.
化合物(e)50mg(0.09mmol)溶于甲醇中，加入20％钯碳，在氢气中室温下搅 拌过夜，TLC检测反应完全，反应液用硅藻土过滤，旋转蒸发仪蒸干后所得产品溶于 乙醇/水(3ml/1.5ml)，加入KOH(3.0eq)，120℃加热过夜，TLC检测反应完全， 反应液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，水相中滴加浓盐酸调至pH<7，过滤所得产品采用硅胶 柱分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)，得化合物13D(E型，10mg)，总产率25％。
化合物(13D)1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.32-4.31(d,1H),3.01-2.96(dd,1H),2.19-2.16(t,2H),1.14-1.09(t,3H),1.02-0.89(m,9H),0.85-0.83(m,7H),0.69(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)174.50,133.53,76.75,50.04,49.90,49.36, 43.99,38.52,36.54,35.71,35.36,35.19,33.70,30.52,30.38,28.10,27.70,27.56,26.00, 25,16,24.94,24.03,20.50,18.98,18.49,17.87,15.82,15.55.
实施例17、化合物12C的合成
Figure BDA0001487078810000221
化合物(f)(215mg)溶于THF(10ml)中，搅拌条件下加入四氢锂铝(38mg， 2.0eq)，反应在室温下搅拌6个小时。反应结束后，向反应液滴加甲醇，中和未反应 的四氢锂铝，硅藻土过滤，然后用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(二 氯甲烷：甲醇5：1)，得化合物12C，产率90％.
化合物14H 1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.64(m,t,J＝6.6Hz,2H), 3.25-3.21(m,1H),1.00(s,3H),0.98(s,3H),0.87(s,3H),0.81(s,3H),0.68(s,3H)； 13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)134.53,79.13,63.25,50.57,50.53,49.94,44.59, 39.02,37.15,36.51,36.31,35.72,33.03,31.11,30.97,28.36,28.10,27.98,26.63,26.35, 26.28,24.40,21.14,19.28,18.84,18.39,15.88,15.56.
实施例18、化合物12D的合成
Figure BDA0001487078810000231
化合物（g）（50mg）溶于DCM，DMP（50mg，1.2eq）加入到反应体系中，室温 搅拌5小时，反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水碳酸钠干燥，然后再用旋转蒸发 仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离（石油醚：乙酸乙酯10：1），得化合物（h） （43mg），产率85%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.51-4.47(m,1H),2.60-2.43(m,2H),2.04(s, 3H),1.38(s,6H),1.00(s,3H),0.91-0.88(m,12H),0.68(s,3H);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ(ppm)215.2,171.2,134.5,134.4,81.0,76.3,50.6,50.5,50.0,44.7,37.9,37.0, 36.2,35.4,32.7,31.1,30.9,30.3,28.3,28.0,26.7,26.5,24.4,24.3,21.5,21.1,19.3,18.6, 18.2,16.7,15.9.
化合物（h）（50mg）溶于10%氢氧化钾乙醇溶液（3mL），反应在90℃反应两个 小时，反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，DCM萃取，无水碳酸钠干燥有机相，然后再 用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离（石油醚：乙酸乙酯5：1），得化 合物（12D）（45mg），产率为89%。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.25-3.22(m,1H),2.57-2.48(m,2H),1.00(s, 3H),0.98(s,3H),0.91-0.88(m,10H),0.81(s,3H),0.69(s,3H);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ(ppm)215.1,134.6,134.5,79.1,76.4,50.60,50.57,50.0,44.7,39.1,37.2,36.3, 35.8,32.8,32.1,31.2,31.0,30.4,29.9,29.5,28.3,28.1,26.72,26.67,24.4,22.8,21.2,19.3,18.6,18.4,15.9,15.6,14.3.
实施例19、化合物13B和13C的合成
Figure BDA0001487078810000232
化合物（i）(200mg)溶于二乙胺（4mL）中，加入金属锂（100mg），室温搅拌过 夜。甲醇慢慢滴加到反应液中，直至没有气泡产生反应变澄清。所得溶液在旋转蒸发 仪中除去甲醇二乙胺，所得产品用饱和碳酸氢钠洗涤，DCM萃取。无水碳酸钠干燥， 然后再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，所得产品采用硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯5：1)， 得化合物(13B)和(13C)，产率分别为25％和15％。
化合物13B：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.19-3.16(m,1H),1.19(s,3H), 1.01(s,3H),0.98(s,3H),0.91(s,3H),0.89(d,J＝6.3Hz,3H),0.79(s,3H),0.77(s,3H)； 13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)78.2,77.3,71.2,50.6,47.6,45.8,45.3,44.5,42.8, 40.6,38.9,36.9,36.1,33.9,29.6,29.4,29.32,29.26,28.4,28.1,28.1,28.06,27.5,23.9,21.5, 21.2,18.8,18.4,16.9,15.5,14.7.
化合物13C：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.41(t,J＝3.7Hz,1H),3.28-3.24 (m,1H),1.21(s,6H),1.17(s,3H)1.19(s,3H),1.01(s,3H),0.98(s,3H),0.91(s,3H),0.89 (d,J＝6.3Hz,3H),0.79(s,3H),0.77(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)78.2, 77.3,71.2,50.6,47.6,45.8,45.3,44.5,42.8,40.6,38.9,36.9,36.1,33.9,29.6,29.4,29.32,29.26,28.4,28.1,28.1,28.06,27.5,23.9,21.5,21.2,18.8,18.4,16.9,15.5,14.7.
实施例20、豆甾醇衍生物的合成
Figure BDA0001487078810000241
将250mg豆甾醇溶于5ml吡啶中，加入116mg TsCl，8mg DMAP催化，室温 下搅拌12h后，TLC监测反应完全。用饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有 机相，旋转蒸干，硅胶色谱柱分离纯化得到190mg化合物2.
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.79(d,J＝8.24Hz,2H),7.32(d,J＝8.08Hz,2 H),5.29-5.29(m,1H),5.14-5.10(m,1H),5.04-4.97(m,1H),2.46-2.39(m,4H),2.28-2.23(m,1H),2.04-1.91(m,4H),0.67(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)144.5,138.9, 138.4,134.8,134.8,129.8,129.4,127.7,123.6,82.46,56.8,56.0,51.3,50.0,42.3,40.6,39.6,39.0,37.0,36.6,36.4,32.0,31.9,31.8,29.0,28.7,25.5,24.4,21.7,21.3,21.2,21.1, 19.2,19.1,12.4,12.1.
将190mg化合物2溶于5ml甲醇中，加入190mg醋酸钾，加热回流3小时。TLC 监测反应完全。用饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅 胶色谱柱分离纯化得到109mg化合物3。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.18-5.12(m,1H),5.04-4.98(m,1H),3.32(s,3H),2.76(dd,J＝2.5Hz,J’＝2.5Hz,1H),0.74(s,3H),0.66(dd,J＝4.5,J’＝4.5Hz,1H), 0.44(dd,J＝8.0Hz,J’＝5.0Hz,1H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)138.4,129.2, 82,4,56.7,56.6,56.1,51.3,48.1,43.4,42.7,40.6,40.2,35.3,35.0,33.4,31.9,30.5,29.1, 25.4,25.0,24.3,22.8,21.5,21.2,21.1,19.3,19.0,13.1,12.5,12.3.
Figure BDA0001487078810000251
将200mg豆甾醇溶于7ml二氯甲烷中，于冰水浴条件下加入300mg间氯过氧酸(85％)和164mg碳酸氢钠，搅拌1小时后恢复至室温继续搅拌12小时，TLC监测 反应完全。用饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅胶色 谱柱分离纯化得到126mg化合物B7，其中包含4种异构体。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)0.61(m,3H),0.95(m,3H),1.05(s,3H),2.91(d, J＝4.3Hz,1H,),3.06(d,J＝2.1Hz,1H),3.61-3.78(m,1H),3.81-3.99(m,1H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)12.01,12.15,12.53,12.66,16.08,16.36,16.45,19.51,19.59,19.68,20.38,20.75,20.80,20.98,21.07,24.42,24.27,27.04,27.94,28.91,29.29,29.46, 30.03,31.17,32.56,35.01,38.89,39.01,39.34,39.35,39.96,42.70,42.81,42.81,42.83, 48.43,48.91,53.26,55.91,56.58,56.61,58.74,59.41,59.48,62.26,62.42,63.28,65.96, 68.74,11.90,12.61,16.25,17.22,19.75,20.33,22.09,22.14,24.60,27.19,29.94, 32.72,37.41,38.70,42.33,51.44,51.53,53.62,55.97,56.22,63.18,63.8,69.48.
Figure BDA0001487078810000252
将70mg化合物3溶于4ml二氯甲烷中，冰浴下加入33mg间氯过氧酸，15mg碳 酸氢钠搅拌10分钟，然后允许恢复室温搅拌12小时。12小时后TLC监测反应完全， 加入1ml水终止反应。用饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸 干，硅胶色谱柱分离纯化得到42mg化合物7。
将化合物7溶于5ml1，4-二氧六环水溶液中(1，4-二氧六环：水＝4：1)，加入一 水合对甲苯磺酸5mg，80℃下搅拌10小时，TLC监测反应完全，用饱和碳酸氢钠水 溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅胶色谱柱分离纯化得到20mg化合 物8H。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.35(d,J＝4.80Hz,1H),3.56-3.50(m,1H), 2.74(dd,J1＝7.04Hz,J2＝2.00Hz,1H),2.49(d,J＝3.56Hz,1H),0.68(s,3H)；13C-NMR (100MHz,CDCl3)δ(ppm)140.93,121.72,71.92,62.28,56.50,53.56,50.21,48.45,42.78, 42.41,39.70,38.86,37.37,36.63,32.00,31.78,29.29,28.09,24.70,21.17,21.00,20.34,19.70,19.54,16.36,12.63,11.99.
Figure BDA0001487078810000261
将90.5mg化合物7溶于5ml二氯甲烷中，冰浴下加入120mg三氯化铝，90m四 氢铝锂搅拌10分钟，然后置于80℃下搅拌2小时，TLC监测反应完全，加入1ml水 终止反应。用饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅胶色 谱柱分离纯化得到70mg化合物8。
将化合物7溶于5ml1，4-二氧六环水溶液中(1，4-二氧六环：水＝4：1)，加入一 水合对甲苯磺酸16mg，80℃下搅拌10小时，TLC监测反应完全，用饱和碳酸氢钠 水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅胶色谱柱分离纯化得到30mg化 合物8H。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.34(s,1H),3.91(t,J＝6.66Hz,1H),3.56-3.48(m,1H),2.32-2.19(m,2H),0.06(s,3H)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)140.89,121.79,71.91,70.76,57.06,56.84,50.20,49.37,42.67,42.54,42.42,39.91,37.37,36.62,34.34, 32.00，31.78，28.74，28.62，24.42，21.28，21.20，19.56，18.47，13.99，11.96.
Figure BDA0001487078810000262
将106mg化合物4B溶于5ml THF中，于冰浴条件下缓慢加入90mg四氢铝锂，加完 后允许恢复至室温并回流搅拌1.5小时，TLC监测反应完全，加入1ml水终止反应。用 饱和碳酸氢钠水溶液、二氯甲烷萃取，分离有机相，旋转蒸干，硅胶色谱柱分离纯化 得到90mg化合物7H和13mg化合物8A。
化合物7H：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.07-4.05(m,1H),2.71(d,J＝6.76 Hz,1H),2.47(d,J＝8.68Hz,1H),1.97-1.81(m,5H),0.63(s,3H)；13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ(ppm)75.39,67.34,63.22,62.24,58.65,56.21,55.88,53.58,53.54,48.86,48.38,45.99,45.90,44.00,43.15,43.11,40.02,39.90,38.98,38.88,38.80,34.83,34.50,30.95, 30.91,29.41,29.22,28.05,27.19,26.02,24.46,24.42,21.45,21.40.21.02,20.96,20.29, 19.66,19.55,19.45,16.33,16.25,12.57,12,47,12.36,12.21.
化合物8A：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)3.80(s,br,1H),3.69-3.60(m,1H), 2.74(d,J＝6.12Hz,1H),2.49(d,J＝7.88Hz,1H),0.68-0.66(m,6H)；13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ(ppm)72.15,71.85,67.49,63.25,62.78,58.71,57.16,56.31,55.91,54.44,54.36,48.93,48.45,47.52,46.00,43.17,40.18,39.97,39.80,39.04,38.76,38.67,35.54,34.54, 34.37,31.65,31.03,30.94,30.53,29.75,29.48,29.30,27.22,26.06,24.62,24.23,21.49, 21.21,21.09,20.31,20.06,19.58,19.51,18.49,16.42,15.93,12.53,12.39,12.24.
二、化合物的生物学评价
本测试例细胞培养用到的培养基组分及细胞培养条件：
Huh-7(人肝癌细胞系；购自ATCC)和Huh-7/SRE-Luc细胞在37℃、5％CO2培 养箱中培养，细胞生长在培养基A(DMEM，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素) 加上10％FBS。CHO-7(CHO-K1细胞在去脂蛋白血清培养基中筛选得到的单克隆细 胞；购自ATCC)细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞生长在培养基B(DMEM 与F12培养基等比例混合，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素)加上5％FBS。
实施例1、本发明化合物对SREBP报告基因活性抑制的测定
以下方法运用Huh-7/SRE-Luc细胞系测定本发明化合物抑制SREBP信号通路的 活性。Huh-7/SRE-Luc细胞系是通过在人肝癌细胞系Huh-7细胞中稳定转染表达了2 个报告基因：分别为启动子具有SREBP蛋白结合位点并依赖于SREBP信号活性表达 的萤火虫荧光素酶SRE-Firefly Luciferase，和持续表达作为内参的绿色荧光蛋白EGFP， 示意图如图1(A)所示。
实验方法简述如下：将Huh-7/SRE-Luc细胞培养在DMEM培养基中(含10％FBS，100units/ml P/S)，待细胞汇合度达到80％时，用0.25％胰酶(EDTA)消化吹匀后以 每孔5×104细胞接种到24孔板中。于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，吸掉培 养基，用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4) 洗1遍。再加入配置有不同浓度化合物的去脂蛋白DMEM培养基(含10％去脂蛋白 血清，1μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸，P/S)，在去脂蛋白培养条件下，有利于最大 程度地激活SREBP信号通路。培养16小时后，吸掉培养基，每孔加入150μl细胞裂 解液Reporter Lysis Buffer(Promega，E397A)，将24孔板置于-80℃冰箱中冻结，再 室温解冻1次，随后以800rpm在涡旋仪上振荡10分钟，达到充分裂解细胞的目的。
吸取100μl裂解液加入到96孔黑色酶标板中(PerkinElmer，6005329)，用EnVsion酶标仪(PerkinElmer)以激发光为485nm，发射光为535nm，测量绿色荧光蛋白EGFP 的荧光强度。吸取20μl裂解液加入到96孔白色酶标板中(Greiner，655075)，并按 照Promega公司的Luciferase Assay System试剂盒说明书，加入30μl的荧光素酶底物， 立即将酶标板放入EnVision酶标仪中，600rpm振荡5秒混匀后，测量荧光的发光值。 最后以荧光素酶的荧光发光值除以EGFP的荧光强度值的比值，作为反应SREBP信号 活性的相对值，并以DMSO未处理组标准化为1。
对本发明化合物进行初步筛选时，采用3μM和10μM两个浓度，通过以上方法 测定其抑制SREBP信号通路的活性，测得的对SREBP通路进行抑制的效果如图1(B) 所示。
表1本发明化合物对SREBP信号通路的抑制活性筛选
Figure BDA0001487078810000281
随后对在初筛中活性较好的化合物进一步做更为详细的浓度梯度，同样通过上述方法测得的对SREBP通路进行抑制的半效抑制浓度IC50值如表2所示。
表2本发明化合物抑制SREBP报告基因活性的IC50
Figure BDA0001487078810000282
Figure BDA0001487078810000291
Figure BDA0001487078810000301
由图1和表2中的数据可以看出，本发明实施例化合物对SREBP报告基因均具有 显著的抑制效果，其中活性最强的化合物1G IC50为0.22μM。
实施例2、本发明化合物抑制SREBP的剪切加工成熟
以下方法用于测定本发明化合物抑制SREBP的剪切加工成熟。实验方法简述如下：将CHO-7细胞以6×105传到60mm培养皿中，培养1天后。吸掉培养基，PBS 洗1遍，去掉PBS，加入含有不同浓度化合物的去脂蛋白DMEM培养基(含10％去 脂蛋白和去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸，P/S)，处理15小时后， 再加入终浓度为10μM的MG132(Cayman，10012628)。处理1小时后，用细胞刮将 培养皿中的细胞刮下，转移到15ml离心管中，并置于冰上。4℃1000g离心5分钟后， 倒掉培养基，加入1ml PBS缓冲液，并转移至1.5ml离心管，4℃1000g离心5分钟。 去掉PBS，加入300μl SDS Lysis Buffer(10mM Tris-HCl(pH 7.6)，100mM氯化钠， 1％十二烷基硫酸钠和蛋白酶抑制剂)，过7号针头15次。13200rpm室温离心10分钟， 转移270μl上清至新1.5ml离心管，并加入90μl 4xLoading Buffer(1.2％十二烷基硫 酸钠，30％甘油，150mM Tris-HCl(pH 6.8)，0.6％β-巯基乙醇和适量溴酚蓝)，混匀后95度煮10分钟，储存于负20度冰箱中。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)检测SREBP的剪切加工
1)上样：每个蛋白样品上样量30μl加于8％SDS-PAGE胶中的胶孔。
2)电泳：先用85伏电压30分钟让蛋白进入浓缩胶，随后120伏1小时让蛋白进 入分离胶。
3)转膜：电泳结束后，取出凝胶按照滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸的顺序放 入转膜装置中，并注意排除气泡，100伏恒压转膜1.5小时。
4)封闭：转膜结束后，将硝酸纤维素膜浸泡于含有5％脱脂奶粉的TBST缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM氯化钠和0.05％Tween-20)中，室温摇床孵育1 小时。
5)一抗孵育：封闭完成后，用TBST缓冲液洗膜3次。加入4μg/ml的SREBP2 抗体(IgG-7D4，识别N-端仓鼠SREBP2的小鼠单克隆抗体)，室温孵育2小时或4 度过夜。回收抗体，将膜用TBST洗4次，每次8分钟。
6)二抗孵育：弃去TBST，加入1:5000稀释的羊抗小鼠HRP偶联二抗，室温孵 育1小时。TBST洗4次，每次8分钟。
7)显色拍照：将ECL发光底物覆盖于硝酸纤维素膜上，用保险膜封好，用LAS4000冷光/生物发光影像分析仪(Fujifilm)拍摄图片。
8)SREBP2剪切加工比例的定量分析，将得到的灰度图片用Image J(NIH)软件 进行定量分析，将核形式SREBP除以前体形式SREBP即为SREBP剪切加工的比例， 以未加药组为1。
测定结果如图2(A)所示，本发明化合物显著地减少了SREBP的核形式(n-SREBP)的形成，同时伴随前体形式SREBP(pre-SREBP)的增多。图2(B)定量分析结果显 示本发明化合物抑制SREBP剪切加工的活性非常强，其IC50值为0.046μM。
实施例3、本发明化合物对SREBP靶基因表达的抑制活性的测定
以下方法用于测定本发明化合物对SREBP靶基因表达的抑制作用。简述如下：
将Huh-7细胞以6×105传到60mm培养皿中，培养24小时。吸掉培养基，PBS 清洗1遍。去掉PBS，加入含有不同浓度化合物的去脂蛋白和去脂肪酸DMEM培养 基(含10％去脂蛋白和去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸，P/S)，处理 16小时。吸去培养基，加入1mlTRIzol(Sigma，T9424)，室温放置10分钟，将细胞 裂解液转移到1.5ml Eppendorf管中，随后用于mRNA的提取、逆转录合成cDNA以 及荧光实时定量PCR。
1、mRNA的提取和定量
1)每1ml TRIzol中加入200μl的氯仿，涡旋仪上剧烈振荡混匀，室温静置15分 钟。
2)4℃，13200rpm离心10分钟，转移500μl的上层水相至新的1.5ml Eppendorf 管中。
3)每份样品中加入600μl异戊醇，来回颠倒混匀。
4)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，管底可见乳白色RNA沉淀。每份 样品中加入1ml的70％乙醇(用DEPC处理过的去离子水稀释)，颠倒混匀。
5)4℃，13200rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀室温晾干，加入30μl DEPC处 理过的去离子水，充分溶解。
6)取2μl RNA到98μl水中，混匀后用分光光度计(Eppendorf)测定260nm的 光吸收值，计算样品浓度，测定260nm与280nm光吸收值的比值，计算样品纯度， 最终调整样品浓度为1μg/μl。
2、逆转录合成cDNA
cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆转录酶试剂盒。每50μl体系含有4μg 的RNA，1μg的OligodT，终浓度各为0.4mM的dNTP。
1)每个0.2ml PCR管中，加入4μl浓度为1μg/μl的RNA，1μl 1μg/μl的OligodT， 15μl DEPC水，混匀。
2)70℃变性5分钟，冰上骤冷。
3)每个反应体系中加入17μl DEPC水，10μl 5×MLV缓冲液，1μl dNTP(各10 mM)，2μl M-MLV逆转录酶，混匀。
4)37℃反应1小时。
5)70℃变性10分钟。
6)10℃降温5分钟，加入200μl水稀释cDNA。
3、荧光实时定量PCR
Realtime PCR采用盛元生物公司的Sharpvue 2x Universal qPCR Master Mix试剂。 每20μl体系中，Sharpvue 2x Mix:10μl，终浓度为0.5μM的引物，2μl模板cDNA(逆 转录产物稀释4倍用)，用水补至20μl。反应体系配置好后，混匀，每个样品3个复 孔。在Stratagene Mx30005P实时荧光定量PCR仪上按照以下程序运行：a.95℃热激 活5分钟，b.95℃变性30秒，c.60℃退火30秒，d.72℃延伸30秒，延伸结束后采集 荧光信号，e.b-d循环40次，f.溶解曲线分析：95℃15秒，60℃1分钟，以1％的速 度上升到95℃，95℃持续15秒，60℃上升到95℃的过程中采集荧光信号。运用比较 Ct法计算mRNA的相对含量，并标准化以DMSO组为1。
本实施例中荧光定量PCR采用的引物序列见表3。
表3本实施例中荧光定量PCR所用引物的信息
Figure BDA0001487078810000321
Figure BDA0001487078810000331
测定结果如图2(C)所示，本发明化合物1G能显著抑制SREBP靶基因：SREBP-2、HMGCR、HMGCS和SS的表达。1G在1μM时，SREBP-2下调了约40％，HMGCR、 HMGCS和SS下调了约80％。
上述试验结果证明本发明化合物对SREBP靶基因的表达具有显著的抑制作用。
实施例4、小鼠肝原代细胞中，本发明化合物对SREBP靶基因表达的抑制活性的 测定
小鼠肝原代细胞分离：
1)1％戊巴比妥钠麻醉小鼠后，迅速打开腹腔，找到下腔静脉，插入留置针，同 时剪断肝门静脉，以7.5ml/分钟的流速灌流150ml，灌流液为：137mM NaCl，5.4mM KCl,0.5mMNaH2PO4，0.4mM Na2HPO4，4.2mM NaHCO3，0.5mM EGTA，5mM Glucose，pH 7.4。
2)换0.15mg/ml的胶原酶溶液同样速度灌流100ml，胶原酶消化液为：137mM NaCl，5.4mM KCl,0.5mM NaH2PO4，0.4mM Na2HPO4，4.2mM NaHCO3，10mM HEPES，pH 7.4，15mg I型胶原酶(Worthington Biochemical)。每100ml溶液。
3)小心将肝摘下并转移入培养皿，用镊子撕碎包膜，将肝组织匀碎，去除包膜。
4)过70μm孔径的筛网，500rpm离心1分钟。小心吸去上清，取离心至管底的 细胞加入适量DMEM培养液(含10％FBS，P/S)，计数，按1x106细胞每60mm培 养皿接种培养。
5)4小时后换液，PBS洗1遍，加入含有不同浓度化合物的去脂蛋白和去脂肪酸DMEM培养基(含10％去脂蛋白和去脂肪酸血清，1μM洛伐他汀，10μM甲羟戊酸， P/S)，处理16小时后。吸去培养基，加入1ml TRIzol(Sigma，T9424)，随后用于 mRNA的提取、逆转录合成cDNA以及荧光实时定量PCR，方法同测试例3。本实施 例中荧光定量PCR采用的引物序列见表4。
表4本实施例中荧光定量PCR所用引物的信息
Figure BDA0001487078810000332
测定结果见图2(D)，利用分离得到的肝原代细胞，本发明中化合物1G显著抑 制SREBP靶基因：SREBP-2、HMGCR、HMGCS和SS的表达。1G在1μM时，SREBP-2 下调了约40％，HMGCR、HMGCS和SS下调了约50％。
本发明实施例化合物在原代肝细胞中，对SREBP靶基因的表达均具有显著的抑制作用，表明有降血脂的功效。
实施例5、本发明化合物不激活LXR
测定本发明化合物对LXR的影响，方法与实施例3相同，简述如下：在人肝癌细 胞系Huh7细胞中，加入含有不同浓度化合物的去脂蛋白和去脂肪酸DMEM培养基处 理后，进行mRNA的提取、逆转录和荧光实时定量PCR分析。本实施例中荧光定量 PCR采用的引物序列见表5。
表5本实施例中荧光定量PCR所用引物的信息
Figure BDA0001487078810000341
LXR的靶基因参与了胆固醇的外排和脂肪酸的合成，激活LXR后显著上调 SREBP-1c的表达，将导致脂肪肝的形成和高甘油三酯血症。图3(A)中的测定结果， 显示本发明化合物不激活LXR靶基因的表达，对参与脂肪酸合成的SREBP-1c、FASN 和SCD1有显著下调作用。而已知LXR激活剂TO901317(Sigma)显著地激活了所有 的LXR靶基因。
本实施例证明本发明化合物不激活LXR靶基因的表达，且对脂肪酸合成相关基因具有显著的抑制作用。
实施例6、小鼠肝原代细胞中，本发明化合物不激活LXR
在小鼠肝原代细胞中，测定本发明化合物对LXR的影响，方法与实施例4相同， 简述如下：首先分离小鼠肝原代细胞，加入含有不同浓度化合物的去脂蛋白和去脂肪 酸DMEM培养基处理后，进行mRNA的提取、逆转录和荧光实时定量PCR分析。本 实施例中荧光定量PCR采用的引物序列见表6。
表6本实施例中荧光定量PCR所用引物的信息
Figure BDA0001487078810000342
Figure BDA0001487078810000351
在肝原代细胞中，图3(B)中的测定结果显示本发明化合物1G不激活LXR靶 基因的表达，对参与脂肪酸合成的SREBP-1c、FASN和SCD1有显著下调作用。而已 知的LXR激活剂TO901317能成倍地激活上述脂肪酸合成相关的基因，将导致脂肪肝 的形成。
上述试验结果证明本发明实施例化合物1G在原代肝细胞中，不激活LXR靶基 因的表达，且对脂肪酸合成相关基因具有显著的抑制作用，不太可能导致脂肪肝的形 成。
实施例7、本发明化合物阻止饮食诱导肥胖小鼠体重和脂肪的增加
上述细胞实验表明本发明化合物强烈抑制SREBP蛋白的剪切加工，进而抑制SREBP靶基因的表达，抑制胆固醇和脂肪酸的合成。接下来在小鼠动物水平，分析本 发明化合物的降脂效果。以下所有小鼠实验的饲养方法都按照武汉大学实验动物中心 的动物饲养及使用条例。
小鼠实验方法如下：8周龄C57BL/6J小鼠(购自上海灵畅公司)随机分为4组， 每组5只小鼠。第1组小鼠喂养基础饲料(Chow Diet，CD)，同时每天灌胃一次生理 盐水。第2-4组小鼠喂养高脂高胆固醇血症饲料(Western Diet，WD)，Western Diet 也叫西方饮食饲料，含20％脂肪、1.25％胆固醇和0.5％胆酸钠。第2组小鼠同时每天 灌胃生理盐水一次；第3组小鼠通过灌胃给药洛伐他汀(Lovastatin，Lova)，给药量 为：60mg/kg体重/天；第4组小鼠灌胃本发明化合物1G，给药量：60mg/kg体重/天。 灌胃给药12周后，系统检测分析小鼠的各项代谢指标。
结果如图4(A)所示(采用统计学的常规One-way ANOVA检验分析，其中*表 示p<0.05，***表示p<0.001)，高脂高胆固醇饲料喂养12周后，生理盐水对照组小鼠 变肥胖，体重增加到31g。洛伐他汀给药组小鼠体重为27.5g，而本发明化合物1G给 药组小鼠体重为24.8g，和基础饲料组小鼠体重接近。以上结果说明本发明化合物1G 具有抑制高脂高胆固醇饲料诱导的小鼠体重的增加，具有减肥效果，而且效果比洛伐 他汀还显著。
高脂高胆固醇饲料诱导的肥胖，会导致脂肪的增加，通过摘取小鼠附睾垫白色脂肪并称重，将脂肪重量除以体重得到脂肪体重比。如图4(B)所示(采用统计学的常 规One-way ANOVA检验分析，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，****表示p<0.0001。)， 洛伐他汀轻度减少脂肪体重比，而本发明化合物1G比洛伐他汀更为显著地降低脂肪 体重比。
实施例8、本发明化合物改善小鼠血液和肝脏中胆固醇和甘油三酯水平
小鼠处死后，收集血液，室温放置1小时后，4℃1500g离心10分钟，取上清用 于后续测定。血液中总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖和游离脂肪酸的含量采用相应的试 剂盒，并按照厂家说明书测定(上海科华生物工程股份有限公司)。如图5(A)和(B) 所示(采用统计学的常规One-way ANOVA检验分析，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01， ****表示p<0.0001)，高脂高胆固醇饲料长期喂养后，小鼠血液中的总胆固醇和甘油三 酯水平成倍的增加，本发明化合物1G给药后，总胆固醇和甘油三酯水平均显著的下 降，而且下降的水平比洛伐他汀还要低。
小鼠肝脏中总胆固醇和甘油三酯的测定：小鼠采血后断颈处死，打开胸腔腹腔，剪开右心耳，从左心室灌流PBS约20ml。灌流后摘取肝脏，并剪下约50mg称重并 记录下重量，加入到含有1.2ml氯仿-甲醇(2：1)以及少量陶瓷珠的2ml组织破碎 管中，用Precellys24组织匀质器(Bertin)中5500rpm匀浆破碎10秒，共3次。匀 浆破碎后室温摇床旋转混匀1-2小时，然后室温13200rpm离心10分钟，吸取1ml 上清转移到新1.5ml离心管中，加入400μl双蒸水震荡混匀，室温放置10分钟后， 13200rpm再离心10分钟。去掉上层水相，吸取500μl下层有机相到新的1.5ml离心 管中，用氮气吹干，酒精溶解，按照上面同样的方法测定总胆固醇和甘油三酯含量。
如图5(C)和(D)所示(采用统计学的常规One-way ANOVA检验分析，其中* 表示p<0.05，***表示p<0.001，****表示p<0.0001)，本发明化合物1G显著降低了高 脂肪高胆固醇饲料诱导的肝脂中总胆固醇和甘油三酯的含量，而且比洛伐他汀更为显 著，具有降低脂肪肝的效果。
实施例9、本发明化合物显著提高饮食诱导肥胖小鼠的胰岛素敏感性
机体中脂肪酸和甘油三酯水平异常升高是诱发胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要原因。由于本发明化合物1G能有效降低血液和肝脏中总胆固醇和甘油三酯的脂质水平， 接下来检测了本发明化合物对小鼠胰岛素敏感性的作用效果。
葡萄糖耐受实验：小鼠给药12周后，实验开始前禁食饥饿过夜。第2天，对每只 小鼠进行称重并做好标记，根据小鼠体重腹腔注射D-葡萄糖溶液(2g/kg体重)。注 射后0、30、60、120分钟时利用血糖仪(强生)检测小鼠尾静脉血液中葡萄糖浓度。
胰岛素耐受实验：实验开始前禁食饥饿4小时，根据小鼠体重腹腔注射胰岛素(0.7U/kg)，注射后0、30、60、120分钟时利用血糖仪检测小鼠尾静脉血液中葡萄糖浓度。
如图6(A)-图6(D)所示(用统计学的常规One-way ANOVA检验分析，其中 *表示p<0.05，**表示p<0.01，****表示p<0.0001)，与正常基础饲料喂养的小鼠相比， 高脂高胆固醇饲料诱导的肥胖小鼠具有明显的葡萄糖和胰岛素耐受。洛伐他汀具有轻 微的改善作用，而本发明化合物1G显著的提高了饮食诱导肥胖小鼠的葡萄糖和胰岛 素敏感性。同时如图6(E)所示，本发明化合物1G也能显著降低饮食诱导肥胖小鼠 的血糖水平。

Claims (3)

1.式Ⅰ’所示化合物在制备预防和/或治疗代谢性疾病的产品中的应用；
所述代谢性疾病为高脂血症或II型糖尿病；
Figure FDA0003025824670000011
式Ⅰ’中，R2为-OH、-F或-H；
R9为取代的醇、酮或环氧，具体选自如下基团中任一种：
Figure FDA0003025824670000012
各式中，n均为0～4之间的数；
R'和R”均为碳原子数为1～4的烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式Ⅰ’所示化合物为式1G；
Figure FDA0003025824670000013
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式Ⅰ’所示化合物为式13A；
Figure FDA0003025824670000021
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