CN1098109A - 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺 - Google Patents

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Inventor
董晓杰
姚志建
徐明波
马贤凯
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Institute Of Basic Medicine Academy Of Military Medical Sciences
Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
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Institute Of Basic Medicine Academy Of Military Medical Sciences
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Abstract

本发明提供了以中试规模制备高级结构纯人重 组白细胞介素-2的方法，应用一步反相高效液相层 析法可有效去除杂质，一次上样可获纯品 300-1000mg，纯度为100％，比活性为1.5—1.7×107，制备时间仅90分钟。

Description

本发明涉及生物工程产物的制备，特别是涉及白细胞介素-2的纯化工艺。
天然人白细胞介素-2（Human Interleukin-2，）是由T细胞产生的细胞因子，目前被广泛用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病。由于天然人白细胞介素-2来源有限，已有人将人白细胞介素-2基因cDNA克隆化并成功地进行了表达，生产人重组白细胞介素-2。
人白细胞介素-2分子是由133个氨基酸组成的多肽链，其中第58、105、125位为半胱氨酸，58、105位半胱酸形成的分子内二硫键为活性必需。人重组白细胞介素-2（Recombinant Human Interleukin-2，简称rIL-2，下同）在大肠杆菌表达过程中以包涵体（Inclusion body）形式存在，因此纯化过程中易形成125位半胱酸与58位及105位半胱氨酸错配的二硫键，分子间形成的二硫键还会产生聚合体，另外可能含有还原态的白细胞介素-2，使rIL-2的活性降低。rIL-2在制备过程中易产生非均一组分，还含有变性/复性试剂等小分子杂质，在临床应用中会出现严重的毒副反应。现有的纯化技术尚无有效方法去除这些杂质，而且纯化工艺过程长，后处理繁琐（Weir-MP，J-Chromatogr.1987，Jun  19，396，209-15;Zhen-H，J.Interferon-Res.，[1990]10，Suppl.1，S53）。
本发明的目的是建立一种制备方法，从而获得具有比活性高和毒副反应低的高级结构纯的rIL-2。
发明的内容为：
本发明采用了反相高效液相层析法，利用rIL-2与其异构体和其他杂质的疏水性差异，通过优化分离条件，达到纯化rIL-2的目的。
1、人重组白介素-2工程菌发酵培养后收集的菌体经破菌和洗涤离心回收包涵体，用十二烷基磺酸钠溶解并进行变性处理，应用Sephacryl S200分离柱分离去除大分子量杂质和部分热原。用Sephadex G-25脱盐后加硫酸铜复性。
2、复性后样品进行反相高效液相层析分离，流动相为乙腈/水系统，应用线性梯度洗脱，去除内毒素、异构体等杂质。收集二硫键正确配对峰。
3、旋转蒸发去除绝大部分乙腈，经除菌过滤、分装后真空条件下冻干。
应用本发明建立的方法制备高级结构纯rIL-2，可以有效地去除各种杂质，纯度达100%，得到的产品质量符合国家规定的基因工程产品质量控制要求。应用本方法可以中试规模制备较大量的rIL-2高级结构纯品，制备所需时间仅90分钟，工艺简单，后处理方便。
本发明是这样实现的：
1、样品的制备
高效表达rIL-2的大肠杆菌悬浮液经过离心收菌，菌体洗涤后进行超声破碎，离心收集沉淀部分经洗涤和抽提去除菌体蛋白，应用含还原剂的溶液溶解抽提rIL-2，离心取上清液进行Sephcryl S200柱分离，收集分子量约15，500组分进行脱盐，用水稀释为1mg蛋白/ml的浓度，经硫酸铜氧化复性。
2、纯化
将上述样品以1-10ml/分钟泵入Spherisorb  C18色谱柱，上样完毕后以5-15ml/分钟的流速按以下线性梯度方式洗脱：
时间  0.1%三氟醋酸水溶液  0.1%三氟醋酸乙腈溶液
(分)  (%)  (%)
0  100  0
40  70  30
90  20  80
收集各洗脱峰，并留取小部分进行活性分析蛋白定量等分析。正确配对高级结构纯rIL-2的乙腈洗脱浓度为70%。
3、后处理
活性峰组分旋转蒸发去除乙腈后，经0.22μm膜除菌过滤后定量分装，经冷冻干燥，4℃密封保存。
利用本发明建立的中试纯化工艺进行了连续三批40升发酵产物的rIL-2纯化，下表为纯化结果。
连续三批40升发酵产物的rIL-2纯化结果
S200纯化  反相高效液相层析法
批号  菌体湿重
(g) IL-2(mg) 复性后比活(×106U/mg) IL-2(mg) 比活(×107U/mg)
91-07  210  3835.4  3.8  1634.5  1.60
91-08  198  3500.2  4.2  1092.7  1.65
91-09  201  3696.4  4.1  1675.2  1.51
活性测定采用H2TDR渗入法：
标准品为IL-2中国国家标准品
每批获得的纯品rIL-2的总活性约1.8-2.6×1010U，纯品量1.0-1.7g，比活为1.5-1.7×107U/mg
4、纯度测定
（1）经SDS（十二烷基磺酸钠）聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，纯度为100%，分子量为15，500
（2）反相高效液相色谱法测得，纯化后IL-2纯度为100%。
测定条件与方法：
色谱柱  μBondapak c18 3.9×300mm
流速  1.0ml/min
流动相及梯度如下表：
时间  0.1%三氟醋酸水溶液  0.1%三氟醋酸乙腈溶液
(分)  (%)  (%)
0  80  20
15  60  40
25  0  60
40  0  100
检测：280nm
（3）经凝胶过滤色谱法测定，纯度为100%。
测定条件和方法：
色谱柱  Protein Pak60
流动相  磷酸缓冲液（含0.1%SDS，PH6.6）
流速   0.8ml/min
检测  280nm
（4）结构分析
纯化后的rIL-2经氨基酸组分分析和肽链N端15个氨基酸残基分析，证明纯化后的rIL-2具有与天然rIL-2相同（N端为Ala）或相似（Met-rIL-2）的结构。
另经反相高效液相色谱对氧化和还原态的rIL-2进行分析，证明纯化后的rIL-2达到了高级结构纯。

Claims (1)

1、一种纯化人重组白细胞介素-2的方法，其特征是采用了一步反相高效液相层析法，流动相中含有乙腈，并且一次上样可获得纯品300-1000mg。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1062311C (zh) * 1996-12-27 2001-02-21 中国医学科学院基础医学研究所 人白细胞介素2衍生物与人心钠素衍生物的融合基因、其蛋白产物及应用
CN111676261A (zh) * 2020-06-24 2020-09-18 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺
CN111825757A (zh) * 2020-08-04 2020-10-27 沈阳何氏眼产业集团有限公司 去除重组il-18中热源的方法及制得的产品

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