CN1098109A - 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了以中试规模制备高级结构纯人重
组白细胞介素-2的方法,应用一步反相高效液相层
析法可有效去除杂质,一次上样可获纯品
300-1000mg,纯度为100%,比活性为1.5—1.7×107,制备时间仅90分钟。
Description
本发明涉及生物工程产物的制备,特别是涉及白细胞介素-2的纯化工艺。
天然人白细胞介素-2(Human Interleukin-2,)是由T细胞产生的细胞因子,目前被广泛用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病。由于天然人白细胞介素-2来源有限,已有人将人白细胞介素-2基因cDNA克隆化并成功地进行了表达,生产人重组白细胞介素-2。
人白细胞介素-2分子是由133个氨基酸组成的多肽链,其中第58、105、125位为半胱氨酸,58、105位半胱酸形成的分子内二硫键为活性必需。人重组白细胞介素-2(Recombinant Human Interleukin-2,简称rIL-2,下同)在大肠杆菌表达过程中以包涵体(Inclusion body)形式存在,因此纯化过程中易形成125位半胱酸与58位及105位半胱氨酸错配的二硫键,分子间形成的二硫键还会产生聚合体,另外可能含有还原态的白细胞介素-2,使rIL-2的活性降低。rIL-2在制备过程中易产生非均一组分,还含有变性/复性试剂等小分子杂质,在临床应用中会出现严重的毒副反应。现有的纯化技术尚无有效方法去除这些杂质,而且纯化工艺过程长,后处理繁琐(Weir-MP,J-Chromatogr.1987,Jun 19,396,209-15;Zhen-H,J.Interferon-Res.,[1990]10,Suppl.1,S53)。
本发明的目的是建立一种制备方法,从而获得具有比活性高和毒副反应低的高级结构纯的rIL-2。
发明的内容为:
本发明采用了反相高效液相层析法,利用rIL-2与其异构体和其他杂质的疏水性差异,通过优化分离条件,达到纯化rIL-2的目的。
1、人重组白介素-2工程菌发酵培养后收集的菌体经破菌和洗涤离心回收包涵体,用十二烷基磺酸钠溶解并进行变性处理,应用Sephacryl S200分离柱分离去除大分子量杂质和部分热原。用Sephadex G-25脱盐后加硫酸铜复性。
2、复性后样品进行反相高效液相层析分离,流动相为乙腈/水系统,应用线性梯度洗脱,去除内毒素、异构体等杂质。收集二硫键正确配对峰。
3、旋转蒸发去除绝大部分乙腈,经除菌过滤、分装后真空条件下冻干。
应用本发明建立的方法制备高级结构纯rIL-2,可以有效地去除各种杂质,纯度达100%,得到的产品质量符合国家规定的基因工程产品质量控制要求。应用本方法可以中试规模制备较大量的rIL-2高级结构纯品,制备所需时间仅90分钟,工艺简单,后处理方便。
本发明是这样实现的:
1、样品的制备
高效表达rIL-2的大肠杆菌悬浮液经过离心收菌,菌体洗涤后进行超声破碎,离心收集沉淀部分经洗涤和抽提去除菌体蛋白,应用含还原剂的溶液溶解抽提rIL-2,离心取上清液进行Sephcryl S200柱分离,收集分子量约15,500组分进行脱盐,用水稀释为1mg蛋白/ml的浓度,经硫酸铜氧化复性。
2、纯化
将上述样品以1-10ml/分钟泵入Spherisorb C18色谱柱,上样完毕后以5-15ml/分钟的流速按以下线性梯度方式洗脱:
时间 0.1%三氟醋酸水溶液 0.1%三氟醋酸乙腈溶液
(分) (%) (%)
0 100 0
40 70 30
90 20 80
收集各洗脱峰,并留取小部分进行活性分析蛋白定量等分析。正确配对高级结构纯rIL-2的乙腈洗脱浓度为70%。
3、后处理
活性峰组分旋转蒸发去除乙腈后,经0.22μm膜除菌过滤后定量分装,经冷冻干燥,4℃密封保存。
利用本发明建立的中试纯化工艺进行了连续三批40升发酵产物的rIL-2纯化,下表为纯化结果。
连续三批40升发酵产物的rIL-2纯化结果
S200纯化 反相高效液相层析法
批号 菌体湿重
(g) IL-2(mg) 复性后比活(×106U/mg) IL-2(mg) 比活(×107U/mg)
91-07 210 3835.4 3.8 1634.5 1.60
91-08 198 3500.2 4.2 1092.7 1.65
91-09 201 3696.4 4.1 1675.2 1.51
活性测定采用H2TDR渗入法:
标准品为IL-2中国国家标准品
每批获得的纯品rIL-2的总活性约1.8-2.6×1010U,纯品量1.0-1.7g,比活为1.5-1.7×107U/mg
4、纯度测定
(1)经SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定,纯度为100%,分子量为15,500
(2)反相高效液相色谱法测得,纯化后IL-2纯度为100%。
测定条件与方法:
色谱柱 μBondapak c18 3.9×300mm
流速 1.0ml/min
流动相及梯度如下表:
时间 0.1%三氟醋酸水溶液 0.1%三氟醋酸乙腈溶液
(分) (%) (%)
0 80 20
15 60 40
25 0 60
40 0 100
检测:280nm
(3)经凝胶过滤色谱法测定,纯度为100%。
测定条件和方法:
色谱柱 Protein Pak60
流动相 磷酸缓冲液(含0.1%SDS,PH6.6)
流速 0.8ml/min
检测 280nm
(4)结构分析
纯化后的rIL-2经氨基酸组分分析和肽链N端15个氨基酸残基分析,证明纯化后的rIL-2具有与天然rIL-2相同(N端为Ala)或相似(Met-rIL-2)的结构。
另经反相高效液相色谱对氧化和还原态的rIL-2进行分析,证明纯化后的rIL-2达到了高级结构纯。
Claims (1)
1、一种纯化人重组白细胞介素-2的方法,其特征是采用了一步反相高效液相层析法,流动相中含有乙腈,并且一次上样可获得纯品300-1000mg。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 93108868 CN1098109A (zh) | 1993-07-28 | 1993-07-28 | 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺 |
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CN 93108868 CN1098109A (zh) | 1993-07-28 | 1993-07-28 | 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1098109A true CN1098109A (zh) | 1995-02-01 |
Family
ID=4987369
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 93108868 Pending CN1098109A (zh) | 1993-07-28 | 1993-07-28 | 高级结构纯人重组白细胞介素-2的精制工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1098109A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1062311C (zh) * | 1996-12-27 | 2001-02-21 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 人白细胞介素2衍生物与人心钠素衍生物的融合基因、其蛋白产物及应用 |
CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
CN111825757A (zh) * | 2020-08-04 | 2020-10-27 | 沈阳何氏眼产业集团有限公司 | 去除重组il-18中热源的方法及制得的产品 |
-
1993
- 1993-07-28 CN CN 93108868 patent/CN1098109A/zh active Pending
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CN1062311C (zh) * | 1996-12-27 | 2001-02-21 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 人白细胞介素2衍生物与人心钠素衍生物的融合基因、其蛋白产物及应用 |
CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |