CN109810947B

CN109810947B - 一种抑制Th17细胞活化的间充质干细胞及其制备方法和应用

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Publication number: CN109810947B
Application number: CN201910047912.7A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 刘广洋; 张晨亮; 王皓
Original assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2039-01-18
Also published as: CN109810947A

Abstract

本发明公开了一种能够抑制Th17细胞活化的间充质干细胞，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，特异表达人白介素23受体类似物，从而竞争性抑制IL‑23与IL‑23受体的结合。因此可用于抑制IL‑23介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。本发明还公开了一种人白介素23受体类似物以及所述间充质干细胞的制备方法和应用。

Description

一种抑制Th17细胞活化的间充质干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基因修饰间充质干细胞制备方法，通过阻断IL23/IL23R传导通路，从而抑制Th17信号通路介导的炎症反应、治疗相关自身免疫性疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

人白介素23(hIL-23)由树突状细胞(DC细胞)、巨噬细胞或其他抗原递呈细胞分泌，是由p19和p40两个亚基以二硫键相连接组成的异二聚体结构的致炎因子[1]。IL-23与IL-12共有p40亚基,其编码基因位于人的5号染色体上；而p19为IL23特有亚单位蛋白，编码基因位于人的12号染色体上。研发发现[2]，IL23通过与其受体(IL-23R)结合，从而介导机体众多炎症反应。

人IL-23受体(IL-23receptor,IL-23R)mRNA全长2.8kb，含有11个外显子，编码蛋白为629个氨基酸残基。其蛋白结构分为细胞外结构(胞外区，包含信号肽)、跨膜结构区及胞内区等三部分组成[3]。IL-23R同样为异质二聚体结构,由与IL-12R共有的IL-12Rβ1亚单位(其与IL-12p40亚单位相结合),及自身特有的IL-23R亚单位(与IL23p19亚单位相结合)共同构成。IL-12Rβ1亚单位在T细胞、NK细胞(natural killer cells自然杀伤细胞)、DC细胞有表达。IL-23R亚单位主要表达于特定的Th17细胞,另有少量表达于B细胞和固有淋巴细胞[4]。IL-23可结合Th17细胞表面的IL-23受体(IL-23R)，活化JAK激酶并使IL23受体结构域酪氨酸磷酸化，进一步激活下游STAT、MAPK等信号通路，从而激活Th17细胞，使其分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等炎症因子[5]，而IL-17A/F(白细胞介素-17A/F)的分泌可激活效应细胞的NF-kB等炎症信号通路，从而引起下游一系列炎症因子(包括TNF-a、Il-1β及IL-6等)释放和炎症发生[6,7]；IL-17A/F也可通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位，刺激前列腺素和金属蛋白酶产生、以及抑制蛋白多糖合成，同时IL-17A可进一步促进趋化因子CCL20、CXCL1、3、5、6、8及VEGF等分泌，进而导致免疫细胞异常分化、过度增殖和免疫细胞的激活[6,8]。

研究发现[2,9]，通过阻断IL-23与其受体结合，可有效降低炎症性肠病、银屑病等众多自身免疫性疾病的发生。比如Ustekinumab(优特克诺单抗)，Guselkumab及Tildrakizumab等单抗药物可阻断IL-23/Th-17信号通路，从而抑制IL-23/Th17轴介导的组织器官的炎症反应，达到治疗炎症性肠病或银屑病的目的[10-13]。其中Ustekinumab单抗是靶向IL-12和IL-23的p40共同亚基的人源化单克隆抗体,而Guselkumab和Tildrakizumab单抗则是靶向IL-23p19亚基，从而抑制IL23p19亚基与其受体IL23R之间的结合，阻断Th17细胞下游激活信号。然而临床研究也发现，用上述单抗治疗病人时有数例患者发生心血管疾病和脑卒中，随后接受了内膜剥离术[14]。此外，用上述单抗治疗病人时有少数患者出现严重不良事件，包括冠状动脉疾病，充血性心力衰竭，病毒综合征，尿路感染，手术伤口蜂窝织炎和肝酶水平升高，这种不良反应更多发于高血糖、高血压及高血脂的病人。另外，上述抗体在使用过程中在部分病人(4％)血清中检测出抗单抗的抗体[14]，提示靶向药物的耐药性仍是单抗药物无法突破的难题。

基于此，亟需一种新的途径解决上述单抗的不足，用于制备治疗自身免疫性疾病(如炎症性肠病、银屑病及类风湿性关节炎等)的药物。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达人白介素23受体类似物，从而竞争性结合IL-23因子，特异性阻断IL23与其受体的结合，从而达到阻断IL23/IL23R传导通路、调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，最终治疗例如IL23/Th17轴介导的自身免疫性疾病的目的。

术语“间充质干细胞”(MSCs)来源于发育早期中胚层，因其具有的免疫调节及组织损伤修复双层功能，从而在自身免疫性疾病治疗中具有良好的临床应用前景。MSCs对炎症部位有较好的归巢和靶向作用，并通过分泌大量的可溶性细胞因子(如转化生长因子β(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、前列腺素(PGE2)等)从而抑制免疫细胞增殖、活化，抑制过激的淋巴细胞增殖和炎症因子释放，改善炎症局部微环境等[17-19]。同时间充质干细胞对损伤组织具有较强修复能力，其具有定向分化为内皮细胞替换损伤皮肤的能力，同时可通过分泌表皮生长因子(EGF)、角蛋白生长因子(KGF)等因子促进皮肤组织的损伤修复[20,21]。然而，间充质干细胞是否能够抑制Th17介导的炎症反应尚存在争议，且目前尚无报道将IL23R-ECD(受体胞外区)或IL23R-ECD:Fc(抗体Fc段)等受体类似物通过基因工程的方法表达于间充质干细胞中，从而阻断IL23与其受体的结合，因此，我们的技术方法具有独创性。

如上所述，高表达人白介素23受体类似物的间充质干细胞具有治疗银屑病等自身免疫性疾病的临床机理并具有降低单抗药物毒副作用和耐药性的机制。其作用表现在：1.间充质干细胞可通过抑制免疫细胞增殖、活化而治疗自身免疫性疾病；2.间充质干细胞对心脏、肝脏等主要器官具有较好的保护作用，因此可降低单抗药物的毒副作用；3.间充质干细胞可促进皮肤、膝盖等组织的损伤修复，从而对银屑病、类风湿关节炎等疾病具有较好的恢复作用。

本发明的第一方面在于提供一种能够抑制Th17细胞活化的间充质干细胞，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，特异表达人白介素17受体类似物，从而竞争性抑制IL-23与IL-23受体的接合，以用于抑制IL23/Th17轴介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。

作为本发明的一种实施方式，所述人白介素23受体类似物选自人白介素23受体胞外区(IL23R-ECD)或其突变体或异构体，以及所述人白介素23受体胞外区或其突变体或异构体与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段(可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)的融合蛋白。所述人白介素23受体胞外区或其突变体或异构体与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段融合，能够增加蛋白结构稳定性和生物学活性。其中，所述人白介素23受体的突变体包括，但不限于，IL-23R-R381Q,IL-23R-G149R和IL-23R-V362I等。

最新的研究发现，IL-23R及其突变体(例如，L23R-R381Q,-G149R,and-V362I)等通过阻断IL23因子与其受体结合，从而抑制IL23受体激活信号通路，降低细胞STAT3磷酸化及后续的炎性因子表达水平，在炎症性肠病、银屑病等方面具有良好的治疗效果[15,16]。所述IL-23受体包括但不限于IL-23受体胞外区及其类似物等。

作为本发明的一种实施方式，所述人白介素23受体胞外区包括人白介素23受体信号肽以及N-端结构域，所述IgG1的Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2、CH3以及铰链区。

在一个特定的实施方案中，所述人白介素23受体信号肽的氨基酸序列为SEQ No:1所示序列：MNQVTIQWDAVIALYILFSWCHG，所述N-端结构域的氨基酸序列为SEQ No:2所示序列：

GITNINCSGHIWVEPATIFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHFYKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMTCTWNAGKLTYIDTKYVVHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGGKKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFDTNFTYVQQSEFYLEPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSLFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTGHLTSDNRGD。

在一个特定的实施方案中，所述人免疫球蛋白G1的Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2和CH3以及铰链区，其编码蛋白为227氨基酸残基。

所述人免疫球蛋白G1的Fc片段的氨基酸序列为SEQ No:3所示序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

作为本发明的一种实施方式，编码所述人白介素23受体类似物的基因，全长为1740bp，编码580个氨基酸，分子量约为66.2kD，包括IL23受体胞外区编码基因、免疫球蛋白G1的Fc片段的编码基因。

本发明中，所采用基因修饰干细胞的方法包括但不限于，病毒表达载体转染、脂质体转染、电转移、基因编辑(例如Crispr/Cas9)以及mRNA转染等。用于基因修饰的间充质干细胞来源包括但不限于，骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等不同组织来源的间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

作为本发明的一种实施方式，所述基因修饰为病毒转染技术；优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术，慢病毒转染系统购于OriGene公司。目的基因IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc其3'-末段连接有IRES序列，后接增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因，形成IL23R-ECD-I-EGFP序列、IL23R-ECD:Fc-I-EGFP序列，即IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc融合蛋白，共同处于CMV启动子下游。

作为本发明的一种实施方式，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，通过慢病毒转染技术将人白介素23受体类似物基因导入人脐带间充质干细胞中，从而使间充质干细胞可表达IL23R-ECD、IL23R-ECD:Fc融合蛋白及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。

在一个特定的实施方案中，可通过荧光显微镜检测绿色荧光表达判断转染成功率，通过IgG1 ELISA方法确定Fc段表达情况，通过IL23受体ELISA方法确定IL-23受体类似物表达情况。

本发明的第二方面在于提供一种人白介素23受体类似物，其特征在于，所述人白介素23受体类似物由哺乳动物细胞表达，并且选自人白介素23受体胞外区结构域或其突变体或异构体,以及所述人白介素17受体胞外区结构域或其突变体或异构体与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段的融合蛋白。所述人白介素23受体类似物可竞争性抑制IL-23与IL-23受体的结合，从而可用于抑制IL-23介导的炎症相关信号通路以及炎症反应，其中所述IL-23受体包括但不限于IL-23受体胞外区及其类似物等。其中，所述人白介素23受体的突变体包括，但不限于，IL-23R-R381Q,IL-23R-G149R和IL-23R-V362I等。

作为本发明的一种实施方式，所述人白介素23受体类似物为所述人白介素23受体类似物或所述人白介素23受体胞外区与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段的融合蛋白，所述人白介素23受体类似物可分泌至宿主细胞外的培养液中，所述哺乳动物细胞为间充质干细胞。

本发明的第三方面在于提供一种根据本发明的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：

(1)利用病毒载体系统构建人白介素23受体类似物病毒表达质粒，

(2)将所述人白介素23受体类似物病毒表达质粒导入T细胞，收获病毒；以及

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达人白介素23受体类似物。

作为本发明的一种实施方式，所述制备方法包括：

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建人白介素17受体类似物慢病毒表达质粒，

(2)将所述人白介素17受体类似物慢病毒表达质粒分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒；

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达人白介素17受体类似物；优选地，所述人白介素17受体类似物选自人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体,以及所述人白介素17受体胞外区结构域或其突变体、异构体与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段的融合蛋白。

作为本发明的一种实施方式，所述制备方法包括：

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建人白介素23受体类似物慢病毒表达质粒，

(2)将所述人白介素23受体类似物慢病毒表达质粒分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒；

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达人白介素23受体类似物；优选地，所述人白介素23受体类似物选自人白介素23受体胞外区或其突变体或异构体,以及所述人白介素23受体胞外区或其突变体或异构体与免疫球蛋白G1、G2或G4的Fc片段的融合蛋白，其中所述人白介素23受体突变体包括IL-23R-R381Q,IL-23R-G149R和IL-23R-V362I。

优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术，慢病毒转染系统购于OriGene公司。目的基因IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc其3'-末段连接有IRES序列，后接增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因，形成IL23R-ECD-I-EGFP序列、IL23R-ECD:Fc-I-EGFP序列，即IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc融合蛋白，共同处于CMV启动子下游。

本发明的第四方面在于提供所述的间充质干细胞或人白介素23受体类似物在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述免疫性疾病包括人银屑病(parapsoriasis,PS)、人类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、慢性阻塞性肺炎(chronicobstructivepneumonia，COPD)、儿童多发性风湿性关节炎(JRA)、克隆氏病(Crohn’s disease,CD)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。

本发明具有以下突出的优点：

本发明所得到的经修饰的间充质干细胞能够高表达人白介素23受体类似物，所述人白介素23受体类似物包括IL23受体胞外区或所述IL23受体胞外区与免疫球蛋白G1的Fc片段的IL23-ECD:Fc融合蛋白，利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达人白介素23受体类似物至炎症部位而发挥作用。通过IL-23/IL23R阻断实验，可以确定基因修饰后的间充质干细胞表达的人白介素23受体类似物可以显著阻断IL23与其受体的结合。因此，所述经修饰的间充质干细胞表达的人白介素23受体类似物，能够特异性阻断Th17细胞介导的炎症信号通路，调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，从而达到治疗Th17轴介导的自身免疫性疾病的目的。

另外，现有IL23阻断性抗体等药物在人体内半衰期较短，单一疗程内需要反复多次大剂量注射，从而增加了治疗成本和药物毒副作用的发生。体外实验显示，基因修饰的间充质干细胞可在体外培养时持续分泌人白介素23受体类似物至上清液中，且该人白介素23受体类似物具有阻断IL23与其受体结合的能力，因此当使用人白介素23受体类似物基因修饰的间充质干细胞治疗银屑病等自身免疫性疾病时，单次注射细胞后即可在病人体内持续分泌融合蛋白，达到持续阻断IL23与其受体结合的目的，治疗效果更为持久、稳定，治疗成本和毒副作用更低。同时，间充质干细胞具有较好的免疫调节能力和组织损伤修复能力，因此该发明为银屑病等自身免疫性疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

附图说明

图1.IL23R-ECD蛋白或IL23R-ECD:Fc融合蛋白基因载体构建，目的基因IL23R-ECD:Fc 3‘-末段连接有IRES序列，后接增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因，形成IL23R-ECD-I-GFP、IL23R-ECD:Fc-I-GFP序列，共同处于CMV启动子下游。对照病毒为LV-GFP病毒，CMV启动子后表达EGFP基因。

图2.免疫荧光检测基因修饰间充质干细胞表达绿色荧光。LV-GFP、LV-IL23R-ECD-I-EGFP以及LV-IL23R-ECD:Fc-I-EGFP慢病毒转染后的间充质干细胞可表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)，而正常间充质干细胞(对照)则不表达EGFP。

图3.通过IgG1 ELISA检测试剂盒检测融合蛋白中IgG1 Fc的表达情况，发现IL23R-ECD:Fc-I-GFP基因修饰的间充质干细胞高表达IgG1(91±8.8ng/ml)，其他组均不表达IgG1。

图4.通过IL23R ELISA试剂盒检测MSC表达IL23受体类似物的情况，发现IL23R及IL23R:Fc基因修饰的间充质干细胞均高表达IL23受体(分别为：76±4.3ng/ml、87± 6.06ng/ml)，且IL23R:Fc-MSC表达IL23受体水平显著高于IL23R-MSC(IL23R-MSC vsIL23R:Fc-MSC，P<0.05)。而正常间充质干细胞以及对照组LV-GFP转染细胞不表达IL23受体。

图5.通过IL23/IL23R结合阻断实验，确定基因修饰后的间充质干细胞表达的IL23R-ECD蛋白和IL23R-ECD:Fc融合蛋白均可以显著阻断IL23与其受体的结合，且IL23R:Fc-MSC(IL23R-ECD:Fc)阻断IL23/IL23R结合的能力显著高于IL23R-MSC(IL23R-ECD)(IL23-MSC vs IL23R:Fc-MSC:#P<0.05)。而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP转染细胞上清液则没有阻断作用(**P<0.01)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：慢病毒基因载体构建

我们通过Genebank设计的IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc基因质粒，利用第四代慢病毒载体系统构建LV-IL23R-ECD-I-EGFP(简称LV-IL23R)以及LV-IL23R-ECD:Fc-I-EGFP(简称LV-IL23R:Fc)融合蛋白慢病毒表达质粒，并以LV-EGFP作为对照病毒(LV-null)(图1为慢病毒载体结构图)。

其中，所述慢病毒转染系统购于OriGene公司。目的基因IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc其3'-末段连接有IRES序列，后接增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因，形成IL23R-ECD-I-EGFP序列、IL23R-ECD:Fc-I-EGFP序列，即IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc融合蛋白，共同处于CMV启动子下游。

所述IL23R-ECD包括人白介素23受体信号肽以及N-端结构域，所述人白介素23受体信号肽的氨基酸序列为：

MNQVTIQWDAVIALYILFSWCHG(SEQ No:1)，所述N-端结构域的氨基酸序列为：

GITNINCSGHIWVEPATIFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHFYKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMTCTWNAGKLTYIDTKYVVHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGGKKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFDTNFTYVQQSEFYLEPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSLFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTGHLTSDNRGD(SEQ No:2)。所述Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2和CH3以及铰链区，其编码蛋白为227氨基酸残基，所述Fc片段的氨基酸序列为

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ No:3)。

实施例2：人脐带间充质干细胞种子库建立

人脐带来源于健康足月妊娠剖宫产孕妇供者，由有资质的国家二甲以上医院提供，由孕妇或其家属签订知情同意书和脐带采集登记表。脐带间充质干细胞提取、培养及细胞库建立等工作均在本公司GMP生产车间完成。细胞经分离培养并传代扩增至第2代(P2)后进行外源微生物、病毒、内毒素等检测；同时检测细胞免疫表型、分化能力及细胞生物学效力等。检测合格的细胞作为种子库细胞，置于-196℃液氮罐中保存。

实施例3：基因修饰间充质干细胞

将实施例1中所述慢病毒质粒载体分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G等框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒后感染MSCs，24h后加入嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。

实施例4：免疫荧光检测基因修饰干细胞表达绿色荧光蛋白

通过荧光显微镜检测病毒感染后细胞绿色荧光，发现LV-null及LV-IL23R-ECD-I-EGFP、LV-IL23R:Fc-ECD-I-EGFP均可成功转染MSCs细胞，感染率达到90％以上(图2为荧光显微镜检测基因修饰MSCs转染效果)。

实施例5：ELISA检测基因修饰的间充质干细胞表达IgG1

采用IgG1 ELISA检测试剂盒(购于Invitrogen公司)检测细胞上清中IgG1的含量，具体方法参照说明书；通过IgG1 ELISA检测试剂盒检测融合蛋白中IgG1 Fc的表达情况，发现IL23R:Fc-I-GFP基因修饰的间充质干细胞高表达IgG1(91±8.8ng/ml)，在随后的传代过程中，表达量有所降低，但代次间差异不显著(P>0.05)；而其他组细胞均不表达IgG1(参见图3)。

实施例6：检测基因修饰的间充质干细胞表达IL-23受体类似物水平

采用IL23受体ELISA检测试剂盒检测间充质干细胞表达IL23受体情况，结果发现IL23R-ECD-I-EGFP及IL23R-ECD:Fc-I-EGFP基因修饰的间充质干细胞均高表达IL23受体类似物(分别为：76±4.3ng/ml、87±6.06ng/ml)，且IL23R-ECD:Fc-I-EGFP基因修饰的间充质干细胞表达IL23受体类似物水平显著高于IL23R-ECD-I-EGFP基因修饰的间充质干细胞(P<0.05)。而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP转染细胞不表达IL23受体(参见图4)。

实施例7：检测基因修饰的间充质干细胞阻断IL-23及其受体结合的能力

采用IL23/IL23R结合阻断实验检测基因修饰间充质干细胞表达的IL-23受体类似物阻断IL23因子及其受体结合情况，具体方法如下：采用2ug/ml重组人IL23蛋白(购于R&Dsystems)包被酶标板，加入0、50、100、200ng/ml生物素结合的IL23R(购于BPS Bioscience公司)进行孵育，样品孔同时加入MSC(或E-MSC)细胞培养上清(原倍、2倍及4倍稀释)孵育2h，加入100ng/ml抗IL23中和抗体作为阳性对照；加入HRP结合的链霉亲和素(购于Invitrogen公司)作为二抗孵育30min，最后加入底物进行显色。通过IL23/IL23R阻断实验，发现IL23R-ECD-I-EGFP、IL23R-ECD:Fc-I-EGFP基因修饰后的间充质干细胞表达的IL23R-ECD和IL23R-ECD:Fc可以竞争抑制IL23因子与其受体的结合，且IL23R-ECD:Fc(IL23R:Fc-MSC)阻断效果显著强于IL23R-ECD(IL23R-MSC)(P<0.05)，而正常间充质干细胞以及对照组LV-EGFP转染细胞上清液则没有阻断作用(参见图5)。

通过IL23/IL23R阻断实验，确定基因修饰后的间充质干细胞表达的人白介素23受体类似物，特别是IL23R-ECD以及IL23R-ECD:Fc融合蛋白可以显著竞争性抑制IL17A与其受体的结合，从而阻断Th17信号通路的激活，治疗相关自身免疫性疾病，其中IL23R-ECD:Fc阻断效果显著强于IL23R-ECD。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

以下出版物通过引用并入本文。这些出版物在本文中由下面提供的数字引用。在该出版物列表中包括任何出版物不应被视为承认本文提及的任何出版物是现有技术。

参考文献：

1.Takahashi,T.,Y.Koga,and M.Kainoh,Anti-IL-12/IL-23p40 antibodyameliorates dermatitis and skin barrier dysfunction in mice with imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis.Eur J Pharmacol,2018.828:p.26-30.

2.Verstockt,B.,et al.,Biological therapy targeting the IL-23/IL-17axis in inflammatory bowel disease.Expert Opin Biol Ther,2017.17(1):p.31-47.

3.Boutet,M.A.,et al.,Role of the IL-23/IL-17 Axis in Psoriasis andPsoriatic Arthritis:The Clinical Importance of Its Divergence in Skin andJoints.Int J Mol Sci,2018.19(2).

4.Chen,X.,et al.,Development and Translational Application of aMinimal Physiologically Based Pharmacokinetic Model for a Monoclonal Antibodyagainst Interleukin 23(IL-23)in IL-23-Induced Psoriasis-Like Mice.J PharmacolExp Ther,2018.365(1):p.140-155.

5.Kagami,S.,et al.,Circulating Th17,Th22,and Th1 cells are increasedin psoriasis.J Invest Dermatol,2010.130(5):p.1373-83.

6.Hanley,T.L.and Z.Z.Yiu,Role of IL-17 in plaque psoriasis:therapeutic potential of ixekizumab.Ther Clin Risk Manag,2017.13:p.315-323.

7.Dong,J.and G.Goldenberg,New biologics in psoriasis:an update on IL-23 and IL-17 inhibitors.Cutis,2017.99(2):p.123-127.

8.Ratner,M.,IL-17-targeting biologics aim to become standard of carein psoriasis.Nat Biotechnol,2015.33(1):p.3-4.

9.Di Cesare,A.,P.Di Meglio,and F.O.Nestle,The IL-23/Th17 axis in theimmunopathogenesis of psoriasis.J Invest Dermatol,2009.129(6):p.1339-50.

10.Bilal,J.,et al.,A systematic review and meta-analysis of theefficacy and safety of the interleukin(IL)-12/23 and IL-17 inhibitorsustekinumab,secukinumab,ixekizumab,brodalumab,guselkumab and tildrakizumabfor the treatment of moderate to severe plaque psoriasis.J Dermatolog Treat,2018.29(6):p.569-578.

11.Langley,R.G.,et al.,Efficacy and safety of guselkumab in patientswith psoriasis who have an inadequate response to ustekinumab:results of therandomized,double-blind,phase III NAVIGATE trial.Br J Dermatol,2018.178(1):p.114-123.

12.Smolen,J.S.,et al.,A randomised phase II study evaluating theefficacy and safety of subcutaneously administered ustekinumab and guselkumabin patients with active rheumatoid arthritis despite treatment withmethotrexate.Ann Rheum Dis,2017.76(5):p.831-839.

13.Tausend,W.,C.Downing,and S.Tyring,Systematic review ofinterleukin-12,interleukin-17,and interleukin-23 pathway inhibitors for thetreatment of moderate-to-severe chronic plaque psoriasis:ustekinumab,briakinumab,tildrakizumab,guselkumab,secukinumab,ixekizumab,and brodalumab.JCutan Med Surg,2014.18(3):p.156-69.

14.Krueger,G.G.,et al.,A human interleukin-12/23 monoclonal antibodyfor the treatment of psoriasis.N Engl J Med,2007.356(6):p.580-92.

15.Sivanesan,D.,et al.,IL23R(Interleukin 23 Receptor)VariantsProtective against Inflammatory Bowel Diseases(IBD)Display Loss of Functiondue to Impaired Protein Stability and Intracellular Trafficking.J Biol Chem,2016.291(16):p.8673-85.

16.Capon,F.,et al.,Sequence variants in the genes for theinterleukin-23 receptor(IL23R)and its ligand(IL12B)confer protection againstpsoriasis.Hum Genet,2007.122(2):p.201-6.

17.Kim,J.Y.,et al.,Tonsil-derived mesenchymal stem cells(T-MSCs)prevent Th17-mediated autoimmune response via regulation of the programmeddeath-1/programmed death ligand-1(PD-1/PD-L1)pathway.J Tissue Eng Regen Med,2017.

18.Al Jumah,M.A.and M.H.Abumaree,The immunomodulatory andneuroprotective effects of mesenchymal stem cells(MSCs)in experimentalautoimmune encephalomyelitis(EAE):a model of multiple sclerosis(MS).Int J MolSci,2012.13(7):p.9298-331.

19.Uccelli,A.and D.J.Prockop,Why should mesenchymal stem cells(MSCs)cure autoimmune diseases？Curr Opin Immunol,2010.22(6):p.768-74.

20.de Mayo,T.,et al.,The role of bone marrow mesenchymal stromal cellderivatives in skin wound healing in diabetic mice.PLoS One,2017.12(6):p.e0177533.

21.Alexaki,V.I.,et al.,Adipose tissue-derived mesenchymal cellssupport skin reepithelialization through secretion of KGF-1 and PDGF-BB:comparison with dermal fibroblasts.Cell Transplant,2012.21(11):p.2441-54.

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝来生物科技有限公司

<120> 一种抑制Th17细胞活化的间充质干细胞及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Asn Gln Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile

1 5 10 15

Leu Phe Ser Trp Cys His Gly

20

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly His Ile Trp Val Glu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile Ser Ile Tyr Cys Gln Ala Ala

20 25 30

Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile

35 40 45

Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu

50 55 60

Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala

65 70 75 80

Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile

85 90 95

Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro Asp Glu Val Thr Cys Val Ile

100 105 110

Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys Thr Trp Asn Ala Gly Lys Leu

115 120 125

Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val His Val Lys Ser Leu Glu Thr

130 135 140

Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr

145 150 155 160

Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Val Trp Val Gln Ala Ala

165 170 175

Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys Gln Leu Gln Ile His Leu Asp

180 185 190

Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile

195 200 205

Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile Tyr Trp Asp Ser Gln Thr Thr

210 215 220

Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln

225 230 235 240

Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln

245 250 255

Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg

260 265 270

Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp Gln Pro Trp Ser Ser Leu Phe

275 280 285

Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

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100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

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130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

Claims

1.一种能够抑制Th17细胞活化的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞通过基因修饰的方法，特异表达人白介素23受体类似物，从而竞争性抑制IL-23与IL-23受体的结合；所述人白介素23受体类似物为人白介素23受体胞外区与免疫球蛋白G1的Fc片段的融合蛋白，所述人白介素23受体胞外区由人白介素23受体信号肽以及N-端结构域组成，所述IgG1的Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2、CH3以及铰链区，所述人白介素23受体信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示，所述N-端结构域的氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，所述人免疫球蛋白G1的Fc片段序列如SEQ ID No:3所示。

2.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，编码所述人白介素23受体类似物的基因，全长为1740bp，编码580个氨基酸，分子量约为66.2 kD，包括IL23受体胞外区编码基因、免疫球蛋白G1的Fc片段的编码基因。

3.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰为病毒转染技术。

4.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰为慢病毒转染技术。

5.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰为第四代慢病毒转染技术。

6.根据权利要求1-5任一项中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞。

7.一种权利要求1-6任一项中所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

（1）利用病毒载体系统构建人白介素23受体类似物病毒表达质粒，所述人白介素23受体类似物为人白介素23受体胞外区与免疫球蛋白G1的Fc片段的融合蛋白，所述人白介素23受体胞外区由人白介素23受体信号肽以及N-端结构域组成，所述IgG1的Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2、CH3以及铰链区，所述人白介素23受体信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述N-端结构域的氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，所述人免疫球蛋白G1的Fc片段序列如SEQ ID No:3所示；

（2）将所述人白介素23受体类似物病毒表达质粒导入T细胞，收获病毒；以及

（3）将收获的病毒转染至间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达人白介素23受体类似物。

8.根据权利要求7所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

（1）利用第四代慢病毒载体系统构建人白介素23受体类似物慢病毒表达质粒，

（2）将所述人白介素23受体类似物慢病毒表达质粒分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒；

（3）将收获的病毒转染至间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达人白介素23受体类似物。

9.根据权利要求1-6任一项所述的间充质干细胞在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用；所述免疫性疾病为人银屑病、炎症性肠病。