CN109797128A - 一种急性细胞铁过载模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种急性细胞铁过载模型的构建方法，所采用的铁源为8‑羟基喹啉铁。采用含有微量8‑羟基喹啉铁的培养基处理细胞，在短时间内即可得到铁过载的细胞。该方法所使用的材料易得，而且步骤简单、快捷高效，可以快速批量地得到铁过载的细胞。

Description

一种急性细胞铁过载模型的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种急性细胞铁过载模型的构建方法。

背景技术

8-羟基喹啉是常用的N、O双齿配体，可以形成多个金属配合物，在分析化学等方面有广泛的应用。三价铁可以与8-羟基喹啉形成络合物，反应式如下所示：

铁是一切生命体都不可缺少的必需元素，也是人体中最丰富的过渡金属元素，主要参与氧气的转运。铁过载是指铁的供给超过铁的需要。过量铁具有显著的毒性效应，使得铁过载的研究愈发重视。铁过载的常见原因一是遗传因素，二是输血过量。当患者接受了20个单位以上的红细胞输注或血清铁蛋白大于1000ug/L，就可诊断为铁过载。

人们已经逐渐认识到许多人类疾病与铁代谢紊乱相关。遗传性血色素沉着病(hereditary haemochromatosis，HH)、β-地中海贫血、阿尔兹海默病等都与铁的过量沉积相关。大量报道认为过量铁的摄取或铁状态的升高，铁能通过Fenton反应产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)以及刺激脂质过氧化(lipid peroxidation，LP)，损伤蛋白质和核酸。

虽然已经认识到了铁在铁过载疾病中发挥出的关键作用，但对其具体的发病机理知之甚少。因此如何构建细胞铁过载模型对铁过载相关疾病的研究具有重要意义。而目前现有技术的铁过载模型主要有两种，一种为体内铁过载模型，另一种为体外铁过载模型。体内铁过载模型构建方法主要通过喂食实验动物含铁食物，虽然其可真实模拟生物体细胞铁过载的整个过程，但其构建速度缓慢且步骤繁琐，整体效率低下，不能满足实验需求。体外铁过载模型的构建主要采用的化合物为柠檬酸铁铵。但是整个过程中，柠檬酸铁铵的作用效果较慢，且所需有效浓度较高。

现有技术中，尚未有关于快速构建细胞铁过载模型的报道，即急性细胞铁过载模型，很难满足当下即制即用的实验研究需要。因此急需提供一种急性细胞铁过载模型的构建方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，并提供一种急性细胞铁过载模型的构建方法。本发明的关键是以8-羟基喹啉铁作为铁源来诱导细胞铁过载，使用8-羟基喹啉铁的其中一个原因是其可以有效跨膜进入细胞，有效提高其作用效率。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种急性细胞铁过载模型的构建方法，包括以下步骤：

将摩尔比为1:2的氯化铁六水合物及8-羟基喹啉混匀后加入至DMSO，并不断搅拌直至完全溶解；然后过滤得到8-羟基喹啉铁母液；再将8-羟基喹啉铁母液稀释于培养基中得到含有8-羟基喹啉铁的培养基，其中8-羟基喹啉铁的浓度为1～10μM；使用含有8-羟基喹啉铁的培养基处理细胞，且处理时间小于等于4小时，最终得到铁过载的细胞。

作为优选，所述8-羟基喹啉铁母液的浓度为10⁵～10⁶μM。

作为优选，所述将8-羟基喹啉铁母液稀释于培养基的稀释倍数大于10000。

作为优选，所述处理时间小于等于1小时。

作为优选，所述培养基为DMEM/F12培养基或DMEM培养基。

作为优选，所述过滤得到8-羟基喹啉铁母液的操作中，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

作为优选，所述细胞为小鼠肝脏细胞、人成纤维肉瘤细胞或大鼠肝脏细胞。

本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

本发明提供的急性细胞铁过载模型的构建方法相比体内铁过载模型构建方法作用步骤简单、快捷高效，可快速批量地得到铁过载的细胞。8-羟基喹啉铁相较于柠檬酸铁铵而言，构建细胞铁过载模型所需的有效浓度更低，只需μM的量级即可；且作用时间更短。

附图说明

图1为8-羟基喹啉铁中的铁进入细胞不同时间后的细胞内铁含量；

图1A为10μM 8-羟基喹啉铁处理AML 12细胞0，15，30分钟后细胞内铁含量；

图1B为10μM 8-羟基喹啉铁处理HT-1080细胞0，15，30分钟后细胞内铁含量。

图2为5mM FAC处理HT-1080细胞0、0.5、1、2小时细胞内铁含量。

图3为10μM 8-羟基喹啉铁诱导10小时后，AML12、HT-1080和BRL 3A细胞的形态变化。

图4为5mM FAC处理HT-1080细胞24小时后细胞的形态变化。

图5为8-羟基喹啉铁处理细胞对细胞活性的影响；

图5A为不同浓度8-羟基喹啉铁处理AML12细胞24小时细胞活性的变化；

图5B为不同浓度8-羟基喹啉铁处理HT-1080细胞24小时细胞活性的变化。

图6为1、5、10、15mM FAC处理HT-1080细胞24小时细胞活性的变化。

图7为8-羟基喹啉铁、FeCl₃、8-羟基喹啉处理细胞的影响。

图7A为8-羟基喹啉铁(10μM),氯化铁(10μM)和8-羟基喹啉(20μM)处理AML 12细胞30分钟细胞内铁含量的变化；

图7B为8-羟基喹啉铁(15μM),氯化铁(15μM)和8-羟基喹啉(30μM)处理AML 12细胞不同时间对细胞活性的影响；

图7C为8-羟基喹啉铁(15μM)或8-羟基喹啉(30μM)处理AML 12细胞14小时对细胞LDH释放的影响；

图7D为8-羟基喹啉铁(15μM)或8-羟基喹啉(30μM)处理HT-1080细胞不同时间对细胞LDH释放的影响。

图8为8-羟基喹啉铁处理后AML12细胞的透射电子与扫描电子显微结构；

图8A为DMSO和8-羟基喹啉铁(10μM,)处理AML 12细胞4h后，细胞的透射电子显微结构；

图8B为DMSO和8-羟基喹啉铁(10μM,)处理AML 12细胞3h后，细胞的扫描电子显微结构。

图9为大鼠在0、8mg、16mg、24mg铁灌胃30天处理后，肝脏细胞的透射电子显微结构；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

以下实施例所用的AML 12细胞(小鼠肝脏细胞)、HT-1080细胞(NRAS突变的人成纤维肉瘤细胞)、BRL 3A细胞(大鼠肝脏细胞)购自ATCC细胞库。

以下实施例的主要试剂为：

FAC(柠檬酸铁铵)，氯化铁六水合物，8-羟基喹啉(8-HQ)，DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亚砜)，地塞米松购自Sigma公司(上海，中国)；Calcein-AM(钙黄绿素-乙酰羟甲基酯)购自Abcam公司；DMEM/F12培养基，FBS(胎牛血清)，PBS，链霉素，ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)试剂，EDTA-胰蛋白酶购自Gibco公司；Accutase细胞消化液购自BD公司；CCK-8(Cell counting Kit-8)细胞活性检测试剂购自MedChem Express公司；LDH(Lactatedehydrogenase，乳酸脱氢酶)检测试剂盒CytoTox Non-Radioactive CytotoxicityAssay购自Promega公司。

以下实施例的主要仪器为：

SANYO细胞培养箱(日本)，超净台，LEICA DCF295显微镜(意大利)，BDFACSCalibur流式细胞仪(美国)，Eppendorf离心机(德国)，SpectraMax M5微孔板检测系统(Molecular Devices公司，美国)，25cm2细胞培养瓶，96孔、6孔细胞培养板，JB-P5型石蜡包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，RM2016型病理切片机(德国徕卡系统有限公司)，微量移液器，Hitachi H-7650透射电子显微镜(日本)，Hitachi SU-8010扫描电子显微镜(日本)。

培养基的配置及使用方法为：

首先，称量0.2703g氯化铁六水合物和0.2903g 8-羟基喹啉(即摩尔比1:2)，混匀完全溶解于10mLDMSO中，经0.22μm微孔滤膜过滤即为8-羟基喹啉铁(Fe-8HQ)母液。将上述的8-羟基喹啉铁母液以不小于10000的稀释倍数稀释于培养基中。最终得到含有8-羟基喹啉铁的培养基，其中8-羟基喹啉铁的浓度可以是1～10μM，可根据需求调整。

AML 12细胞要用DMEM/F12培养基培养；HT-1080及BRL 3A细胞要用DMEM培养基培养。若需在培养基中添加8HQ、FeCl₃及FAC等物质，只需将上述物质以大于10000的稀释倍数稀释于所需培养基中即可。实施例中所述的对照即为只有DMEM培养基或DMEM/F12培养基，不添加其余物质。

为保证细胞的生长，在使用上述培养基或含有添加物质的培养基前，需要按照ATCC推荐方法对培养基进行配置。其中，配置后的DMEM培养液中额外含有质量分数为10％的胎牛血清、100μg/mL的链霉素、100IU/mL的青霉素；配置后的DMEM/F12培养液额外含有质量分数为10％的胎牛血清、100μg/m L的链霉素、100IU/mL的青霉素、100nM的地塞米松、质量分数1％的ITS。

细胞培养方法为：将AML 12细胞培养在DMEM/F12培养基中，HT-1080和BRL 3A细胞培养在DMEM培养基中。然后将上述细胞均放置于37℃，5％CO₂细胞培养箱内，当细胞生长融合至80％～90％时用胰酶消化传代。下述实施例中所述的处理即为使用该培养基培养细胞一定时间。

实施例1：细胞内铁水平测定。

1)试验前一天，将生长融合至80％～90％的AML 12和HT-1080细胞消化离心，然后以每孔2×10⁵个细胞数，接种至6孔细胞培养板，细胞生长24小时；

2)用8-羟基喹啉铁浓度为10μM的DMEM/F12培养基处理AML 12细胞0分钟、15分钟、30分钟；用8-羟基喹啉铁浓度为10μM的DMEM培养基处理HT-1080细胞0分钟、15分钟、30分钟；用柠檬酸铁铵为5mM(以铁计)的DMEM培养基处理HT-1080细胞0小时、0.5小时、1小时、2小时；

3)处理时间到后，弃去六孔板中培养基，用PBS轻轻洗涤两次，加入含有100nMCalcein-AM的PBS1mL，并置于细胞培养箱中15分钟使细胞染色；

4)染色时间到后，每孔加入600μL Accutase细胞消化液；然后加入2mL PBS将细胞收集至离心管中；然后在2500rpm转速下离心5分钟，弃去上清液；之后加入500μL PBS，使细胞重新悬浮；

5)通过BD FACSCalibur流式细胞仪的FL1通道检测细胞荧光信号，收集至少10000个细胞数用以分析计算，流式数据采用FlowJo_V10软件处理。每个试验进行三次独立操作。结果如图1、图2所示。

实施例2：光学显微镜观察拍照。

1)将生长融合至80％～90％的AML 12、HT-1080及BRL 3A细胞消化离心；之后以每孔2×10⁵个细胞数，接种至6孔细胞培养板中生长24小时；

2)分别用对照或8-羟基喹啉铁浓度为10μM的DMEM/F12培养基处理AML12细胞10小时；分别用对照或8-羟基喹啉铁浓度为10μM的DMEM培养基处理HT-1080及BRL 3A细胞10小时；含0mM或5mM柠檬酸铁铵(以铁计)培养液处理HT-1080细胞24小时；

3)到处理时间后，在LEICA DCF295显微镜下观察细胞形态，并在视野中选择三个随机区域拍照。每个试验进行三次独立操作，结果如图3、图4所示。

实施例3：细胞活性检测。

1)将生长融合至80％～90％的AML 12和HT-1080细胞消化离心；之后，每孔1×10⁴个细胞数分别接种至96孔细胞培养板上培养24小时；

2)①向含有AML 12细胞的96孔板中分别加入对照或8-羟基喹啉铁浓度为0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的DMEM/F12培养基；②向含有HT-1080细胞的96孔板中分别加入对照或8-羟基喹啉铁浓度为0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM的DMEM培养基；③向含有HT-1080细胞的96孔板中加入对照或FAC浓度为1mM、5mM、10mM、15mM(以铁计)的DMEM培养基；每个处理设置6个重复。

3)将上步细胞置于37℃、5％CO₂条件的细胞培养箱中培养；

4)一段时间后，分别吸取96孔板中的处理液，并添加提前配制好的CCK-8细胞活性检测试剂质量浓度为10％的培养基；然后继续置于37℃、5％CO₂条件细胞培养箱中培养1～4小时；

5)然后在SpectraMax M5微孔板检测系统上检测细胞活性，其中设置CCK-8检测参数为450nm。

6)将各组细胞的测定数值比上对照组数值并乘以100％得到各组细胞活性，以上试验均进行三次独立操作，其结果如图5、图6所示。

实施例4：细胞LDH释放检测。

1)将生长融合至80％～90％的AML 12和HT-1080细胞消化离心；之后以每孔1×10⁴个细胞数，各自接种至96孔细胞培养板中培养24小时；

2)打开CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒，解冻60mL测定缓冲液，并将其分装成5等分；取其中一份加入Substrate Mix，轻轻颠倒并摇晃，使Substrate溶解，得到测定液；

3)向含AML 12细胞96孔板中添加8-羟基喹啉铁浓度为15μM或30μM的DMEM/F12培养基，处理14小时；并设置一空白对照组(不含细胞及培养基)，另设两组对照分别添加DMSO浓度为15μM及30μM的DMEM/F12培养基；向含HT-1080细胞96孔培养板中添加8-羟基喹啉铁浓度为15μM或30μM的DMEM培养基处理细胞4小时、6小时、8小时、10小时；并设置一空白对照组(不含细胞及培养基)，另设两组对照分别添加DMSO浓度为15μM及30μM的DMEM培养基；

4)到达预定处理时间45分钟前，往其中一个DMSO对照组孔中加入10μL10×裂解液裂解细胞45分钟，以建立LDH释放最大值组；

5)到达预定时间后，将50μL96孔板中的培养基转移至新的96孔板中，然后加入50μL测定液，避光保存，室温孵育30分钟；

6)孵育时间到后，往各孔中添加50μL反应终止液，用注射器针头刺破较大气泡；在SpectraMax M5微孔板检测系统上检测LDH释放情况，设置参数为OD490nm；还需对各组细胞进行铁含量测量，测量方法与实施例1一致。

7)将各孔数据减去背景值，然后根据LDH释放(100％)＝100×处理组吸光度/LDH释放最大组吸光度计算得到最终结果。每个试验进行三次独立操作。结果如图7所示。

实施例5：大鼠体内铁过载模型。

本实施例所用的健康SD大鼠为雄性，4-5周龄，体重在100-105g范围，购自浙江中医药大学动物实验研究中心。

表1基础日粮组成

其中：

矿物质预混料a包括(基于全价料)：钙0.52％，磷0.20％，钾0.38％，钠0.11％，镁0.05％，铁52.02mg/kg，锌36.76mg/kg，锰11.33mg/kg，铜6.73mg/kg，钴0.02mg/kg，碘0.21mg/kg；

维生素预混料包括b(基于全价料)：维生素A 4.00IU/g，维生素D₃ 1.00IU/g，α-生育酚75.00IU/kg，硫胺素5.00mg/kg，核黄素6.0mg/kg，烟酸30.00mg/kg，泛酸15.00mg/kg，胆碱1000.00mg/kg，吡哆醇6.00mg/kg，叶酸2.00mg/kg，生物素0.20mg/kg，维生素B1225.00mg/kg，维生素K 0.90mg/kg。

1)大鼠饲养：SD大鼠饲养在浙江大学实验动物中心清洁级标准的鼠房中，温度维持在17-23℃，采用12小时光照/黑暗的照明系统。所有大鼠均饲养在不锈钢笼子中自由采食饮水。大鼠饲喂饲料采购自上海斯莱克实验动物有限公司，营养成分根据AIN-93G营养需求配制而成，其中含有120mg/kg铁元素，具体组成成分见表1。饲养一周以适应新环境后进行相应试验。所有试验均得到浙江大学实验动物福利伦理审查委员会的批准。

2)模型构建方法如下：

选取体重相近的大鼠随机分为四组，每组10个重复。对照组每天灌胃1ml0.01mol/L的HCl溶液，其余三处理组每天分别灌胃含8mg、16mg、24mg铁的0.01mol/L HCl溶液。试验期30天，每两天记录体重和采食量。屠宰前，大鼠禁食16h后使用水合氯醛麻醉，大鼠麻醉后通过心脏穿刺法采血。采取1ml血液分装于抗凝管中以备全血生化分析，其余血液分装于促凝管中，3500rpm，4℃离心十分钟后收集上层血清以备后续分析。采血后通过脊椎脱臼法处死大鼠，快速收集肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胰腺，同时在冰上快速刮取肠道黏膜。样品包裹好后通过液氮速冻并储存在零下80℃冰箱中待用。

3)铁含量的测试方法为：

之后采用全自动血液学分析仪测定血液中血红蛋白水平。血清铁由血清铁检测试剂盒测定，具体操作参照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书。肝脏、脾脏、肾脏、心脏以及胰腺的铁沉积情况由原子吸收分光光度计测定。原子吸收分光光度计测定的方法简单来说如下：切取脏器的相同部位并称重，加硝酸后放入微波消解仪中消解，然后通过去离子水稀释消解液并定容至容量瓶中，最后上机检测铁元素含量。结果如表2所示。

4)肝脏细胞的透射电镜观察：

迅速切取新鲜的小块肝脏样品固定于0.25％戊二醛溶液中，4℃固定过夜。然后倒掉戊二醛溶液，用0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15分钟；之后，在通风橱中用1％的锇酸固定样品2小时；再倒掉锇酸废液，用0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15分钟；然后用由低至高梯度浓度的乙醇溶液(包括30％，50％，70％，80％，90％和95％六种浓度)对样品进行脱水处理，每种浓度处理15分钟；再用100％的乙醇处理20分钟，然后过渡到纯丙酮处理20分钟。之后使用包埋剂与丙酮的混合液(体积比1:1)处理样品1小时，再用包埋剂与丙酮的混合液(体积比3:1)处理样品3小时，然后用纯包埋剂处理样品过夜。最后将经过浸蜡处理的肝脏样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。将样品放入LEICA EM UC7型超薄切片机中得到70-90nm的切片；切片经过柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10分钟，最后在Hitachi H-7650透射电子显微镜中观察肝脏及其结构并拍照。结果如图9所示。

数据分析

流式数据采用FlowJo_V10软件分析并作图，其他所有数据均以平均值±标准差(means±SD)或means+SD表示。数据分析采用GraphPad Prism(version 5.01)的One-wayANOVA进行统计分析，多重比较采用Bonferroni检验。实施例5的数据统计分析采用SPSS22.0版本软件(IBM，美国)。所有数据均以平均值±标准差(means±SD)表示。采用One-wayANOVA进行统计分析，多重比较采用Bonferroni检验。P<0.05为差异显著。

实施例1的结果分析如下：8-羟基喹啉铁诱导AML 12和HT-1080细胞诱导细胞铁过载情况如图1所示。FAC诱导HT-1080细胞诱导细胞铁过载情况如图2所示。Calcein-AM能够进入细胞，而且结合细胞内铁后即被猝灭。因此细胞内铁含量高，荧光信号弱，细胞内铁水平含量低，荧光信号强，因此能够反映细胞内的铁含量。设置细胞内基础铁含量所对应的荧光强度为90％。使用8-羟基喹啉铁浓度为10μM的DMEM/F12培养基处理AML 12后，在15分钟时，Calcein-AM的荧光信号降至2％(图1B)。HT-1080细胞的实验也出现了类似的结果(图1A)。而5mM的FAC处理HT-1080细胞0.5h后荧光信号为50％，2h后的荧光强度为15％(图2)。由此可知，8-羟基喹啉铁可在更短的时间内迅速提高细胞内铁含量，造成细胞急性铁过载。

实施例2的结果分析如下：光学显微镜观察显示使用10μM 8-羟基喹啉铁诱导10小时后，AML 12细胞、HT-1080细胞以及BRL 3A细胞均出现明显死亡现象(图3)。通过向培养液中添加过量柠檬酸铁铵可以诱导HT-1080细胞死亡(图4)，但所需时间为24h。

实施例3的结果分析如下：8-羟基喹啉铁诱导细胞死亡情况如图5所示，AML 12和HT-1080细胞对8-羟基喹啉铁均非常敏感，8-羟基喹啉铁对两种细胞的24小时半抑制浓度,均小于5μM(图5)。而FAC的含量即使达到10mM，其效果依然不能与8-羟基喹啉铁媲美(图6)。

实施例4的结果分析如下：Calcein-AM染色结果显示(图7A)，10μM FeCl₃对细胞内铁水平无明显影响。然而20μM 8-羟基喹啉可以小幅度地提高细胞内的铁水平，其原因可能为8-羟基喹啉和培养基中的微量铁络合并生成少量的8-羟基喹啉铁并导致细胞内铁水平的小幅度升高。8-羟基喹啉诱导的小部分铁的进入能够导致细胞内出现氧化应激，并降低细胞活性(图7B)。使用15μM 8-羟基喹啉铁诱导AML12细胞14小时将会导致LDH大量释放，这说明细胞死亡伴随着细胞膜的破裂。而且8-羟基喹啉与DMSO对照相比其LDH释放量几乎一致，这表明8-羟基喹啉诱导的轻微氧化应激并不会导致AML12细胞死亡(图7C)。此外，30μM8-羟基喹啉对LDH释放并无影响(图7D)。所以可以确定诱导细胞铁过载的有效化合物为8-羟基喹啉铁，而非8-羟基喹啉与FeCl₃。

实施例5的结果分析如下：

如表2所示，与对照组相比灌胃过量铁30天后，大鼠的血清铁含量并未出现显著差异，但三组灌胃过量铁大鼠的肝脏铁含量显著高于对照组(P<0.05)，且呈现剂量依赖。灌胃16mg和24mg铁组大鼠的脾脏铁含量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比，灌胃过量铁能够使得大鼠肾脏铁水平出现升高的趋势，而对心脏和胰腺铁水平无显著影响。

灌胃过量铁组大鼠肝脏细胞的内质网形态与对照组相似(图9)，未出现明显的膨胀现象；然而灌胃16mg铁和24mg铁组大鼠肝脏细胞的线粒体出现严重的膨胀现象(图中黑色箭头所示)，而且出现了细胞质的空泡化。图8为体外铁过载细胞的微结构；图8A为DMSO和8-羟基喹啉铁(10μM)处理AML 12细胞4h后，细胞的透射电子显微结构；图8B为DMSO和8-羟基喹啉铁(10μM,)处理AML 12细胞3h后，细胞的扫描电子显微结构。对比图8与图9可知，体外铁过载细胞模型与体内铁过载模型在细胞超微结构上存在相似性，因此体外铁过载细胞模型可以替代体内铁过载模型。

表2.过量铁对大鼠机体铁状态的影响

结论

综上所述，采用8-羟基喹啉铁作为铁源的急性细胞铁过载模型的构建方法是行之有效。8-羟基喹啉铁只需要将近千分之一的柠檬酸铁铵有效浓度，即可快速构建出体外细胞铁过载模型，即急性细胞铁过载模型。而且其机理与体内细胞铁过载模型具有相似性。而且本发明所用的方法步骤简单方便易操作，可用于批量生产急性铁过载的细胞。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将摩尔比为1:2的氯化铁六水合物及8-羟基喹啉混匀后加入至DMSO，并不断搅拌直至完全溶解；然后过滤得到8-羟基喹啉铁母液；再将8-羟基喹啉铁母液稀释于培养基中得到含有8-羟基喹啉铁的培养基；含有8-羟基喹啉铁的培养基中的8-羟基喹啉铁的浓度为1～10μM；使用含有8-羟基喹啉铁的培养基处理细胞，且处理时间小于等于4小时，最终得到铁过载的细胞。

2.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述8-羟基喹啉铁母液的浓度为10⁵～10⁶μM。

3.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述将8-羟基喹啉铁母液稀释于培养基的稀释倍数大于10000。

4.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述处理时间小于等于1小时。

5.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述培养基为DMEM/F12培养基或DMEM培养基。

6.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述过滤得到8-羟基喹啉铁母液的操作中，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤。

7.如权利要求1所述的一种急性细胞铁过载模型的构建方法，其特征在于，所述细胞为小鼠肝脏细胞、人成纤维肉瘤细胞或大鼠肝脏细胞。