CN109781872A - 植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，该方法对植烟土壤中的化感物质进行提取，并按照碱性、中性及酸性组分进行分离，浓缩后采用气质联用仪进行测定。本发明所述方法具有对植烟土壤化感物质提取专属性好、提取效率高、操作简单、检测快速灵敏等优点。

Description

植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法

技术领域

本发明属于植烟土壤分析技术领域，具体涉及植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法。

背景技术

在我国，受耕地资源和水利条件制约，烟田连作现象非常普遍。然而，烟草作为一种忌连作作物，常常会表现出连作障碍，比如：烟叶病虫害增多、产质量下降等。许多研究表明烟草连作障碍与化感自毒作用密切相关，植株根系分泌的化感物质可以通过影响细胞膜透性、酶活性、离子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白质和DNA合成等来影响烟株生长。因此，建立一种准确测定植烟土壤中的化感物质的方法，对探讨引起烟草连作障碍的物质因素，阐明和解决烟草连作障碍具有重要意义。

关于植烟土壤化感物质的提取及检测方法，目前相关研究及报道较少，吴文祥、陈冬梅等进行了烤烟根际土壤化感潜力评价及其自毒物质的GC-MS鉴定，但其仅对乙酸乙酯浸提的烤烟根际土壤酸性和碱性物质进行分离鉴定，且未对乙酸乙酯相提取物进行进一步分离，定量采用峰面积比进行，仅能确定各物质的相对含量。付建国等对轮作与连作烟田根际土壤酸性有机组分的初步分离与鉴定，但并未真正明确连作植烟土壤中哪些组分为化感物质，且对各物质定量采用面积归一法，测定的为相对含量，未指明哪些物质是真正具有化感自毒作用的物质，并未开发针对性的检测方法。

可见，为实现合理轮作，亟需建立一种能对植烟土壤中化感物质进行全面检测和合理定量分析的新方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其具有对植烟土壤化感物质提取专属性好、提取效率高、操作简单、检测快速灵敏等优点。

本发明可被提取并检测的化感物质包括邻苯二酚、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、丁醇、苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、邻苯二甲酸二异丁酯、邻,对二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯和对苯二甲酸；

所述提取方法为：(1)向土壤样品中加入甲醇/水混合液，震荡后离心取上清液，将上清液浓缩，并向其中加入盐酸调节至pH＝3.0，然后用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为提取液a、水相为提取液b；(2)将所述提取液b用氢氧化钠溶液调节至pH＝10.0，再用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为含有碱性化感物质的提取液B；(2)将所述提取液a用氢氧化钠溶液洗，得到含有中性化感物质的提取液N；(3)收集(2)中的水相，用盐酸调节至pH＝3.0，然后用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为含有酸性化感物质的提取液A；(4)将所述提取液B和提取液N均浓缩至1mL，得到待测液B和待测液N；所述提取液A浓缩至1mL后进行硅烷化处理，得到待测液A；

所述检测方法为：采用GC-MS分别对所述待测液B、所述待测液N和所述待测液A进行检测，并通过外标法确定化感物质的含量；所述GC-MS的色谱条件如下：

色谱柱：HP-5MS，30m x 0.25mm x 0.25μm；

载气流量：1mL/min；

进样口温度：230℃；

分流比：5:1；

进样量：1μL；

升温程序：40℃保持2min，然后以5℃/min升温至220℃保持10min，再以10℃/min升温至280℃保持3min。

进一步地，甲醇与水的体积比为2:1至5:1。

进一步地，每克土壤样品所需甲醇/水混合液不少于6mL。

进一步地，所述震荡的时间为60min-120min。

进一步地，所述硅烷化是指将硅烷化试剂加入到含有待测液A的色谱瓶中，拧紧瓶盖后在60℃反应1小时；其中所述硅烷化试剂为BSTFA+TMCS,99:1。

本发明的有益效果：

本发明所述植烟土壤中化感物质的提取方法通过酸碱调节可以分别对不同种化感物质进行充分提取，得到含有碱性化感物质的提取液B、含有中性化感物质的提取液N和含有酸性化感物质的提取液A，为全面测量土壤中的化感物质创造了条件，特别是将提取液A烷基化后再进行测量可以有效解决GC-MS对酸性物质检测峰型不标准、非挥发性酸性物质不易检出、色谱柱损耗大的问题。

在得到待测液B、待测液N和待测液A的基础上，本发明分别对它们进行检测，本发明所述检测方法可以准确测定13种化感物质，不仅检测快速、灵敏度高，而且选择性好、精确度高。

本发明可被检测出的化感物质种类多、含量准确，为阐明和解决烟草连作障碍具有重要意义，可广泛应用和推广。

附图说明

图1为植烟土壤化感物质提取流程图；

图2为植烟土壤提取液经分离得到的酸性组分的色谱图；

图2中：峰A为苯甲酸；峰B为对羟基苯甲酸；峰C为3-甲氧基-4-羟基苯甲酸；峰D为邻苯二酚；峰E为邻苯二甲酸，峰F为对苯二甲酸，峰G为邻,对二叔丁基苯酚。

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明的实施情况，但它们不构成对本发明的限定，仅作举例而已。同时通过具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

实施例1提取剂的筛选

取连作5年的植烟田块烟株根系土壤，在室内阴凉处自然风干，去除土壤中的石块、植物根系及腐殖质等，然后过2mm筛。称取25g土壤样品于250mL具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入提取剂，在回旋振荡器上以150rpm震荡提取60min，将锥形瓶中混合物转移至离心管，离心机上以4000转/分离心5min，将上清液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上浓缩，得到20mL土壤提取浓缩液。

为优化提取溶剂，分别采用表1中序号1-7的溶剂对土壤进行提取并浓缩至20mL，该浓缩液每毫升含有1.25g土壤的提取物。每个培养皿加5mL浓缩液，以5mL未浸提土壤的有机溶剂为对照，放置于通风橱中挥发干后加入5mL的水，每个培养皿内点播10粒的烟草种子，5次重复，培养10d后测定烟草根重，并计算提取物较对照对烟草根生长的抑制率。

表1：提取参数的筛选条件

结果表明：乙酸乙酯、正己烷提取物对烟草根生长几乎无抑制作用，表明采用这两种提取剂提取到的化感物质量非常少，采用氯仿、丙酮、水作为提取剂，提取物对烟草根生长的抑制率分别为16.78％、19.27％、24.76％，而采用甲醇、甲醇/水为提取剂，提取液对烟草根生长的抑制率达到50.32％、63.27％，对烟草生长的抑制作用最强，因此甲醇/水为最优的提取剂。

为进一步考察甲醇/水的比例及提取时间对提取效率的影响，考察了表1中序号7-10的提取方法，以对苯二甲酸、丁醇和邻苯二酚的含量为指标，考察不同提取条件对上述物质提取含量的影响，结果表明：采用甲醇/水体系作为提取剂，甲醇水比例在2：1～5：1时，提取液中上述物质的含量最高，若提取时间低于60min，上述物质含量下降，表明提取时间至少为60min。

实施例2烟植土壤中化感物质的确认

第一步：按照如图1所示的提取方法对土壤样品进行提取。

取连作5年的植烟田块烟株根系土壤，在室内阴凉处自然风干，去除土壤中的石块、植物根系及腐殖质等，然后过2mm筛。称取25g土壤样品于250mL具塞锥形瓶中，向锥形瓶中加入甲醇/水(体积比5:1)提取剂，在回旋振荡器上以150rpm震荡提取60min，将锥形瓶中混合物转移至离心管，离心机上以4000转/分离心5min，将上清液转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上浓缩，得到20mL土壤提取浓缩液。

向土壤提取浓缩液中滴加2％盐酸溶液，调节pH＝3.0，加入20mL乙酸乙酯萃取，分液，重复萃取3次，合并有机相得到提取液a，剩余水相为提取液b。

向提取液b中滴加8％氢氧化钠溶液，调节pH＝10.0，用20mL乙酸乙酯萃取，重复萃取3次并分液，合并有机相得到含有碱性化感物质的提取液B，水相1舍弃。

将提取液a用20mL NaOH溶液洗3次(每次用量为20mL)，得到含有中性化感物质的提取液N，收集水相2。

将水相2用2％盐酸溶液调节至pH＝3.0，将混合物用20mL乙酸乙酯萃取，分液，分液，重复萃取3次，合并有机相得到含有酸性化感物质的提取液A，水相3舍弃。

将所述提取液B和所述提取液N均浓缩至1mL得到待测液B和待测液N，装入棕色色谱瓶中备用；而所述提取液A浓缩至1mL后，先装入棕色色谱瓶中，之后向其中加入100μLBSTFA+TMCS,99:1，拧紧瓶盖置于烘箱中，在60℃下反应1小时得到待测液A，取出棕色色谱瓶备用。

第二步：对待测液A、待测液B和待测液N分别进行检测。

采用安捷伦公司1890A-5975C气相色谱-质谱联用仪对所述待测液B、所述待测液N和所述待测液A进行检测，并采用NIST谱库检索结合标准物质保留时间确认进行定性，外标法进行定量。

其中，色谱条件为：

色谱柱：HP-5MS，30m x 0.25mm x 0.25μm；

载气：He，流量1mL/min；

进样口温度：230℃；

分流比：5:1；

进样量：1μL；

升温程序：40℃保持2min，然后以5℃/min升温至220℃保持10min，再以10℃/min升温至280℃保持3min。

其中，质谱条件为：

离子源：电子轰击源(EI)；

离子源温度：230℃；

四级杆温度150℃；

EI电离能量：70eV；

GC-MS传输线温度：230℃；

扫描模式：35-1050amu全扫描。

通过质谱全扫描，NIST谱库检索，在酸性组分中检测出27种物质，在碱性组分中检测出18种物质，在中性组分中检测出22种物质。

采用基质培养的烤烟(云87)幼苗(6叶1芯)，用清水洗掉根系基质，移栽到250mL锥形瓶中，采用营养液培养，每个处理培养5瓶，每瓶加入0.2mL配制好的采用表1中序号9提取方法提取，采用上述检测方法检测到的物质溶液(共计67种)，营养液采用(阿农/霍格兰营养液配方)：每隔2d补充一次营养液，连续培养20d后，检测植株根系活力及植株的根干重。其中对植物根系活力和根生长有严重抑制作用的，且在非连作烟田中几乎检测不到的物质，确定为烟草连作化感物质。

表2为本方法确定的13种化感物质，这些物质在非植烟土壤中几乎检测不到，而在连作烟田根系土壤中含量高，且随着连作年限的增加其含量显著增加，其水溶液对烟苗根系活力及根生长表现出显著的抑制作用，因此确定13种物质为主要的烟株根系化感物质。

表2：不同处理对烟苗根系活力及根生长的抑制率(％)

实施例3本发明所述提取方法及检测方法的精确度实验

取连作3年土壤按照实施例1表1序号9的方法进行提取，采用实施例2中的检测方法进行检测，平行测定6组，13种化感物质6次平行测定的RSD值介于1.25％-5.63％之间(见表3)，可见，本发明所述提取方法和检测方法精确度高，重复性好。

表3：13种化感物质平行测定6组后的精密度

实施例4对不连作和不同连作年限植烟土壤的分析和对比

分别取不连作、连作1年、连作2年、连作4年、连作10年的田块烟株根系土壤，按照实施例1表1序号9的方法进行提取，采用实施例2中的检测方法进行检测，13种化感物质含量如表4所示：

表4：不同连作年限植烟土壤中化感物质含量

由表4可见，随着连作年限的延长，植烟土壤中的13种化感物质均呈现增加趋势，表明化感物质积累是引起烟草连作障碍的主要因素之一，因此在烟草种植中，应当合理采取轮作措施，以保证烟叶及烟区的可持续发展。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其特征在于：

所述化感物质包括邻苯二酚、邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、丁醇、苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛、邻苯二甲酸二异丁酯、邻,对二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异辛酯和对苯二甲酸；

所述提取方法为：(1)向土壤样品中加入甲醇/水混合液，震荡后离心取上清液，将上清液浓缩，并向其中加入盐酸调节至pH＝3.0，然后用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为提取液a、水相为提取液b；(2)将所述提取液b用氢氧化钠溶液调节至pH＝10.0，再用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为含有碱性化感物质的提取液B；(2)将所述提取液a用氢氧化钠溶液洗，得到含有中性化感物质的提取液N；(3)收集(2)中的水相，用盐酸调节至pH＝3.0，然后用乙酸乙酯萃取，分液所得有机相为含有酸性化感物质的提取液A；(4)将所述提取液B和提取液N均浓缩至1mL，得到待测液B和待测液N；所述提取液A浓缩至1mL后进行硅烷化处理，得到待测液A；

所述检测方法为：采用GC-MS分别对所述待测液B、所述待测液N和所述待测液A进行检测，并通过外标法确定化感物质的含量；所述GC-MS的色谱条件如下：

色谱柱：HP-5MS，30m x 0.25mm x 0.25μm；

载气流量：1mL/min；

进样口温度：230℃；

分流比：5:1；

进样量：1μL；

升温程序：40℃保持2min，然后以5℃/min升温至220℃保持10min，再以10℃/min升温至280℃保持3min。

2.根据权利要求1所述的植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其特征在于：甲醇与水的体积比为2:1至5:1。

3.根据权利要求2所述的植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其特征在于：每克土壤样品所需甲醇/水混合液不少于6mL。

4.根据权利要求3所述的植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其特征在于：所述震荡的时间为60min-120min。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的植烟土壤中化感物质的提取方法及检测方法，其特征在于：所述硅烷化是指将硅烷化试剂加入到含有待测液A的色谱瓶中，拧紧瓶盖在60℃反应1小时；其中所述硅烷化试剂为BSTFA+TMCS,99:1。