CN106706772B

CN106706772B - 烟草复合肥中致畸化合物的检测方法及应用

Info

Publication number: CN106706772B
Application number: CN201610676074.6A
Authority: CN
Inventors: 陈泽鹏; 万树青; 林先丰
Original assignee: China National Tobacco Corp Guangdong Branch
Current assignee: China National Tobacco Corp Guangdong Branch
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN106706772A

Abstract

本发明公开了一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法及应用。本发明采用科学的方法提取烟草复合肥中致畸物质，将提取所得的待检测样品液经气相色谱‑质谱（GC‑MS）检测，利用所得的质谱图，采用相应质谱图计算机检索的方法对保留时间为33min的特征峰所标记的化学成分进行确认是否含有致畸成分2‑（3‑次甲基哒嗪基）丙二酸二甲酯、9‑甲氧基甲基菲、3，3‑二甲基‑2‑次甲基1‑丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和/或（E）（3‑氧代‑4‑氟代‑1（3H）‑异苯并呋喃亚基）乙酸甲酯。本发明确定了烟田出现烟叶生长畸形另一关键影响因素：施用的肥料因含有致畸化合物而导致烟草生长畸形，为现有研究成果中二氯喹啉酸致畸烟草提供了重要的补充研究成果，为全面综合查明烟叶畸形生长原因、为烟叶畸形生长的综合治理提供了科学的依据。

Description

烟草复合肥中致畸化合物的检测方法及应用

技术领域

本发明涉及烟草种植技术领域，更具体地，涉及一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法及应用。

背景技术

烟草复合肥中含有氮、磷、钾等植物必需元素，复合肥的施用对于烟草的产量和品质具有决定性的影响。正因为如此，目前市场上出现了各种品牌的烟草专用复合肥。但这些复合肥鱼龙混杂，其中所含的养分和肥效差别很大，更重要的是，除了标准规定的营养成分以外，复合肥中所含的其他成分缺少监控和研究。

广东曾有烟叶产区因水稻田施用二氯喹啉酸防治杂草后，第二年种植烟草则出现生长畸形，烟叶质量受到严重影响，造成了较大的经济损失。针对该问题，广东省烟草公司联合相关科研院所开展了研究攻关，查明致畸原因是因土壤残留二氯喹啉酸等除草剂致烟草畸形生长。我国西南烟区也曾出现烟叶生长畸形的情况，主要症状为：植株叶片向叶背卷曲、皱缩、有的植株叶片向叶背弯曲呈船形、并具有整块田整齐一致发生的特点。烟叶质量明显下降，造成了较大的经济损失，严重影响烟农种烟的积极性，阻碍了烟区的稳定和发展。经过长期大量的研究试验和检测，排除了烟叶生长畸形是由二氯喹啉酸所引起的可能性。由此说明，烟草致畸的关键因素中，除了二氯喹啉酸残留导致的因素之外，还存在另外的关键因素。对此，现有技术缺乏进一步地研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是烟草致畸因素的监控技术不足，提供一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法。

本发明要要解决的另一技术问题是提供所述烟草复合肥中致畸化合物的检测方法的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，包括以下步骤：

S1.烟草复合肥中致畸物质的提取：分别采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇对复合肥样进行超声波提取，提取后除去样品残渣，所得滤液中加入适量无水硫酸钠，除去滤液中的水分，过滤，收集滤液得到样品滤液；将样品滤液经旋转蒸发浓缩，浓缩后的样品分别经石油醚、乙酸乙酯、乙醇溶解并定容得到待检测样品液；

S2.将待检测样品液经气相色谱-质谱(GC-MS)检测；

所述气相色谱的分析条件为：色谱柱：HP-1柱，30m×0.25mm；载气He；流量1mL/min；柱起始温度：50℃，保持1min，以3℃/min升至120℃，保持2min，然后以5℃/min升至220℃，保持50min；进样量0.1μl，采取分流进样，分流比为20：1；进样口温度220℃；

所述质谱的分析条件为：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；电子倍增器电压330V；质量范围扫描35～395amu；

S3.利用步骤S2所得的质谱图，采用相应质谱图计算机检索的方法对保留时间为33min的特征峰所标记的化学成分进行确认是否含有致畸成分。

优选地，步骤S1所述烟草复合肥中致畸物质的提取是称取3份烟草复合肥样品，每份10g；所述3份样品分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇进行超声波提取；所述定容是定容至10mL。用石油醚提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用石油醚溶解并定容，用乙酸乙酯提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙酸乙酯溶解并定容，用乙醇提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙醇溶解并定容。

进一步地，所述超声波提取的时间为40min。

进一步地，所述超声波的功率为280W。

所述的致畸成分为2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和/或(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯。

本发明同时提供了所述检测方法在防治烟草致畸方面的应用。具体是经检测后，如果复合肥中含有2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和/或(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯时，提示该复合肥不能使用于烟草种植方面。

本发明具有以下有益效果：

通过从植物病理学、农药残留分析等方面开展研究，确定了烟田出现烟叶生长畸形另一关键影响因素：施用的复合肥对烟草致畸的根本原因，为现有研究成果中二氯喹啉酸致畸烟草提供了重要的补充研究成果，为全面综合查明烟叶畸形生长原因、为烟叶畸形生长的综合治理提供了科学的依据。

进一步地，本发明针对烟草复合肥提供了针对性的气-质联用检测方法，能够准确科学地检判断烟草复合肥中是否含有致畸烟草的化合物，有效区分致畸肥料与非致畸肥料，为烟草种植选择安全性烟草复合肥提供有力的科学依据。

附图说明

图1血清学测定畸形烟叶三种病毒结果。

图2 PCR法检测烟草曲叶病毒结果。

图3 T1兴仁县乌沙镇纳姑村后槽子组受害土样二氯喹啉酸含量HPLC检测结果。

图4 S2石油醚GC-MS总离子流图。

图5 S2乙醇GC-MS总离子图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

本实施例提供一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，包括以下步骤：

S2.将待检测样品液经气相色谱-质谱(GC-MS)检测；

S3.利用步骤S2所得的质谱图，采用相应质谱图计算机检索的方法对保留时间为33min的特征峰所标记的化学成分进行确认。

步骤S1所述烟草复合肥中致畸物质的提取是称取3份烟草复合肥样品，每份10g；所述3份样品分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇进行超声波提取；所述定容是定容至10mL。用石油醚提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用石油醚溶解并定容，用乙酸乙酯提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙酸乙酯溶解并定容，用乙醇提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙醇溶解并定容。

进一步地，所述超声波提取的时间为40min。

进一步地，所述超声波的功率为280W。

如果分析结果中显示复合肥含有化合物2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯中的一种或多种，则判定该复合肥可能导致烟草畸形生长。

实施例2含有致畸化合物肥料的应用实验

(一)供试材料

供试肥料：①库存肥料(888)罗汉N:P:K＝12:12:24，实验代号为S1；②农户自购(与①库存肥料来源不一样)用剩肥料(888)罗汉N:P:K＝12:12:24，实验代号为S2；③兴义坪东烟叶站肥料N:P:K＝11:15:22，实验代号为S3；④普安罗汉乡罗汉村肥料N:P:K＝12:12:24，实验代号为S4。

供试植物：烟草品种K326：来源于中国烟草总公司广东省公司，心叶烟、苋色黎、黄瓜、西葫芦等鉴别寄主由华南农业大学植物病毒研究室保管提供。

抗血清：黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血清由华南农业大学植物病毒研究室保管提供。

供试土壤：受害田土壤：兴仁县乌沙镇纳姑村后槽子组，实验代号为T1；来自普安县罗汉乡罗汉村，实验代号为T2。

正常田土壤：兴仁县乌沙镇纳姑村后槽子组，实验代号为Z1；来自兴仁县屯脚镇泵街村鹅点组，实验代号为Z2。

试剂：二氯甲烷，硼砂缓冲液，甲醇为色谱纯，石油醚、乙酸乙酯、乙醇均为分析纯。仪器：HP 1100高效液相色谱仪，恒温培养振荡箱，RE-52C旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂生产，Finnigan TRACE气相色谱质谱仪：德国Finigan公司产品，配有NIST谱库。

(二)病理学检测

1.生物学测定

田间采回的烟草畸形叶，取1.0g叶加上10mL0.02mol/L磷酸缓冲液在碾钵中完全碾碎，通过机械摩擦接种法，接种温室培育的4～6叶期幼苗的顶部平展叶的普通烟(K326)、心叶烟、苋色黎、黄瓜、西葫芦等鉴别寄主各5株，以0.02mol/L磷酸缓冲液接种烟草为阴性对照，接种烟草花叶病毒(TMV)为阳性对照。接种的植株置于网室内，保持温度20～27℃。接种后72h内经常洒水保持叶面湿润。从接种第7d起，每天观察植株表现。第10d仍未显症者，再接种一次。观察植株一直到开花才结束。

2.血清学测定

参照clark&Adams(1984)的方法进行间接ELISA法检测，步骤如下：

⑴取烟草畸形叶样品0.1g，捣碎，加入1mL的抗原包被缓冲液(每1000mL中含1.59gNa₂CO₃，2.93g NaHCO₃，0.2g NaN₃，调节pH值至9.6)，转入1.5mL离心管中，2700g离心；

⑵加入200μL酶联板包被抗原，37℃下，2h；

⑶倒掉包被液，用PBST(每1000mL中，含2.2g Na₂HP0₄.12H₂O、0.2gKH₂P0₃、8.0gNaCl、0.2g KCl、0.2g NaN₃，调节pH至7.3，加0.5mL Tween-20)，洗板3次，每次3min；

⑷在不同酶标板上分别加入黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒的抗血清特异性IgG，每孔150μl，37℃，温育2h；

⑸倒掉此溶液，洗板，同前；

⑹加入酶标羊抗兔IgG，每孔100μl(工作浓度1：1000)，37℃下温育2h；

⑺倒掉此溶液，洗板，同前；

⑻加入底物浴液，每孔150μl，室温20～30min，每孔加1滴2mol/L的H₂SO₄终止反应；

⑼用450型酶标仪测OD₄₉₅值，重复三次。

3.嫁接试验

采用常规嫁接法将5株表现畸形叶的病株接穗分别嫁接在健康烟草植株的砧木上，置于网室内生长观察。反之，将5株健康烟株的接穗分别嫁接到病株的砧木上，置于网室内生长观察。

4.烟草曲叶病毒PCR测定试验

(1)CTAB法抽提植物总DNA；

(2)PCR检测体系：以所提取的烟草植物基因组总DNA为模板，用烟草曲叶病毒通用基因的特异引物P1、P2进行PCR扩增，以检测畸形烟草中是否含有烟草曲叶病毒。

①PCR反应体系如下：

②PCR反应程度

③琼脂糖凝胶电泳：待反应结束后，取扩增产物10μl与2μl溴酚兰混匀，于1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，以0.5×TBE为缓冲液，DL2000Marker为分子量参照。在5V/cm电场强度下电泳30min，用UVP凝胶成像系统观察电泳结果。

(三)受害土壤中二氯喹啉酸含量HPLC检测

取待测土壤样品50g，浸泡于pH10硼砂缓冲液100mL振荡1h、高速离心20min(6000r/min)，取上清液过0.45μm滤膜，HPLC测定。

HPLC测定条件：

(1)紫外吸收检定器；(2)色谱柱：HP ODS Hypersil 5μm，4.0×250mm；(3)流动相：甲醇：1％乙酸水溶液(体积比为60/40)；(4)流量：1mL/min；(5)检测波长为：240nm；(6)进样量：10μl；(7)保留时间：4.0～6.0min。

(四)盆栽生物测定实验

选用直径为17cm，高为13cm大小一致的花盆。采集建筑工地无污染的红色粘土(未使用过除草剂或其他农药)，每株烟草的化肥施用量为5g/kg。每个处理有三个重复。设未施肥料为对照。选取生长状况相近的烟苗，将肥料均匀的混入花盆的土内，栽入烟苗。定期观察烟苗是否会出现生长畸形的现象，并记录观察结果。

(五)气相色谱--质谱联用仪分析

1.肥料中致畸物质提取：分别称取S1、S2、S3、S4肥料各3份，每份10g。分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇进行超声波提取，超声波功率为280W，提取时间40min。提取液经滤纸过滤一次，除去样品残渣，滤液中加入适量无水硫酸钠，除去滤液中的水分。再过滤一次，收集滤液。在75℃下对样品滤液进行旋转蒸发，浓缩后样品S1、S2、S3、S4(石油醚提取)用石油醚溶解定容到10mL,浓缩样品S1、S2、S3、S4(乙酸乙酯提取)用乙酸乙酯溶解和并定容到10mL，浓缩样品S1、S2、S3、S4(乙醇提取)用乙醇溶解并用乙醇定容至10mL。进行气相色谱-质谱(GC-MS)检测。

2.色谱分析条件：色谱柱：HP-1柱，30m×0.25mm；载气He；流量1mL/min；柱起始温度：50℃，保持1min，以3℃/min升至120℃，保持2min，然后以5℃/min升至220℃，保持50min；进样量0.1μl，采取分流进样，分流比为20：1；进样口温度220℃。质谱分析条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；电子倍增器电压330V；质量范围扫描35～395amu。

二、结果与分析

(一)病理学检测结果

1.生物学测定

从田间采回的烟草畸形叶，通过机械摩擦接种法分别接种普通烟(K326)、心叶烟、苋色黎、西葫芦等鉴别寄主。结果显示，在接种5d后，其作为阳性对照(接种TMV和CMV)的烟草出现明显的花叶症状，而阴性对照在观察结束时都无任何症状。而用田间采回的烟草畸形叶接种烟草、以及其它任何病毒鉴别寄主，直至接种的所有植株开花，都没有畸形或任何其它不良症状出现。这表明，这些畸形烟草叶标样不能使这些鉴别寄主发病或致畸，这些畸形叶不是由TMV和CMV所引起的。

2.血清学测定

采用三种病毒(黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒、烟草曲叶病毒)的抗血清对烟草畸形叶标样进行间接ELISA实验。结果显示畸形叶标样的OD值与健康烟草标样的OD值都在0.045～0.056间，二者之间没有超过2倍，见图1所示，图1中，B3孔和B4孔为阳性对照。这表明烟草畸形叶标样与上述三种病毒没有血清学反应，即畸形叶标样体内不含有上述三种病毒。

3.嫁接试验

烟草畸形叶除了可能由植物病毒引起外，还可能由植原体、内立克次体、内病毒、螺旋体等病原物引起。为了证实或排除是否由这些病原物引起，所以本申请人进行了大量的嫁接实验。当将表现畸形叶的病株接穗嫁接在健康烟草植株砧木上，置于网室内生长，一个星期后发现，畸形叶接穗长出的新叶仍然畸形，但两个星期后新长出的叶则转为正常。当将健康烟株接穗嫁接到畸形病株砧木上，发现健康接穗长出的叶仍然正常。该实验在嫁接接穗开花时结束，所有自嫁接后长出的叶都表现正常。这表明，在畸形叶和畸形叶的植株体内不含有上述病原侵染物。

4.烟草曲叶病毒PCR测定试验

采用烟草曲叶病毒通用引物，对畸形叶进行烟草曲叶病毒进行PCR检测。结果表明，作为阳性对照的烟株能够扩增出病毒基因片段，表明PCR系统工作正常，而5个畸形烟草标样都没有扩增片段，这表明这些标样不含有烟草曲叶病毒。

(二)受害土壤中二氯喹啉酸含量HPLC检测结果

供试土壤样品T1，T2，Z1，Z2经HPLC检测，其中均未检测到二氯喹啉酸的特征峰，所以4个供试土壤样品中均不含有二氯喹啉酸，受害烟田中的烟草生长畸形不是由二氯喹啉酸造成的。结果见图3所示。

(三)盆栽生物测定实验结果

移栽烟苗10天后，分别施入肥料S1、S2、S3、S4，施用量为5g/kg。其中施用S2肥料的烟苗出现生长畸形现象。烟草畸形形态描述：初期，烟叶向叶片背面弯曲生长，叶片边缘向内卷曲，呈船状。随叶片逐渐生长，叶片边缘向叶背面卷缩，使叶片不能伸展，叶片变小狭窄呈线状，而且畸形叶片质地变厚，触摸时感觉不柔软，叶片发硬。

(四)S1、S2、S3、S4石油醚样品GC-MS指纹图谱分析

1.质谱图比较

其中，S2石油醚的质谱结果见图4所示。实验证明，S2石油醚的质谱图中出现保留时间在33min上有一个特征峰，而S1、S3、S4石油醚的质谱图则无此峰出现(图略)。

2.乙醇样品的GC-MS图谱分析

S2的图谱请见图5所示。从图5可以看出在S2乙醇样品中在33min的保留时间具有显著的峰的形态，而实验发现S1、S3和S4的乙酸乙酯和乙醇样品在保留时间33min时无明显的峰(图略)。

综上样品的GC-MS分析结果表明，致烟草畸形的化肥S2在保留时间在33min处都有一个特征的峰，该峰所含的物质分析是造成烟草生长畸形的原因之一。

(五)保留时间33min的化学成分分析。

采用相应质谱图计算机检索的方法对S2中保留时间为33min的所标记的化学成分进行检索，共检测出5种化学成分，用面积归一法计算它们的相对含量，结果列于表1。从分析结果表明，致畸与下列化合物2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯的一种或多种成分有关。

表1 S2中保留时间为33min的所标记的化学成分

实施例3不含致畸化合物肥料的应用实验

(一)供试材料

供试肥料：从广东烟草产区所采购的肥料中随机抽取烟草专用复合肥、硝酸钾、硫酸钾三种肥料样品，实验代号分别为G1、G2、G3。样品经本发明的气相色谱-质谱(GC-MS)检测，确认不含有2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2，2，1]庚烷和/或(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯。

供试植物：烟草品种K326。

供试土壤：采集建筑工地无污染的红色粘土(未使用过除草剂或其他农药)。

(二)盆栽生物测定实验

选用直径为17cm，高为13cm大小一致的花盆，每株烟草的化肥施用量为5g/kg。每个处理有三个重复。设未施肥料为对照。选取生长状况相近的烟苗，将肥料均匀的混入花盆的土内，栽入烟苗。定期观察烟苗是否会出现生长畸形的现象，并记录观察结果。

(三)盆栽生物测定实验结果

移栽烟苗10天后，分别施入肥料G1、G2、G3，施用量为5g/kg。经观察，试验和对照组烟株在整个生长期均无出现畸形形态。

Claims

1.一种烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 烟草复合肥中致畸物质的提取：分别采用石油醚、乙酸乙酯、乙醇对复合肥样进行超声波提取，提取后除去样品残渣，所得滤液中加入适量无水硫酸钠，除去滤液中的水分，过滤，收集滤液得到样品滤液；将样品滤液经旋转蒸发浓缩，浓缩后的样品分别经石油醚、乙酸乙酯、乙醇溶解并定容得到待检测样品液；

S2. 将待检测样品液经气相色谱-质谱（GC-MS）检测；

所述气相色谱的分析条件为：色谱柱：HP-1柱，30 m×0.25 mm；载气He；流量1 mL/min；柱起始温度：50℃，保持1 min，以3℃/min升至120℃，保持2 min，然后以5℃/min升至220℃，保持50 min；进样量0.1 μL，采取分流进样，分流比为20：1；进样口温度220℃；

所述质谱的分析条件为：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；电子倍增器电压330V；质量范围扫描35～395 amu；

S3. 利用步骤S2所得的质谱图，采用相应质谱图计算机检索的方法对保留时间为33min 的特征峰所标记的化学成分进行确认是否含有致畸成分；

所述致畸成分为2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3，3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2, 2, 1]庚烷和/或(E)(3-氧代-4-氟代-1(3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯。

2.根据权利要求1所述烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，其特征在于，步骤S1所述烟草复合肥中致畸物质的提取是称取3份烟草复合肥样品，每份10 g；所述3份样品分别用石油醚、乙酸乙酯、乙醇进行超声波提取；所述定容是定容至10 mL，用石油醚提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用石油醚溶解并定容，用乙酸乙酯提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙酸乙酯溶解并定容，用乙醇提取所得的滤液后续经浓缩后的样品则采用乙醇溶解并定容。

3.根据权利要求1所述烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，其特征在于，所述超声波提取的时间为40 min。

4.根据权利要求3所述烟草复合肥中致畸化合物的检测方法，其特征在于，所述超声波的功率为280 W。

5.权利要求1至4任一项所述检测方法在防治烟草致畸方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是采用权利要求1至4任一项所述检测方法检测烟草复合肥，如果烟草复合肥中含有2-(3-次甲基哒嗪基)丙二酸二甲酯、9-甲氧基甲基菲、3, 3-二甲基-2-次甲基1-丙酸基甲酯二环[2, 2, 1]庚烷和/或(E)(3-氧代-4-氟代-1 (3H)-异苯并呋喃亚基)乙酸甲酯时，提示该复合肥不能使用于烟草种植方面。