CN109776549B - 水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂及其制备方法和应用，该光敏剂是以水溶性共轭寡聚物为外围，卟啉为内核，通过缩合反应共价连接而成，得到的新型光敏剂具有良好的水溶性。由于水溶性共轭寡聚物的发射光谱和卟啉的吸收光谱有很好的重叠，可发生从水溶性共轭寡聚物到卟啉的荧光能量共振转移，当光敏剂与细菌共孵育时，阳离子水溶性共轭寡聚物通过静电作用吸附在细菌表面，在白光照射下，卟啉通过吸收共轭寡聚物的能量产生活性氧，最终杀死细菌，且最大抗菌浓度仅在纳摩尔级别，在光动力抗菌领域具有很好的应用前景。

Description

水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于光敏剂杀菌技术领域，具体涉及一类新型的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂，以及该类敏化剂的制备方法和在抗菌方面的应用。

背景技术

细菌对抗生素的抵抗已经成为临床治疗的一大挑战，因此发展一种快速有效的抗菌方法已经引起了人们的关注。近年来，卟啉和它的衍生物因其杰出的光物理性质和高的单线态氧产率已经被广泛应用于光动力学治疗领域。另外，阳离子共轭寡聚物是一类众所周知的π共轭材料，具有确定的分子结构，可调控的光物理性质及良好的生物相容性，已经引起了人们极大的兴趣。由于阳离子寡聚物带正电荷，可以吸附在带负电荷的细菌膜表面，为抗菌剂的设计合成提供了机会。

发明内容

本发明的目的是提供一类共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂，以及该光敏剂的制备方法，并为该类光敏剂提供一种新的用途。

针对上述目的，本发明所采用的光敏剂的结构式如下所示：

其中R选自以下式I、式II中任意一种：

其中m为1～6之间的任意整数，n为1～19之间的任意整数，p为整数1或2，R₁选自-N⁺(CH₃)₃Cl^-、-N⁺(CH₃)₃I^-、-N⁺(CH₃)₃Br^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃Cl^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃I^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃Br^-中任意一种。

上述光敏剂的结构式中，R为式I取代基时，其制备方法如下：

1、将2,5-二碘-4-甲氧基苯酚溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入碳酸钾，回流反应20～30min后，加入式III化合物，继续反应30～40min，反应结束后分离纯化得到式IV化合物；其中2,5-二碘-4-甲氧基苯酚与式III化合物、碳酸钾的摩尔比为1:1～4:1～4。

2、将式IV化合物和式V化合物溶解于脱气三乙胺和甲苯混合液中，在氮气条件下，依次加入醋酸钯和三(邻甲基苯基)磷，回流反应2～4h，分离纯化得到式VI化合物，式VI化合物再经过季铵化反应和酯水解反应得到式VII化合物；其中所述式IV化合物和式V化合物、醋酸钯、三(邻甲基苯基)磷的摩尔比为1:2～4:0.05～0.1:0.1～0.2。

式V、式VI中R₂选自-N(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂、Br中任意一种。

3、将5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式VII化合物溶解于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，再加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)和二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅60～72h，分离纯化得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂；其中所述5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式VII化合物、PyBOP、二异丙基乙胺的摩尔比为1:4～8:18～36:30～50。

上述光敏剂的结构式中，R为式II取代基时，其制备方法如下：

1、根据上述步骤1的方法合成式IV化合物。

2、将式IV化合物和式VIII化合物溶解于脱气三乙胺和三氯甲烷混合液中，在氮气条件下，依次加入碘化亚铜和双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)，室温搅拌16～24h，分离纯化得到式IX所示中间体，式IX所示中间体再经过季铵化反应和酯水解反应得到式X化合物；其中所述式IV化合物与式VIII化合物、碘化亚铜、双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)的摩尔比为1:2～4:1.5～3:0.1～0.2。

3、将5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式X化合物溶解于干燥的DMF中，加入PyBOP、二异丙基乙胺，在氮气保护下，室温搅60～72h，分离纯化得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂；其中所述5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式X化合物、PyBOP、二异丙基乙胺的摩尔比为1:4～8:18～36:30～50。

本发明水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂作为抗菌材料的应用，所述的菌为革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、变形杆菌等)或革兰氏阳性菌(如耐甲氧西林金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等)。

本发明的有益效果如下：

本发明光敏剂以水溶性共轭寡聚物为外围，卟啉为内核，通过缩合反应共价连接而成，得到的新型光敏剂具有良好的水溶性。由于水溶性共轭寡聚物的吸收光谱和卟啉的发射光谱有很好的重叠，在白光照射下，可发生从水溶性共轭寡聚物到卟啉的荧光能量共振转移，大大增强卟啉的抗菌能力，最大抗菌浓度仅在纳摩尔级别。该光敏剂优异的抗菌效果使其在光动力抗菌领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1所制备光敏剂的荧光光谱图。

图2是实施例2所制备光敏剂的荧光光谱图。

图3是实施例1所制备的光敏剂在避光和光照30min和60min后对耐甲氧西林金色葡萄球菌的抗菌活性图。

图4是实施例2所制备的光敏剂在避光和光照30min和60min后对耐甲氧西林金色葡萄球菌的抗菌活性图。

图5是实施例1所制备的光敏剂在避光和光照30min和60min后对大肠杆菌的抗菌活性图。

图6是实施例2所制备的光敏剂在避光和光照30min和60min后对大肠杆菌的抗菌活性图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、将25mL N,N-二甲基甲酰胺加入到100mL圆底烧瓶中，先加入2g(5mmol)2,5-二碘-4-甲氧基苯酚使其溶解完全后，再加入1.47g(11mmol)碳酸钾，升高温度至100℃，回流搅拌反应20min后，加入1.52mL(11mmol)式III-1所示4-溴丁酸乙酯，继续反应30min。反应结束后冷却至室温，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取,所得有机相经无水硫酸镁干燥2h后，减压浓缩，所得的粗产物经过硅胶柱层析分离纯化后真空干燥，得到式IV-1化合物。

2、将490mg(1mmol)式IV-1化合物和613mg(3mmol)式V-1化合物溶解于22.5mL脱气三乙胺和甲苯体积比为1:2的混合液中，再加入22.4mg(0.1mmol)醋酸钯和60.8mg(0.2mmol)三(邻甲基苯基)磷，在80℃下回流反应3h。反应结束后冷却至室温，用饱和食盐水和二氯甲烷萃取，所得有机相经无水硫酸镁干燥2h后,减压浓缩，所得的粗产物经过硅胶柱层析分离纯化后真空干燥，得到式VI-1化合物。将式VI-1化合物溶解于5mL三氯甲烷中，加入150μL碘甲烷，室温搅拌10h，将溶剂旋干得到中间体1。再将中间体1溶于2mL甲醇和1mL四氢呋喃的混合液中，然后加入1mL 0.5mol/L氢氧化钠水溶液，室温搅拌10h，再将溶剂旋干得到式VII-1化合物。

3、将7mg(0.01mmol)5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉和70mg(0.08mmol)式VII-1化合物溶解于4mL干燥的DMF中，然后向溶液中加入92mg(0.18mmol)PyBOP、60μL(0.3mmol)二异丙基乙胺，在氮气保护下，室温搅拌72h。反应结束后，用MWCO＝2000Da的透析袋透析3d，将所得溶液冷冻干燥得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂1。

实施例2

1、将25mL N,N-二甲基甲酰胺加入到100mL圆底烧瓶中，先加入1g(2.6mmol)2,5-二碘-4-甲氧基苯酚使其溶解完全后，再加入718mg(5.2mmol)碳酸钾，升高温度至100℃，回流搅拌反应20min后，加入1mL(5.2mmol)式III-2所示7-溴庚酸乙酯，继续反应30min。反应结束后冷却至室温，用饱和食盐水和乙酸乙酯萃取，所得有机相经无水硫酸镁干燥2h后,减压浓缩，所得的粗产物经过硅胶柱层析分离纯化后真空干燥，得到式IV-2化合物。

2、将697mg(1mmol)式IV-2化合物和613mg(3mmol)式V-2化合物溶解于22.5mL脱气三乙胺和甲苯体积比为1:2的混合液中，再加入22.4mg(0.1mmol)醋酸钯和60.8mg(0.2mmol)三(邻甲基苯基)磷，在80℃下回流反应3h。反应结束后冷却至室温，用饱和食盐水和二氯甲烷萃取，所得有机相经无水硫酸镁干燥2h后,减压浓缩，所得的粗产物经过硅胶柱层析分离纯化后真空干燥，得到式VI-2化合物。将式VI-2化合物溶解于5mL三氯甲烷中，加入130μL碘甲烷，室温搅拌10h，将溶剂旋干得到中间体2。再将中间体2溶于2mL甲醇和1mL四氢呋喃的混合液中，然后加入700μL0.5mol/L氢氧化钠水溶液，室温搅拌10h，再将溶剂旋干得到式VII-2化合物。

3、将7mg(0.01mmol)5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉和64mg(0.08mmol)式VII-2化合物溶解于4mL干燥的DMF中，然后向溶液中加入92mg(0.18mmol)PyBOP、85μL(0.48mmol)二异丙基乙胺，在氮气保护下，室温搅拌72h。反应结束后，用MWCO＝2000Da的透析袋透析3d，将所得溶液冷冻干燥得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂2。

实施例3

1、按照实施例2步骤1的方法制备式IV-2化合物。

2、将697mg(1mmol)式IV-2化合物和610mg(3mmol)式VIII-1化合物溶解于22.5mL脱气三乙胺和甲苯体积比为1:2的混合液中，再加入114mg(0.6mmol)碘化亚铜和210mg(0.3mmol)双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)，室温搅拌18h。反应结束后冷却至室温，用饱和食盐水和二氯甲烷萃取，所得有机相经无水硫酸镁干燥2h后,减压浓缩，所得的粗产物经过硅胶柱层析分离纯化后真空干燥，得到式IX-1化合物。将式IX-1化合物溶解于5mL三氯甲烷中，加入130μL碘甲烷，室温搅拌10h，将溶剂旋干得到中间体3。再将中间体3溶于2mL甲醇和1mL四氢呋喃的混合液中，然后加入700μL0.5mol/L氢氧化钠水溶液，室温搅拌10h，再将溶剂旋干得到式X-1化合物。

3、将7mg(0.01mmol)5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉和70mg(0.08mmol)式X-1化合物溶解于4mL干燥的DMF中，然后向溶液中加入92mg(0.18mmol)PyBOP、85μL(0.48mmol)二异丙基乙胺，在氮气保护下，室温搅拌72h。反应结束后，用MWCO＝2000Da的透析袋透析3d，将所得溶液冷冻干燥得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂3。

发明人将上述实施例1和实施例2制备的光敏剂分别用去离子水稀释到终浓度为10^-6mol/L后，在荧光分光光度计上测定其荧光强度，其中实施例1光敏剂的激发波长为384nm，实施例2光敏剂的激发波长为386nm。同时，以光敏剂合成所用寡聚物(式VII-1化合物和式VII-2化合物)和5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉(TPP)作对照实验。结果见图1和图2。

由图1、图2可知，实施例1和实施例2制备的光敏剂在426nm处的发射均被明显猝灭，同时在650nm处出现了卟啉的发射峰，而卟啉由于自身在水中的聚集没有明显的发射。此外，我们也测定了寡聚物/卟啉混合物的荧光光谱，与寡聚物相比，426nm处的荧光强度没有明显变化，并且在650nm处也没有卟啉的发射。这一结果表明本发明光敏剂被激发后，确实发生了从寡聚物到卟啉的荧光能量共振转移。

实施例4

实施例1和实施例2制备的光敏剂作为抗菌材料的应用

将储存在低温的耐甲氧西林金色葡萄球菌和大肠杆菌的菌液分别稀释10⁶倍、10⁷倍后，均匀的涂布在细菌固体培养基上，37℃下培养12h，然后从固体培养基上挑选一个单菌落置于液体培养基中震荡过夜。所得菌液通过离心沉淀的方法除去培养基后重悬在0.9％的氯化钠中备用。

向终浓度为2×10⁷的细菌悬浮液中分别加入不同浓度的光敏剂(实施例1和实施例2)，平行制备两组样品，在避光条件下孵育10min后，一组继续在避光条件下孵育30min和60min，另一组在白光下(90mW/cm²)照射30min和60min，没有加光敏剂的细菌悬浮液作为对照。光照或避光处理结束后，用细菌混合染料SYTO 24/PI(用于耐甲氧西林金色葡萄球菌)或SYTO 9/PI(用于大肠杆菌)避光染色15min，最后用流式细胞仪检测细菌存活率。取样量为100000个信号，信号收集选择FL1(530±15nm)通道收集绿色荧光信号，FL2(585±20nm)通道收集红色荧光信号。结果见图3～6。

由图3和图4可知，随着光敏剂浓度的升高，抗菌活性明显增加，当光敏剂浓度达到60nM时，白光照射30min，就会有90％的细菌被杀死，而当光照时间达到60min时，仅需光敏剂40nM就可以杀死90％以上的细菌，这说明本发明光敏剂对耐甲氧西林金色葡萄球菌的抗菌活性与光敏剂浓度和光照时间呈正相关，而且仅在纳摩尔级别就可以将细菌全部杀死。由图5和图6可知，本发明光敏剂对大肠杆菌的抗菌趋势与耐甲氧西林金色葡萄球菌相似，随光敏剂浓度的增加而增加，但由于大肠杆菌独特的外膜结构，需要更大剂量的光敏剂和更长的光照时间才能达到与耐甲氧西林金色葡萄球菌相同的抗菌效果，当光敏剂浓度为160nM，光照时间为60min时，超过90％的细菌被杀死。而在避光条件下，本发明光敏剂对两种细菌均不产生抗菌效果，说明其抗菌能力主要取决于活性氧的生成。

同时，发明人对实施例3所得光敏剂的抗菌活性采用上述方法也进行了测试，结果与实施例1和实施例2所得结果基本相同。

Claims (10)

1.一种水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂，其特征在于该光敏剂的结构式如下所示：

其中R选自以下式I、式II取代基中任意一种：

I

II

其中m为1～6之间的任意整数，n为1～19之间的任意整数，p为整数1或2，R₁选自-N⁺(CH₃)₃Cl^-、-N⁺(CH₃)₃I^-、-N⁺(CH₃)₃Br^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃Cl^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃I^-、-N⁺(CH₂CH₃)₃Br^-中任意一种。

2.一种权利要求1所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其中R选自式I取代基时，其特征在于该方法由下述步骤组成：

（1）将2,5-二碘-4-甲氧基苯酚溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入碳酸钾，回流反应20～30 min后，加入式III化合物，继续反应30～40 min，反应结束后分离纯化得到式IV化合物；

III IV

（2）将式IV化合物和式V化合物溶解于脱气三乙胺和甲苯混合液中，在氮气条件下，依次加入醋酸钯和三(邻甲基苯基)磷，回流反应2～4h，分离纯化得到式VI化合物，式VI化合物再经过季铵化反应和酯水解反应得到式VII化合物；

V VI

VII

式V、式VI中R₂选自-N(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂中任意一种；

（3）将5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式VII化合物溶解于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，再加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷和二异丙基乙胺，在氮气保护下室温搅60～72h，分离纯化得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂。

3.根据权利要求2所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述2,5-二碘-4-甲氧基苯酚与式III化合物、碳酸钾的摩尔比为1:1～4:1～4。

4.根据权利要求2所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述式IV化合物和式V化合物、醋酸钯、三(邻甲基苯基)磷的摩尔比为1:2～4:0.05～0.1:0.1～0.2。

5.根据权利要求2所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式VII化合物、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、二异丙基乙胺的摩尔比为1:4～8:18～36:0.1～0.5。

6.一种权利要求1所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其中R选自式II取代基时，其特征在于该方法由下述步骤组成：

（1）将2,5-二碘-4-甲氧基苯酚溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入碳酸钾，回流反应20～30 min后，加入式III化合物，继续反应30～40 min，反应结束后分离纯化得到式IV化合物；

III IV

（2）将式IV化合物和式VIII化合物溶解于脱气三乙胺和三氯甲烷混合液中，在氮气条件下，依次加入碘化亚铜和双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)，室温搅拌16～24h，分离纯化得到式IX所示中间体，式IX所示中间体再经过季铵化反应和酯水解反应得到式X化合物；

VIII IX

X

式VIII、式IX中R₂选自-N(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂中任意一种；

（3）将5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式X化合物溶解于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、二异丙基乙胺，在氮气保护下，室温搅60～72 h，分离纯化得到水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂。

7.根据权利要求6所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述式IV化合物与式VIII化合物、碘化亚铜、双(三苯基膦)氯化钯(Ⅱ)的摩尔比为1:2～4:1.5～3:0.1～0.2。

8.根据权利要求6所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述5,10,15,20-四(4-氨基苯)-21H,23H-卟啉与式X化合物、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、二异丙基乙胺的摩尔比为1:4～8:18～36:0.1～0.5。

9.权利要求1所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂作为非疾病的诊断和治疗目的的抗菌材料的应用。

10.根据权利要求9所述的水溶性共轭寡聚物功能化的卟啉光敏剂作为非疾病的诊断和治疗目的的抗菌材料的应用，其特征在于：所述的菌为大肠杆菌、变形杆菌、耐甲氧西林金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌中任意一种。

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