CN109750080B - 一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法 - Google Patents
一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法，本发明快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法是以花生幼苗离体子叶为接种对象，接种花生果腐病病原真菌的菌丝体，接种后置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养20天，接种2天后，每天观察发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；导入花生果腐病感‑抗模型中，筛选抗果腐病花生品种。本发明筛选花生抗果腐病种质资源的方法实验结果直观性强、易于分级鉴定，能够快速、高效率的鉴定大量种质资源，大大缩短了种质鉴定的筛选周期，快速为花生抗病育种提供优质资源。
Description
技术领域
本发明属于抗病种质资源筛选方法技术领域，具体涉及一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法。
背景技术
花生是世界重要的油料作物和经济作物，其地下结果的特性使其易受土传病害的影响。花生果腐病是一种土传病害，发病时，花生地上部分完好，地下部分发黑霉烂，极难防控并严重影响花生品质。近年来此病在我国北方产区呈连年加重之势。该病害已成为花生生产上的一种主要病害，对花生的产量和品质构成了严重的威胁。花生果腐病的病原复杂致使果腐病的防控困难，无论是使用杀菌剂还是采用栽培手段，都不能预防果腐病的发生，因此抗病育种无疑是经济安全有效的花生果腐病防控手段。
已有研究证明，花生果腐病的病原是复合病原(Peanut pod rot complex)，包括病原真菌、植物寄生线虫和土壤螨类等，其中多真菌病原菌互作是主要致病因素。从1968年首次鉴定出果腐病病原真菌之后，陆续鉴定出多种病原菌。在我国鉴定出的病原菌以镰孢菌、链格包霉菌等为主。目前对于花生果腐病的研究多集中在已知病原菌的分类和鉴定上，而且花生与果腐病病原菌之间的关系还不明确，几乎所有的花生品种对于果腐病都没有抗性，花生不同部位组织对果腐病的易感程度不同，因此，针对花生易感果腐病部位筛选花生抗病种质资源的是目前对抗花生果腐病的重中之重。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法，步骤如下：
1、花生果腐病感-抗模型的建立
取花生不同品种、饱满、健康、无霉变的种子，每品种花生种子分为两份，其中一份用于培育花生幼苗，在幼苗果腐病易感部位上接种果腐病病原菌；另一份用于大田种植，收获得鲜种子直接接种果腐病病原菌；每天记录观察鲜种子和幼苗果腐病易感部位的果腐病发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；将不同感抗病品种鲜种子对应的花生幼苗果腐病易感部位果腐病发病情况作为花生果腐病感-抗模型；
其中，将鲜种子中：
接种5天出现病斑，发病率90％以上，种子接种点腐烂，病斑直径0.5cm以上为易感病(HS)品种；
接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，种子接种位置发黑，病斑直径0.2～0.5cm为感病(S)品种；
接种7天无病斑，发病率在10～20％，种子接种位置发黄为抗病(R)品种；
接种7天无病斑，发病率在10％以下，接种位置无变化，种子可以正常生长发芽为高抗病(HR)品种；
统计不同感抗病品种鲜种子对应的花生幼苗离体子叶的发病情况，
将不同感抗病品种鲜种子对应的花生幼苗子叶的发病情况作为花生果腐病感-抗模型。
所述花生果腐病感-抗模型为：
易感病(HS)：接种5天出现病斑，发病率90％及以上，子叶整体发黑，接种点腐烂，病斑直径1cm以上；
感病(S)：接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，子叶整体发黄，接种位置发黑，病斑直径0.3cm～1cm；
抗病(R)：发病率在20％～10％，接种位置发黄；
高抗病(HR)：发病率在10％以下，接种位置无变化，整个茎部正常生长。
2、筛选抗果腐病花生品种
(1)果腐病病原真菌的培养：将PDA斜面培养基上保存的花生果腐病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌种ACCC37064，接种于PDA固体培养基上，在25℃恒温培养箱中培养15天，以菌丝体作为接种病原物形态；
(2)花生幼苗培育及易感果腐病部位组织分离：将待筛选花生种子放在无菌水中浸泡8小时后铺于平皿上培养至露白，后单粒摆放在水培培养箱上，加适量水并且每隔3天添加MS培养液，培养至20天，花生幼苗真叶4片，全长10-15cm，将幼苗用无菌水洗净，分离花生易感果腐病部位组织；
(3)离体组织培育：在无菌培养皿内平铺一层厚度为0.3cm的脱脂无菌棉，加入10ml无菌水，保持水分和湿度，将花生离体组织铺在湿棉花上，置于25℃光照培养箱中光照16小时，黑暗8小时培养2天待用；
(4)果腐病病原菌的接种：超净工作台中将准备好的花生离体组织置于培养皿，接种时先用接种针轻轻划伤花生离体组织表面，然后将菌丝体直接置于伤口处，接种块大小为直径0.5cm，封板置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养20天，以不接种致病菌的花生离体组织作为对照组；
(5)每天记录观察离体组织的发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；导入花生果腐病感-抗模型中，筛选抗病花生品种。
在上述方案的基础上，所述花生易感果腐病部位为花生幼苗子叶。
田间花生鲜种子感染果腐病后的表型最能反映花生品种属于易感病(HS)、感病(S)、抗病(R)还是高抗病(HR)的品种，如果利用花生鲜种子来鉴别花生品种的抗病类型会延长鉴定的周期，增加鉴定的工作量。因此，我们创造性的提出利用花生的子叶来代替花生鲜种子来鉴定筛选抗果腐病的花生品种，不但可以节约大量的鉴定时间，而且会显著降低育种前期花生品种抗病性状筛选的工作量。
本发明技术方案的优点
本发明建立了一套快速筛选花生抗果腐病种质的方法，该方法根据室内培养花生离体组织接种病原真菌后的表型，对花生感染果腐病后发病程度进行分级，并根据不同离体组织的发病情况，建立了以花生子叶为快速筛选花生抗病种质的组织部位的花生感染果腐病的抗-感模型。通过子叶发病程度能够直观的反映出花生种质的发病程度，从而快速鉴定出花生种质的抗病性。
相较于传统在田间调查花生抗果腐病发病情况的不确定性，和田间筛选抗病种质的局限性，本发明具有明确的优势：(1)本发明使用花生果腐病主效致病真菌在室内接种花生的不同组织部分，实验过程易于重复，实验结果具有直观性，易于分级鉴定；(2)本发明能够快速、高效率的鉴定大量种质资源，大大缩短了种质鉴定的筛选周期，快速为花生抗病育种提供优质资源。
附图说明
图1尖孢镰刀菌ACCC 37064侵染花生离体组织情况(Ck：表示对照；Treated：表示用菌丝块侵染的花生离体组织，a、b、e、g分别是离体组织子叶、茎、叶片及根未接种尖孢镰刀菌的对照；c、d、f、h分别是离体组织子叶、茎、叶片及根接种尖孢镰刀菌的处理，图中箭头指示位置为接种位置)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
一种确定花生易感果腐病部位的方法，步骤如下：
(1)果腐病致病真菌的培养：将PDA斜面培养基上保存的花生果腐病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌种，接种于PDA固体培养基上，在25℃恒温培养箱中培养15天，以菌丝体作为接种病原物形态；
其中，所述花生果腐病致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌种ACCC37064，购自北京北纳创联生物技术研究院。
(2)花生不同离体组织的分离：将花生种子(花育20号)放在无菌水中浸泡8小时后铺于平皿上培养至露白，后单粒摆放在水培培养箱上，加适量水并且每隔3天添加MS培养液，培养至20天，花生幼苗真叶4片，全长10-15cm，将幼苗用无菌水洗净，取花生子叶、叶、茎(2cm)和全根系待用；
(3)离体组织的培养：准备尺寸为15cm*15cm无菌培养皿，在无菌培养皿内平铺一层厚度为0.3cm的脱脂无菌棉，加入10ml无菌水，保持水分和湿度，将花生不同离体组织铺在湿棉花上，置于25℃光照培养箱中光照16小时，黑暗8小时培养2天待用；
(4)病原真菌的接种：将准备好的花生不同组织培养皿置于超净工作台中，接种时先用接种针轻轻划伤花生组织表面，然后将菌丝体直接置于伤口处，接种块大小为直径0.5cm，封板置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养20天，以不接种致病菌的花生组织作为对照组；每组2个重复，每个实验重复3次。
(5)发病状态观察与记录：接种2天后，每天观察发病情况，并于接种后7天拍照记录；其中，易感果腐病的离体组织从接种位置的发黄、发黑、腐烂并向未接种部位扩散，具有抗果腐病的离体组织接种后接种位置没有明显变化，也未出现病斑，组织生长良好。
实验结果发现，该真菌接种于花生3天后，花生各组织表现出发黄、发黑等明显的果腐病症状，接种7天时，花生子叶、茎发黑，其中子叶开始腐烂，茎部接种位置发黑。接种至15天时，花生颈部、根部发黑伴有腐烂，子叶严重腐烂，叶片接种位置发黄，病斑开始扩散。如图1中，c显示，离体组织子叶在接种后，子叶接种位置明显腐烂，并向未接种位置扩散。d接种的茎发黄、发紫，两个对照组织没有明显变化；h离体组织根系在接种7天后，主根明显发黑，并向未接种位置扩散，对照根系发黄；f是花生离体组织叶片在接种7天后，出现病斑，发黄并向未接种位置扩散，对照叶片无明显变化；a、b、e、g是离体组织子叶、茎、叶片及根未接种尖孢镰刀菌的对照。Ck：表示对照；Treated：表示用菌丝块侵染的花生离体组织，箭头指示位置为接种位置。
从上述实验结果可以看出，子叶属于花生最易感果腐病病菌的组织。
实施例2
花生果腐病感-抗模型的建立：
取不同花生种质资源的饱满、健康、无霉变的花生种子，每个资源100粒，其中90粒用于培育花生幼苗，在幼苗子叶上接种果腐病病原菌，果腐病病原菌接种方法与接种量同实施例1；另外10粒用于大田种植，种植收获后，直接利用收获的鲜种子进行果腐病病菌侵染，接种量同实施例1。
其中，所述花生果腐病致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌种ACCC37064，购自北京北纳创联生物技术研究院。
(1)鲜种子果腐病发病情况
取每个花生种质收获后鲜种子100粒，用无菌水清洗后，置于准备好的培养皿(皿中铺脱脂棉一层，厚度为0.3cm，加入15ml无菌水浸湿棉花)中，用接种针刺破花生种皮，将菌丝块倒置于花生伤口上，封板置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养15天，在接种5天后，每天观察接种变化和统计发病率，结果如表1所示。
表1鲜种子发病情况
其中，将鲜种子中：
接种5天出现病斑，发病率90％以上，种子接种点腐烂，病斑直径0.5cm以上为易感病(HS)品种；
接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，种子接种位置发黑，病斑直径0.2～0.5cm为感病(S)品种；
接种7天无病斑，发病率在10～20％，种子接种位置发黄为抗病(R)品种；
接种7天无病斑，发病率在5％以下，接种位置无变化，种子可以正常生长发芽为高抗病(HR)品种.
(2)幼苗离体子叶果腐病发病情况
每天记录观察幼苗子叶的发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小。
表2幼苗子叶发病情况
易感病(HS)：接种5天出现病斑，发病率90％及以上，子叶整体发黑，接种点腐烂，病斑直径1cm以上；
感病(S)：接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，子叶整体发黄，接种位置发黑，病斑直径0.3cm～1cm；
抗病(R)：发病率在20％～10％，接种位置发黄；
高抗病(HR)：发病率在10％以下，接种位置无变化，整个茎部正常生长。
将不同感抗病品种鲜种子对应的花生幼苗离体子叶的发病情况作为花生果腐病感-抗模型。
实施例3(方法验证)
一种快速筛选花生抗果腐病种质资源的方法，步骤如下：
(1)果腐病病原真菌的培养：将PDA斜面培养基上保存的花生果腐病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)菌种ACCC 37064，接种于PDA固体培养基上，在25℃恒温培养箱中培养15天，以菌丝体作为接种病原物形态；
(2)花生幼苗培育：将花生种子放在无菌水中浸泡8小时后铺于平皿上培养至露白，后单粒摆放在水培培养箱上，加适量水并且每隔3天添加MS培养液，培养至20天，花生幼苗真叶4片，全长10-15cm，将幼苗用无菌水洗净，取花生子叶；
(3)离体子叶培育：在无菌培养皿内平铺一层厚度为0.3cm的脱脂无菌棉，加入10ml无菌水，保持水分和湿度，将花生离体子叶铺在湿棉花上，置于25℃光照培养箱中光照16小时，黑暗8小时培养2天待用；
(4)果腐病病原菌的接种：超净工作台中将准备好的花生子叶置于培养皿，接种时先用接种针轻轻划伤花生子叶表面，然后将菌丝体直接置于伤口处，接种块大小为直径0.5cm，封板置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养20天，以不接种致病菌的花生子叶作为对照组；
(5)每天记录观察子叶的发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；导入花生果腐病感-抗模型中，筛选抗病花生品种。结果如表3所示：
表3不同品种花生的果腐病抗性情况
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)花生果腐病感-抗模型的建立
取花生不同品种、饱满、健康、无霉变的种子，每品种花生种子分为两份，其中一份用于培育花生幼苗，在幼苗果腐病易感部位子叶上接种果腐病病原真菌；另一份用于大田种植，收获得鲜种子直接接种果腐病病原真菌；每天记录观察鲜种子和幼苗果腐病易感部位子叶的果腐病发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；将不同感抗病品种鲜种子对应的花生幼苗果腐病易感部位子叶的果腐病发病情况作为花生果腐病感-抗模型；
(2)筛选抗果腐病花生品种
将花生果腐病病原真菌的菌丝体作为接种病原物形态接种于经培养的待筛选花生幼苗易感果腐病部位子叶的离体组织，接种后置于25℃光照培养箱，16h光照、8h黑暗，培养20天，接种2天后，每天观察发病情况，记录发病率、病害严重程度以及病斑大小；导入花生果腐病感-抗模型中，筛选抗果腐病花生品种；
所述果腐病病原真菌为尖孢镰刀菌；
所述果腐病病原真菌的接种量为每片子叶直径0.5cm菌丝体。
2.根据权利要求1所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：
鲜种子中：
接种5天出现病斑，发病率90％以上，种子接种点腐烂，病斑直径0.5cm以上为易感病品种；
接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，种子接种位置发黑，病斑直径0 .2～0.5cm为感病品种；
接种7天无病斑，发病率在10～20％，种子接种位置发黄为抗病品种；
接种7天无病斑，发病率在10％以下，接种位置无变化，种子可以正常生长发芽为高抗病品种。
3.根据权利要求1或2所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：
所述花生果腐病感-抗模型为：
易感病：接种5天出现病斑，发病率90％及以上，子叶整体发黑，接种点腐烂，病斑直径1cm以上；
感病：接种5天出现病斑，发病率在70％～90％，子叶整体发黄，接种位置发黑，病斑直径0.3cm～1cm；
抗病：发病率在20％～10％，接种位置发黄；
高抗病：发病率在10％以下，接种位置无变化，整个茎部正常生长。
4.据权利要求1所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：所述花生果腐病病原真菌的菌丝体获得方法为：将PDA斜面培养基上保存的菌种，接种于PDA固体培养基上，在25℃恒温培养箱中培养15天，获得病原真菌菌丝体。
5.根据权利要求1所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：所述花生易感果腐病部位子叶的离体组织分离方法是：将花生种子放在无菌水中浸泡8小时后铺于平皿上培养至露白后单粒摆放在水培培养箱上，加适量水并且每隔3天添加MS培养液，培养至20天，花生幼苗真叶4片，全长10-15cm，将幼苗用无菌水洗净，取子叶组织。
6.根据权利要求1所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：所述花生易感果腐病部位子叶的离体组织的培养方法为：在无菌培养皿内平铺一层厚度为0.3cm的脱脂无菌棉，加入10ml无菌水，保持水分和湿度，将花生子叶离体组织铺在湿棉花上，置于25℃光照培养箱中光照16小时，黑暗8小时培养2天待用。
7.根据权利要求1所述筛选花生抗果腐病种质资源的方法，其特征在于：所述花生易感果腐病部位子叶的离体组织上病原真菌的接种方法为：超净工作台中将准备好的花生子叶组织置于培养皿中，接种时先用接种针轻轻划伤花生子叶组织表面，然后将菌丝体直接置于伤口处。
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