CN109749098A - 一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法，包括：利用Traut’s试剂、甲基丙烯酸酐试剂分别对明胶、壳聚糖进行修饰；水凝胶的制备；利用碱性硫酸盐溶液浸泡法引入物理、化学交联制得双交联网络高强度明胶‑壳聚糖水凝胶。本发明利用物理、化学双交联法得到一种明胶‑壳聚糖高强度水凝胶，该方法简单方便、快速高效，避免了合成高分子、有毒交联剂的使用，得到的高强度明胶‑壳聚糖水凝胶具有优异的力学性能及生物相容性。本发明为制备高强度、生物相容的蛋白质基水凝胶提供一种新的思路及方法，有助于拓宽蛋白质基水凝胶材料在生物材料、组织工程等领域的应用。

Description

一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法，属于生物材料领域。
背景技术
水凝胶是由亲水性聚合物形成富含水分（>50%）的三维网络结构物质，因其独特的理化性质，如质地柔软、力学性能可控、组织相容性好、与人体软组织相似，水凝胶被誉为是最为理想的生物医用材料。然而，由于存在大量的水、网络结构不均一导致水凝胶在力学性能方面远不及人体软组织，大大限制了其在生物医用材料领域的应用。目前已报道的制备高强度水凝胶的方法，如双网络水凝胶、双交联水凝胶等，是利用其中一种物质网络/交联网络来支撑形变、分散应力，而另一种物质网络/交联网络来耗散能量，从而实现水凝胶优异的力学性能。然而这些方法均含有生物不相容的合成高分子、有毒的交联剂、复杂的操作流程，因此，利用天然来源的高分子开发一种兼具优异力学性能及生物相容性的水凝胶是一个亟待解决的挑战。
明胶是胶原蛋白的水解产物，因其优异的生物相容性、生物降解性等特性受到广泛关注；但是，力学性能较差是明胶基水凝胶用于生物医学领域最大的阻碍，若能提高其力学性能，该材料将是一类极具潜力的生物医用材料。近年来，许多已报道的明胶基水凝胶在提高力学性能的同时，采用了合成高分子、有毒的交联剂或刺激的操作步骤，导致水凝胶的生物相容性大大降低。因此，制备由天然来源高分子组成的明胶基高强度、生物相容的水凝胶具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述研究领域的不足，提供一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶及其制备方法，得到的物理/化学双交联网络明胶水凝胶兼具有优异的力学性能及良好的生物相容性。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明利用浸泡法制备一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶，包括如下步骤：
（1）巯基明胶的制备：取明胶，与去离子水混合，加热溶解后，加入一定量Traut’s试剂，一定条件下反应后，透析、冻干，得到巯基明胶；
（2）烯烃壳聚糖的制备：取壳聚糖，与醋酸溶液混合，溶解后，加入等体积乙醇，搅拌均匀后超声波除气泡，加入一定量甲基丙烯酸酐，一定条件下反应后，透析、冻干，得到烯烃壳聚糖；
（3）明胶-壳聚糖水凝胶的制备：取烯烃壳聚糖溶于醋酸溶液中，完全溶解后加入一定量巯基明胶，50℃下搅拌溶解，超声波除气泡，制得预成胶液；将预成胶液倒入模具中，低温成胶，得明胶-壳聚糖水凝胶；
（4）高强度明胶-壳聚糖水凝胶的制备：利用浸泡法将明胶-壳聚糖水凝胶浸泡在pH 为10.0的硫酸盐溶液中，产生物理/化学双交联网络水凝胶；再用磷酸盐缓冲液不断冲洗，除去凝胶中多余的硫酸盐，即得物理/化学双交联网络高强度明胶-壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤（1）中巯基明胶的制备如下：取一定量的明胶，加入去离子水后于50℃下搅拌溶解，制得质量浓度为1%的明胶溶液，加入Traut’s试剂，于氮气保护环境下常温反应24h后，先用5 mM HCl溶液在常温下透析2次，每次12h，再用1 mM HCl溶液透析2次，每次12h，透析袋截留分子量为3500 Da，透析结束后，采用冷冻干燥方法得到巯基明胶。
进一步地，步骤（2）中烯烃壳聚糖的制备如下：取一定量的壳聚糖，加入2.0%醋酸溶液，搅拌溶解后，加入等体积的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波除气泡，加入一定量的甲基丙烯酸酐，室温下搅拌反应12h，反应结束后先用15 mM NaCl溶液透析12h，再用去离子水透析4次，每次12h，透析袋截留分子量为3500Da，透析结束后，采用冷冻干燥方法得到烯烃壳聚糖。
进一步地，步骤（3）中明胶-壳聚糖水凝胶的制备具体操作如下：取一定量烯烃壳聚糖溶于1.0%醋酸溶液中，完全溶解后加入一定量巯基明胶，50℃下搅拌溶解，得到预成胶液；然后将预成胶液超声波除气泡后，倒入模具中，置于4℃下2h成胶，得到明胶-壳聚糖水凝胶。
进一步地，步骤（4）中高强度明胶-壳聚糖水凝胶的制备具体操作如下：称取一定量的硫酸盐，加入去离子水搅拌溶解，用NaOH溶液调pH至10.0，将步骤（3）中的明胶-壳聚糖水凝胶于25℃下浸泡在盐溶液中12h，取出，用0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液不断冲洗，除去水凝胶中的硫酸盐，即得到物理/化学双交联网络明胶高强度水凝胶。
本发明以猪皮明胶为原材料，辅助添加壳聚糖，利用巯基-烯烃迈克尔加成反应引入化学交联，利用硫酸盐及碱性条件引入壳聚糖、明胶的物理交联，得到物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶。本发明采用简单的浸泡法，对天然高分子水凝胶产生物理、化学交联网络，避免了合成高分子、有毒交联剂的使用，得到的高强度明胶水凝胶兼具优异的力学性能及生物相容性，为制备高强度蛋白质基水凝胶提供一种新的思路及方法，有助于蛋白质基水凝胶材料的开发利用，以便其应用在生物材料、组织工程等领域。
附图说明
图1为明胶、壳聚糖的修饰化学反应式；
图2为物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶的压缩和拉伸力学性能图；
图3为物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶的生物相容性结果图。
具体实施方式
实施例1
第一步：称取1.0g猪皮明胶，加入99.0mL去离子水，50℃下搅拌直至完全溶解，制得质量浓度为1.0%的明胶溶液，加入200mg Traut’s试剂，在氮气保护的环境下室温搅拌24h。反应结束后将溶液装至截留分子量为3500Da的透析袋中，先用5 mM HCl溶液在常温下透析2次，每次12h，再用1 mM HCl溶液透析2次，每次12h，透析结束后，将样品取出移至-20℃冰箱放置24h后，再移至-80℃冰箱放置2h，冷冻干燥，得到巯基明胶，其反应化学式如图1所示。
第二步：称取3.0g壳聚糖，溶于100mL 2.0%醋酸溶液，加入等体积的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波除气泡，加入0.305g甲基丙烯酸酐，室温下搅拌反应12h，反应结束将溶液装至截留分子量为3500Da的透析袋中，先用15 mM NaCl溶液在常温下透析12h，再用去离子水透析4次，每次12h，透析结束后，将样品取出移至-20℃冰箱放置24h后，再移至-80℃冰箱放置2h，冷冻干燥，得到烯烃壳聚糖，其反应化学式如图1所示。
第三步：称取0.2g烯烃壳聚糖溶于10mL 1.0%醋酸溶液中，完全溶解后加入1.0g巯基明胶，50℃下搅拌溶解，使烯烃壳聚糖、巯基明胶的质量浓度分别为2.0%、10.0%。将混合溶液超声波除气泡后，倒入模具中，置于4℃下2h成胶，得到明胶-壳聚糖水凝胶。
第四步：称取20.0g硫酸铵，加入80mL去离子水，制得质量浓度为20%的硫酸铵溶液，用NaOH溶液调pH至10.0，将明胶-壳聚糖水凝胶于25℃下浸泡在盐溶液中12h，取出，用0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液不断冲洗，除去水凝胶中的硫酸盐，得到物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶。
第五步：利用质构仪在Return to Start模式下对水凝胶进行压缩、拉伸力学性能测试。对于压缩实验，将水凝胶制成直径为8mm，高度为10mm的圆柱形，测试速度为5mm/min；对于拉伸实验，将水凝胶制成“哑铃型”（定位销长、宽、厚度分别为30、3、2mm，钟状物长、宽、厚度分别为10、15、2mm），测试速度为50mm/min；通过将水凝胶的长度改变对其初始长度进行计算得到应变，将水凝胶所受的力除以其初始横截面积计算得到应力，绘制水凝胶应力-应变图形（如图2）。
从图2可知，通过引入物理/化学双交联，所得的高强度明胶水凝胶具有优异的力学性能，压缩时断裂形变高达80%，断裂应力高达1.8 MPa；拉伸时断裂形变为142%，断裂应力为0.4MPa，远远高于物理交联水凝胶及化学交联水凝胶。
第六步：人体皮肤成纤维细胞用含有10%胎牛血清及1.0%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，传代至2-3代时方可使用；物理/化学双交联明胶水凝胶置于6孔板中并用无菌的磷酸盐缓冲液浸泡，在紫外灯下照射1h灭菌后，吸出磷酸盐缓冲液，加入DMEM培养基于37℃下浸润12h。在移除DMEM培养基后，加入1mL人体皮肤成纤维细胞悬浮液（5×104 细胞/孔），于37℃ 5.0% CO2的条件下培养。细胞在水凝胶上的存活力及形态采用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒进行染色观察，将6孔板中的培养基吸出，用磷酸盐缓冲液清洗后，加入染料，于37℃培养30min，用磷酸盐缓冲液再次清洗之后，将水凝胶置于荧光倒置显微镜下观察，拍照成像。
由图3可知，成纤维细胞在水凝胶上繁殖生长情况良好，无死细胞出现，说明物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶具有良好的生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
（1）巯基明胶的制备：取明胶，与去离子水混合，加热溶解后，加入一定量Traut’s试剂，一定条件下反应后，透析、冻干，得到巯基明胶；
（2）烯烃壳聚糖的制备：取壳聚糖，与醋酸溶液混合，溶解后，加入等体积乙醇，搅拌均匀后超声波除气泡，加入一定量甲基丙烯酸酐，一定条件下反应后，透析、冻干，得到烯烃壳聚糖；
（3）明胶-壳聚糖水凝胶的制备：取烯烃壳聚糖溶于醋酸溶液中，完全溶解后加入一定量巯基明胶，50℃下搅拌溶解，超声波除气泡，制得预成胶液；将预成胶液倒入模具中，低温成胶，得明胶-壳聚糖水凝胶；
（4）高强度明胶-壳聚糖水凝胶的制备：利用浸泡法将明胶-壳聚糖水凝胶浸泡在pH为10.0的硫酸盐溶液中，产生物理/化学双交联网络水凝胶；再用磷酸盐缓冲液不断冲洗，除去凝胶中多余的硫酸盐，即得物理/化学双交联网络高强度明胶-壳聚糖水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述巯基明胶的制备具体操作如下：取一定量的明胶，加入去离子水后于50℃下搅拌溶解，制得质量浓度为1%的明胶溶液，加入Traut’s试剂，于氮气保护环境下常温反应24h后，先用5 mM HCl溶液在常温下透析2次，每次12h，再用1 mM HCl溶液透析2次，每次12h，透析袋截留分子量为3500 Da，透析结束后，采用冷冻干燥方法得到巯基明胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述烯烃壳聚糖的制备具体操作如下：取一定量的壳聚糖，加入2.0%醋酸溶液，溶解后，加入等体积的乙醇溶液，搅拌均匀后超声波除气泡，加入甲基丙烯酸酐，室温下搅拌反应12h后，先用15 mM NaCl溶液透析12h，再用去离子水透析4次，每次12h，透析袋截留分子量为3500Da，透析结束后，采用冷冻干燥方法得到烯烃壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述明胶-壳聚糖水凝胶的制备具体操作如下：取烯烃壳聚糖溶于1.0%醋酸溶液中，完全溶解后加入巯基明胶，50℃下搅拌溶解，得到预成胶液；然后将预成胶液超声波除气泡后，倒入模具中，置于4℃下2h成胶，得到明胶-壳聚糖水凝胶。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）的预成胶液中巯基明胶和烯烃壳聚糖的质量分数分别为5.0-20.0%、0.2-3.0%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述高强度明胶-壳聚糖水凝胶的制备具体操作如下：称取一定量的硫酸盐，加入去离子水搅拌溶解，用NaOH溶液调pH至10.0，将步骤（3）中的明胶-壳聚糖水凝胶于25℃下浸泡在盐溶液中12h，取出，用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液不断冲洗，除去水凝胶中的硫酸盐，即得到物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的物理/化学双交联网络高强度明胶水凝胶。
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