CN109718260A - 透明质酸修饰的苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂，其公开了透明质酸修饰的苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂及其制备方法、应用；以聚γ‑谷氨酸苄酯（γ‑BzPGA）为核材料，以含98%磷脂酰胆碱（PC）的大豆卵磷脂及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）等两亲性化合物为表面活性剂，以透明质酸（HA）或聚乙二醇‑b‑软脂酸（PEG‑b‑C16）为壳材料；该载体可用于负载苦木总生物碱。该制备方法工艺成熟、高效，为制备苦木总生物碱复杂活性成分及其他活性单体纳米制剂提供了可能。

Description

透明质酸修饰的苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂及其制备方 法、应用

技术领域

本发明涉及苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂，特别涉及透明质酸(HA)化或PEG化苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂及其制备方法

背景技术

核壳结构纳米粒(Core-shell nanoparticles)由一种材料作为它的核，由另一种材料作为它的壳通过非共价的相互作用包裹在核的外部，最早作为一种脂质-聚合物杂交纳米粒(lipid-polymer hybrid NPs)由华人学者张良方于2009年提出，作者根据聚合物胶束和脂质体，设计合成了一种新型的用于大量包载脂溶性药物的至于脂质体和胶束之间的一种新的制剂类型，相关的研究成果发表在美国纳米制剂的顶尖杂志ACS nano上【ZhangL，Chan J M，Gu F X，et al.Self-assembled lipid-polymer hybrid nanoparticles:arobust drug delivery platform.[J].Acs Nano，2008，2(8):1696-1702.】。至此以后，核壳结构纳米制剂以其良好的制剂稳定性，超强的包载性能而一直是纳米制剂领域的研究热点。

随着近年来药物化学家和天然药物化学家的不断探索，越来越多的具有良好活性的小分子药物被发掘，尤其在抗炎、抗癌、抗疟等领域，如藤黄酸、阿霉素、青蒿素、大黄酸等。同时，也有一些独特的中药浸膏、复方等复杂活性混合物如苦木总生物碱，但这些药物水溶性较差，体内代谢快，从而导致很窄的治疗窗，且有的毒性很强，严重影响药物的治疗效果。而通过制剂手段改善其溶解性，降低其毒性，提高其在体内的循环时间从而提高疗效是克服上述问题的方法之一。

采用透明质酸化或PEG化纳米制剂的手段可提高纳米制剂的水溶性，而透明质酸和PEG被广泛应用于医药卫生等多个领域中，具有无毒、无刺激，使得纳米粒理化稳定性得到改善，透明质酸也能够使纳米制剂获得一定的靶向性，同时提高了其细胞摄取能力，降低了RES系统的识别与摄取，延长了纳米粒在体内的循环时间。

大豆卵磷脂是一种天然的两亲性磷脂，主要成分为磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)等被广泛应用在医药工业领域，如脂质体等制剂的制备中，主要起着湿润剂、稳定剂和胆碱浓缩载体的作用，也有助于制剂的乳化和包封，并且是良好的分散剂。而γ-PGA又被称为“纳豆胶”，最先由日本科学家在纳豆中被发现，是一种天然的高分子化合物，BzPGA针对γ-PGA进行苄基化修饰，本发明均利用天然来源的化合物，旨在制备一种生物相容性好，生物可降解的安全的药物载体，并可在临床上得以应用。

现有的专利和文章都针对的PLGA或PLA的核材料【中国专利CN 104434806 A；YangX Z，Dou S，Wang Y C，et al.Single-step assembly of cationic lipid-polymerhybrid nanoparticles for systemic delivery of siRNA[J].ACS Nano，2012，6(6):4955-4965.】，且多采用PEG-DSPE【中国专利CN 104434806 A】的材料，价格高昂，增加了药物生产成本。而中国专利【CN 107714675A】虽采用了新的核材料，但在壳材料中加入了全反式维甲酸，为材料增加了额外的毒性，不适用于非癌症的药物递送，且材料成本较高。

苦木(Picrasma quassioides(D.Don)Benn.)为苦木科植物苦木的干燥枝、叶，性味苦寒，有小毒，归肺、大肠经。具清热，祛湿，解毒之功效，用于风热感冒，咽喉肿痛，腹泻下痢，湿疹，疮疖，毒蛇咬伤。其作为抗菌消炎药在我国南方各省具有很悠久的用药历史。研究表明，苦木具有良好的抗炎活性，其生物碱如β-咔巴啉类生物碱，铁屎米酮类生物碱是其主要的抗炎活性成分。【焦伟华.中药苦木抗炎活性成分研究[D].沈阳药科大学，2010；蒋梅香.苦木抗肿瘤活性成分及生物转化研究[D].中南大学，2008；Zhao F，Gao Z，Jiao W，etal.In vitro anti-inflammatory effects of beta-carboline alkaloids，isolatedfrom Picrasma quassioides，through inhibition of the iNOS pathway.[J].PlantaMedica，2012，78(18):1906-1911.】。然而，并没有找到苦木中活性极好的生物碱单体，临床依旧使用苦木总生物碱部位【陈猛.苦木生物碱活性成分的研究[D].烟台大学，2007.】。苦木总生物碱毒性高，水溶性差，缺乏靶向性，限制了它的临床应用，本发明针对具有一类大π共轭体系的化合物的苦木总生物碱纳米制剂的制备，满足临床需要。

发明内容

本发明公开一种工艺可靠、稳定性好、成本低廉的苦木总生物碱核壳结构纳米制剂的制备工艺，目的在于降低其毒性，提高其水溶性及抗炎活性，进而增强疗效。

本发明所述的纳米制剂以HA或PEG为壳材料，以大豆卵磷脂或含DPPE的大豆卵磷脂为表面活性剂，以聚γ-谷氨酸苄酯(BzPGA)为核材料，使用纳米沉淀法制备核壳型纳米制剂。核材料作为内核骨架用来包载一些脂溶性药物，大豆卵磷脂和DPPE的疏水链通过疏水作用力包裹在纳米核的表面，同时水相中的乙醇也起到增溶的作用。本发明所述的纳米制剂示意图见图1。

1.核材料(BzPGA)的合成

本发明采用γ-PGA即聚γ-谷氨酸，俗称“纳豆胶”，分子量为100万Da。

如上式所示，现将聚γ-谷氨酸进行亲脂性修饰，让其溶解于有机试剂中，避免两相反应。采用“一锅煮”法，根据中国专利【CN 107714675A】的方法，投入待反应的γ-PGA-CTA和溴苄，50-60℃反应8h，处理后得到白色胶皮状固体，冷冻干燥，即得聚γ-谷氨酸苄酯BzPGA，其合成结果的¹H-NMR见图2。

2.壳材料(mPEG-b-C₁₆)的合成

其中FA是叶酸受体，TF是转铁蛋白受体。

本发明的壳材料以分子量2000的聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)或含靶头的聚乙二醇(叶酸-PEG-OH或转铁蛋白-PEG-OH)为起始原料，根据文献【Warren N J，Mykhaylyk O O，Mahmood D，et al.RAFT Aqueous Dispersion Polymerization Yields Poly(ethyleneglycol)-Based Diblock Copolymer Nano-Objects with Predictable SinglePhase Morphologies[J].Journal of the American Chemical Society，2013，136(3):1023-1033.】先将mPEG-OH末端基团反应为氨基，其¹H-NMR结果见图3。之后再通过酯化反应合成聚乙二醇软脂酸酯mPEG-b-C₁₆，其合成步骤的如上式。其¹H-NMR见图4。

3..纳米制剂的制备工艺

本发明采用纳米沉淀法制备纳米制剂。

取核材料及药物溶解于与水互溶的有机相中，搅拌溶解至无颗粒状。取适当比例的壳材料及大豆卵磷脂直接溶解于特定的水相溶液中，事先搅拌均匀，使用前超声3-5分钟至澄清无颗粒状，并加热至65℃(升高温度使当前浓度略低于大豆卵磷脂在此温度下的临界胶束浓度)，将有机溶液缓慢加入搅拌、加热的水相溶液中，结束后涡旋3分钟，使壳材料充分分散，搅拌2h，缓慢降低温度至室温。将溶液转移至超滤管中离心20分钟，三次(2000rpm×2)去除有机溶剂及游离的大豆卵磷脂，调节最终体积至适宜的药物浓度。

上述制备工艺中，有L/P值(0，0.2，0.375，0.6；w/w，其中Lipid的质量为总脂质的质量)，核材料的浓度，Vo/Vw，核材料BzPGA的分子量，水相的种类(含乙醇的比例，v/v)等参数。不同参数制备的纳米制剂的粒径、粒径分布见图6～图10。

根据单因素实验法，筛选制备纳米制剂的最优参数如下：L/P值0.375，核材料的浓度4mg/mL，Vo/Vw为1/10，BzPGA分子量为100万，水相为4％乙醇溶液，药载比30％。其中当L/P大于0.375时，粒径将变大，可能由于过量的磷脂会导致自组装成胶束或粒径更大的脂质体；而当核材料浓度大于4mg/mL，Vo/Vw中水相的比例小于1/10时，都会有肉眼可见的固体析出；而100万Da的BzPGA拥有更大的刚性，使其拥有更适宜的粒径且粒径分布较窄；10％的乙醇水溶液是最好的水相种类，当乙醇浓度过低时，卵磷脂容易自组装成胶束，其乳化作用降低，乙醇浓度太高时，卵磷脂不易自组装到核材料的表面，且过多的有机溶剂导致毒性增强；D/P大于30％时，有明显的药物固体析出。

综上所述，通过系统的制备工艺优化，通过平行试验，发现其工艺成熟，所制备的纳米制剂均一性好，符合纳米药物的标准。

4.苦木总生物碱的提取

本发明通过酸提碱沉法制备苦木总生物碱。

取风干的苦木茎4.75kg，粉碎。在回流条件下用20L 80％乙醇水溶液提取两次，每次约2h。合并两次的提取液，旋蒸浓缩的得到119g浸膏。加入1.29L 3％-5％的HCl(pH为1-2)溶解浸膏，用等体积的二氯甲烷萃取三次除去不溶性化合物，用25％的氨水调节pH至9-10，用等体积的二氯甲烷萃取生物碱。旋蒸合并二氯甲烷得6.55g苦木总生物碱。该总生物碱通过HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS分析，从中得到14个生物碱，为β-咔巴啉类和铁屎米酮类生物碱。其总离子流图见图5及化合物罗列表见表1。

表1为由TAPQ的TIC图解析出来的14个生物碱化合物

有益效果：

1)首次将透明质酸修饰在杂交脂质纳米粒上，使纳米粒具一定的长循环及靶向作用，为苦木治疗类风湿性关节炎等局部炎症提供了可能；

2)首次将苦木主要活性成分——苦木总生物碱包载于纳米制剂中，降低毒性，极大地提高其抗炎活性；

3)本发明优选工艺，该制备工艺下的纳米粒具有较适宜的粒径，其PDI较低，均一性较好，具有大工业生产的潜能；

4)该纳米制剂具有良好的包载性能；

5)所用试剂均为安全无毒生物相容的材料或其衍生物，满足临床用药的要求。

附图说明

图1：透明质酸修饰的核壳结构纳米制剂示意图

图2：聚γ-谷氨酸苄酯3的¹H-NMR in DMSO-d₆

图3：mPEG-NH₂的¹H-NMR in CDCl₃

图4：mPEG-b-C₁₆的¹H-NMR in d₆-DMSO

图5：苦木总生物碱HPLC-Q-TOF-MS/MS的总离子流图

图6：不同的L/P值对粒径和PDI影响

图7：不同浓度的BzPGA对粒径和PDI的影响

图8：不同体积比的有机相/水相对粒径和PDI的影响

图9：不同分子量的BzPGA对粒径和PDI的影响

图10：不同种类的水相对粒径和PDI的影响

图11：最佳制备工艺下的透明质酸修饰的核壳结构载药纳米粒的粒径分布图

图12：最佳制备工艺下的透明质酸修饰的核壳结构载药纳米粒的电位图

图13：最佳制备工艺下的透明质酸修饰的核壳结构载药纳米粒的TEM图

图14：透明质酸化纳米制剂与游离药物的水溶性对比及纳米制剂的丁达尔效应

图15：游离药物(TAPQ)与透明质酸化纳米制剂(TAPQ-NPs)对RAW264.7细胞存活率

图16：游离药物(TAPQ)与透明质酸化纳米制剂(TAPQ-NPs)对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性评价，其中A为NO抑制率检测，B为TNF-α抑制率检测，C为IL-6抑制率检测。

图17：游离药物(TAPQ)、透明质酸化纳米制剂(TAPQ-NPs)和地塞米松(Dex)在相同浓度下的抗炎活性对比图

具体实施案例

下面结合实施案例对本发明作进一步阐述，但这些实施案例绝不是对本发明的任何限制。

以下实施例所用主要仪器和材料

实验材料：大豆卵磷脂(Lecithin，PC>98％，上海阿拉丁试剂有限公司)；二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE，上海艾伟拓医药科技有限公司)；透明质酸(Hyaluronic Acid，14600Da，镇江东元生物科技有限公司)；聚乙二醇单甲醚(mPEG，2000Da，上海梯希爱化成工业发展有限公司)。DMEM高糖培养基(不含双抗，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；Gibico胎牛血清(FBS，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；脂多糖(LPS，碧云天生物技术有限公司)；其他化学试剂都为分析纯；地塞米松磷酸钠(Dex，马鞍山丰原药业有限公司)

实验仪器：微量注射泵(WZ-50C6，浙江史密斯医学仪器有限公司)；马尔文粒度与电位仪(Malvern Zetasizer Nano-ZS90，Malvern Instruments，U.K.)；透射电子显微镜(TEM，Tecnai-12；Philips company，Holland)；实验室级超纯水器(SYNERJY UV，默克化工技术有限公司)；电子天平(BSA124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。超滤管(截留分子量100，000Da，Amicon Ultra-15)；台式高速冷冻离心机(HR/T16M，湖南赫西仪器装备有限公司)；数显智能控温磁力搅拌器(SZCL-2，巩义市予华仪器有限责任公司)；二氧化碳培养箱(CCL-170B-8，ESCO，新加坡)；超净工作台(AirstreamⅡ级A2型生物安全柜，ESCO，新加坡)；倒置生物显微镜(江南XD-202，上海)；酶标仪(Multiskan FC，赛默飞世尔上海仪器有限公司)。

实施例1

BzPGA的合成：取分子量为100万Da的γ-PGA10g溶于200mL去离子水中，搅拌下滴加3％(w/v)的十六烷基三甲基氯化铵水溶液过量至不再产生沉淀，搅拌5min，砂芯漏斗抽滤，白色沉淀用适量热的去离子水洗涤至滴下的滤液无泡为止，冷冻干燥得白色固体粉末γ-PGA-CTA；取2g上述γ-PGA-CTA和1.036g NaHCO₃于干燥器里干燥过夜除去微量水分，加入到60mL无水氮甲基吡咯烷酮(NMP)中，冰浴下加入1.88mL溴苄，55℃反应8h至溶液微微澄清；冷却至室温，抽滤除去过量NaHCO₃和NaCl，滤液倾至200mL甲醇与100mL 1％HCl混合溶液中，冰浴下搅拌0.5h，砂芯漏斗抽滤，滤渣用冷乙醇与水混合溶液(v/v，2:1)洗三次，沉淀用30mL NMP溶解，重复上步操作，滤渣冷冻干燥，用研钵研成颗粒粉末，获得BzPGA；其¹H-NMR图谱见图2，(300MHz，CDCl₃)，8.27(brs，1H，酰胺H)，7.31(s，5H，Ar-H)，5.08(s，2H，Ar-CH₂-H)，4.26(m，1H，α-H)，2.21(t，2H，γ-H)，1.96，1.79(m，2H，β-H)。

实施例2

mPEG-b-C₁₆的合成:

(1)将5g的mPEG-OH溶于50mL无水甲苯中，氩气保护下共沸除水2-3h，冷却至室温，冰浴下滴加无水二氯甲烷至溶液澄清；搅拌下加入0.520mL三乙胺，之后逐滴加入0.290mL甲磺酰氯，冰浴反应18h后，抽滤除去不溶性甲磺酸盐酸盐，用过量乙醚沉淀；将上述产物加入到圆底烧瓶中，加入85mL 25％的氨水，封口膜封存，20℃搅拌反应4天，将反应液在通风橱中挥发氨至湿润的pH试纸不变色为止；用5M的氢氧化钠逐滴加入调节pH至13，二氯甲烷萃取3次(3×25mL)，浓盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩，过量乙醚沉出，抽滤挥尽乙醚得mPEG-NH₂，产率66.71％；其¹H-NMR图谱见图3，(600MHz，CDCl₃)3.36(s，3H，mPEG-CH₃)，2.84(t，2H，-NH₂)。

(2)取硬脂酸0.077g与圆底烧瓶中，加入20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.086g，，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)0.052g，搅拌至溶解，再加入上述mPEG-NH₂ 0.5g 65℃反应24h，将反应液用大量的乙醚/石油醚混合溶液析出，抽滤，10mL二氯甲烷溶解，用蒸馏水萃取2次(2×8mL)，少量浓盐水洗涤，旋蒸浓缩，挥尽溶剂得mPEG-b-C₁₆ 0.228g，产率40.42％，其¹H-NMR图谱见图4，(600MHz，d6-DMSO)，3.25(s，3H，mPEG-CH₃)，2.05(t，2H，C₁₆-C2-H)，1.47(q，2H，C₁₆-C₁₅-H)，1.24(s，24H，C₁₆-CH₂)，0.86(t，3H，C₁₆-CH₃)。

实施例3

考察不同的L/P值对对粒径和PDI影响

配制10mL 4mg/mL的BzPGA/DMSO溶液作为有机相；配制大豆卵磷脂浓度为0，0.04，0.08，0.15，0.24mg/mL的10％的乙醇水溶液各10mL，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，作为水相；用微量注射泵将BzPGA溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射过程中，水相保持在65℃，注射体积1mL，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇，使大豆卵磷脂分散，防止大豆卵磷脂被包裹在核的内部，之后再缓慢搅拌2h至室温，将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次。用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的size和PDI，结果如图6。

实施例4

考察不同浓度BzPGA对对粒径和PDI影响

配制1，2.5，4，10mg/mL BzPGA的DMSO溶液各1mL；配制大豆卵磷脂浓度为0.0375，0.09375，0.15，0.375mg/mL的10％的乙醇水溶液10mL(固定L/P值为0.375)提前溶解，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积1mL，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇并使大豆卵磷脂分散，防止大豆卵磷脂被包裹在核的内部，缓慢搅拌2h至室温；将溶液转移至AmiconUltra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次。用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的size和PDI，结果如图7。

实施例5

不同体积比的有机相/水相对粒径和PDI影响

配制10mL 4mg/mL的BzPGA DMSO溶液。相应的配制大豆卵磷脂浓度为0.3mg/mL的10％的乙醇水溶液5mL，0.15mg/mL的10％的乙醇水溶液10mL，0.1mg/mL的10％的乙醇水溶液15mL，提前溶解，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积1mL，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇使大豆卵磷脂分散，防止大豆卵磷脂被包裹在核的内部，再缓慢搅拌2h至室温。将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次。用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的size和PDI，结果如图8。

实施例6

不同分子量的BzPGA对粒径和PDI影响

配制分子量为1万Da、，10万Da，100万Da的BzPGA的DMSO溶液各10mL，浓度为4mg/mL。配制大豆卵磷脂浓度为0.15mg/mL的10％的乙醇水溶液10mL，提前溶解，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积1mL，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇并使大豆卵磷脂分散，防止大豆卵磷脂被包裹在核的内部，再缓慢搅拌2h至室温，将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次；用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的size和PDI，结果如图9。

实施例7

不同种类的水相对粒径和PDI影响

配制10mL 4mg/mL的BzPGA DMSO溶液。相应地用纯水、4％乙醇、10％乙醇配制0.15mg/mL大豆卵磷脂溶液各10mL，提前溶解，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积1mL，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇并使大豆卵磷脂分散，防止大豆卵磷脂被包裹在核的内部，再缓慢搅拌2h至室温。将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次。用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的size和PDI，结果如图10。

实施例8

对最佳制备工艺下的PEG化核壳结构载药纳米制剂

采用最优的制剂制备工艺，配制4mg/mL的BzPGA的DMSO溶液，加入30％(w/w，drug/polymer)的苦木总生物碱(1.2mg/mL)，超声溶解至无颗粒状，配制0.1455mg/mL的大豆卵磷脂10％的乙醇水溶液，加入mPEG-b-C₁₆使其浓度为0.1328mg/mL(总摩尔比的3％)提前溶解并分散，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA的DMAO溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积为比为1/10(Vo/Vw)，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇，再缓慢搅拌2h至室温；将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次。

实施例9

对最佳制备工艺下的透明质酸化核壳结构载药纳米制剂

采用最优的制剂制备工艺，配制4mg/mL的BzPGA的DMSO溶液，加入30％(w/w，drug/polymer)的苦木总生物碱(1.2mg/mL)，超声溶解至无颗粒状，配制0.1425mg/mL的磷脂10％的乙醇水溶液，提前溶解，加入的DPPE使得DPPE的浓度为0.006846mg/mL(使活化的HA能够通过酰胺键化学接枝到DPPE上，DPPE占总摩尔比的5％)，制备前用水浴超声3-5分钟，水浴加热至65℃，用微量注射泵将BzPGA的DMAO溶液以30mL/h的速度注射入水相溶液中，注射体积为比为1/10(Vo/Vw)，低速搅拌，注射完毕后高速涡旋3分钟挥发乙醇再缓慢搅拌1h至室温；将溶液转移至Amicon Ultra-15超滤管中超滤离心，转速2000rpm，总共洗涤2次；提前配制2mg/mL的透明质酸乙酸钠-乙酸缓冲液(pH＝4.5)，并加入1.1eq EDCI37℃活化2h，将上述活化的透明质酸用硼酸盐缓冲溶液(pH＝11)调节pH至8，按240μg/μmol(每1μmol总脂质需加入240μg透明质酸)加入到上述超滤后的纳米制剂溶液中，常温搅拌过夜。过滤除去不溶物，2000rpm超滤洗涤两次，获得载药制剂；用马尔文粒度与电位分析仪分析纳米制剂的粒径为150.5±4.38nm，PDI为0.057±0.027，电位是-14.57±2.53mv，结果如图11、图12，其TEM图像结果见图13。其对溶解性的改善如图14，纳米制剂有良好的丁达尔效应。

取一定量的样品，3倍量甲醇破乳，液相分析得到含量，并按以下公式计算载药量(DL％)与包封率(EE％)。

Drug loading efficiency(DL％)＝W/(W+W_P+W_L)×100％

Entrapment efficiency(EE％)＝W/W₀×100％

W为包载药物的质量，W_P为核材料的质量，W_L为壳材料和透明质酸的质量，W₀为理论加入药物的质量。由于苦木总生物碱的复杂性，我们在计算其包封率、载药量时挑选其中主要的1-羟甲基-β-咔巴啉，3-甲基铁屎米-5，6-二酮，5-羟基-4-甲氧基铁屎米酮三种活性成分作为检测指标，其结果分别为53.89％±1.21％，47.90％±1.45％和49.74％±1.45％。其载药量为0.269％±0.006％，0.099％±0.003％和0.980％±0.004％。

实施例10

透明质酸化纳米制剂的细胞毒活性考察；RAW264.7小鼠巨噬细胞以5.0×10⁴/mL(含10％FBS的DMEM溶液)浓度以5.0×10³/孔的密度接种于96孔板中。37℃，5％CO₂的细胞培养箱内孵育24h。待细胞贴壁后，吸取上清液，加入不同药物浓度的DMEM溶液(不含FBS)，再次培养24h。每孔加入20μl，5mg/mL MTT溶液，细胞培养箱内孵育4h。小心吸出细胞上清液，并加入150μl DMSO，使用酶标仪在测量前快速震荡15s，最后在570nm波长下测定各孔的吸光度，记录结果，按照下述公式计算细胞的存活率

细胞存活率(％)＝试验组吸光度值/对照组吸光度值×100％，其结果如图15所示。游离药物TAPQ对于RAW264.7细胞的IC₅₀为8.088±0.903μg/mL，而透明质酸化纳米制剂药物TAPQ-NPs的IC₅₀为15.85±1.01μg/mL。纳米制剂与游离药物相比，毒性显著降低。

实施例11

透明质酸化纳米制剂的抗炎活性考察：RAW264.7小鼠巨噬细胞以2.0×10⁴-5.0×10⁴/孔的密度接种于96孔板中。37℃，5％CO₂的细胞培养箱内孵育24-12h。待细胞贴壁后，加入不同药物浓度的DMEM溶液(含10μg/mL的LPS及10％的FBS)，继续培养24h，吸取上清液分别用Griess法用来测量NO，用Elisa试剂盒测量TNF-α及IL-6，其结果见图16。其与阳性药地塞米松在5μg/mL的浓度下的抑制活性见图17。计算游离药物TAPQ及透明质酸化纳米制剂TAPQ-NPs的IC₅₀。游离药物TAPQ对NO的IC₅₀为5.740±0.334μg/mL，而TAPQ-NPs对NO的IC₅₀为2.159±0.277μg/mL。游离药物TAPQ对TNF-α的IC₅₀为22.88±4.005μg/mL，而TAPQ-NPs对TNF-α的IC₅₀为7.136±0.56μg/mL。同样的，游离药物TAPQ对IL-6的IC₅₀为8.672±0.330μg/mL，而纳米制剂TAPQ-NPs对IL-6的IC₅₀为4.014±0.569μg/mL。

Claims (8)

1.一种苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂，其特征在于：所述纳米制剂具典型的核壳结构，以聚γ-谷氨酸苄酯BzPGA为核壳结构纳米粒的内核，以大豆卵磷脂或含摩尔百分比为5％DPPE的大豆卵磷脂为表面活性剂，以HA或PEG-b-C16为壳材料，负载苦木总生物碱TAPQ制备而成。

2.如权利要求1所述的一种苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂，其特征在于所述苦木总生物碱TAPQ由下列步骤获得：取苦木茎80％用乙醇水溶液提取，提取液浓缩得到浸膏，加入pH为1-2的HCl溶解浸膏，用等体积的二氯甲烷萃取除去不溶成分，用25％的氨水调节酸水pH至9-10，用等体积的二氯甲烷萃取生物碱，浓缩得苦木总生物碱TAPQ。

3.根据权利要求1所述的一种苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂，其特征在于：所述的聚γ-谷氨酸苄酯BzPGA由γ-PGA-CTA和溴苄，50-60℃碱性条件下反应8h，获得BzPGA；其中所述的γ-PGA的分子量为100万Da。

4.根据权利要求1所述的一种苦木总生物碱核壳结构纳米制剂，其特征在于：所述的壳材料中mPEG-b-C₁₆以下列步骤制备获得：聚乙二醇单甲醚、叶酸-PEG-OH或转铁蛋白-PEG-OH为起始原料，先将PEG-OH末端羟基反应为氨基，之后再通过酯化反应合成聚乙二醇软脂酸酯mPEG-b-C₁₆；其中聚乙二醇的分子量为2000Da。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂的制备方法，其特征在于按如下步骤：

(1)、有机相溶液的制备：称取一定量的BzPGA加入DMSO(浓度为1-10mg/mL)搅拌过夜至完全溶解；

(2)、水相的制备：称取占核材料质量比为0-0.6的大豆卵磷脂或含摩尔百分比为5％DPPE的大豆卵磷脂，1％-3％摩尔比的mPEG-b-C₁₆(当壳材料为PEG时加入)，用溶剂搅拌溶解至无颗粒状，于4℃封闭保存，制备前超声3-5min至溶液澄清，放置于65℃水浴中加热；

(3)、纳米沉淀法：用微量注射泵，将有机相以30mL/h的速度加入到搅拌加热65℃的水相溶液中，注射完毕后，搅拌2h至室温；

(4)、洗涤：超滤除去DMSO及游离卵磷脂；

(5)、连接透明质酸：加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐活化的HA，搅拌过夜，超滤除去未反应的HA及杂质，获得透明质酸化苦木总生物碱核壳结构纳米制剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中有机溶剂是DMSO、DMF、丙酮、氯仿中的一种或两种以上混合溶剂。

7.如权利要求5所述的制备方法中，其特征在于步骤(2)中所述的溶剂是纯水、4％-10％乙醇或5％-12％甲醇。

8.如权利要求1所述的一种苦木总生物碱杂交脂质纳米制剂应用于苦木总生物碱及其他难溶性脂溶性药物的纳米制剂的制备。