CN107714675A - 一种藤黄酸核壳结构复合纳米制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种藤黄酸核壳结构复合纳米制剂及其制备方法。所述复合纳米制剂，以聚(γ‑谷氨酸)α‑苄基酯为核材料，以接枝维甲酸的透明质酸为壳材料，核材料以纳米粒形式位于纳米制剂内部，以π‑π堆积与疏水作用力荷载藤黄酸，两亲性壳材料以亲脂端维甲酸包裹排列于纳米粒周围，亲水端透明质酸链位于纳米制剂最外侧，壳材料起到保护内核中药物，维持纳米制剂稳定性和实现主动靶向的作用。本发明主要优势有：纳米制剂制备工艺可控、稳定性好，包封率高，具备主动靶向能力，能很好地改善水溶性差、不稳定、易被代谢清除等影响藤黄酸成药性的问题，提高藤黄酸抗肿瘤活性的同时，还能消除藤黄酸原有的轻微毒副作用。

Description

一种藤黄酸核壳结构复合纳米制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料与纳米生物技术领域，具体涉及一种藤黄酸核壳结构复合纳米制剂及其制备方法。
背景技术
藤黄酸是中药藤黄树脂抗肿瘤的主要活性成分之一，大量研究显示，藤黄酸能通过多种机制发挥非常好的抗肿瘤作用，而且与传统化疗药相比，藤黄酸毒副作用较低，除在静脉注射时存在血管刺激性外，对荷瘤动物的造血功能及免疫功能无明显影响，动物耐受良好，临床试验数据表明，藤黄酸最大耐受剂量为55mg/m2，主要不良反应为肝功能损害、血管刺激性等。然而，藤黄酸在水中溶解度极低，稳定性差，药代动力学数据显示，藤黄酸口服生物利用度极低，血浆清除速率快，静脉给药藤黄酸在大鼠体内消除半衰期仅为15min左右，藤黄酸在大鼠体内主要代谢产物的抗肿瘤活性均明显下降。这些问题影响了藤黄酸的开发利用，特别是藤黄酸的稳定性差与易被代谢清除等问题，极大限制了其成药性。
曾有人尝试通过结构改造的方法，以期获得成药性更好的藤黄酸类似物，虽然也获得了抗肿瘤活性更好的藤黄酸衍生物，但均未从根本上解决藤黄酸易被代谢清除的问题。即使通过全合成途径获得具备抗肿瘤基本药效团的藤黄酸类似物，这些化合物很有可能丧失了藤黄酸所具备的低毒性、多靶点抗肿瘤的优势，而且对于这些全新结构的化合物，需要重新评价药效、毒理、ADME等一系列新药资料，大大增加了新药研发成本。
近年来，纳米靶向制剂成为研究热点，各种纳米载体如脂质体、聚合物胶束、聚合物纳米粒子等被开发用于运载抗癌药物和蛋白质，实现对肿瘤的高效低毒治疗。相对于传统治疗方法，纳米载体系统具有以下优点：(1)能大大提高难溶性抗癌药物(如紫杉醇、喜树碱等)的水溶性，有效延长易被代谢清除药物在血液中的循环时间，提高药物的生物利用度；(2)能通过肿瘤组织增强的渗透和滞留效应(EPR effect)富集到实体肿瘤中，具有一定的肿瘤靶向性能(“被动靶向”)，或者根据肿瘤组织与正常组织的差别，设计主动靶向制剂；(3)能降低药物对正常细胞和组织的毒副作用。
目前，已有多个品种的纳米抗癌药物进入了临床或临床不同试验阶段，例如包载紫杉醇(PTX)的聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)胶束药物(Genexol-PM)，临床用于治疗乳腺癌、肺癌和卵巢癌等；紫杉醇白蛋白纳米粒ABRAXANE，用于转移性乳腺癌联合化疗失败后或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌。临床治疗结果表明，纳米药物具有更好的药物利用率，能很好地降低毒副作用，极大提高了病人在治疗期间对药物的耐受性等优点。
上述已上市纳米制剂均为通过EPR效应实现被动靶向的第一代靶向制剂，即被动靶向制剂，包括脂质体、胶束、纳米粒等，其具备制备工艺可工业化、所制备纳米制剂物理、化学、生物稳定性良好等优势，这些优势使其能够进入临床应用的必要条件之一。在被动靶向纳米制剂基础上，将肿瘤细胞表面特异性受体的配体，比如多糖(如透明质酸)，以及其他小分子配体(如叶酸)等，修饰于纳米制剂的表面，从而使得纳米制剂能够主动识别肿瘤组织，即主动靶向制剂。理论上，该类型纳米制剂的靶向性会明显好于被动靶向制剂，然而，目前为止还未有一个抗肿瘤主动靶向制剂上市，主要原因就是由于当前的主动靶向制剂工艺复杂，无法工业化，以及稳定性差，难以克服体内的一些生物屏障。
以疏水性材料制备的纳米粒为内核，外层包裹由两亲性材料组成的胶束作为外壳，采用简单的“纳米沉淀法”，能够制备出具备核-壳结构的复合纳米制剂(core-shellnanoparticle，C-S NP)，其组合了纳米粒与胶束的优势，而且可对外壳材料进行特定改造，使C-S NP具备主动靶向能力。比如，可将药物与纳米粒材料溶于能与水互溶的溶剂中(如丙酮)，功能性两亲性材料分散于水中，将后者加热至65～70℃，以形成均一分散体系，剧烈搅拌下，将前者缓慢滴加至后者，纳米粒材料会包裹药物形成纳米粒，而功能性两亲性材料会通过疏水作用力自组装于纳米粒表面，亲水端伸展于水溶液中，起到稳定作用，待溶剂挥发后，离心既得C-S NP。
聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯(BzPGA)可作为C-S NP的纳米粒内核材料，其具有良好的生物相容性和低毒性。BzPGA能通过α-螺旋形成的大π键体系与具有共轭体系的抗肿瘤药物，如藤黄酸，产生超共轭相互作用，这使其载药量要明显高于聚乳酸-羟基乙酸共聚物等单纯靠疏水作用力荷载药物的材料。并且BzPGA与药物通过π-π堆积形成致密的疏水性纳米粒，能够减缓水或生物基质对纳米制剂的侵蚀，从而达到缓释和提高药物稳定性的目的。
接枝维甲酸的透明质酸(HA-CC-ATRA)可作为C-S NP的外壳材料，其具有以下优势：一、透明质酸(HA)的羧基能使纳米制剂表面带负电荷，能通过电荷排斥阻止纳米粒的聚集，从而大大提高纳米制剂的稳定性，而且还能提高纳米制剂逃避内皮-网状系统(RES)捕获的能力；二、HA还是肿瘤细胞表面高表达的CD44受体的配体，HA-ATRA能使C-S NP具有主动靶向性和促进肿瘤细胞摄取的能力；三、维甲酸(ATRA)具备协同抗肿瘤活性，能够增强藤黄酸等抗肿瘤化合物的活性；四、ATRA具有共轭体系，通过超共轭作用和疏水作用在纳米粒内核表面形成的分子栅栏，比由单纯疏水作用形成的脂肪链分子栅栏的包裹作用更强，使得由HA-ATRA作为壳材料组成的C-S NP的药物包封率更高、稳定性更好。
本发明通过设计、合成合理的纳米制剂材料，摸索、筛选纳米制剂制备工艺，制备工艺可控、稳定性良好，且具备主动靶向能力的C-S NP，实现肿瘤部位主动靶向作用、进一步提高抗肿瘤活性的同时，提高藤黄酸的水溶性、稳定性和延长其在体内滞留时间，从纳米靶向制剂角度，解决藤黄酸所存在的影响其成药性的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供工艺可控、稳定性良好，且具备主动靶向能力的藤黄酸C-SNP，从纳米靶向制剂角度，解决藤黄酸所存在的影响其成药性的问题。
本发明所述C-S NP，以聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯(BzPGA)为核材料，以接枝维甲酸的透明质酸(HA-CC-ATRA)为壳材料，使用纳米沉淀法制备而成。C-S NP结构示意图见图1，BzPGA以纳米粒形式位于C-S NP内部，通过α-螺旋形成的π-π堆积与疏水作用力荷载藤黄酸，具备两亲性的HA-CC-ATRA，通过亲脂端ATRA通过π键堆积与疏水作用力包裹排列于纳米粒周围，亲水端HA位于C-S NP最外侧。本发明所述荷载藤黄酸C-S NP示意图见图1。
1.核材料的合成
所述BzPGA，是由聚(γ-谷氨酸)的羧基与溴苄经取代反应而成，分子量为10～1000KDa，可通过α-螺旋形成的π-π堆积与疏水作用力荷载亲脂性药物，特别是具共轭体系的药物或化合物，如藤黄酸。
本发明以聚(γ-谷氨酸钠)与溴苄为原料，合成核材料，由于聚(γ-谷氨酸钠)为水溶性大分子化合物，而溴苄为脂溶性小分子化合物，无法将两者配置成均一的反应体系，而非均相反应由于需要更高的反应温度和更长的反应时间，这可能会造成高分子链的断裂。因此，本发明探索出一条更高效的BzPGA合成工艺，能使聚(γ-谷氨酸钠)与溴苄在均相条件下反应，与文献J.Polym.Sci.Part A：Polym.Chem.1993，31(11)：2877～2878相比，所需反应温度更低，反应时间更短。合成方法如下：
(1)聚(γ-谷氨酸)-十六烷基三甲基铵复合物的制备：取一定量的特定分子量的聚(γ-谷氨酸钠)，溶于适量水中，搅拌下分别滴加的CTA-Br水溶液至不再产生沉淀，减压抽滤的沉淀，以适量热水洗三次，真空干燥得白色固体，即为聚(γ-谷氨酸)-十六烷基三甲基铵复合物(γ-P藤黄酸-CTA)。
(2)BzPGA的制备：取适量上述γ-P藤黄酸-CTA复合物，溶于适量有机溶剂(DMSO、DMF、NMP等)中，按γ-P藤黄酸-CTA复合物结构中氨基酸单元摩尔数，加入3倍当量NaHCO3，1.1倍当量溴苄，搅拌溶解后，40～50℃反应一定时间。反应结束后，静置冷却，过滤除去不溶物(过量的NaHCO3与生成的NaBr)，滤液倾入至适量冷甲醇中，再加入甲醇0.5倍体积的冷盐酸水溶液(1N)，冰浴下搅拌0.5h，减压抽滤，适量冷甲醇∶水(2∶1)洗三次，所得沉淀溶于适量NMP，重复上述操作，真空干燥得白色粉末，即为BzPGA，1H-NMR图谱见图2。
(3)为进行核材料种类的筛选，另外合成聚(γ-谷氨酸)α-正丙基酯(PrP藤黄酸)，作为对照用核材料，并与BzPGA比较，以突显BzPGA作为核材料的优势。PrP藤黄酸的合成方法基本同BzPGA，具体为：取适量γ-P藤黄酸-CTA复合物，溶于适量有机溶剂(DMSO、DMF、NMP等)中，按γ-P藤黄酸-CTA复合物结构中氨基酸单元摩尔数，加入3倍当量NaHCO3，1.1倍当量1-溴丙烷，搅拌溶解后，50～60℃反应一定时间。反应结束后，静置冷却，过滤除去不溶物(过量的NaHCO3与生成的NaBr)，滤液倾入至适量冷甲醇中，再加入甲醇1倍体积的冷盐酸水溶液(1N)，冰浴下搅拌0.5h，减压抽滤，适量冷甲醇∶水(2∶1)洗三次，所得沉淀溶于适量NMP，重复上述操作，真空干燥得白色粉末，即为PrP藤黄酸，1H-NMR图谱见图2。
2.壳材料的合成
所述HA-CC-ATRA，是由HA的羧基与ATRA的羧基，通过1，6-二溴己烷链接而成，其中，HA分子量为14600Da，ATRA在HA上的接枝率为20％，该接枝率既能保证材料的两亲性，又能保证HA与CD44受体的亲和力。进一步的，所述ATRA具备超共轭体系，通过疏水作用和超共轭作用形成牢固的分子栅栏，可发挥防止药物泄露，阻止生物基质侵蚀，以及提高包封率等作用，负电性的亲水端HA能够发挥主动靶向、稳定C-S NP、躲避RES捕获等作用。参考文献Biomaterials 2011，32(29)：7181～7190，合成方法如下：
(1)透明质酸钠的酸化与透明质酸-四丁基铵复合物的制备：取732型阳离子交换树脂，以去离子水洗至中性，以4％盐酸溶液充分冲洗，浸泡5h后，去离子水冲洗至中性，再以4％氢氧化钠水溶液充分冲洗，浸泡5h后，去离子水冲洗至中性，以2mol/L盐酸溶液充分冲洗，浸泡两天，备用。以去离子水冲洗至中性。称取适量透明质酸钠，加入适量去离子水，制备成一定浓度的透明质酸钠水溶液，加入适量上述预处理后的732强酸型离子交换树脂，室温搅拌6h，pH试纸检测交换效果，过滤得HA水溶液。取25％四丁基氢氧化铵的水溶液，室温搅拌下逐滴加入至上述HA水溶液中，直至溶液体系pH＝7，冷冻干燥制得白色固体，即为透明质酸-四丁基铵复合物(HA-TBA)，1H-NMR图谱见图3。
(2)全反式维甲酸-6-溴正己酯的合成：取1.2eq的1，6-二溴己烷溶于适量四氢呋喃中，加入适量碳酸钾搅拌。取1eq的全反式维甲酸溶于四氢呋喃中，再分批滴加到上述溶液中，室温反应4h，加水终止反应，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱色谱纯化，得到产物全反式维甲酸-6-溴正己酯(ATRA-CC)，1H-NMR图谱见图4。
(3)透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯的合成：取上述HA-TBA盐溶于DMSO中，按HA-TBA中的COOTBA基团摩尔数，加入相应当量的ATRA-CC，40℃反应48h，反应结束后，滴加适量饱和食盐水，搅拌一段时间后，将反应混合液慢慢倾入至过量的丙酮中，析出沉淀。沉淀再用丙酮/水、丙酮洗涤，冷冻干燥，得产物透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯(HA-CC-ATRA)，1H-NMR图谱见图5。
(4)接枝率的测定：以ATRA为标准品，通过紫外分光光度计测定其在345nm处的吸收度，以ATRA的浓度为横坐标，吸光度作纵坐标建立标准曲线(见图6)，利用此标准曲线测定HA-CC-ATRA结构中ATRA含量，从而计算接枝率，测得HA-CC-ATRA中ATRA接枝率为20.4％。
(5)为进行壳材料的筛选，另外合成对照用壳材料透明质酸正十六烷基酯(HA-C16)，并与HA-CC-ATRA比较，以突显HA-CC-ATRA作为壳材料的优势，其合成方法参考HA-CC-ATRA，控制接枝率为20％，接枝率的测定采用1H-NMR特征峰峰面积比较法，具体为：将HA-C16溶于d6-DMSO∶D2O(1∶1)，进行1H-NMR分析(图7)，通过比较十六烷基的甲基氢信号与HA的甲基氢信号数目，确定C16接枝率。
3.纳米制剂制备工艺
(1)空白CS NL制备工艺优化
本发明目的之一在于提供工艺可控、稳定性良好的，可荷载藤黄酸的主动靶向制剂CS NL，所述纳米制剂采用纳米沉淀法，又名“一步法”，空白CS NL制备方法如下：
取核材料(如BzPGA等)，溶于能与水互溶的有机溶剂(比如丙酮、DMSO等)，作为有机相；另取壳材料(如HA-CC-ATRA等)水溶液，作为水相；加热搅拌下，将溶有核材料的有机溶剂溶液(有机相)，通过微量注射泵加入至壳材料水溶液(水相)中；充分涡旋、搅拌后，将含纳米粒的溶液转移至Amicon Ultra-15centrifu藤黄酸l filter(Millipore，Billerica，MA)，离心，所得富集纳米制剂中以水洗二次，以除去残余有机溶剂与自由大分子，同时富集纳米制剂；所得纳米制剂重新混悬于去离子水，或重新混悬于含冻干保护剂的水溶液，冷冻干燥制得纳米制剂产品CS NL。
所述制备工艺中，HA-CC-ATRA与BzPGA质量比(L/P值)，BzPGA浓度，有机相与水相体积比(Vo/Vw)，BzPGA分子量(分别由分子量为10K、100K、1000KDa的P藤黄酸制备而来，分别以BzPGA-10K、100K、1000KDa表示)，有机溶剂种类，冻干保护剂等参数对所制备纳米制剂质量影响较大。因此，本发明通过单因素爬坡试验，以所制备纳米制剂的粒径、粒径分布、电位等为指标，筛选最佳工艺，要求所制备空白CS NL粒径大小合适，粒径分布窄，电位绝对值大。所筛选各工艺参数范围如下：
L/P值：0、5、10、20、50、100、200、500％；
BzPGA浓度：0.3、1.5、7.5mg/mL；
Vo/Vw：1∶10、1∶5、2∶5；
BzPGA分子量：BzPGA-10K、100K、1000KDa；
有机溶剂种类：丙酮、DMSO；
冻干保护剂：无冻干保护剂、5％蔗糖、10％蔗糖、5％葡萄糖、10％葡萄糖。
各参数不同条件下制备的CS NL粒径、粒径分布、电位见图8、图10～图14，初步确定CS NL的最佳制备工艺：L/P值50％，BzPGA浓度1.5mg/mL，Vo/Vw为1∶5，BzPGA由分子量100KDa或1000KDa的P藤黄酸制备而来，有机溶剂种类为丙酮，冻干保护剂为10％葡萄糖。其中，L/P值为最关键参数，L/P值对纳米制剂抵抗离心的能力有明显影响(图9)，当L/P值低于10％时，在超滤离心时所制备CS NL会聚集成肉眼可见固体，因此本发明所使用纳米沉淀法要求L/P值不能低于10％，但L/P值过高则会造成过量的壳材料自组装成胶束。
(2)荷载藤黄酸的CS NL制备工艺的进一步优化
本发明还公开了一种荷载藤黄酸的CS NL，制备方法是在有机相中加入藤黄酸，按上述空白CS NL最佳工艺制备荷载藤黄酸的CS NL。在制备荷载藤黄酸的CS NL过程中，藤黄酸占核材料质量的百分比(药/载比，D/P比)、L/P值、核材料BzPGA分子量、核材料种类、壳材料种类等会影响药物载药量与包封率、缓释性能，以及纳米制剂对药物的保护作用。因此，需要在空白CS NL工艺优化的基础上，以载药量与包封率(图16～图18)、缓释性能(图19)、对药物的保护作用(图20)、冻干稳定性(图21)等为指标，进一步优化工艺，要求所制备荷载藤黄酸CS NL的载药量、包封率高，缓释性能好，对所荷载药物保护能力强，冻干稳定。所筛选各工艺参数范围如下：
D/P比：5％、10％、20％；
L/P值：20、50、100％；
BzPGA分子量：BzPGA-10K、100K、1000KDa；
核材料种类：BzPGA、PrP藤黄酸；
壳材料种类：HA-CC-ATRA、HA-C16；
冻干保护剂：选择空白CS NL最佳冻干保护剂(10％葡萄糖)，考察冻干前后药物泄漏量。
各参数对荷载藤黄酸CS NL的影响如下：
①D/P比：D/P比越高则载药量越高，但D/P比过高会导致药物泄露、包封率降低，造成原料的浪费。D/P比为5％、10％时，包封率均接近100％，D/P比为20％时，包封率有所下降，表明有药物泄露情况。
②L/P值：CS NL制备工艺参数L/P值对藤黄酸CS NL极为重要，过低则由壳材料组成的外壳对疏水性内核保护不够，发生纳米制剂的聚集和药物的泄露，过高则壳材料在疏水性内核表面饱和，过量的壳材料会自组装成粒径较大的纳米胶束，单纯靠粒径、粒径分布、电位为指标，可能无法筛选出最佳L/P值。因此，需要以载药量与包封率、稳定性、释药速率等为指标，进一步优化L/P值。由图16，D/P比为20％时，包封率随L/P值增加而增加，表明L/P值对包封率有一定影响，但影响不大。由图19，L/P值对藤黄酸CS NL释药曲线影响有较明显影响，L/P值50％的载药纳米制剂释药速率具有一定的优势，释药速率最慢，L/P值20％时，壳材料对载药内核的保护不够，L/P值100％时，壳材料过量，会自组装成释药速率较快的胶束。
③BzPGA分子量：BzPGA分子量对藤黄酸CS NL载药量、包封率有一定影响，BzPGA分子量越大，对藤黄酸的荷载、包封能力越强，BzPGA-1000KDa包封能力更强。BzPGA分子量对藤黄酸CS NL释药曲线由较明显影响，释药速率随着BzPGA分子量的增大而减慢，BzPGA-1000KDa作为核材料的藤黄酸CS NL缓释效果最好。由图20，与BzPGA-100KDa相比，BzPGA-1000KDa作为核材料制备的CS NL对藤黄酸的保护效果更具备优势。虽然与BzPGA-1000KDa相比，BzPGA-100KDa作为核材料制备的藤黄酸CS NL粒径更小，但BzPGA-1000KDa在载药量与包封率、缓释效果、对藤黄酸的保护效果等方面更具优势，而且BzPGA-100KDa作为核材料制备的藤黄酸CS NL的粒径不到80nm，完全满足要求，因此确定BzPGA-100KDa作为最佳核材料。
④核材料种类：核材料种类对载药量、包封率有明显影响，具备π键堆积能力的BzPGA对藤黄酸的荷载、包封能力具有巨大的优势。
⑤壳材料种类：壳材料种类对藤黄酸CS NL载药量、包封率有一定影响，HA-CC-ATRA对载药内核的包封能力具备一定优势。由图19，壳材料种类对藤黄酸CS NL释药曲线有明显影响，HA-CC-ATRA的缓释效果明显优于HA-C16。由图20，与HA-C16相比，HA-CC-ATRA作为壳材料制备的CS NL对藤黄酸的保护效果更具备优势。
⑥冻干保护剂：由图21，10％葡萄糖对藤黄酸CS NL具有很好的冻干保护作用，冻干后几乎无药物泄漏，冻干前后藤黄酸CS NL粒径变化(冻干后粒径与冻干前粒径比值，Sf/Si)在1±0.3范围内，符合文献Eur.J.Pharm.Biopharm.2000，50(3)：379～387要求，冻干后药物几乎无泄漏。
综上所述，通过系统的制备工艺优化，本发明获得了藤黄酸CS NL的最佳制备工艺，条件如下：BzPGA-1000KDa为核材料，HA-CC-ATRA为壳材料，L/P值50％，BzPGA浓度1.5mg/mL，Vo/Vw为1∶5，有机溶剂种类为丙酮，冻干保护剂为10％葡萄糖，D/P值为10％。所制备藤黄酸CS NL的粒径在80nm左右，粒径分布小于0.2，电位-30mV左右(图22)；D/P值为10％时包封率接近100％；10％葡萄糖对藤黄酸CS NL冻干保护效果好；释药特征符合一级动力学方程(Mt＝83.54×(1-e-0.048t)，r＝0.99，p＜0.001)，无突释、速释现象，释放50％药物所需时间为19小时；CS NL对藤黄酸具有良好的保护作用，载入CS NL后，藤黄酸在各基质中稳定性大大提高；所制备藤黄酸浓度为1mg/mL的藤黄酸CS NL在4℃储存2周内，粒径、粒径分布、电位、包封率无明显改变(图23)，表明本发明所述藤黄酸CS NL储存稳定性良好。
按上述最佳工艺条件，制备的藤黄酸CS NL的粒径、粒径分布、电位、载药量与包封率、缓释性能、对藤黄酸的保护作用等基本一致，不同批次之间的相对标准偏差在5％以内，说明本发明所述制备工艺简单可控、稳定性良好。
4.纳米靶向制剂CS NL对影响藤黄酸成药性的问题的改善作用
本发明所述纳米靶向制剂CS NL对影响藤黄酸成药性的问题具明显改善作用，具体表现在改善水溶性、提高稳定性、改善体内药代动力学特征、赋予藤黄酸肿瘤靶向性、提高藤黄酸抗肿瘤活性。
(1)改善水溶性
藤黄酸难溶于水，虽然藤黄酸与精氨酸制成的复盐能溶于水，但藤黄酸在精氨酸的碱性条件下极不稳定，本发明所公开的藤黄酸CS NL，不需要精氨酸等碱性物质，即可在水中具良好分散性，即使4℃静置1天后，其仍具有近似溶液状态的分散性(表1)。藤黄酸浓度为1mg/mL的纳米制剂混悬液4℃静置1天，其仍具有近似溶液状态的分散性，4℃静置14d后，纳米制剂的均一性变差，纳米制剂会发生一定程度的沉降，但重新摇匀后，纳米制剂混悬液重新呈现均一状态，即使于4℃静置1天，样品体系总RSD值不超过5％。
表1 藤黄酸CS NL均一性考察
U：上层取样；M：中层取样；D：下层取样。
(2)提高稳定性
藤黄酸在氧化剂、还原剂、血浆、全血、组织中均不稳定，甚至在水中放置也会发生降解，将藤黄酸载入本发明所述CS NL后，由于疏水性内核材料BzPGA与壳材料HA-CC-ATRA所形成的分子栅栏的保护作用，能够隔绝基质中的不稳定因素，从而大大提高藤黄酸的稳定性。其中，藤黄酸CS NL在水中4℃放置4周后无药物泄露，而且几乎无任何药物降解；PBS缓冲盐溶液(含0.1％w/v吐温80)37℃孵育120小时，藤黄酸CS NL降解率不超过10％，而单纯藤黄酸的降解率会接近80％；此外，与单纯藤黄酸相比，将藤黄酸载入CS NL后，在H2O2、GSH、血浆、全血、肝脏匀浆液、肿瘤匀浆液中稳定性均有明显或极明显提高(图20、表2)。
表2 各纳米制剂在不同基质中降解半衰期
“L/P50％”是指L/P值为50％，“C100”、“C1000”分别表示以BzPGA-100KDa与BzPGA-1000KDa为核材料，“SC16”、“SATRA”分别表示以HA-C16与HA-CC-ATRA为壳材料；
“*”各纳米制剂与藤黄酸比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
“#”L/P50％/C100SATRA NL与L/P50％/C100SC16NL比较，#P＜0.05；
“Δ”L/P50％/C1000SATRA NL与L/P50％/C100SATRA NL比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.05。
(3)改善药代动力学特性
藤黄酸在体内极易被代谢清除，这明显影响了藤黄酸在体内的活性，将藤黄酸载入本发明所述CS NL后，由于疏水性内核材料BzPGA与壳材料HA-CC-ATRA所形成的分子栅栏的保护作用，能够隔绝机体内包括药物代谢酶在内的不稳定因素，从而明显提高藤黄酸在血液中的稳定性，延长藤黄酸在体内滞留时间，尤其是能显著提高藤黄酸在血浆中的暴露量(AUC)与组织分布量，这为藤黄酸在体内抗肿瘤活性的发挥提供了必要的条件。
藤黄酸载入CS NL前后在大鼠体内药-时曲线见图24，在小鼠体内血浆、组织分布见图25，药代动力学参数分别见表3、表4。由表3可知，相对于普通藤黄酸注射液，本发明所公开的藤黄酸CS NL能使藤黄酸的t1/2提高6.88倍，MRT(0-∞)提高6.24倍，AUC(0-∞)提高14.85倍，Cmax提高7.55倍，而CL则降为0.061倍，即与普通藤黄酸注射液相比，藤黄酸CS NL的各药动学参数均有极显著的提升(P＜0.01)。由表4，相同给药剂量下(按藤黄酸计算，6mg/Kg)，载入纳米制剂后的藤黄酸半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT0-∞)、血浆清除率(Cl)分别为普通藤黄酸注射液的11.80、16.80、0.11倍，血浆总暴露量(AUC0-∞)提高9.43倍，并且最高血药浓度(Cmax)也明显提高(P＜0.05)。由图25，载入本发明所述纳米靶向制剂后，藤黄酸在各组织中滞留时间与总暴露量均有不同程度的提高。
表3 普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL大鼠药代动力学参数比较
“*”与普通藤黄酸注射液相比，P＜0.05；“**”与普通藤黄酸注射液相比，P＜0.01。
表4 普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL大鼠药代动力学参数比较
“*”与普通藤黄酸注射液相比，P＜0.05。
(4)提高肿瘤组织靶向性
肿瘤组织靶向性的提高能够进一步提高抗肿瘤药物(如藤黄酸等)的疗效，同时减低抗肿瘤药物对正常组织的毒性。将藤黄酸载入本发明所述CS NL后，由于本发明所使用壳材料HA-CC-ATRA中HA能够主动式别肿瘤细胞表面高表达的CD44受体，从而使荷载藤黄酸的CS NL具有肿瘤部位主动靶向能力，使得藤黄酸在肿瘤部位的分布量大大增加。在到达肿瘤组织中后，由于CS NL对藤黄酸具有很好的保护作用和缓释性能，这使得藤黄酸在肿瘤部位能够保持很好的稳定性，并缓慢释放藤黄酸，发挥长效抗肿瘤效果。
藤黄酸载入CS NL前后在荷瘤小鼠体内血浆、组织分布见图26，相关参数见表5。载入本发明所述纳米靶向制剂后，藤黄酸在荷瘤小鼠体内血浆总暴露量明显提高，但滞留时间的延长幅度不如正常小鼠大(表4)，这可能是由于藤黄酸纳米制剂在进入血液循环后，迅速分布到肿瘤组织的原因。载入本发明所述CS NL后，藤黄酸主要分布到肿瘤组织，其在肿瘤组织的滞留时间与总暴露量均大幅度提高，其在肿瘤的相对摄取率(re)达到155.11，大大高于其他组织，这说明本发明所述CS NL具备很好的肿瘤靶向性。
表5 普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL在荷瘤小鼠肿瘤以及各主要器官组织分布参数
aCe，峰浓度比-峰浓度比，Ce＝(Cmax)n/(Cmax)s，其中(Cmax i)n与(Cmax i)s分别表示纳米制剂与普通制剂在第i个器官或组织的峰浓度，Ce值愈大，表明改变药物分布的效果愈明显；
bre，相对摄取率，re＝(AUCi)n/(AUCi)s，式中(AUCi)n与(AUCi)s分别表示纳米制剂与普通制剂在第i个器官或组织的药时曲线下面积，re大于1表示纳米给药系统在该器官或组织有靶向性，re愈大靶向效果愈好，等于或小于1表示无靶向性；
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
(5)提高体内抗肿瘤活性
在验证本发明所述CS NL能够改善藤黄酸水溶性、提高稳定性、改善药代动力学特征、提高肿瘤组织靶向性的基础上，进一步提高藤黄酸抗肿瘤活性是本发明所述CS NL的最终目的。本发明以小鼠Heps肝癌细胞与黑色素瘤B16F10细胞分别构建实体瘤模型，研究本发明所述荷载藤黄酸CS NL的体内抗肿瘤活性，主要药效学指标包括动物体重动态监测数据、肿瘤体积动态监测数据、肿瘤重量与抑瘤率、肿瘤组织病理切片、肿瘤与免疫器官指数、生存期等。数据显示，将藤黄酸载入本发明所述CS NL后，藤黄酸的抗肿瘤活性能显著提高。本发明所述荷载藤黄酸CS NL能够明显抑制Heps、B16F10实体瘤的生长，肿瘤体积、重量明显缩小，抑瘤率大大提高(图27～图32)。而且与藤黄酸相比，本发明所述荷载藤黄酸CS NL能明显延长B16F10黑色素瘤模型小鼠的生存时间(图33)，抑制B16F10的肺转移(图34、图35)。
(6)安全性初步评价
组织分布与药代动力学数据显示，本发明所述CS NL能够提高藤黄酸在动物体内血浆以及各组织的暴露量，延长体内滞留时间，这为藤黄酸的抗肿瘤活性的提高提供依据，但也有可能增加藤黄酸的毒副作用，而且也需要确切的数据证实空白CS NL是否对机体有不良影响。基于此，本发明初步评价了荷载藤黄酸CS NL以及空白CS NL的安全性。主要的评价指标有：动物体重、各脏器指数、血常规、血生化等。数据显示，本发明所述荷载藤黄酸CSNL以及空白CS NL的安全性良好，对动物体重、各脏器指数(图36)、血生化(表6)等均无明显影响。另外，本发明数据显示，藤黄酸对脾脏指数与丙氨酸氨基转氨酶(ALT)有一定影响，而载入本发明所述CS NL后，藤黄酸的这一影响消失。这说明本发明所述CS NL不仅不会增加藤黄酸的毒副作用，而且还能消除藤黄酸原有的轻微的毒副作用。
表6 经静脉注射给予藤黄酸、空白CS NL、藤黄酸CS NL后小鼠血生化指标
“*”藤黄酸组、CS NL组、藤黄酸/CS NL组与Saline组比较，*P＜0.05。
附图说明
图1：藤黄酸CS NL结构示意图；
图2：实施例2中由分子量为100KDa的聚(γ-谷氨酸钠)制备而来的聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯与聚(γ-谷氨酸)α-丙基酯的1H-NMR图谱；
图3：实施例3中透明质酸-四丁基铵复合物的1H-NMR图谱；
图4：实施例4中全反式维甲酸-6-溴正己酯的1H-NMR图谱；
图5：实施例5中透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯的1H-NMR图谱；
图6：实施例6中HA-CC-ATRA接枝率计算用标准曲线；
图7：透明质酸十六烷基酯的1H-NMR谱图
图8：不同L/P值条件下核-壳结构纳米制剂的粒径与电位；
图9：离心前后各L/P值核-壳结构纳米制剂的粒径、电位变化情况；
图10：不同BzPGA浓度条件下的纳米制剂的粒径、PDI、电位；
图11：不同Vo/Vw条件下的纳米制剂的粒径、PDI、电位；
图12：使用不同分子量BzPGA制备的纳米制剂的粒径、PDI、电位；
图13：不同有机溶剂条件下的纳米制剂的粒径、PDI、电位；
图14：冻干保护剂对空白CS NL粒径的冻干保护作用；
图15：不同L/P值、D/P比的藤黄酸CS NL粒径、PDI、电位；
图16：不同L/P值、D/P比的藤黄酸CS NL的载药量与包封率；
图17：不同种类核材料的藤黄酸CS NL的载药量与包封率；
图18：不同种类壳材料的藤黄酸CS NL的载药量与包封率；
图19：各载药纳米制剂的释药曲线；
图20：藤黄酸CS NL在PBS缓冲盐(A)、H2O2(B)、GSH(C)、血浆(D)、全血(E)、肝脏匀浆液(F)、肿瘤匀浆液(G)中的稳定性；
图21：藤黄酸CS NL在冻干前后粒径、电位、PDI(A)以及包封率(B)变化情况；
图22：藤黄酸CS NL的粒径电位分布图(A)与TEM图(B)；
图23：储存过程中藤黄酸CS NL的粒径、PDI、电位(A)与包封率变化情况(B)；
图24：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予大鼠(5mg/Kg)后药-时曲线；
图25：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予正常小鼠(6mg/Kg)后血浆与组织分布；
图26：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予荷瘤小鼠(6mg/Kg)后血浆与组织分布；
图27：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后Heps肝癌实体瘤模型小鼠的肿瘤体积；
图28：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后Heps肝癌实体瘤模型小鼠的肿瘤重量；
图29：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后Heps肝癌实体瘤模型小鼠的剥离实体瘤；
图30：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的肿瘤体积；
图31：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的肿瘤重量；
图32：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的剥离实体瘤；
图33：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的生存曲线；
图34：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的肺转移情况；
图35：普通藤黄酸注射液与藤黄酸CS NL经静脉注射给予小鼠(6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的肺转移灶数目；
图36：藤黄酸CS NL及空白CS NL对体重(A)与各脏器指数的影响。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明的进一步说明，但仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
聚(γ-谷氨酸)-十六烷基三甲基铵复合物的制备：
分别称取分子量为100KDa的聚(γ-谷氨酸钠)10g，溶于200mL水中，搅拌下分别滴加3％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液至不再产生沉淀，减压抽滤的沉淀，以适量热水洗三次，真空干燥得白色固体21.53g，即为由分子量为100KDa的聚(γ-谷氨酸钠)制备而来的聚(γ-谷氨酸)-十六烷基三甲基铵复合物(以γ-P藤黄酸-CTA-100KDa表示)。
实施例2
聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯的制备：
取γ-P藤黄酸-CTA-100KDa 2g(含谷氨酸单元4.84mmol)，溶于60mL NMP中，加入1.22g NaHCO3(14.52mmol)，0.414mL溴苄(5.33mmol)，50℃加热搅拌使γ-P藤黄酸-CTA复合物溶解后，50℃反应8h。反应结束后，静置冷却，过滤除去不溶物(过量的NaHCO3与生成的NaBr)，滤液倾入至200mL甲醇中，再加入100mL 4％盐酸水溶液，冰浴下搅拌0.5h，减压抽滤，适量冷甲醇∶水(2∶1)洗三次，所得沉淀溶于50mL NMP，重复上述操作，真空干燥得白色粉末0.9044g，即为由分子量为10万Da的聚(γ-谷氨酸钠)制备而来的聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯(以BzPGA-100KDa表示)，其1H-NMR见图2。
白色粉末，1H-NMR(300MHz，d6-DMSO，δ)：1.79(m，1H，β-CH 2)，1.96(m，1H，β-CH 2)，2.21(m，2H，α-CH 2)，4.26(m，1H，CH)，5.08(s，2H，CH 2Ar)，7.31(s，5H，Ar-H)，8.27(brs，1H，NH)。
实施例3
透明质酸钠的酸化与透明质酸-四丁基铵复合物的制备：
取预处理后的强酸型离子交换树脂31.5g，以去离子水冲洗至中性。称取HA-Na(14600Da)9g，加入450mL去离子水，制得2％(w/v)的HA-Na水溶液，加入强酸型离子交换树脂柱后，室温搅拌6h，pH试纸检测交换效果，过滤得HA水溶液(2％w/v的HA-Na水溶液pH为6～7，2％w/v的HA水溶液pH为3)。
取25％TBA-OH的水溶液，室温搅拌下逐滴加入至上述HA水溶液中，直至溶液体系pH～7(共使用TBA-OH的水溶液21mL)，冷冻干燥制得白色固体13.6g，即为透明质酸-四丁基铵复合物(HA-TBA)，其1H-NMR见图3。
淡黄色固体，1H-NMR(300MHz，d6-DMSO，δ)1.80(s，3H，CH3)，3.61～4.66(m，12H，10CH&CH2)，0.93(t，24H，4×CH3，J＝7.5Hz)，1.30(m，16H，4×CH2)，1.56(m，16H，4×CH2)，3.16(t，16H，4×CH2，J＝7.5Hz)。
实施例4
全反式维甲酸-6-溴正己酯的合成：
取0.6g的1，6-二溴己烷溶于10ml四氢呋喃中，加入650mg的碳酸钾搅拌，取0.5g全反式维甲酸溶于四氢呋喃中，再分批滴加到上述溶液中，室温反应4h，加水终止反应，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，硅胶柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1)，得黄色粉末348mg，即为全反式维甲酸-6-溴正己酯(ATRA-CC)，其1H-NMR见图4。
黄色粉末，1H-NMR(CDCl3，300MHz)，δ1.04(s，6H，16-H，17-H)，1.28(m，2H，H-2)，1.48(m，8H，H-22，23，24，25)，1.65(m，2H，H-3)，1.73(s，3H，H-18)，2.02(s，5H，H-19，H-4)，2.38(s，3H，H-20)，5.80(s，1H，H-4)，6.19(m，2H，H-8，H-10)，6.34(m，2H，H-11，H-12)，7.0(m，1H，H-7)，3.41(t，6.6Hz，2H，H-26)，4.14(t，6.6Hz，2H，H-21)。
实施例5
透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯的合成：
取0.44g的HA-TBA盐(含COOTBA基团0.668mmol)，溶于15mL无水DMSO中，按HA-TBA中的COOTBA基团摩尔数，加入0.2eq的ATRA-CC，40℃反应48h；反应结束后，滴加4ml饱和食盐水，充分搅拌后，将反应混合液慢慢倾入至80mL丙酮中，析出沉淀，减压抽滤，所得白色沉淀以丙酮-水(5∶1)洗三次，丙酮洗三次，挥干丙酮得白色粉末；上述沉淀充分溶于12mL的1％NaCl水溶液，搅拌下缓慢倾入至60mL丙酮中，充分搅拌后减压抽滤，所得白色沉淀以丙酮-水(5∶1)洗三次，丙酮洗三次，挥干丙酮、真空干燥得黄色粉末0.2g，即为透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯(HA-CC-ATRA)，其1H-NMR见图5。
黄色粉末，1H-NMR(300MHz，D2O-6％d6-DMSO，δ)5.43～5.54(ATRA：-CR＝CH-)，3.60～4.14(HA：-OCH，CH2OH)，3.23-3.43(CC linker：-OCH2-)，2.27(HA：CH3CO-)，1.18-1.96ppm(CC linker：-CH2-，ATRA：-CH2-).
实施例6
透明质酸正十六烷基酯的合成：
取0.44g的HA-TBA(0.02mmol，含COOTBA 0.668mmol)，溶于15mL无水DMSO中，搅拌下加入40.8mg的1-溴正十六烷(20％Eq COOTBA)，40℃反应48h。反应结束后，反应结束后的后处理按实施例5进行，得白色粉末产物HA-C16(20％接枝率)0.19g。即为透明质酸(6-全反式维甲酰氧基)正己酯(HA-CC-ATRA)，其1H-NMR见图7，计算接枝率为20.26％。
HA-C16，白色粉末，1H-NMR(300MHz，d6-DMSO∶D2O＝1∶1，δ)：1.98(m，14.81H，HA-CH3)，2.80～4.61(m，HA-CH&CH2)，0.90(m，3.00H，C16-CH3)，1.29(m，C16-CH2×13)，1.67(m，C16-CH2)，4.21(m，C16-CH2).
实施例7
HA-CC-ATRA接枝率的测定：
精密称取10mg的全反式维甲酸，加入DMSO∶H2O(v∶v＝6∶4)定容至100ml，得到浓度为0.1mg/mL的全反式维甲酸母液。取母液分别配置成1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/mL工作溶液。再利用紫外分光光度计测定其在345nm处的吸收度(n＝3)，以ATRA的浓度为横坐标，吸光度作纵坐标建立标准曲线。
精密称取HA-CC-ATRA于容量瓶中，加DMSO∶H2O(v∶v＝6∶4)定容至10mL，超声溶解后分别测定其在345nm处的吸光度(n＝3)，利用标准曲线，计算得到全反式维甲酸的质量，进而计算全反式维甲酸的接枝率。
所得标准曲线如图6所示，ATRA浓度与紫外吸收值具良好的线性关系，对HA-CC-ATRA溶液进行紫外分光光度测量，根据标准曲线计算实施例5的实际接枝率为20.4％。
实施例8
纳米制剂制备工艺摸索：HA-CC-ATRA与BzPGA质量比值(L/P值)
通过固定BzPGA浓度(1.5mg/mL)、Vo/Vw(1∶5)、分子量(BzPGA-100KDa)、有机溶剂种类(丙酮)，调整HA-CC-ATRA浓度(0、0.015、0.03、0.06、0.15、0.3、0.6、1.5mg/mL)，来调节L/P值(0、5、10、20、50、100、200、500％)。具体制备方法如下：
精密称取45mg BzPGA，溶于30mL丙酮中，制得1.5mg/mL的BzPGA溶液。精密称取30mg HA-CC-ATRA，溶于20mL水中，加热至65℃(体系呈均一透明溶液，无Tyndall效应)，以此为储备液配制0、0.015、0.03、0.06、0.15、0.3、0.6、1.5mg/mL的HA-CC-ATRA水溶液。
取10mL上述不同浓度的HA-CC-ATRA水溶液，加热至65℃，搅拌下，将2mL浓度为1.5mg/mL的BzPGA溶液通过注射泵以0.5mL/min速度加入至HA-CC-ATRA水溶液中，涡旋1min，65℃敞口搅拌4min，室温敞口搅拌3h，搅拌结束后，将含纳米粒的溶液转移至AmiconUltra-15centrifu藤黄酸l filter(Millipore，Billerica，MA，cutoff 100KDa)，4℃、2000rpm离心20min，所得富集纳米制剂中以水洗二次后，重新混悬于去离子水，使最终纳米制剂产品浓度为1mg/mL(浓度按BzPGA计算，1mg/mL是指每mL含1mgBzPGA)。测定制备所得纳米制剂的粒径与电位，以考察最佳的L/P值，另外，为考察离心对纳米制剂的影响，需在超滤离心前，测定粒径与电位，考察超滤离心前后粒径、电位的变化情况。所有纳米制剂不用时均置于4℃冰箱保存。
不同L/P值条件下CS NL的粒径与电位(超滤离心前)见图8，超滤离心前后各L/P值核-壳结构纳米制剂的粒径、电位变化情况见图9。在L/P值为0～10％条件下制备的纳米制剂在离心后，会析出肉眼可见固体，图9中“+++”、“++”、“+”分别表示析出固体的情况严重、中等、轻微。当L/P值大于20％时，超滤离心前后各L/P值CS NL的粒径、电位变化不大。这说明壳材料HA-CC-ATRA对疏水性内核具有很好的保护作用，足够比例的HA-CC-ATRA能够避免离心等处理对纳米制剂的影响。在超过50％后，壳材料HA-CC-ATRA逐渐在疏水性内核表面达到饱和，过量HA-CC-ATRA可能会自组装成的粒径较大的胶束，但需要进一步以其他指标确证。
因此，确定L/P值应大于20％，初步确定最佳L/P值为50％，此条件下，HA-CC-ATRA在疏水性内核表面接近饱和，所制备的核-壳结构纳米制剂粒径70nm，电位-28mV。
实施例9
纳米制剂制备工艺摸索：BzPGA浓度
通过固定L/P值为50％、Vo/Vw(1∶5)、分子量(BzPGA-100KDa)、有机溶剂种类(丙酮)，改变BzPGA在有机相浓度(0.3、1.5、7.5mg/mL)与HA-CC-ATRA在水相浓度(0.03、1.5、0.75mg/mL)，按实施例7方法制备纳米制剂(BzPGA浓度0.3、1.5、7.5mg/mL)，测定粒径与电位，以考察最佳的BzPGA浓度。
不同BzPGA浓度条件下的CS NL的粒径、PDI、电位见图10。BzPGA浓度1.5mg/mL条件下，所制备的纳米制剂粒径、PDI最小，电位绝对值最大。浓度7.5mg/mL时，由于BzPGA析出速度过快，使得纳米制剂粒径大于200nm。因此，为制备合适的核-壳结构纳米制剂，BzPGA浓度不能过高。但是当BzPGA浓度降低至0.3mg/mL时，所制备的纳米制剂粒径会超过100nm，这可能是由于当BzPGA、HA-CC-ATRA浓度过低时，会有一部分高分子材料处于溶解状态，在超滤离心除去溶剂时，会因浓缩而迅速聚集形成粒径较大的纳米粒，同时也使得PDI大大增加。另外，由于本发明使用的Millipore超滤管截留分子量为100KDa，处于游离状态的HA-CC-ATRA会被超滤除掉，这使得BzPGA浓度0.3mg/mL条件下的纳米制剂表面的HA-CC-ATRA低于实际的50％(m/m％)，因此最终的纳米制剂电位远低于BzPGA浓度1.5mg/mL条件下的纳米制剂。
因此，确定BzPGA浓度1.5mg/mL为最佳条件。
实施例10
纳米制剂制备工艺摸索：有机相与水相体积比(Vo/Vw)
通过固定L/P值为50％、BzPGA在有机相浓度(1.5mg/mL)、分子量(BzPGA-100KDa)、有机溶剂种类(丙酮)，改变水相体积(1∶10、1∶5、2∶5)与HA-CC-ATRA在水相浓度(0.075、1.5、0.3mg/mL)，按实施例7方法制备纳米制剂(Vo/Vw为1∶10、1∶5、2∶5)，测定粒径与电位，考察最佳的Vo/Vw值。
不同Vo/Vw条件下的纳米制剂的粒径、PDI、电位见图11。类似于实施例9，若体系中有机溶剂比例过高(Vo/Vw＝2∶5)，会有一部分高分子材料处于溶解状态，在超滤离心除去溶剂时，会因浓缩而迅速聚集形成粒径较大的纳米粒，同时也使得PDI大大增加，同时处于游离状态的HA-CC-ATRA会被超滤除掉，而使电位绝对值降低。Vo/Vw为1∶10条件下制备的纳米制剂具有更小的粒径，这可能是由于高体积的水相对BzPGA具备更快的分散作用，使得聚集成单个纳米粒的BzPGA分子数变少，从而能得到稍小的粒径。但从工艺角度上，Vo/Vw为1∶10条件下，制备相同量的纳米制剂，需要使用1倍量的水，这增加了后续超滤浓缩处理的工作量，并且1∶10、1∶5两条件下所制备的CS NL粒径相差不大，Vo/Vw为1∶5条件下制备的纳米制剂粒径(70nm)完全能够满足靶向性等要求。
因此，本发明仍选择Vo/Vw 1∶5作为纳米制剂制备工艺条件。
实施例11
纳米制剂制备工艺摸索：BzPGA分子量考察
通过固定L/P值为50％、BzPGA在有机相浓度为1.5mg/mL、Vo/Vw为1∶5、有机溶剂种类(含5％DMSO的丙酮)，按实施例7方法制备由不同分子量BzPGA(分别由分子量为10K、100K、1000KDa的P藤黄酸制备而来，分别以BzPGA-10K、100K、1000KDa表示)的纳米制剂，测定粒径与电位，考察BzPGA分子量对纳米制剂的影响。
使用不同分子量BzPGA制备的纳米制剂的粒径、PDI、电位见图12。不同分子量的同一高分子材料的粘度会有差别，粘度会影响核-壳结构纳米制剂的粒径与表面电位，随疏水性核材料分子量的增大，粒径与电位均变小，这是因为分子量越大，在纳米沉淀的过程中，由核材料形成的疏水性内核更致密，致密的结构也使得药物缓释作用更明显。然而对于超大分子量的BzPGA(1000KDa)，即使由单个分子形成的疏水性内核的粒径也可能超过50nm，若发生多个分子的聚集，则很容易形成粒径较大的纳米粒。因此，随着BzPGA分子量的增加，所制备纳米制剂粒径呈现先增加后减少趋势，其中由BzPGA-10KDa制备而来的纳米制剂电位要明显小于后两者，这可能是由于其纳米制剂粒径较大，使得纳米制剂表面单位面积内的HA-CC-ATRA数量降低，从而使电位下降。由BzPGA-100KDa制备而来的纳米制剂粒径小于BzPGA-1000KDa，但理论上后者形成的纳米粒对药物的包载能力会更强。
因此，初步确定BzPGA-100KDa与BzPGA-1000KDa作为核-壳结构纳米制剂的核材料。
实施例12
纳米制剂制备工艺摸索：有机溶剂种类考察
通过固定L/P值为50％、BzPGA在有机相浓度(1.5mg/mL)、Vo/Vw(1∶5)、分子量(BzPGA-100KDa)，分别使用丙酮、DMSO作为有机相，按实施例8方法制备纳米制剂，测定粒径与电位，考察有机溶剂对纳米制剂的影响。
不同有机溶剂条件下的纳米制剂的粒径、PDI、电位见图13。丙酮为挥发性溶剂，在制备纳米制剂的过程中，会挥发大部分，即Vo/Vw发生改变，而DMSO为非挥发性溶剂，在超滤离心之前，Vo/Vw不发生改变，再加上介电常数等的差别，两者制成的纳米制剂可能会有差别。由图13可知，使用丙酮作为有机相的所制备的CS NL要明显好于DMSO。
因此，本发明选择丙酮作为纳米沉淀法制备CS NL的有机相。
实施例13
纳米制剂制备工艺摸索：冻干保护剂初步考察(空白纳米制剂)
固定L/P值为50％，BzPGA在有机相浓度为1.5mg/mL，Vo/Vw(1∶5)，分子量(BzPGA-100KDa)、有机溶剂种类(含5％DMSO的丙酮)，按实施例7方法制备浓度为10mg/mL的空白CSNL(按BzPGA计算，下同，1mg/mL是指每mL含1mg BzPGA)。设三组：①无冻干保护剂；②蔗糖：5％、10％；③葡萄糖：5％、10％。测定冻干前后粒径变化情况(Sf/Si，即冻干后粒径与冻干前粒径比值，1±0.3认为是正常)，考察冻干对空白CS NL的影响与冻干保护剂对空白CS NL冻干保护作用。
冻干保护剂对空白CS NL粒径的影响结果见图14。经冻干、复溶后，空白纳米制剂粒径会增加1倍，蔗糖的冻干保护效果较差，葡萄糖具有较好的冻干保护作用，特别是10％葡萄糖，Sf/Si在1±0.3范围内。
因此，确定10％葡萄糖作为冻干保护剂，该冻干保护剂对载藤黄酸CS NL的冻干保护作用将在实施例16中作进一步评价。
实施例14
藤黄酸CS NL制备：
以HA-CC-ATRA为壳材料，BzPGA为核材料，按实施例8～实施例12优化所得工艺，即：L/P值50％，HA-CC-ATRA在水相浓度为0.15mg/mL，BzPGA在有机相浓度为1.5mg/mL，Vo/Vw为1∶5，分子量(BzPGA-100KDa)，有机溶剂种类(丙酮)。藤黄酸溶于有机相，投药量为BzPGA质量的5％、10％、20％，即药/载比(Drug/Polymer Ratio，D/P比)分别为5％、10％、20％。具体制备方法如下：
精密称取150mg BzPGA，加入5mL丙酮，加热搅拌溶解，制得30mg/mL BzPGA的丙酮溶液。称取15.73mg藤黄酸，加入15.73mL丙酮，制得1mg/mL藤黄酸的丙酮溶液。分取30mg/mLBzPGA的丙酮溶液三份，每份0.5mL，分别加入1mg/mL藤黄酸的丙酮溶液0.75mL、1.5mL、3mL，再分别以丙酮定容至10mL，制得分别含5％、10％、20％(相当于BzPGA质量)藤黄酸的1.5mg/mL BzPGA溶液。
取含有不同比例藤黄酸的1.5mg/mL BzPGA溶液，与0.15mg/mL的HA-CC-ATRA水溶液，按实施例7方法制备荷载藤黄酸纳米制剂，所得纳米制剂经Amicon Ultra-15离心过滤器超滤离心后(4℃、2000rpm离心20min，水洗二次)，重新混悬于去离子水，制得一定浓度的纳米制剂产品(浓度按BzPGA计算，下同，1mg/mL是指每1mL含1mg BzPGA，后续试验之前，再根据不同试验目的以不同溶剂对该纳米制剂进行相应稀释)。所有纳米制剂不用时均置于4℃冰箱保存。
为进一步优化工艺参数，以包封率为指标，分别进一步考察实施例8～实施例12未完全确定的工艺参数，包括L/P值(20％、50％、100％)、BzPGA分子量(BzPGA-10KDa、100KDa、1000KDa)。同时，为对照比较本发明所使用核、壳材料的优势，同时制备HA-C16为壳材料的荷载藤黄酸纳米制剂与PrP藤黄酸为核材料的荷载藤黄酸纳米制剂。D/P比均分别为5％、10％、20％，并按以下公式计算载药量(DL％)与包封率(EE％)：
Drug-loading efficiency(DL，％)＝W/(W+WP+WL)×100％
Entrapment efficiency(EE，％)＝W/W0×100％
其中W为纳米制剂混悬液中藤黄酸的量，W0为藤黄酸投药量，WP为核材料量，WL为壳材料量。
不同L/P值、不同D/P比的藤黄酸-CS NL的粒径、PDI、电位见图15。由图15，与空白纳米制剂相比，在L/P值20％～100％，特别是L/P值50％条件下，D/P比在5％～20％范围内的藤黄酸CS NL的粒径、PDI呈减小趋势，电位绝对值呈增大趋势，说明载入藤黄酸后不仅不会破坏纳米制剂的结构，藤黄酸反而能通过π键堆积与疏水相互作用，进一步增加纳米制剂的稳定性。进一步地，所制备藤黄酸CS NL的粒径随着D/P比的增加，呈现先减小后增大的趋势，推测D/P比低于10％时，藤黄酸主要通过π键堆积镶嵌于同一条BzPGA链的芳香环之间，当超过10％时，会有部分藤黄酸通过疏水相互作用载于不同BzPGA链之间，使得粒径开始增大。L/P值为50％条件下的纳米制剂载药前后的电位变化，可能是由于在载入藤黄酸后纳米制剂粒径变小，纳米制剂表面壳材料的密度相对增加，电位绝对值增大。
L/P值对包封率影响：以HA-CC-ATRA为壳材料，BzPGA为核材料，L/P值20％、50％、100％条件下，不同D/P比(5％、10％、20％)的藤黄酸CS NL的DL％与EE％见图16。由图16可知，以HA-CC-ATRA为壳材料，BzPGA为核材料，L/P值20％～100％条件下，所制备的载药纳米制剂EE％均较高。当D/P比低于10％时，EE％不受L/P值影响，均为100％，即全部药物被包载于纳米制剂中。当D/P比为20％时，会有部分药物未被包载，并且L/P值会对EE％产生一定影响，L/P值20％、50％、100％条件下的载药纳米制剂EE％分别为87.93±1.26％、90.48±0.42％、92.69±0.20％，提示壳材料对EE％有一定影响。
壳材料种类对包封率影响：不同种类壳材料的藤黄酸/CS NL的载药量与包封率见图18。由图18可知，将壳材料由HA-CC-ATRA按摩尔数替换为HA-C16后，纳米制剂包封率有所下降，这一趋势在高D/P比纳米制剂(D/P比20％)中更明显。当D/P比为5％、10％时，以HA-C16为壳材料的纳米制剂包封率仍接近100％。这说明壳材料种类对载药量、包封率有一定影响，但只有在高D/P比(20％)时，不同种类壳材料的包封作用差别才有所体现。
BzPGA分子量对载药量和包封率影响：不同分子量BzPGA作为核材料制备纳米制剂的载药量、包封率见图17。总体上，纳米制剂对藤黄酸包封率随核材料BzPGA分子量减小而减小，特别是高D/P比纳米制剂(D/P比20％)，这一趋势更明显。对于低药载比纳米制剂(D/P比5％、10％)，BzPGA-100、1000KDa作为核材料的纳米制剂对藤黄酸包封率均接近100％，BzPGA-10KDa作为核材料的纳米制剂，D/P比5％时包封率接近100％，D/P比10％时包封率为93.89％。综上所述，BzPGA分子量对包封率有一定影响，分子量越大包封率越高，总体上BzPGA-10KDa作为核材料的纳米制剂包封率最低，其次为BzPGA-100KDa，BzPGA-100KDa作为核材料的纳米制剂包封率最高，但后两者差别不明显。
核材料种类对载药量和包封率影响：不同核材料种类制备纳米制剂的载药量、包封率见图17。核材料种类对载药量、包封率有明显影响，具备π键堆积能力的BzPGA对藤黄酸的荷载、包封能力具有巨大的优势。
实施例15
藤黄酸CS NL形态学观察：
将L/P值50％、D/P比为10％条件下制备的藤黄酸CS NL稀释一定倍数后，滴加至300目铜网，用1％磷钨酸染色，采用透射电子显微镜(transmission electronmicroscopy，TEM)观察所藤黄酸CS NL的形态，同时以马尔文粒径电位仪测定粒径、电位、PDI。
藤黄酸CS NL的TEM图见图22。
实施例16
藤黄酸CS NL储存稳定性与冻干工艺考察：
按实施例14制备藤黄酸浓度为1mg/mL的L/P值50％、BzPGA-1000KDa、D/P比10％条件的藤黄酸CS NL，4℃储存，分别于第1、2周后，取样测定粒径、PDI、电位，0.22μm微孔滤膜过滤后，测定药物含量，计算包封率。
另外，根据实施例13，10％葡萄糖的冻干保护效果较好，为进一步验证10％葡萄糖对荷载藤黄酸的纳米制剂的冻干保护作用，按实施例14制备藤黄酸浓度为1mg/mL的L/P值50％、BzPGA-1000KDa、D/P比10％条件的藤黄酸CS NL，加入10％(w/v)的葡萄糖，冷冻干燥，得载药纳米制剂的冻干制剂。复溶至相同浓度后，测定粒径、PDI、电位，按实施例12方法计算纳米制剂粒径的变化。0.22μm微孔滤膜过滤后，测定药物含量，计算包封率，考察冻干前后包封率变化情况。
储存前后藤黄酸CS NL的粒径、PDI、电位与包封率变化情况见图23，藤黄酸CS NL在水中4℃放置2周内粒径、PDI、电位几乎未发生改变，而且无药物泄露，同时也说明几乎无任何药物降解。
冻干前后藤黄酸CS NL的粒径、PDI、电位与包封率变化情况见图21，冻干前后藤黄酸CS NL的粒径有所增加，但Sf/Si在1±0.3范围内，而电位、PDI变化不大，在无冻干保护剂的情况下，藤黄酸从纳米制剂中泄露严重，包封率下降明显，而在10％葡萄糖的冻干保护作用下，包封率几乎未受到影响。以上数据说明，10％葡萄糖对藤黄酸CS NL冻干保护效果良好。
实施例17
藤黄酸CS NL体外释药：
根据稳定性数据，藤黄酸在37℃的PBS缓冲盐溶液中不稳定，而载入纳米制剂后稳定性大大增加。因此，本发明参考文献Biomaterials 2009，30(8)：1627～1634方法，测定透析膜内的纳米制剂中未释放藤黄酸的含量，以此计算药物释放量，具体如下：
取1mL 1mg/mL的D/P比为10％的各藤黄酸CS NL，分别加入1mL的20mM PBS缓冲盐溶液(含0.2％w/v吐温80)，装入透析袋(截留分子量10KDa)，以100mL的10mM PBS缓冲盐溶液(含0.1％w/v吐温80)透析，每12h更换以此透析液。分别于0、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120h，分取50μL(分取前轻轻搅动透析袋内纳米制剂混悬液)，加入250μL甲醇提取，HPLC分析，各时间点测得药物含量与0h之差即为药物释放量。所得结果见图19。
L/P值对释药速率影响(纳米制剂I、II、III比较)：L/P50％/CS NL释药速率具有一定的优势，释药速率最慢，释药50％需要15.73±2.09h，1h时仅释放2.25％。与L/P50％/CS NL相比，L/P20％/CS NL释药速率最快，释药50％需要8.40±0.63h，1h时释放8.99％。两者相比较，说明由壳材料HA-CC-ATRA组成的分子栅栏具有延缓藤黄酸释放的作用，载药疏水性内核表面的壳材料密度越高，形成的分子栅栏排列越紧密，药物缓释效果越明显。有趣的是，L/P100％/CS NL释药速率要快于L/P50％/CS NL，释药50％需要9.24±0.87h，1h时释放10.82％。在0～120h内，L/P100％/CS NL释药速率呈明显的先快后慢趋势，在8h前，其释药曲线与L/P20％/CS NL相似，8h后，释药速率开始变慢，并逐渐与L/P50％/CS NL接近。这说明L/P100％/CSNL存在一小部分由HA-CC-ATRA组成的荷载藤黄酸的纳米胶束，这部分胶束的释药速率要明显快于本发明制备的核-壳结构纳米制剂，即8h前由胶束和核-壳结构纳米制剂共同构成释药曲线，8h后才为核-壳结构纳米制剂的释药曲线。综上所述，L/P值对释药速率具有一定影响，壳材料必须达到一定比例(50％，不能过高或过低)，才能使得纳米制剂具有最佳的缓释作用。
核材料对释药速率影响(纳米制剂II、IV、V比较)：核材料分子量大小对释药速率具有一定影响。由图19可知，L/P50％/C1000S NL的缓释作用最明显，释药50％需要19.23±1.49h，1h时仅释放2.16±0.07％，即释药速率慢于L/P50％/C100S NL(但释药10％、30％、50％、80％所需时间无统计差异)，为所有制极中缓释效果最好的。L/P50％/C10S NL的释药速率最快，释药50％仅需要8.40±0.63h，并且与L/P50％/C1000S NL相比，释药10％、30％、50％、80％所需时间均有显著性差异。综上所述，核材料分子量对纳米制剂的释药速率具有明显影响，分子量越大，纳米制剂缓释效果越明显，由BzPGA-1000KDa所制备的载药纳米制剂的缓释效果最好。
壳材料种类对释药速率影响(纳米制剂II、VI比较)：与以HA-CC-ATRA作为核材料的纳米制剂(L/P50％/CS NL)相比，将壳材料按摩尔数替换为HA-C16所制备纳米制剂释药速率会大大加快，释药50％需要8.70±0.53h，1h时释放11.17％，并且与L/P50％/CS NL相比，释药10％、30％、50％所需时间有显著性差异。这说明由ATRA通过π键堆积组成的分子栅栏延缓药物释放效果，要明显优于C16通过疏水作用组成的分子栅栏。
实施例18
荷载藤黄酸的纳米制剂混悬液均一性考察(藤黄酸溶解性问题改善作用考察)：
按实施例14制备藤黄酸浓度为1mg/mL的L/P值50％、BzPGA-1000KDa、D/P比10％条件的藤黄酸CS NL水混悬液，取6mL于10mL样品瓶(规格：22×50mm)中，4℃静置6h、14d，分别于上(U)、中(M)、下(D)各取三份(每份取样位置不同)，每份50μL，稀释100倍后，再分取50μL，加入250μL甲醇提取，HPLC测定。以U、M、D不同取样点藤黄酸峰面积的RSD值，以及整体RSD值，评价藤黄酸/CS NL制剂混悬液均一性。取静置14d的纳米制剂，振摇后4℃静置6h，按上述相同操作，考察长时间储存、在混匀后样品均一性。
BzPGA浓度为10mg/mL的纳米制剂混悬液4℃静置6h，上、中、下三层所含藤黄酸浓度均接近各自理论值，均一性均良好，总RSD值均未超过1％。4℃静置14d后，纳米制剂的均一性变差，总RSD值为21.51％，样品上、中、下三层藤黄酸浓度呈增加趋势，说明经长时间储存后，纳米制剂会发生一定程度的沉降。将4℃静置14d的样品经重新摇匀后，纳米制剂混悬液重新呈现均一状态，即使于4℃静置6h，样品体系总RSD值不超过5％。
已知藤黄酸难溶于水，虽然藤黄酸与精氨酸制成的复盐能溶于水，但藤黄酸在精氨酸的碱性条件下极不稳定，而若使用聚氧乙烯蓖麻油作为助溶剂或增溶剂，则可能引起一系列不良反应，如过敏、心血管毒性、肾毒性、神经毒性等。而本发明所公开的藤黄酸纳米制剂，不需要精氨酸等碱性物质与聚氧乙烯蓖麻油等有毒辅料，即可在水中具良好分散性，即使4℃静置1天后，其仍具有近似溶液状态的分散性。
综上，本发明所述及纳米制剂能够很好地改善藤黄酸水溶性问题，避免使用精氨酸等带来的制剂不稳定问题，以及使用聚氧乙烯蓖麻油等所带来的辅料毒性。
实施例19
载药纳米制剂中藤黄酸稳定性考察(藤黄酸稳定性问题改善作用考察)：
按实施例14制备藤黄酸浓度为1mg/mL的L/P值50％、BzPGA-1000KDa、D/P比10％条件的藤黄酸CS NL水混悬液，分别配制成藤黄酸浓度为10μg/mL的以下溶液：
缓冲盐组：0.1％w/v吐温80、10mM PBS缓冲盐溶液；
H2O2组：10mM H2O2、0.1％w/v吐温80、10mM PBS缓冲盐溶液；
GSH组：10mM GSH、0.1％w/v吐温80、10mM PBS缓冲盐溶液；
血浆组：大鼠新鲜血浆；
全血组：大鼠新鲜全血；
肝脏匀浆液组：小鼠肝脏，加入1倍体积生理盐水，制备肝脏匀浆液。
Heps实体瘤匀浆液组：小鼠Heps实体瘤，加入1倍体积生理盐水，制备肿瘤匀浆液。
上述含纳米制剂体系于37℃孵育，分别于不同时间点取样，按以下方法处理：
缓冲盐组、H2O2组、GSH组：分别于不同时间点分取50μL，加入250μL甲醇提取，用于HPLC分析，所得数据用于计算藤黄酸降解率(以0h点作为100％，其他时间点与之比较)；
血浆组、全血组、肝脏、肿瘤匀浆液组：分别于不同时间点分取50μL，立即加入50μL0.5mol/L盐酸，加入200μL甲醇，充分涡旋，4℃、10000rpm离心10min，取上清，用于HPLC分析，所得数据用于计算藤黄酸降解率(以0h点作为100％，其他时间点与之比较)；
上述稳定性测试中，藤黄酸浓度为10μg/mL，每组均设10μg/mL未载入纳米制剂的藤黄酸作为对照。为验证由HA-CC-ATRA组成的外壳对疏水性内核中藤黄酸的保护作用优势，每组均设HA-C16为壳材料的藤黄酸纳米制剂，作为对照。为比较BzPGA-100KDa与BzPGA-1000KDa对藤黄酸保护作用差别，每组均设BzPGA-100KDa为核材料的藤黄酸纳米制剂，作为对照。
结果见图20，藤黄酸在各种基质中均不稳定，而载入载入本发明核-壳结构纳米制剂中后，藤黄酸在各基质中稳定性均明显提高。即使在PBS缓冲盐中，藤黄酸仍会发生缓慢降解，37℃孵育120h后(PBS缓冲盐中)，会有近80％的藤黄酸发生降解，而载入纳米制剂后，藤黄酸在PBS缓冲盐中孵育120h，仅降解10％。因此在实施例17中，通过检测纳米制剂中未释放部分的藤黄酸进行释药曲线研究。本发明所设计的核-壳结构纳米制剂能够大大提高藤黄酸的血浆、全血稳定性，这一稳定能够保证藤黄酸以有活性的原型药形式进入肿瘤部位。藤黄酸在肝脏、肿瘤组织匀浆液中降解速率比血浆、全血中更快，降解半衰期均未超过0.1h。而载入纳米制剂后，藤黄酸的稳定性大大提高，特别是在肝脏匀浆液中降解半衰期要比其他基质中长。这可能是由于，肝脏、肿瘤组织中代谢酶对藤黄酸降解速率更快，而载入纳米制剂后，由于代谢酶为大分子，其对纳米制剂的侵袭能力不如GSH、H2O2，使得载入纳米制剂前后，降解速率差别更明显，这一稳定作用保证了藤黄酸能够在肿瘤部位发挥长效作用。
三种L/P值的载药纳米制剂相比较可知，纳米制剂对藤黄酸的保护作用与壳材料种类、核材料分子量明显相关，三种纳米制剂对藤黄酸保护作用强弱顺序为L/P50％/C1000SATRANL＞L/P50％/C100SATRA NL＞L/P50％/C100SC16NL。通过L/P50％/C100SATRA NL与L/P50％/C100SC16NL比较可知，由π键堆积形成的分子栅栏(HA-CC-ATRA)对疏水性内核保护作用明显强于单纯通过疏水作用力形成的分子栅栏(HA-C16)。通过L/P50％/C1000SATRA NL与L/P50％/C100SATRA NL比较可知，核材料分子量也能影响纳米制剂对藤黄酸的保护作用，这可能是由于核材料分子量会影响藤黄酸在各基质中释放速率(具体见实施例17)，使得两种制剂在各基质中释药速率产生差别。
综上所述，可确定本发明所公开的纳米制剂能够很好地改善藤黄酸稳定性问题，载入纳米制剂后，本发明所述及核-壳结构复合纳米制剂能够很好地保护藤黄酸，抵抗基质中氧化剂、还原剂、代谢酶等的侵蚀。
实施例20
载药纳米制剂大鼠药代动力学实验(藤黄酸药代动力学问题改善作用考察)：
给药溶液配制：
藤黄酸对照注射液组(藤黄酸injection solution，藤黄酸/IS)：精密称取10mg藤黄酸、6mg L-精氨酸于样品瓶中，加入10mL注射用生理盐水，超声至溶解，0.22μM微孔滤膜过滤，制得1mg/mL藤黄酸注射液。
藤黄酸CS NL(藤黄酸/CS NL)：按实施例13制备10mg/mL的L/P值50％、D/P比10％条件的藤黄酸CS NL(即每1mL含BzPGA 10mg，藤黄酸1mg)，超滤离心后，以注射用生理盐水洗两次，重新混悬于注射用生理盐水使得藤黄酸浓度为1mg/mL，0.22μM微孔滤膜过滤，制得1mg/mL藤黄酸CS NL注射液。
给药方案：雄性SD大鼠10只，随机分为两组，每组5只，给药前禁食不禁水过夜，分别尾静脉注射藤黄酸对照注射液与本发明所公开的藤黄酸CS NL，给药剂量为5mg/kg，分别于0.083h、0.167h、0.333h、0.5h、1h、2h、4h、8h与12h眼眶后静脉丛取血约0.4mL，置于肝素化聚丙烯微量离心管中，立即以4℃、10000×g离心5min，分取血浆50μL至0.5mL聚丙烯微量离心管中，立即加入50μL的0.5M盐酸，充分涡旋，-20℃储存，待测时4℃解冻，加入200μL甲醇，涡旋1min后，4℃、8000rpm离心10min，取上清液，HPLC进样，记录峰面积，并代入标准曲线计算各时间点的大鼠血浆所含藤黄酸浓度。将大鼠血药浓度-时间数据用DAS 2.0版软件进行拟合，按非房室拟合、采用统计矩方法估算药动学参数。
大鼠尾静脉注射藤黄酸对照注射液与藤黄酸CS NL的血药浓度-时间曲线如图24所示，尾静脉注射给予大鼠后，藤黄酸对照注射液的血药浓度-时间曲线与藤黄酸CS NL相比，有显著差别，藤黄酸对照注射液的最高血药浓度(Cmax)明显低于藤黄酸CS NL。相对于藤黄酸对照注射液，本发明所公开的藤黄酸CS NL能使藤黄酸的t1/2提高6.88倍，MRT(0-∞)提高6.24倍，AUC(0-∞)提高14.85倍，Cmax提高7.55倍，而CL则降为0.061倍，即与藤黄酸对照注射液相比，藤黄酸CS NL的各药动学参数均有极显著的提升(P＜0.01)。
以上数据表明，本发明所公开的核-壳结构复合纳米制剂能够很好改善藤黄酸易被代谢清除等药代动力学特征差的问题，明显提高藤黄酸在机体中的稳定性，延长藤黄酸在体内滞留时间，尤其是能显著提高藤黄酸在血浆中的暴露量(AUC)，这为藤黄酸在体内抗肿瘤活性的发挥提供了必要的条件。
实施例21
载药纳米制剂正常小鼠药代动力学与组织分布实验(藤黄酸药代动力学问题改善作用考察)：
取雄性、昆明种小鼠(18～22g)，随机为2组(每组54只)，分别为藤黄酸溶液组(藤黄酸，6mg/Kg)、载药纳米制剂组(藤黄酸/CS-NL，按藤黄酸计算6mg/Kg)，给药后分别于5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、12h(每组、每时间点6只)，眼球取血处死，分取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑、血浆，液相色谱串联质谱测定样品中藤黄酸含量，获得药代动力学与组织分布特征，考察CS-NL对藤黄酸在正常小鼠体内的滞留时间的延长作用，以及藤黄酸在载入纳米制剂前后的组织分布差异。
经静脉注射给予藤黄酸与藤黄酸/CS NL(给药剂量：6mg/Kg)后藤黄酸在正常小鼠体内血浆药代动力学以及重要器官的组织分布结果见图25。相同给药剂量下(按藤黄酸计算，6mg/Kg)，载入纳米制剂后的藤黄酸半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT0-∞)、血浆清除率(Cl)分别为普通藤黄酸注射液的11.80、16.80、0.11倍，血浆总暴露量(AUC0-∞)提高9.43倍，并且最高血药浓度(Cmax)也明显提高(P＜0.05)，而表观分布容积(Vz)差别不大。由各药代动力学参数可知，本发明所设计核-壳结构纳米制剂对藤黄酸具有明显的缓释长效作用。根据实施例19数据，本发明所设计核-壳结构纳米制剂能够使所荷载藤黄酸在各基质中稳定性大大提高，藤黄酸/CS NL进入小鼠体内后，CS NL能够保护藤黄酸不被血液、组织中的代谢酶等物质的破坏，从而大大延长藤黄酸在体内的滞留时间与血浆总暴露量，这一数据为CS NL对藤黄酸体内抗肿瘤活性的提高提供了重要依据。
载入纳米制剂前后，藤黄酸的组织分布特征发生一定变化：普通藤黄酸制剂主要分布器官为肝脏，其次为心、脾、肺、肾；载入纳米制剂后，藤黄酸主要分布器官为肺、肝脏，其次为心、脾、肾；总体上，载入纳米制剂后，藤黄酸在各器官的暴露量均有一定提高，re从大到小依次为：肺(11.25)、肾(5.00)、心(3.42)、脾(2.04)、肝(1.94)。一般认为re大于1，就代表纳米制剂对该器官或组织具有靶向性，本发明所设计纳米制剂对正常小鼠肺的靶向性最好，但应当注意，藤黄酸在生物基质中不稳定，这一组织分布差异并不只由纳米制剂靶向性本身所引起，本发明所设计纳米制剂对藤黄酸的稳定性也是造成组织分布差异的重要原因之一。
通常，对于纳米制剂的设计，应首先考虑如何提高纳米制剂在血液运输的过程中稳定性，这是因为血液中一些生物大分子，比如血清蛋白等，会与纳米制剂发生非特异性相互作用，导致纳米制剂解散或聚集，进而被网状内皮系统(RES)捕获进入肝、脾。因此易被RES清除的纳米制剂，通常循环时间较短，并且会在肝、脾出现高分布。由载药前后藤黄酸在正常小鼠体内血浆药代动力学与组织分布结果可知，将藤黄酸载入本发明所设计纳米制剂后，RES清除情况并不严重，藤黄酸/CS NL在体内循环时间较长，肝、脾分布较少。
实施例22
载药纳米制剂荷瘤小鼠药代动力学与组织分布实验(藤黄酸肿瘤靶向作用考察)：
取传代保种6至7天，生长旺盛且无溃破的健康Heps腹水小鼠，颈椎脱臼处死，置超净工作台，无菌条件下从腹腔抽出含Heps细胞的腹水瘤液，以无菌生理盐水按1∶3～5的体积比制成肿瘤细胞悬液，计数并调节细胞数为1×108/mL。取雄性、昆明种小鼠(18～22g)，以2×107/只(0.2mL)的数量将上述Heps细胞接种于小鼠右后肢腋窝皮下，构建荷瘤鼠模型，并以游标卡尺动态测量瘤块体积。肿瘤体积计算公式：V＝0.5×L×D2(其中：V为肿瘤体积，L为肿瘤长径，D为肿瘤短径)。
利用所建立的荷瘤小鼠模型，待肿瘤生长至300mm3时(接种后第9天)，将荷瘤小鼠随机为2组(每组54只)，分别为藤黄酸溶液组(藤黄酸，6mg/Kg)、载药纳米制剂组(藤黄酸/CS-NL，按藤黄酸计算6mg/Kg)，给药后分别于5min、10min、20min、30min、1h、2h、4h、8h、12h(每组、每时间点6只)，眼球取血处死，分取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、血浆，液相色谱串联质谱测定样品中藤黄酸含量，获得药代动力学与组织分布特征，考察CS-NL对藤黄酸在荷瘤小鼠体内的滞留时间的延长作用与对肿瘤的靶向性。
经静脉注射给予藤黄酸与藤黄酸/CS NL(给药剂量：6mg/Kg)后藤黄酸在荷瘤小鼠体内血浆药代动力学以及重要器官的组织分布结果见图26。
相同给药剂量下(按藤黄酸计算，6mg/Kg)，载入纳米制剂后的藤黄酸半衰期(t1/2)、平均滞留时间(MRT0-∞)分别为普通藤黄酸注射液的1.46、2.23倍，这一差异性不如正常小鼠的大(分别提高11.80、16.80倍，具体见实施例21)，但血浆总暴露量(AUC0-∞)等均有明显提高。造成这一现象的可能原因是，进入体内后，藤黄酸/CS NL会通过EPR效应与HA-CD44介导的主动靶向作用，快速靶向到肿瘤组织，使得血液中载藤黄酸纳米制剂含量迅速下降。
载入纳米制剂前后，藤黄酸在荷瘤小鼠体内组织分布特征发生明显变化：普通藤黄酸制剂主要分布器官为肺，其次为肝、心、肾、肿瘤、脾，即普通藤黄酸制剂在肿瘤分布较少；载入纳米制剂后，藤黄酸主要分布于肿瘤，在各主要器官分布从多到少依次为肺、肝、心、肾、脾；载入纳米制剂后，藤黄酸在肿瘤内暴露量提高155倍，在各正常器官的re从大到小依次为：心(5.21)、肾(4.79)、肝(3.89)、肺(3.01)、脾(1.67)，即载入纳米制剂后，藤黄酸对肿瘤组织的靶向性远高于其他正常组织。而且，载入纳米制剂后，藤黄酸在肿瘤组织的峰浓度也明显高于藤黄酸普通制剂(P＜0.01，Ce值39.98)，而其他正常器官Ce值明显低于肿瘤组织。
组织分布数据进一步证实，藤黄酸/CS NL会通过EPR效应与HA-CD44介导的主动靶向作用，快速高效的靶向到肿瘤组织。大量研究显示，表面修饰HA后，纳米制剂表面呈负电性，对肝脏亲和力低，对于多数纳米制剂均能显著延长体内循环时间并避免RES清除，这一功能通常称为“stealth”特征。本发明选用有效避免RES清除的低分子量(14.6KDa)HA作为壳材料包被纳米制剂，根据正常小鼠与荷瘤小鼠肝、脾分布数据可知，本发明所设计纳米制剂具备一定逃避RES清除能力，能够逃避RES清除的纳米制剂通常均具备较高的肿瘤组织分布，这是由于实体瘤组织中血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，造成大分子类物质和粒径小于200nm的纳米制剂能够顺利进入并滞留在肿瘤组织内部，表面包被HA的纳米制剂还会进一步被高表达CD44受体的肿瘤细胞所摄取。而正常组织中的微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子和纳米制剂不易透过血管壁，使其分布相对较少。
另外，如前所述，对于藤黄酸在载入纳米制剂前后的肿瘤组织分布差异如此之大的原因，除了纳米制剂本身靶向性之外，藤黄酸在肿瘤组织的稳定性也是重要原因之一。
综上所述，本发明所设计纳米制剂通过EPR效应与HA-CD44介导的主动靶向作用快速高效的靶向到肿瘤组织，靶向到肿瘤组织后，纳米制剂还能提高藤黄酸的稳定性，发挥长效抗肿瘤效果。
实施例23
载药纳米制剂对Heps肝癌实体瘤模型小鼠的抗肿瘤活性(藤黄酸肿瘤活性评价之一)：
按实施例22建立Heps肝癌实体瘤小鼠模型，待肿瘤生长至100mm3时(接种后第6天)，将荷瘤小鼠随机为3组(每组6只)，分别为对照组(氯化钠注射液组，Saline)、藤黄酸溶液组(藤黄酸，6mg/Kg)、载药纳米制剂组(藤黄酸/CS NL，按藤黄酸计算6mg/Kg)。第一次给药时间计为0d，分别于0、2、4、6、8、10、12d给药，并进行以下试验：
①肿瘤生长曲线：于每次给药前与于末次给药后2d(14d)，以游标卡尺测量肿瘤的短径(a)和长径(b)，按公式V＝0.5×a2×b计算肿瘤的体积，并绘制体积-时间曲线。
②瘤体重量：于末次给药后2天(第14天)将荷瘤鼠脱曰处死，解剖分离肿瘤组织，于PBS中清洗掉血迹，以滤纸吸干瘤体上的液体，电子天平称重，拍照对比，并按公式IRT％＝(Wc-We)/Wc×100％计算抑瘤率(IRT％)。
经静脉注射给予藤黄酸与藤黄酸/CS NL(给药剂量：6mg/Kg)后Heps肝癌实体瘤模型小鼠的肿瘤体积变化曲线见图27，肿瘤重量见图28，所剥离实体瘤见图29。数据显示，藤黄酸与藤黄酸/CS NL均能明显的抑制肿瘤的生长，在第14d时，空白对照组的肿瘤体积达到2480.26±663.44mm3，而藤黄酸与藤黄酸/CS NL则分别为833.59±129.18mm3、357.19±201.62mm3，均与空白对照组有极显著性差异(p＜0.001)，而且藤黄酸/CS NL在第14d时的肿瘤体积也明显小于藤黄酸组(p＜0.001)，14d内，藤黄酸/CS NL组的肿瘤体积仅增长了三倍左右。第14d时，空白对照组的肿瘤重量达到1.38±0.26g，而藤黄酸与藤黄酸/CS NL组的肿瘤重量分别为0.66±0.15与0.22±0.14g，抑瘤率分别为52.17％与84.06％。综合肿瘤生长曲线与肿瘤重量、抑瘤率数据，可确定藤黄酸/CS NL能够进一步提高藤黄酸的抗肿瘤活性，结合实施例21、22数据，可确定这一提高作用主要是通过CS NL的靶向功能与延长藤黄酸体内特别是肿瘤内滞留时间来实现的。
实施例24
载药纳米制剂对B16F10实体瘤模型小鼠的抗肿瘤活性(藤黄酸肿瘤活性评价之一)：
B16F10黑色素瘤细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2的恒温环境中培养，约1～2d传代。收集对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞，以0.25％胰酶消化成细胞悬液，PBS洗一次(1000rpm，5min)，RPMI 1640完全培养基调整到浓度为1×107/mL台盼蓝染色计数活细胞＞95％，用于动物试验。
取雄性C57BL6小鼠(18～22g)，选择处于对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞，以2×106/只(0.2mL)的数量接种于C57BL6小鼠右后肢腋窝皮下，构建荷瘤鼠模型，并以游标卡尺动态测量瘤块体积。肿瘤体积计算公式：V＝0.5×L×D2(其中：V为肿瘤体积，L为肿瘤长径，D为肿瘤短径)。
利用建立的黑色素瘤小鼠皮下移植模型，待肿瘤生长至100mm3时(接种后第9天)，将荷瘤小鼠随机为3组(每组6只)，分别为对照组(氯化钠注射液组，Saline)、藤黄酸溶液组(藤黄酸，6mg/Kg)、载药纳米制剂组(藤黄酸/CS-NL，按藤黄酸计算6mg/Kg)。第一次给药时间计为0d，分别于0、2、4、6、8、10d给药，按实施例23方法获得肿瘤生长曲线、瘤体重量、抑瘤率、等数据。在末次给药后2d，处死动物、剥取肿瘤与免疫器官的同时，剥取完整的肺组织，于Bouin氏液(饱和苦味酸75mL+40％甲醛25mL+冰醋酸5mL)中固定。24h后，正常肺组织呈棕黄色，而肿瘤转移灶呈白色隆起。用解剖显微镜观察并记录肺转移灶的数目和大小，并按转移灶的大小分级。I级转移灶：直径小于0.5mm；II级转移灶：直径0.5～1mm；III级转移灶：直径1～2mm；IV级转移灶：直径大于2mm。按下面公式计算：总转移灶数＝I级转移灶数+II级转移灶数×2+III级转移灶数×3+IV级转移灶数×4。由两名研究者独立计数肺表面转移灶，计算平均值。
经静脉注射给予藤黄酸与藤黄酸/CS NL(给药剂量：6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的肿瘤体积变化曲线见图30，肿瘤重量见图31，所剥离实体瘤见图32。数据显示，藤黄酸与藤黄酸/CS NL均能明显的抑制肿瘤的生长，在第12d时，空白对照组的肿瘤体积达到5026.66±913.34mm3，而藤黄酸与藤黄酸/CS NL则分别为2567.74±856.29mm3、1067.08±425.77mm3，均与空白对照组有极显著性差异(p＜0.001)，而且藤黄酸/CS NL在第14d时的肿瘤体积也明显小于藤黄酸组(p＜0.01)。另外，由于B16F10细胞恶性增值能力较强，使得各组B16F10黑色素瘤模型小鼠的肿瘤体积增脏幅度大于Heps实体瘤(具体见实施例23部分)。空白对照组的肿瘤重量达到8.40±0.84g，而藤黄酸与藤黄酸/CS NL组的肿瘤重量分别为4.14±0.66与1.63±0.35g，抑瘤率分别为50.71％与82.62％，抑瘤率与Heps实体瘤模型评价结果基本一致(具体见实施例23部分)。综合肿瘤生长曲线与肿瘤重量、抑瘤率数据，可确定藤黄酸/CS NL能够进一步提高藤黄酸的抗肿瘤活性。CD44表达水平与黑色素瘤细胞转移、侵袭能力密切相关，B16F10细胞的CD44表达水平极高，而本发明所设计纳米制剂具备CD44主动靶向能力和CD44受体介导的摄取促进能力，结合实施例21、22数据，可进一步确定，本发明所设计纳米制剂能够通过CD44靶向功能与延长藤黄酸体内特别是肿瘤内滞留时间来实现对藤黄酸活性的提高。
另外，前已述及，B16F10具有高转移特征，其主要侵袭靶器官是肺。由图34可知，本发明所建立的B16F10黑色素瘤小鼠模型也会出现肺转移，利用文献Cell Tissue Res，2001，305(3)：285-98方法，对各组小鼠肺上B16F10黑色素瘤转移灶进行计数统计，图35结果显示，本发明所设计纳米制剂能进一步提高藤黄酸抑制B16F10肺转移的活性。
实施例25
载药纳米制剂对B16F10实体瘤模型小鼠的生存期延长作用(藤黄酸肿瘤活性评价之一)：
按实施例24建立的黑色素瘤小鼠皮下移植模型，待肿瘤生长至100mm3时(接种后第6天)，将荷瘤小鼠按上述分组方法随机为3组(每组10只)，分别为对照组(氯化钠注射液组，Saline)、藤黄酸溶液组(藤黄酸，6mg/Kg)、载药纳米制剂组(藤黄酸/CS NL，按藤黄酸计算6mg/Kg)。给药完成后记录每只小鼠死亡时间，记录各组小鼠的生存时间，以60d为限，生存时间超过60d按未死亡(治愈)计算。利用Kaplan-Meier法进行生存分析，绘制生存曲线，计算平均生存时间(Mean Survival Time)与中位生存时间(Median Survival Time)，利用对数秩检验(Log Rank Test)统计分析各组之间的显著性差异。
经静脉注射给予藤黄酸与藤黄酸/CS NL(给药剂量：6mg/Kg)后B16F10黑色素瘤模型小鼠的生存曲线见图33，经藤黄酸与藤黄酸/CS NL治疗后，B16F10黑色素瘤模型小鼠的生存时间均能明显延长(藤黄酸组：P＜0.05；藤黄酸/CS NL：P＜0.001)，与藤黄酸相比，藤黄酸/CS NL组动物平均生存时间能够得到进一步的明显延长(P＜0.01)，并且平均生存时间与中位生存时间也有较大差别。
实施例26
载药纳米制剂的安全性评价：
取18～22g的ICR小鼠(4～6周)，按体重随机分为四组(8只/组)，分别为：Saline组(生理盐水对照)；藤黄酸组(未载入纳米制剂的藤黄酸，6mg/Kg)；CS NL组(空白纳米制剂，按核材料BzPGA 60mg/Kg)；藤黄酸/CS NL组(载入纳米制剂的藤黄酸，按藤黄酸6mg/Kg)。给药间隔与周期同实施例23活性评价试验，并进行动物体重、各脏器指数、血常规、血生化等指标的评价。
经静脉注射给予藤黄酸、CS NL、藤黄酸/CS NL后小鼠体重相对变化率与各脏器指数见图36，本发明所述荷载藤黄酸CS NL以及空白CS NL的安全性良好，对动物体重、各脏器指数、血生化等均无明显影响。另外，本发明数据显示，藤黄酸对脾脏指数与丙氨酸氨基转氨酶(ALT)有一定影响，而载入本发明所述CS NL后，藤黄酸的这一影响消失。这说明本发明所述CS NL不仅不会增加藤黄酸的毒副作用，而且还能消除藤黄酸原有的轻微的毒副作用。

Claims (7)

1.一种藤黄酸核壳结构复合纳米制剂及其制备方法，其特征在于：纳米制剂制备工艺可控、稳定性良好，载药量与包封率高，具备主动靶向能力，能很好的改善水溶性差、不稳定、易被代谢清除等影响藤黄酸成药性的问题，所述纳米制剂内部为疏水性纳米粒，通过α-螺旋形成的π-π堆积与疏水作用力荷载藤黄酸，疏水性纳米粒外部为两亲性的壳材料，其通过亲脂端以π键堆积与疏水作用力包裹排列于纳米粒周围，亲水端则位于纳米制剂最外侧，起到保护内核中的药物，维持纳米制剂稳定性和实现主动靶向的作用。
2.根据权利要求1所述的藤黄酸核壳结构复合纳米制剂，其特征在于：所述核材料为聚(γ-谷氨酸)α-苄基酯(BzPGA)，分子量为10～1000KDa。
3.根据权利要求2所述的BzPGA，其特征在于：是以聚(γ-谷氨酸钠)与溴苄为原料，合成核材料，本发明探索出的核材料合成工艺更高效，能使水溶性大分子化合物(如聚(γ-谷氨酸钠)等)与脂溶性小分子化合物(如溴苄等)，以溶解状态，在均相条件下反应，与非均相反应相比，所需反应温度更低，反应时间更短，此合成方法还可高效的合成以下聚(γ-谷氨酸)衍生物：
R＝-(CH2)n-CH3，n＝1～9；-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝1～8，m＝1～8；
-X-Y；
其中“-X-Y”中的“Y”是指药物或活性天然产物，包括藤黄酸、新藤黄酸、黄芩素、汉黄芩素、喜树碱类、紫杉醇类、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、甲氨喋呤、环孢素A、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、冬凌草素、灯盏花素、银杏内酯、水飞蓟素、齐墩果酸、熊果酸，此外，“Y”还可以为以下小分子基团：
H；-(CH2)n-CH3，n＝1～9；-(CH2)n-CH＝CH-(CH2)m-CH3，n＝1～8，m＝1～8；
“-X-Y”中的“X”是指连接基团，可以为-(CH2)n-、-(CH2)nCO-、-(CH2)n-O-、-(CH2)n-NH-、-(CH2)n-S-、-CH2-Ph-CO-，通过碳碳键、酯键、酰胺键与药物、活性天然产物或小分子基团连接。
4.根据权利要求1所述的藤黄酸核壳结构复合纳米制剂，其特征在于：所述壳材料为接枝维甲酸的透明质酸，其由HA的羧基与ATRA的羧基，通过1，6-二溴己烷链接而成(HA-CC-ATRA)，其中，HA分子量为14600Da，ATRA在HA上的接枝率为20％，另外，ATRA也可通过双(2-羟基乙基)二硫醚接枝于HA的羧基上制备而成的两亲性材料HA-SS-ATRA作为壳材料，其结构如下：
5.根据权利要求1所述的藤黄酸核壳结构复合纳米制剂，其特征在于所述纳米制剂制备工艺为纳米沉淀法，又名“一步法”，其方法如下：
取药物与核材料BzPGA，溶于能与水互溶的有机溶剂，作为有机相；另取HA-CC-ATRA水溶液，作为水相；加热搅拌下，将溶有BzPGA与藤黄酸的有机溶剂溶液(有机相)，通过微量注射泵加入至HA-CC-ATRA水溶液(水相)中；充分涡旋、搅拌后，将含纳米粒的溶液转移至Amicon Ultra-15 centrifugal filter(Millipore，Billerica，MA)，离心，所得富集纳米制剂中以水洗二次，以除去残余有机溶剂与自由大分子，同时富集纳米制剂；所得纳米制剂重新混悬于去离子水，或重新混悬于含冻干保护剂的水溶液，冷冻干燥制得藤黄酸核壳结构复合纳米制剂产品。
6.根据权利要求5所述藤黄酸核壳结构复合纳米制剂制备方法，其特征在于进行了系统的工艺优化，通过单因素爬坡试验，确定最优化各工艺参数：
L/P值(HA-CC-ATRA与BzPGA质量比)为50％，BzPGA浓度为1.5mg/mL，Vo/Vw(有机相与水相体积比)为1∶5，BzPGA分子量由1000KDa制备而来，有机溶剂种类为丙酮，冻干保护剂为10％葡萄糖，D/P值(药/载比，即藤黄酸占核材料BzPGA质量的百分比)为10％；
在最优化工艺条件下：所制备藤黄酸核壳结构复合纳米制剂的粒径在80nm左右，粒径分布小于0.18，电位-30mV左右；包封率接近100％；在10％葡萄糖保护作用下，冻干前后，藤黄酸CS NP粒径、包封率等未发生明显改变；按最优化工艺制备的藤黄酸纳米制剂的粒径、粒径分布、电位、载药量与包封率等基本一致，不同批次之间的相对标准偏差在5％以内，说明本发明所述制备工艺简单可控、稳定性良好；对影响藤黄酸成药性的问题具明显改善作用，包括在水中具近似溶液状态的分散性，明显提高在氧化剂、还原剂、血浆、全血等环境中的稳定性，明显改善藤黄酸药代动力学特性(包括延长藤黄酸在体内滞留时间、提高GA在血浆中的暴露量等)，为藤黄酸在体内抗肿瘤活性的发挥提供了必要的条件。
7.根据权利要求6所述藤黄酸核壳结构复合纳米制剂最佳制备工艺，其特征在于不仅能荷载藤黄酸，还能荷载其他脂溶性、尤其是具共轭体系的药物或活性天然产物，包括：新藤黄酸、黄芩素、汉黄芩素、喜树碱类、紫杉醇类、阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、尼莫地平、硝苯地平、尼群地平、水飞蓟素、雌激素类等，亦可用于荷载造影剂等用于医学诊断。
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