CN109704938B - 一种生育酚单体制备对醌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生育酚单体制备对醌的方法，其包括，制备α‑、β‑、γ‑和δ‑生育酚四种单体：采用高压制备正相液相色谱制备α‑、β‑、γ‑和δ‑生育酚单体；反应制备生育酚对醌：将所述α‑、β‑、γ‑和δ‑生育酚单体和三氯化铁分别溶于反应介质中，分别进行反应，旋蒸；分离纯化制备生育酚对醌：通过薄层层析色谱进行分离，得到纯化的生育酚对醌。本发明克服了现有技术采用反相系统无法将β‑生育酚和γ‑生育酚分离的技术缺陷，制得的α‑TQ纯度为97％以上，γ‑TQ纯度为93.8％以上，β‑TQ纯度为92％以上，δ‑TQ纯度为95％以上。

Description

一种生育酚单体制备对醌的方法

技术领域

本发明属于分离工程技术领域，具体涉及一种生育酚单体制备对醌的方法。

背景技术

维生素E是油溶性的物质，它主要存在于动植物油脂中，植物油脂富含维生素E，但植物油脂种类繁多，不同种类的植物油脂不但维生素E的含量不等，而且其所含生育酚的类型也大不相同，差别很大。几个世纪以来，学者对生育酚的检测方法、生理功能等进行了大量研究。而生育酚醌(对醌)(TQ)作为生育酚的氧化产物之一，主要有8种物质，其在生物系统中具有抗氧化、选择性细胞毒性等作用，近年来逐渐得到重视。如α-TQ是生氧光合作用生物体的一种微量组成成分，存在于众多的绿色植物组织中(含量约为1-2mol/100mol叶绿素)，其也存在于非绿色植物组织中，如色素母细胞生长阶段或叶子衰老阶段会有一定程度的合成。与此同时，越来越多的研究表明α-TQ、中六元环被完全取代，不具有芳基化活性，而其他种类的TQ，由于六元环未被完全取代，具有芳基化活性，具有一定的细胞毒性。

由于现价段报道TQ具有一定的抗氧化活性；与此同时，由于α-TQ中六元环被完全取代，不具有芳基化活性，而其他种类的TQ，由于六元环未被完全取代，具有芳基化活性，对特定的癌细胞具有一定的细胞毒性。研究发现γ-TQ、δ-TQ均呈现一定的细胞(平滑肌细胞)毒性，引起细胞有丝分裂的变化，并呈剂量依赖性，且γ-TQ毒性更强。与此同时，γ-TQ对药物敏感的急性淋巴细胞白血病细胞系(CEM)和多重耐药淋巴细胞白血病细胞系(CEM/VLB100)也具有高细胞毒性，并认为该物质毒性可能源于Michael加合物生成。研究发现α-TQ无细胞毒性，而γ-TQ、δ-TQ在CEM和CEM/VLB100均具有高细胞毒性(LD50＜10μM)，且γ-TQ、δ-TQ相较于阿霉素(一种抗肿瘤药物)具有更高的细胞毒性，同样针对CEM细胞具有选择性细胞毒性。研究发现正常情况下血清中含有α-TQ(＜1μM)，γ-TQ、δ-TQ生育醌代谢产物(＞1μM)对急性淋巴细胞白血病细胞系具有细胞毒性，且上述两种醌属于亲核烷基化试剂，可生成Michael加合物生成和醌甲基类似物。烷基化反应是亲核醌类物质致毒性的原因所在。由于γ-TQ、δ-TQ属于芳基化醌类化合物，且有研究进一步指出芳基化醌类毒性机理主要源于Michael加合物生成和内质网应急反应，而非仅仅源于Michael加合物生成。现阶段该类物质的细胞毒性需要进一步确证研究，如对于正常细胞的致毒性需要更多研究论证；对于特定癌细胞的选择性致毒性具有良好的应用前景(抗癌药)，需进一步通过体内体外实验佐证。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种生育酚单体制备对醌的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种生育酚单体制备对醌的方法，其包括，

制备α-、β-、γ-和δ-生育酚四种单体：采用高压制备正相液相色谱制备α-、β-、γ-和δ-生育酚单体；

反应制备生育酚对醌：将所述α-、β-、γ-和δ-生育酚单体和三氯化铁分别溶于反应介质中，分别进行反应，旋蒸；

分离纯化制备生育酚对醌：通过薄层层析色谱、高压制备液相色谱进行分离，得到纯化的生育酚对醌。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述制备α-、β-、γ-和δ-生育酚四种单体，为将95％纯度的混合生育酚溶于正己烷中，配置成5～15mg/mL的溶液，采用高压制备正相液相色谱制备α-、β-、γ-和δ-生育酚单体。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述制备α-、β-、γ-和δ-生育酚四种单体，其高压制备正相液相色谱条件包括，正己烷：异丙醇＝99：1，流速为10mL/min，柱温为常温，进样浓度为10mg/mL。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述反应介质包括乙醇、甲醇、水中的一种或几种。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述α-、β-、γ-和δ-生育酚单体和三氯化铁分别溶于反应介质中，其中，生育酚单体的浓度分别为0.3～0.5mg/mL，三氯化铁的浓度为3.5～4mg/mL。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述分别进行反应，其中，所述生育酚单体的溶液体积是所述三氯化铁的溶液体积的二倍。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述分别进行反应，反应温度为室温，时间为5～10min，剧烈搅动进行反应，干燥，旋蒸。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述过薄层层析色谱进行分离，其中，展开剂包括正己烷-乙醚。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述正己烷与乙醚的体积比为7.5～9.5：1。

作为本发明所述的生育酚单体制备对醌的方法的一种优选方案：所述对醌，α-TQ纯度为97％以上，γ-TQ纯度为93.8％以上，β-TQ纯度为92％以上，δ-TQ纯度为95％以上。

本发明的有益效果：本发明使用正相高压制备液相色谱，将β-与γ-生育酚分离，得到四种高纯度的生育酚单体，同时针对各TQ单体合成、定量方面的缺乏，提供了一种合成、分离纯化各TQ的方法。本发明克服了现有技术采用反相系统无法将β-生育酚和γ-生育酚分离的技术缺陷，制得的α-TQ纯度为97％以上，γ-TQ纯度为93.8％以上，β-TQ纯度为92％以上，δ-TQ纯度为95％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明TQ物质的薄层层析色谱。

图2为实施例1的α-TQ的液相色谱图。

图3为实施例1的α-TQ的质谱图(正离子条件下)。

图4为实施例1的α-TQ的质谱图(负离子条件下)。

图5为实施例2的γ-TQ的液相色谱图。

图6为实施例2的γ-TQ的质谱图(正离子条件下)。

图7为实施例2的γ-TQ的质谱图(负离子条件下)。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

正相高压制备液相制备α-、β-、γ-和δ-生育酚四种单体：原料为江苏科鼐公司生产的95％的生育酚混合样品，将该混合生育酚溶解于正己烷中，配置溶液浓度为10mg/mL的溶液，本发明使用正相高压制备液相系统制备四种生育酚单体，该系统配置了紫外检测器、自动收集装置、操作软件及

HPLC Columns(DAVISIL 710NW 22mm)色谱柱。

将95％纯度的混合生育酚溶于正己烷中，配置成10mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为50cm，流动相为正己烷：异丙醇(99:1，v/v)，流速为10mL/min，检测波长210nm、295nm(最大吸收波长)，发现α-生育酚、δ-生育酚物质纯度高达99％以上，β-生育酚纯度为98％，γ-生育酚纯度98.6％，四者的物质回收率均在80％以上。

将40mL 0.5mg/mL的α-生育酚乙醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁乙醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌室温下反应14min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC(展开剂为正己烷-乙醚，7.5:1，体积比)跑板富集，刮板后对物质进行分析，发现经液质分析所得物质主要为α-TQ，且其纯度为97％以上。

实施例2：

将95％纯度混合生育酚溶于正己烷中，配置成12mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为50cm，流动相为正己烷：异丙醇(99:1，v/v)，流速为10mL/min，检测波长210nm、295nm(最大吸收波长)，发现α-生育酚、δ-生育酚物质纯度高达99％以上；而β-生育酚纯度为98.5％，而γ-生育酚纯度可在98.8％，四者的物质回收率均在75％以上。

将40mL 0.3mg/mL的γ-生育酚甲醇溶液与20mL 4mg/mL的三氯化铁甲醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌室温下反应10min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入50mL正己烷，并经过3次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经氮吹浓缩，经多次TLC(展开剂为正己烷-乙醚，9.5:1，体积比)跑板富集，后续经过制备液相分离，经液质鉴定为γ-TQ，且其纯度为93.8％以上。

实施例3：

将95％纯度混合生育酚溶于正己烷中，配置成9mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为50cm，流动相为正己烷：异丙醇(99:1，v/v)，流速为12mL/min，检测波长210nm、295nm(最大吸收波长)，发现α-生育酚、δ-生育酚物质纯度高达99％以上；而β-生育酚纯度为98％，而γ-生育酚纯度可在99％，四者的物质回收率均在78％以上。

将40mL 0.5mg/mL的β-生育酚乙醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁乙醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌60℃下反应14min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC(展开剂为正己烷-乙醚，7.5:1，体积比)跑板富集，后经高压制备液相进一步纯化，后对物质进行液质分析为β-TQ，且其纯度为92％以上。

实施例4：

将95％纯度混合生育酚溶于正己烷中，配置成10mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为50cm，流动相为正己烷：异丙醇(99:1，v/v)，流速为10mL/min，检测波长210nm、295nm(最大吸收波长)，发现α-生育酚、δ-生育酚物质纯度高达98％以上；而β-生育酚纯度为98.2％，而γ-生育酚纯度可在99％，四者的物质回收率均在70％以上。

将40mL 0.5mg/mL的δ-生育酚甲醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁甲醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌60℃下反应10min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC(展开剂为正己烷-乙醚，9.5:1，体积比)跑板富集，进一步经高压制备液相分离纯化，后经液质分析所得物质主要为δ-TQ，且其纯度为95％以上。

实施例5(对照例)：

将将95％纯度混合生育酚溶于正己烷中，配置成10mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为25cm，流动相为正己烷：异丙醚(90:10，v/v)，流速为20mL/min，检测波长210nm、295nm(最大吸收波长)，发现色谱图各峰的分离度较低。

本发明使用正相高压制备液相色谱，将β-与γ-生育酚分离，得到四种高纯度的生育酚单体，同时针对各TQ单体合成、定量方面的缺乏，提供了一种合成、分离纯化各TQ的方法。本发明克服了现有技术采用反相系统无法将β-生育酚和γ-生育酚分离的技术缺陷，制得的α-TQ纯度为97％以上，γ-TQ纯度为93.8％以上，β-TQ纯度为92％以上，δ-TQ纯度为95％以上。本发明所用溶剂可进行回收利用，降低了资源浪费，同时操作相对简单，产品纯度较高。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种生育酚单体制备对醌的方法，其特征在于：包括，

制备α-、β-、γ-和δ-生育酚四种单体：将95％纯度的混合生育酚溶于正己烷中，配置成10mg/mL的溶液，后进行正相高压制备液相的分离纯化，具体条件如下：色谱柱为制备型硅胶柱，柱长度为50cm，流动相为正己烷：异丙醇(99:1，v/v)，流速为10mL/min；

反应制备生育酚对醌：将40mL 0.5mg/mL的α-生育酚乙醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁乙醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌室温下反应14min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC，展开剂为正己烷-乙醚，所述正己烷与乙醚的体积比为7.5：1，得到纯度为97％以上的α-TQ；

将40mL 0.5mg/mL的β-生育酚乙醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁乙醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌60℃下反应14min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC，展开剂为正己烷-乙醚，所述正己烷与乙醚的体积比为7.5：1，得到纯度为92％以上的β-TQ；

将40mL 0.3mg/mL的γ-生育酚甲醇溶液与20mL 4mg/mL的三氯化铁甲醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌室温下反应10min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入50mL正己烷，并经过3次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经氮吹浓缩，经多次TLC，展开剂为正己烷-乙醚，所述正己烷与乙醚的体积比为9.5：1，得到纯度为93.8％以上的γ-TQ；

将40mL 0.5mg/mL的δ-生育酚甲醇溶液与20mL 3.5mg/mL的三氯化铁甲醇溶液混合，并在磁力搅拌器上进行高速搅拌60℃下反应10min，待反应结束后转至分液漏斗中，向反应体系加入100mL正己烷，并经过2次水洗，振荡数分钟，弃去水层，剩下的正己烷层使用无水硫酸钠干燥，所得溶液经旋转蒸发浓缩，经多次TLC，展开剂为正己烷-乙醚，所述正己烷与乙醚的体积比为9.5：1，得到纯度为95％以上的δ-TQ。

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