CN109699499A - 一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥 - Google Patents

Abstract

一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥，本发明包括：亚克隆来自于土壤宏基因组的TfdB和BphC基因；共表达TfdB+BphC植物通过植物表达载体的构建、农杆菌介导的植物遗传转化、筛选转基因阳性植株、转基因植株修复PCB 28污染土壤等步骤获得；在拟南芥体内构建类似细菌降解PCBs的通路，提高拟南芥对PCBs的耐受能力，降低PCB28对植物生长的限制，提高植物修复PCBs污染土壤的效能，获得新型的PCBs污染土壤的植物修复材料；在降低污染物对生态系统的威胁与提升PCBs植物修复生态安全性方面，具有很好的应用前景。

Description

一种修复PCBs污染土壤的转基因拟南芥

技术领域

本发明属生物修复及环境保护技术领域，特别是利用转基因植物修复有机物污染土壤。

背景技术

(1)多氯联苯的危害及污染现状

多氯联苯(Polychlorinated Biphenyls，PCBs)一类人工合成的环境异源物质，其特征为联苯环上的氢原子被1-10个氯原子所取代，理论上共有209种同系物。PCBs具有良好的热化学稳定性，抗氧化性和绝缘性，曾在全球范围内作为电容器的绝缘介质(如变压器油)被广泛应用。但由于微量的PCBs就可对生物体产生致癌、致畸和致突变等作用，并且其具有远距离迁移、生物富集及难降解性，PCBs已被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)之一。

(2)PCBs污染土壤修复研究现状

国内外对PCBs污染土壤的治理，可分为物理修复、化学修复和生物修复等。虽然物理和化学修复方法也在深入研究和改进，但是仍然存在着成本高、能耗高、工艺复杂、破坏土壤结构，易造成环境二次污染等问题。而生物修复(微生物修复、植物修复和植物-微生物联合修复)，因具有低成本、应用性强、对环境友好、并可最大程度保持土壤基本性质不变等特点，一直为国内外学术界所关注。但已有研究表明，大多数微生物只能降解低氯代的PCBs，并且微生物活性容易受环境条件的影响，致使PCBs污染土壤微生物修复效能低下，因此植物修复已经成为PCBs污染土壤生物修复研究的热点。

(3)植物修复及其限制因素

植物根际修复PCBs污染土壤，在盆栽和温室模拟试验研究中获得了较为理想的结果，但是在实际场地修复过程中，往往达不到预期效果，其原因主要包括：A.植物吸收土壤中PCBs后，生长发育受到抑制；主要原因之一在于植物体内缺乏类似细菌的能使联苯开环的2,3-二羟基联苯双加氧酶(BphC)。B.PCBs强烈吸附于土壤介质中，生物可利用性差；C.微生物中催化PCBs分解代谢的基因表达水平低，不能有效降解PCBs。

(4)转基因植物修复

近年来，应用转基因技术对修复植物进行遗传改造，已大幅度改善了修复植物对PCBs的耐受、吸收和转化能力。如将细菌BphC基因转入烟草，能够减轻羟基化多氯联苯对烟草的毒害作用，并增强其代谢PCBs的能力。申请者在前期工作中，将一个新BphC基因转入紫花苜蓿，其耐受性显著优于野生型苜蓿。

然而，进一步分析发现单羟基氯代联苯的降解并不显著，植物体内存在大量的单羟基氯代联苯，对植物仍有毒害作用，对生态系统的威胁仍然存在。因为修复植物体内积累了大量PCBs，仍是危险废物，需做进一步处理；并且植物体内的羟基化氯代联苯由于水溶性的增强，其毒性强于母体PCBs。

因此有必要将单羟基的氧化酶(Tfdb-Jlu酶)转入到植物体内，构建共表达TfdB和BphC的转基因植株，预期在植物体内建立起类似于微生物降解PCBs的通路，进而高效清除植物体内残留PCBs，降低污染物对生态系统的威胁，提升PCBs植物修复生态安全性的潜力和实际应用价值。

发明内容

本发明的转基因拟南芥中共表达TfdB、BphC基因，TfdB酶具有2,4-二氯苯酚羟化酶活性，BphC酶具有2,3-二羟基联苯双加氧酶活性。

本发明的转基因拟南芥能在修复PCBs污染土壤中得到应用。

本发明的转基因拟南芥能修复有机污染物，有机污染物为：联苯、多氯联苯、二噁英、3-甲基邻苯二酚、卤代邻苯二酚和多环芳烃。

以修复植物为受体，采用农杆菌介导转化法，将TfdB基因和BphC基因转入受体植物，获得共表达TfdB+BphC的转基因植株，能有效清除植物体内残留的机污染物，为高效去除土壤中机污染物提供新的植物修复技术体系，对有机物污染土壤原位植物修复技术的发展，具有积极的理论意义和实用价值。

本发明具有如下优点：

1.将可增强植物对有机污染物羟基化和苯环开环的基因在植物体内共表达，高效清除植物体内积累的有机污染物，提高植物对有机污染物的耐受性和积累能力。

2.本发明的转基因拟南芥能显著提高对多氯联苯等难溶性有机污染土壤的修复效能。

附图说明

图1为共表达TfdB+BphC拟南芥BphC基因PCR电泳图

其中：M：DNA maker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+TfdB+BphC质粒；2-16：共表达TfdB+BphC拟南芥；17：野生型拟南芥；18：空白对照

图2为共表达TfdB+BphC拟南芥TfdB基因PCR电泳图

其中：M：DNA maker，DL2000；1：pCAMBIA3300N+TfdB+BphC质粒；2-6：共表达TfdB+BphC拟南芥；7：野生型拟南芥；8：空白对照

图3为转基因拟南芥的Western blot鉴定

其中：1、2：共表达TfdB+BphC拟南芥；3、4：转BphC拟南芥；5、6：转TfdB拟南芥、7、8：野生型拟南芥

图4为转基因拟南芥BphC酶活性

其中：T-b1～7：共表达TfdB+BphC拟南芥；B-1～5：转BphC基因拟南芥；T：转TfdB拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)

图5为转基因拟南芥TfdB酶活性

其中：T-b1～7：共表达TfdB+BphC拟南芥；T-2～6：转TfdB拟南芥；B：转BphC基因拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)

图6为转基因拟南芥对PCB28的耐受性

其中：1:转BphC拟南芥；2:转TfdB拟南芥；3:共表达TfdB+BphC拟南芥；4:野生型拟南芥

图7为转基因拟南芥体内PCB28的含量

图8为培养液中PCB28的去除率

图9为转基因拟南芥修复PCB28污染土壤

其中：A：植株生长30天；B：植株生长80天；

a：野生型拟南芥；b：转BphC拟南芥；c：转TfdB拟南芥；d：共表达TfdB+BphC拟南芥

图10为拟南芥体内PCB28的含量

图11为土壤中PCB28的去除率

图10和图11中：TfdB+BphC：共表达TfdB+BphC拟南芥；TfdB：转TfdB拟南芥；BphC：转BphC拟南芥；WT：野生型拟南芥(注：图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)

具体实施方式

实施例1：共表达TfdB+BphC植物筛选

2,4-二氯苯酚羟化酶基因(TfdB)是来至于土壤宏基因组文库，研究表明TfdB酶对氯酚类底物、联苯类底物以及除了3-甲基吲哚以外的所有吲哚类底物都有一定的活性。2,3-二羟基加氧酶(BphC)基因也来至于土壤宏基因组文库，2,3-二羟基加氧酶是植物缺少的能将羟基化联苯开环的关键基因。

(1)TfdB和BphC基因的亚克隆

亚克隆来源于土壤宏基因组的2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB基因(GQ403987.1)和2,3-二羟基联苯双加氧酶BphC基因(GQ403988.1)。

以实验室保存的质粒为模板，利用含有酶切位点的引物FBphC和RBphC扩增BphC基因；利用引物FTfdB和RTfdB扩增TfdB基因。

FBphC：5’-GGAAGATCTATGGTAGCAGTCACGGAAC-3’,

RBphC：5’-ACTGGACACGTGACTAGTATGCCATGGGCCGAGGGGAATATCCATT-3’；

FTfdB：5’-CTAGTCTAGAATGAAAGAACTCAGAACCCCC-3’，

RTfdB：5’-AACGAGCTCTGCGAGCGCCGGCTG-3’；

BphC基因PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min；TfdB基因PCR扩增反应程序为：98℃预变性3min；98℃10s，60℃15s,72℃2min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物通过胶回收试剂盒纯化后，连接到pMD18-T载体上，然后转化入E.coli Top10中，备用。

(2)植物表达载体的构建

以pCAMBIA3301N(pCAMBIA3301+MCS)质粒为基础，构建植物表达载体。该质粒携带Bar标记基因和Gus报告基因。将pMD18-T-BphC质粒，通过BglII+PmlI双酶切后，连接到pCAMBIA3300N，替换Gus基因，得到载体A；将pMD18-T-EGFP，通过NcoI+SpeI双酶切后，与载体A连接，得到载体B，即pCAMBIA3301N+BphC+EGFP；将pMD18-T-TfdB，通过XbaI+BamHI双酶切后，连接到载体B，得到载体G；将RFP(681bp)，通过BamHI+SacI双酶切后与载体G连接，得到目的载体H，即pCAMBIA3300N+TfdB+RFP+BphC+EGFP；

将连接产物用热击转化法，转入E.coli Top10感受态中，提取质粒，经PCR方法鉴定的阳性菌株，送交测序公司测序分析，序列分析鉴定质粒构建正确后，提取质粒，利用冻融法转入农杆菌EHA105中备用。

实验例2植物转化及转基因植株的鉴定

以拟南芥为受体材料进行遗传转化，筛选获得具有目标性状(共表达TfdB+BphC)的株系；用PCR和Western blot方法对转基因植株进行分子鉴定，通过测定植株体内TfdB或BphC酶活性和植株生物学性状，筛选出共表达TfdB+BphC植株中对联苯降解活性最强的植株用于后续实验。

(1)植物遗传转化

取适量的拟南芥种子，避光4℃放置2～3d，进行春化；播种于蛭石与营养土按体积比1:1混合土中，温室中22℃培养，16h光照，8h黑暗；大约生长3周后，拟南芥开花，剪掉第一个花序，促进侧枝的生长，修剪后6～10天，当花蕾较多且刚露一点的白色花时，是侵染的最佳时机。挑取农杆菌单菌落，接种于5mL LB液体培养基(含Kan50mg/l和Rif 50mg/l)，200rpm，28℃振荡培养过夜16h，按照1:100转至200mL LB液体培养基(含Kan 50mg/l和Rif50mg/l)，200rpm，28℃振荡培养约12h，至OD₆₀₀≈1～2；4000rpm，离心10min，收集菌体；将菌体重悬于1/2MS液体培养基中，OD₆₀₀≈0.4～0.6，其中含5％的蔗糖和0.05％的Silwet-77，调整pH至5.8。挑选健壮的拟南芥，剪去已结的种荚；将拟南芥倒置，使花蕾朝下浸入侵染液中，停留20～40s；用透气黑塑料袋覆盖，黑暗培养24h，3天后再侵染一次，黑暗培养24h，放入光照培养箱中进行培养，待种子成熟后对种子进行采集，获得转基因T₀代种子。

(2)转基因植物的抗性筛选

转基因拟南芥种子播种于含有草铵膦(4mg/l)1/2MS的固体培养基平板中，待长出幼苗之后，移栽于营养钵中，收获T1代种子，将其播种于含2,4-二氯苯酚(50mg/l)的1/2MS平板中进行二次抗性筛选，将幼苗移栽于营养钵中，待收获T2代纯合的拟南芥种子，播种于营养钵中，待用。CTAB法提取拟南芥植株的基因组DNA，采用PCR方法鉴定目的基因是否插入拟南芥基因组(图1和图2)；提取植物总蛋白，以GFP、RFP多克隆抗体为一抗，用Westernblot方法鉴定目的蛋白能否在植物体内表达(图3)。

(3)转基因植物的酶活检测

通过酶活检测，筛选对邻苯二酚或2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)具有较高降解活性转基因植株。BphC酶活检测的反应体系(1m l)为：3mL含0.1mM邻苯二酚的磷酸缓冲液(0.2M，pH7.5)，50μl植物蛋白溶液(共表达TfdB+BphC拟南芥、转BphC拟南芥，以野生型拟南芥为阴性对照)，反应温度控制在25±1℃。迅速测定434nm处吸光值，反应3min。

TfdB酶活检测的反应体系(1m l)为：3m l含0.1mM 2,4-DCP和0.2mM NADPH的磷酸缓冲液(0.1M，pH 7.5)，50μl植物蛋白溶液(共表达TfdB+BphC拟南芥、转TfdB拟南芥，以转BphC拟南芥和野生型拟南芥为阴性对照)，反应温度控制在25±1℃。迅速测定340nm处吸光值，反应3min。

酶活计算方式

酶活＝ΔA×V×10³/(ε×L)

比酶活＝酶活(U)/蛋白量(mg)

其中，ΔA为1min在340nm或434nm处吸光值的变化，V为反应液体积(m l)，ε为摩尔吸光系数，HOPDA摩尔消光系数为13200L/(mol·cm)，NADPH摩尔消光系数为6220L/(mol·cm)，L为光程距离(cm)。

通过酶活比较分析，选择酶活性较高的共表达TfdB+BphC基因植株T-b1、转TfdB基因T-2和转BphC基因B-3用于后续对PCBs去除效能研究(图4和图5)。

实施例3：水培法模拟修复试验

将野生型和转基因拟南芥种子分别播种于1/2MS固体培养基上培养，培养15天后，测定各组拟南芥生长情况。取长势良好且相近的拟南芥幼苗，转入到含有0.05μg/ml PCB28的1/2MS液体培养基中，每个处理20株拟南芥幼苗，于25℃，14/10h光暗交替条件下培养。7天后，收集培养液和植株，测量植株的株高和鲜重，通过耐受指数分析野生型拟南芥和转基因拟南芥对PCB28的耐受性差别。

拟南芥洗净后置于锡箔纸上，放入烘箱中60℃干燥12h，将植株分为根和地上部分，并记录干物质的量。样品经过研磨成均一的粉末后，加入20mL体积比为1:1的丙酮和正己烷震荡，经超声波振荡提取20min，静置过夜。提取液经过Na₂SO₄柱，用正己烷淋洗后收集滤液，浓缩后，经氮吹仪吹干后定容至500μl。所有样品选用气相色谱仪GC-MS-6890/5973进行分析。气相色谱仪选用DB-5-MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)分离和检测PCB28，以SIM模式进行GC-MS分析。色谱条件：色谱柱为DB-5MS(30m×0.25um×0.25mm)，以恒流方式进样，不分流；升温程序为：60℃2min，以7℃/min速度升温到250℃，保持2min，继续以20℃/min的速度升温至280℃，保持10min；四级杆温度150℃，离子源230℃。PCBs的定量分析采用是外标法。

在PCB28胁迫下，野生型拟南芥生长明显受到抑制，植株变白，生物量降低，而转基因拟南芥植株仍为绿色，其中共表达TfdB+BphC拟南芥长势最好，其耐受指数显著高于转BphC拟南芥、转TfdB拟南芥和野生型拟南芥，这说明2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB协同2,3-二羟基加氧酶BphC在植物体内表达，显著提高植物的耐受能力(图6和表1)。

表1转基因拟南芥对PCB 28的耐受性

注：TfdB+BphC：共表达TfdB+BphC拟南芥；BphC：转BphC拟南芥；TfdB：转TfdB拟南芥；WT：野生型拟南芥

共表达TfdB+BphC拟南芥的地上和地下部分的PCB 28含量都显著低于转BphC拟南芥、转TfdB拟南芥和野生型拟南芥(图7)，说明2,4-二氯苯酚羟化酶TfdB可以协同2,3-二羟基加氧酶BphC，加快拟南芥体内PCB28的降解，有效减缓PCB 28对拟南芥生长的毒害作用。共表达TfdB+BphC拟南芥对培养液中PCB28的去除效率为71.46％，高于转BphC拟南芥(65.49％)，显著高于转TfdB拟南芥(48.55％)，是野生型拟南芥(23.23％)的3倍(图8)。共表达TfdB+BphC拟南芥能高效清除了培养液中的PCB 28。

实施例4：盆栽模拟修复实验

制备PCB28污染土壤(理论浓度为150μg/kg)。采集土壤，经风干、除杂、过筛之后，土壤平展于锡箔纸上，厚度不超过2mm；将PCB28溶解于丙酮中，均匀喷施于土层，待有机溶剂挥发后，反复混匀土壤，保存备用。

利用盆栽实验，研究转基因拟南芥对土壤中PCB28的去除效能。设置5种处理：A：共表达TfdB+BphC拟南芥；B：转BphC拟南芥；C：转TfdB拟南芥；D：野生型拟南芥；E：未种植拟南芥。植物种植2个月后，收集植株和根际土壤，检测植株的生理性状，植株体内和土壤中PCB28的含量。

植物中PCB28的提取参照实施例3。土壤样品自然风干后，过60目筛，称取5g土壤置于索氏提取器中，加入同等重量的无水硫酸钠和1g活化过的铜片。以丙酮和正己烷按1:1(v/v)的混合溶剂作为萃取溶剂，索氏提取16h。提取液浓缩并将溶剂替换为正己烷，过2cm的无水硫酸钠的柱子，先用10ml的正己烷淋洗柱子，加入样品后再用正己烷冲洗。洗脱液浓缩后用氮吹，用色谱级正己烷定容至1ml。参照实施例3的方法利用气相色谱GC-MS-6890/5973分析土壤及植物体内的PCB28含量。

在PCB28胁迫下生长30天后，50％的野生型拟南芥死亡，其他处理组未死亡，但出现了褐化现象(图9)。植物生长第80天，野生型拟南芥的存活率仅为20％，共表达TfdB+BphC拟南芥的生长状况显著优于其它处理组。转基因拟南芥植株的株高、鲜重和干重都显著高于野生型(表2)，说明与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥能显著提高对PCB 28的耐受性；共表达TfdB+BphC拟南芥的生理指标显著高于其它处理，表现出较好的生理性状。

表2 PCB28胁迫下拟南芥生理指标

(注：TfdB+BphC：共表达TfdB+BphC拟南芥；BphC：转BphC拟南芥；TfdB：转TfdB拟南芥；WT：野生型拟南芥图中不同小写字母表示在p＜0.05水平差异显著)

共表达TfdB+BphC拟南芥地上和地下部分的PCB28显著低于其他处理，说明共表达TfdB+BphC拟南芥可以有效去除植物体内PCB28(图10)。共表达TfdB+BphC拟南芥对土壤中PCB28的去除率(85.94％)显著高于转BphC拟南芥(68.07％)、转TfdB拟南芥(50.89％)和野生型拟南芥(27.11％)。未种植拟南芥的土壤，PCB28的去除率仅为8.01％(图11)。

共表达TfdB+BphC拟南芥体内PCB28的含量显著低于其它处理组，并且对土壤中PCB28的去除效率最高，说明TfdB+BphC共表达能降低PCB28对拟南芥的生理毒害作用，显著提高拟南芥对土壤中PCB28的去除效能。因此本发明共表达TfdB+BphC拟南芥可高效修复PCBs等有机污染物污染的土壤。在降低污染物对生态系统的威胁与提升PCBs植物修复生态安全性方面具有很好的应用前景。

Claims (2)

1.一种转基因拟南芥，其特征在于,拟南芥中共表达TfdB、BphC基因，TfdB酶具有2,4-二氯苯酚羟化酶活性，BphC酶具有2,3-二羟基联苯双加氧酶活性。

2.权利要求1所述转基因拟南芥在修复PCBs污染土壤中的应用。