CN109694908A - 检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及检测方法，突变位点来自GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、MT‑RNR1 12S rRNA基因；该方法包括如下步骤：使用针对突变位点的多重PCR引物对样本DNA进行目标区域扩增；在目标区域扩增产物中加入针对突变位点的分子倒置杂交探针，进行探针变性、退火反应；在恒温聚合酶、磷酸化酶和连接酶的存在下，进行延伸连接反应以将突变位点所在的缺口补齐形成单链环状文库；其中分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游区域互补。该方法减少反应步骤，降低建库试剂成本，缩短建库周期；采用分子倒置杂交探针，使待测突变位点位于测序读长上游50bp以内，只需要SE50测序就能稳定检测到突变位点，提高数据利用率，降低测序成本。
Description
技术领域
本发明涉及耳聋基因检测技术领域，具体涉及一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及采用所构建的快速文库进行耳聋基因突变位点检测的方法。
背景技术
耳聋是临床上最常见的遗传病之一，据2006年第二次全国残疾人调查结果显示，我国现有听力语言残疾者达2780万人，占全国总残疾人口的33.5％，其中听力残疾更是居各类残疾之首。耳聋病因复杂，但研究表明超过50％的耳聋缘于遗传因素。
耳聋相关的基因很多，但绝大部分耳聋患者是由几个单基因的缺损导致，其中最常见的耳聋基因为GJB2。GJB2基因突变在1997年首次被定位，它在儿童语前聋中占26％～33％，GJB2基因突变在亚种人遗传性耳聋中有一定的发生比例，在我国33％的语前聋为该基因导致，其中在我国突变频率最高的为234delC，其次为299_300delAT及176del16.SLC26A4，是常染色体隐性遗传性耳聋致病基因之一，占语前耳聋的8％左右，仅次于GJB2。
SLC26A4突变可以造成两种临床表现，一种是pendred综合征，表现为甲状腺肿大和耳聋；另一种在中国最为常见，患儿仅表现为耳聋，即大前庭水管综合征(enlargedvestibular aqueduct syndrome，EVAS)。SLC26A4是常染色体隐形遗传性耳聋最常见的致病基因在之一，占语前聋患儿的5％～10％。
GJB3基因突变的报道最早见于1998年，研究发现该基因的编码区538位碱基由C突变为T，导致该基因提前终止；而547位碱基由G变为A，发生了错义突变，导致183号氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。GJB3是在我国定位和克隆的常染色体显性遗传性耳聋致病基因，被认为与高频听力下降有关，主要会引起迟发听力损失。
线粒体基因mtDNA A1555G与C1494T突变导致的耳聋主要与氨基糖苷类药物使用有关。突变携带者对氨基糖苷类药物异常敏感，低剂量使用就会出现耳鸣，甚至严重的听力下降。
现有用于耳聋基因检测的NGS文库构建方法，是用修饰有双端标签(INDEX)的引物进行多重PCR，PCR产物混合、再经过末端修复、3’端加“A”、接头连接、PCR及多步DNA纯化，操作步骤繁琐，试剂耗费大。
此外由于PCR产物具有一定长度，而待检测耳聋突变位点在PCR产物上的位置不一，为了保证测序过程中能读取到待测突变位点，往往得采用相对较长的读长策略如SE100或者PE100。一方面造成了测序数据的浪费，提高了测序成本；另一方面测序时间也更长，延长了检测周期。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及采用所构建的快速文库进行耳聋基因突变位点检测的方法，减少反应步骤，降低建库试剂成本，缩短建库周期；本发明采用分子倒置杂交探针，使得待测突变位点正好位于测序读长上游50bp以内，只需要SE50测序既可以稳定检测到突变位点，提高数据利用率，降低测序成本。
根据第一方面，一种实施例中提供一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法，上述20个突变位点包括GJB2基因的35delG、167delT、176_191del16(GCTGCAAGAACGTGTG)、235delC、299_300delAT，GJB3基因的538C>T、547G>A，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>T、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G，MT-RNR1 12S rRNA基因的1494C>T、1555A>G；
上述快速文库构建方法，包括如下步骤：
(1)使用针对上述20个突变位点的多重PCR引物对样本DNA进行目标区域扩增，以富集包含上述突变位点的目标区域；
(2)在上一步的目标区域扩增产物中加入针对上述20个突变位点的分子倒置杂交探针，进行探针变性、退火反应；然后在恒温聚合酶、磷酸化酶和连接酶的存在下，进行延伸连接反应以将上述突变位点所在的缺口补齐形成单链环状文库；
其中，上述分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游区域互补。
进一步地，上述分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游20bp互补。
进一步地，上述分子倒置杂交探针中包含用于区分不同样本的样本标签序列；上述快速文库构建方法还包括：将不同样本来源的上述单链环状文库混合以进行上机测序。
进一步地，上述样本标签序列是一段用以区分样本来源的序列，其中相同样本的不同位点的探针上的标签序列一致，而不同样本的探针上的标签序列不一致。
进一步地，上述样本标签序列的长度是6-10个碱基，优选8个碱基。
进一步地，上述多重PCR引物包括如SEQ ID NO：1-40所示的引物序列。
进一步地，上述分子倒置杂交探针包括如SEQ ID NO：41-60所示的探针序列。
进一步地，上述步骤(1)中上述目标区域扩增的程序是：95℃热变性3min；95℃变性15sec，56℃退火20sec，72℃延伸20sec，45个循环；72℃终延伸10min。
进一步地，上述步骤(2)中上述探针变性、退火反应的程序是：95℃变性10min，60℃退火30min，然后自然降温至室温；上述延伸连接反应的程序是：37℃孵育30min，20℃孵育1h。
根据第二方面，一种实施例中提供一种检测耳聋基因20个突变位点的方法，包括对第一方面的快速文库构建方法构建的单链环状文库进行上机测序，并分析上述突变位点的碱基情况。
进一步地，上述测序的方法是SE50测序。
本发明实施例的检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法，减少反应步骤，降低建库试剂成本，缩短建库周期；采用特定设计的分子倒置杂交探针，只需要一步多重PCR反应和探针退火及延伸连接反应，经DNA纯化就可直接出库，无需常规的末端修复等多步反应。缩短测序周期，降低测序成本；本发明的分子倒置杂交探针两端优选地与待测突变位点上下游20bp互补，使得待测突变位点正好位于文库插入片段上游30bp以内，仅需要通过SE50测序读长就可保证读取到待测突变位点，从而降低测序成本，缩短测序周期，提高数据利用率。
附图说明
图1为本发明实施例的分子倒置杂交探针与模板退火原理示意图。
图2为本发明实施例中通过探针上的样本标签序列对下机数据进行数据拆分及覆盖深度分析，得到的待测SNP位点有效覆盖深度结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
本发明实施例的快速文库构建方法，包括如下步骤：
(1)使用针对20个突变位点的多重PCR引物对样本DNA进行目标区域扩增，以富集包含突变位点的目标区域；
(2)在上一步的目标区域扩增产物中加入针对20个突变位点的分子倒置杂交探针，进行探针变性、退火反应；然后在恒温聚合酶、磷酸化酶和连接酶的存在下，进行延伸连接反应以将突变位点所在的缺口补齐形成单链环状文库。
如图1所示，分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点(例如，图1中A/G位点)上下游区域互补，优选地，与待测突变位点上下游20bp互补。
以下通过实施例详细说明本发明的方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
(1)使用针对待测的20个耳聋突变位点设计的多重PCR引物(如表1)对不同样本DNA进行目标区域扩增。
表1多重PCR引物序列
反应体系(如表2)及反应条件如下：
表2多重PCR反应体系
其中，引物MIX-F是表1中所有正向引物的混合物，引物MIX-R是表1中所有反向引物的混合物。
反应程序为：95℃热变性3min；95℃变性15sec，56℃退火20sec，72℃延伸20sec，45个循环；72℃终延伸10min。
(2)对不同样本分别加入特定设计的分子倒置杂交探针(如表3)，高温变性，低温退火。
表3分子倒置杂交探针序列
其中，NNNNNNNN表示样本标签序列，同一样本的不同位点采用相同的标签序列，不同样本间标签序列不同，为了满足大批量样本的混合建库上机，本发明设计了不同的标签序列如表4所示，供选择使用。
表4
向步骤(1)中的多重PCR产物中加入配置好的所有的分子倒置杂交探针MIX(20μM)20μL，95℃变性10min，60℃退火30min，然后样本自然降温至室温。
(3)向退火产物中加入聚合酶、磷酸化酶和连接酶，反应体系(如表5)及反应条件如下：
表5
37℃孵育30min，20℃孵育1h。
(4)将步骤(3)中的反应产物等体积混合，使用1X Ampure XP磁珠纯化后，经Qubit定量即可出库上机。
(5)单链文库制备DNA纳米球(DNB)，DNB浓度合格后即可上机测序。
(6)通过探针上的样本标签序列对下机数据进行数据拆分及覆盖深度(depth)分析，要求样本目标区域平均覆盖深度大于500X，待测SNP位点有效覆盖深度大于100X。
(7)选取已经进行质谱检测，分型结果明确的样本，拆分后深度分析如图2所示。
(8)数据分析结果显示，同一样本在不同位点的覆盖深度较为均一且均能达到深度要求。
(9)不同样本在相同位点的覆盖深度受各自样本质量及扩增效率影响，但在等体积混合情况下，覆盖深度较为一致且均能合格。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市乐土精准医疗科技有限公司
<120> 检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法及检测方法
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<400> 2
ccaccatgaa gtaggtgaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 3
agagtagaag atggattggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 4
tctttccaat gctggtggag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 5
agtgaacgtt cccaaagtgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 6
gtgatctcac tccaacaacg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 7
tgcagctgat cttcgtgtcc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 8
tctccccctt gatgaacttc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 9
tctcttgttt tgtggccacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 10
aaggctgttg ttcctacctg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 11
agatgagcag gccgactttg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 12
gatcgtagca cacgttcttg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 13
aatgcgggtt ctttgacgac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 14
ccctcttgag atttcacttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 15
ttctatggca atgtcgatgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 16
gaagtctcaa aagaggttag 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 17
cttgtaagtt cattacctg 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 18
acagctagag tcctgattgc 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 19
gttcagcatt atttggttga c 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 20
ccatatgaaa tggcagtagc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 21
cagaaaacca gaaccttacc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 22
tccatagcct tgtgcttgac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 23
tggcgtggac acgaagatca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 24
gtgctacgat cactacttcc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 25
tctcttgttt tgtggccacc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 26
aaggctgttg ttcctacctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 27
ccaacatcgt ggactgctac 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 28
ccaccatgaa gtaggtgaag 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 29
ccctcttgag atttcacttg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 30
aatgcgggtt ctttgacgac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 31
gtaggatcgt tgtcatccag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 32
tggtggccac aaaacaagag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 33
gtcctagcta gtgattcctg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 34
tctgggtttt gatctcctcg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 35
cccagaaaac tacgatagcc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 36
cactttccag tacacttacc 20
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 37
actttccagt acacttacc 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 38
ccagaaaact acgatagcc 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 39
tgactctctc cactaaggg 19
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(20)
<400> 40
tccccaaata ccgactcaag 20
<210> 41
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(97)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
gggtaggtcg ggcaatgtag tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnngta ggtgaagatt ttcttct 97
<210> 42
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
tgtgaacaaa cactccacca gagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnncgc tgcagacgat cctggggg 98
<210> 43
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
aaggctatgg attggcactt tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnngat atagctccac agtcaagca 99
<210> 44
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
gagaagaaga ggaagttcat cagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnatg cacgtggcct accggagac 99
<210> 45
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 45
tgcgggaaag agcagtggtg gagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnncca gtgctctcct ggacggcc 98
<210> 46
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
gcagccaggc tgcaagaacg tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnccg actttgtctg caacaccc 98
<210> 47
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
tcaaaaagaa tgtgtccttt cagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnntag tgtatagcat catggacc 98
<210> 48
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(97)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 48
ttactgtgga cttgatacat tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnaaa tttctaggga taaaata 97
<210> 49
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(97)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 49
aaccagcaga gtcagggcac tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnttc attacctgta taaattc 97
<210> 50
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
gaaataaaac aaaagatgtt aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnatg gcagtagcaa ttatcgtc 98
<210> 51
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
gtgatctcac tccaacaacg tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnaaa ccagaacctt accacccgc 99
<210> 52
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52
tgcagctgat cttcgtgtcc aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnctc ccacatccgg ctatgggcc 99
<210> 53
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
gggaaagagc agtggtggcc aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnagt gctctcctgg acggccgtg 99
<210> 54
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 54
ggcaatgtag cagtccacga tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnaag attttcttct cggtaggtc 99
<210> 55
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 55
ggaccgtcaa aaagaatgtg tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnctg tagatagagt atagcatca 99
<210> 56
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
gctgatccca aaggcaatga aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnngag aagaatcctg agaagatgt 99
<210> 57
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 57
ctacgatcac tacttcccca tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnntct gcaacaccct gcagccag 98
<210> 58
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(98)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 58
ctcctctata taaatgcgta gagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnncac ttaccatgtt acgacttg 98
<210> 59
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 59
gtgacgggcg gtgtgtacgc gagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnncct ttgaagtata cttgaggag 99
<210> 60
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 合成序列
<222> (1)..(99)
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(77)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 60
tactaactcc cgaaatgacg tagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aacaactcct 60
tggctcacan nnnnnnnttg cagcgtggcc actagccca 99
Claims (10)
1. 一种检测耳聋基因20个突变位点的快速文库构建方法，其特征在于，所述20个突变位点包括GJB2基因的35delG、167delT、176_191del16、235delC、299_300delAT，GJB3基因的538C>T、547G>A，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>T、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G，MT-RNR1 12S rRNA基因的1494C>T、1555A>G；
所述快速文库构建方法，包括如下步骤：
（1）使用针对所述20个突变位点的多重PCR引物对样本DNA进行目标区域扩增，以富集包含所述突变位点的目标区域；
（2）在上一步的目标区域扩增产物中加入针对所述20个突变位点的分子倒置杂交探针，进行探针变性、退火反应；然后在恒温聚合酶、磷酸化酶和连接酶的存在下，进行延伸连接反应以将所述突变位点所在的缺口补齐形成单链环状文库；
其中，所述分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游区域互补。
2.根据权利要求1所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述分子倒置杂交探针的两端分别与待测突变位点上下游20bp互补。
3.根据权利要求1所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述分子倒置杂交探针中包含用于区分不同样本的样本标签序列；所述快速文库构建方法还包括：将不同样本来源的所述单链环状文库混合以进行上机测序。
4.根据权利要求3所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述样本标签序列是一段用以区分样本来源的序列，其中相同样本的不同位点的探针上的标签序列一致，而不同样本的探针上的标签序列不一致。
5.根据权利要求4所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述样本标签序列的长度是6-10个碱基，优选8个碱基。
6. 根据权利要求1所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQ ID NO：1-40所示的引物序列。
7. 根据权利要求1所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述分子倒置杂交探针包括如SEQ ID NO：41-60所示的探针序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的快速文库构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述目标区域扩增的程序是：95℃热变性3min；95℃变性15sec，56℃退火20sec，72℃延伸20sec，45个循环；72℃终延伸10min；
所述步骤（2）中所述探针变性、退火反应的程序是：95℃变性10min，60℃退火30min，然后自然降温至室温；所述延伸连接反应的程序是：37℃孵育30min，20℃孵育1h。
9.一种检测耳聋基因20个突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括对权利要求1-8任一项所述的快速文库构建方法构建的单链环状文库进行上机测序，并分析所述突变位点的碱基情况。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述测序的方法是SE50测序。
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