CN109689061A - 三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物用于预防和治疗细菌感染的新用途 - Google Patents
三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物用于预防和治疗细菌感染的新用途 Download PDFInfo
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Abstract
三唑并(4,5‑d)嘧啶衍生物用于治疗或预防需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染，或者用作生物材料或医疗装置(特别是心血管装置如人工心脏瓣膜或起搏器)的表面上的生物膜形成的抑制剂。
Description
本发明涉及三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物用于预防和治疗细菌感染的新用途。
细菌通常牵连医疗保健相关的感染(包括医疗装置相关的感染)，导致患者发病率和死亡率增加，并且对医疗保健服务造成巨大的经济负担。由于越来越多的细菌变得对属于各种类别的抗生素(诸如青霉素类(Penicillins)、甲氧西林(Methicillins)、碳青霉烯类(Carbapenems)、头孢菌素类(Cephalosporins)、喹诺酮类(Quinolones)、氨基糖苷类(Amino-glycosides)和糖肽类(Glycopeptides))具有耐药性，并且越来越多的感染变得难以治愈，因此这种情况变得至关重要。
由于可用于这些严重感染的治疗选择有限，所以对抗生素的耐药性增加是日益严重的公众健康问题。在欧洲，抗微生物剂耐药性每年导致大约25,000人死亡。与抗微生物剂耐药性相关的临床负担估计每年花费大约15亿欧元。
目前，在全球估计有700,000人死于抗微生物剂耐药性，如在Review on AMR,Antimicrobial resistance:Tackling a crisis for the health and wealth ofnations,2014(AMR综述，抗微生物剂耐药性：解决国家健康和财富危机，2014年)中报道的。
抗生素的使用并不安全，特别是在长期疗法或高剂量疗法中。这样的环境压力可能促进耐药细菌的选择、种群、改变种群结构和增加水平基因转移的风险，导致耐药基因进入微生物组。
抗生素治疗针对“好”和“坏”细菌二者。
人胃肠道(GI)微生物群由约数兆微生物组成，它们中的大多数是细菌。微生物群和宿主的防御关系对于促成健康的代谢和生理功能至关重要。通过破坏这种有益相互作用，饮食成分、身体和心理压力、药物以及抗生素提高了若干疾病如肥胖、炎症和心血管疾病(CVD)的发病率。CVD仍是工业社会的首要死因，其他国家的发病率也在不断上升。
例如，最近的研究表明，在小鼠中，长期抗生素治疗、GI微生物群的破坏和动脉粥样硬化风险之间存在直接关联。
细菌感染的来源多种多样，并且存在大量的细菌感染。
不仅在发病率和死亡率方面，而且在增加患者管理和实施感染控制措施的支出方面，革兰氏阳性细菌引起的感染都是一项重大的公共卫生负担。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肠球菌(enterococci)是医院环境中确定的病原体，并且其频繁的多药耐药性使得治疗复杂化。
金黄色葡萄球菌是一种重要的病原体，其负责广泛的临床表现，从相对良性的皮肤感染到危及生命的疾病如心内膜炎和骨髓炎。它也是一种共生细菌(定殖于大约30％的人口)。
自20世纪90年代以来，金黄色葡萄球菌(S.aureus)流行病学发生了两次重大转变：社区相关皮肤和软组织感染的流行(主要由特定的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[MRSA]菌株驱动)，以及医疗保健相关感染(尤其是感染性心内膜炎和假体装置感染)数量的增加。
凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)是皮肤的正常菌群中最常见的成分。这些生物体是临床标本中的常见污染物，并且越来越多地被认为是临床上重要感染(包括菌血症和心内膜炎)的媒介。处于CoNS感染的特别风险中的患者包括具有假体装置、起搏器、血管内导管的患者和免疫受损的宿主。
凝固酶阴性葡萄球菌占重症监护室中血流分离株的大约三分之一，使得这些生物体成为医院血流感染的最常见病因。
肠球菌物种可以引起多种感染，包括尿路感染、菌血症、心内膜炎和脑膜炎。肠球菌对细胞壁活性剂(青霉素、氨苄青霉素和万古霉素)的杀伤作用具有相对抗性，并且对于氨基糖苷类是不可渗透的。
耐万古霉素肠球菌(VRE)是医院获得性感染的一种日益普遍且难以治疗的病因。
已经在不同的医院环境(例如，医疗和外科重症监护室，以及医疗和儿科病房)中描述了VRE感染的多种流行病，并且像耐甲氧西林金黄色葡萄球菌一样，VRE在许多大医院中是流行的。
β-溶血性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌，GBS)是另一种革兰氏阳性细菌。细菌可以引起新生儿的败血症和/或脑膜炎。它也是老年人和免疫受损成人的发病率和死亡率的重要原因。感染的并发症包括败血症、肺炎、骨髓炎、心内膜炎和尿路感染。
使这些细菌特别擅长在各种生物材料上存活的因素包括生物膜的粘附和产生(参见下文)。
上述四种细菌具有在生物和非生物的任何表面上形成生物膜的能力。生物膜形成的初始步骤是附着/粘附于表面，其在剪切应力条件下更强。主要负责这种粘附的蛋白质是多糖胞间粘附素(PIA)，其使得细菌彼此结合以及与表面结合，从而产生生物膜。生物膜形成的第二阶段是社区结构和生态系统的发展，从而产生成熟生物膜。最后阶段是从表面脱附，随后扩散到其他位置。在生物膜形成的所有阶段中，涉及介导细胞与细胞之间通讯的群体感应(QS)系统。
生物膜中的细菌产生细胞外聚合物物质(EPS)，其主要由多糖、核酸(细胞外DNA)和蛋白质组成，保护它们免受外部威胁(包括免疫系统组分和抗微生物剂)。此外，生物膜中的细菌具有减少的代谢，使其不易受抗生素的影响；这是因为大多数抗微生物剂需要一定程度的细胞活性才能有效。增强这种耐药性的另一个因素是抗生素在整个生物膜中的扩散受损，因为存在EPS基质屏障。
还报道了在生物膜中存在更高的质粒交换速率，增加了发展天然存在和抗微生物剂诱导的耐药性的机会。
已经开发的用于消除生物膜的策略针对生物膜形成中的3个不同步骤：抑制初始阶段，即细菌与表面的粘附；在成熟过程或步骤2期间破坏生物膜结构；抑制QS系统或步骤3。
由于这些生物膜对抗生素的高耐药性，越来越需要控制和防止步骤2中的微生物生长和生物膜形成。在受感染的医疗装置的情况下，治疗是保守治疗或移除设备连同长期抗生素治疗，但是这些方法具有高失败率和增加的经济负担。
这是临床医生尝试在植入前通过分剂量给予(subminister)抗生素而采用预防方法的原因。另一种解决方案可以是修饰医疗装置，仅举几个例子，例如表面涂有银(其具有抗微生物性能)或涂有水凝胶以及聚氨酯(其减少细菌粘附)。
根据Eggiman的American Society for Microbiology Press,Washington,DC2000.p.247，起搏器和植入式复律除颤器[ICD]可能被感染，感染率为0.8％至5.7％。
感染可能涉及包含装置的皮下袋或导联的皮下区段。还可能发生涉及导联的经静脉部分的更深的感染，通常伴有相关的菌血症和/或血管内感染。
该装置和/或袋本身可以是感染源，通常是由于植入时的污染，或者可以继发于来自不同来源的菌血症。
带有皮肤菌群的起搏器袋的围手术期污染似乎是最常见的皮下感染源。
与心脏装置相关的感染性心内膜炎(CDRIE)是另一种危及生命的疾病，由于植入数量增加(欧洲每年有81000个起搏器植入)而发病率增加。CDRIE的发病率达到0.14％，并且在ICD植入后甚至更高。
金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(通常为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis))引起65％至75％的发电机袋感染和高达89％的装置相关心内膜炎。植入两周内出现的发作更可能是由金黄色葡萄球菌引起的。
无论涉及的组件如何，成功治疗受感染的医疗装置或生物材料通常需要移除整个系统并且施用针对致病细菌的抗生素。重要的是，单独的药物治疗与高死亡率和复发风险相关。
人工瓣膜心内膜炎(PVE)是一种严重的感染，可能导致致命的后果。
在手术后的最初几天和几周内，细菌可以通过术中直接污染或通过血源性扩散而到达瓣膜假体。由于瓣膜缝合环、心脏瓣环和锚定缝线在瓣膜植入后早期不能内皮化，因此细菌可以沿着缝线路径直接进入假体-瓣环界面和瓣周组织。这些结构涂覆有宿主蛋白质，诸如纤连蛋白和纤维蛋白原，一些生物可以粘附于所述蛋白质并且引发感染。
手术后最初三个月期间发生人工瓣膜心内膜炎(PVE)的风险最大，高风险持续到第六个月，然后逐渐下降，术后向前12个月的年率为大约0.4％。瓣膜置换后第一年中发生PVE的患者的百分比在积极随访的研究中为1％至3％；五年后，累积百分比为3％至6％。
早期PVE(植入两个月内)中最常见的病原体是金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。
晚期PVE(瓣膜植入后两个月)中最常见的病原体是链球菌和金黄色葡萄球菌，其次是凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌。
在手术后第一年中引起PVE的凝固酶阴性葡萄球菌几乎完全是表皮葡萄球菌。这些生物体中的84％至87％是耐甲氧西林的，因此对所有β-内酰胺抗生素都具有耐药性。
根据2008年法国调查，PVE占所有感染性心内膜炎的约20％。在约30％的病例中，PVE与医疗保健有关。金黄色葡萄球菌是首要的致病病原体，占PVE的多于20％。重要的是，在比较1999年的数据时，PVE相关死亡率仍然很高，手术后达到约40％，并且住院死亡率达到25％。
假体周围关节感染(PJI)发生在1％至2％的关节置换手术中，并且是关节成形术失败的主要原因。
生物膜在PJI的发病机制中起重要作用。生物膜内的细菌对治疗产生耐药性；因此，除非通过外科清创将生物膜物理破坏或移除，否则抗菌治疗通常是不成功的。根据植入后症状发作的时间将假体关节感染分类：早发性(手术后<3个月)，迟发性(手术后3至12个月)，和晚发性(手术后＞12个月)。这些感染具有以下特性。早发性感染通常在植入期间获得，并且通常是由于毒性生物体，诸如金黄色葡萄球菌，或混合感染。通常也在植入期间获得迟发性感染。与进展缓慢的表现一致，延迟感染通常由较低毒性的细菌引起，诸如凝固酶阴性葡萄球菌或肠球菌。由血源性接种引起的晚发性感染通常是急性的并且通常由金黄色葡萄球菌或β溶血性链球菌引起。
PJI的管理通常包含手术和抗菌治疗二者。
因此，本领域迫切需要一种新的抗菌治疗。
我们惊奇地发现，三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物具有抗菌活性，并且可以用于治疗或预防宿主哺乳动物中的细菌感染。
我们还发现，这样的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物也可以用于控制早期阶段(诸如步骤1或2)中生物膜形成中的细菌生长的方法，或者用于在生物膜形成的所有步骤(包括最后的步骤3，其中生物膜已经达到其基质形成的成熟阶段并且开始从表面脱附，细菌随后扩散到其他位置)中杀灭细菌。
在第一方面，本发明因此提供三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其用于治疗或预防需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染。
细菌感染尤其意指革兰氏阳性细菌感染，诸如例如肺炎，败血症，心内膜炎，骨髓炎，脑膜炎，尿路、皮肤和软组织感染。细菌感染的来源是多种多样的，并且可以例如通过使用植入式生物材料引起。
生物材料意指用于宿主哺乳动物中的临床用途的所有植入式外来材料，例如用于假体关节、起搏器、植入式复律除颤器、血管内导管、冠状动脉支架、人工心脏瓣膜、人工晶状体、牙科植入物等。
三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物意指下式(I)的化合物，
其中R1是任选地被一个或多个卤素原子取代的C3-5烷基；R2是任选地被一个或多个卤素原子取代的苯基；R3和R4二者都是羟基；R是OH或XOH，其中X是CH2、OCH2CH2或键；
或其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物，条件是当X是CH2或键时，R1不是丙基；当X是CH2并且R1CH2CH2CF3、丁基或戊基时，R2处的苯基必须被氟取代；当X是OCH2CH2并且R1是丙基时，R2处的苯基必须是被氟取代。
无论是单独的还是作为另一个基团的一部分，烷基是直链的且完全饱和的。
R1是任选地被一个或多个氟原子取代的C3-5烷基。优选地，R1是3,3,3,-三氟丙基、丁基或丙基。
R2是苯基或被一个或多个卤素原子取代的苯基。优选地，R2是被氟原子取代的苯基。更优选地，R2是4-氟苯基或3,4-二氟苯基。
R是OH或XOH，其中X是CH2、OCH2CH2或键；优选地，R是OH或OCH2CH2OH。当X是键时，R是OH。
最优选的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是包括R2为4-氟苯基或3,4-二氟苯基和或R为OCH2CH2OH的衍生物。
三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是众所周知的化合物。它们可以根据US6,525,060(通过引用结合于此)中描述的方法获得。
三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物用作针对血小板粘附和聚集(其是动脉血栓形成的主要步骤)的药物。
它们通过以可逆方式拮抗ADP的血小板P2Y12受体起作用，在口服施用后提供抗血小板作用。P2Y12是血小板表达的两种ADP受体之一，通过扩增血小板对其他激动剂的反应而起作用，其稳定血小板聚集并且促进血栓形成。因此，单独的或与阿司匹林组合的P2Y12抑制剂显著地改善患有冠状动脉疾病和外周血管疾病的患者的结局。
我们现在惊奇地发现，这样的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物也具有抗菌作用。
优选的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是其中R是OH或OCH2CH2OH和/或R2是4-氟苯基或3,4二氟苯基的衍生物。
最优选的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是(1R-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-((3,3,3-三氟丙基)硫基)3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(羟基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)(3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(4-氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
(1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇；
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
最优选的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是如式(II)所限定并且在下文中也称为Triafluocyl的(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)。
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
另一个最优选的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是如式(III)所限定并且在下文中也称为Fluometacyl的(1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
根据本发明，三唑(4,5-d)嘧啶衍生物必须在数天内施用至患者(特别是在预防的情况下)。三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物可以以其自身或作为药物组合物施用，无毒剂量低于1.8g/天。
本发明的另一个优选目的是用于预防或治疗细菌感染的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的药物组合物，
药物组合物可以是干粉或具有生理相容性的液体组合物。除三唑(4,5-d)嘧啶衍生物以外，组合物还包括辅助物质、防腐剂、溶剂和/或粘度调节剂。溶剂意指例如水、盐水或任何其他生理溶液、乙醇、甘油、油(诸如植物油)或其混合物。粘度调节剂意指例如羧甲基纤维素。
本发明的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物通过口服、静脉内、血管内、肌内、肠胃外或局部施用显示其效果，并且可以另外用于肠胃外施用的组合物，特别是注射组合物或在用于局部施用的组合物中。它也可以装载于纳米粒子中用于纳米医学应用。它可以用于气溶胶组合物中。这样的气溶胶组合物是例如溶液、混悬液、微粒化粉末混合物等。通过使用喷雾器、定量吸入器或干粉吸入器或任何设计用于此种施用的装置来施用组合物。
盖伦组合物的实例包括片剂、胶囊、粉剂、丸剂、糖浆、咀嚼物、颗粒剂等。这些可以通过众所周知的技术和使用典型的添加剂如赋形剂、润滑剂和粘合剂来生产。
合适的辅助物质和药物组合物描述于Oslo等人编辑的Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，1980年，Mack Publishing Co.。通常，在组合物中使用适量的药用盐以使组合物等渗。药用物质的实例包括盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选为约5至约8，并且更优选约7至约7.5。
本发明的另一个优选目的是治疗或预防需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染的方法，所述方法包括向宿主施用有效量的如式(I)所限定的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，
优选地，(1R-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-((3,3,3-三氟丙基)硫基)3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(羟基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)(3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
最优选地，如式II所限定的(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(4-氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
或者最优选地，如式III所限定的(1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇；
或其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
在另一个方面，本发明提供了三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物作为表面上的生物膜的抑制剂、特别是生物材料表面或医疗装置表面上的生物膜的抑制剂的用途，所述衍生物优选(1R-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-((3,3,3-三氟丙基)硫基)3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(羟基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)(3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(4-氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物；
并且最优选(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
表面上的生物膜的最优选的抑制剂是如式III所限定的(1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物；
表面意指任何类型的表面，诸如橡胶或塑料表面，例如由聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚四氟乙烯、有机硅等或共聚物制成的表面，但还优选金属表面诸如不锈钢、银、金、钛、金属合金、热解炭等。它还可以用于生物可吸收或生物材料表面，诸如生物假体或由生物材料制成的装置，诸如例如猪或牛心包。
抑制表面上的生物膜意指在生物膜形成的所有阶段抑制其形成，从在步骤1中预防或抑制细菌在表面上的粘附开始，并且主要是在步骤2中抑制细菌生长、增殖和在表面上的微菌落形成。抑制生物膜还意指在成熟步骤3中抑制基质并且在定殖步骤中抑制细菌从基质中的分散。抑制生物膜还意指在生物膜形成的所有步骤中杀灭细菌。
医疗装置意指如上定义的生物材料，以及要求无细菌污染的医疗装置，诸如伤口敷料、软组织填充物、根管填充物、隐形眼镜、血袋等。
根据本发明的最后另一个方面是杀灭或控制表面上的生物膜形成中细菌生长的方法，所述方法包括在预防步骤中在表面上施用三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，减少在基底上或在已经存在生物膜的阶段中或者甚至在具有基质形成的成熟步骤(其中建立了更复杂的生物膜结构，作为对常规抗菌剂的屏障来保护细菌)中的细菌粘附和存活。
杀灭细菌或预防表面上的细菌生长的方法通常应用于生物材料或医疗装置。
生物材料或医疗装置优选是植入式外来材料，用于宿主哺乳动物中的临床用途，诸如假体装置、起搏器、植入式复律除颤器、血管内导管、冠状动脉支架、心脏瓣膜、人工晶状体等，但是可以扩展到要求无细菌污染的其他医疗装置，诸如例如伤口敷料、含有局部麻醉剂的软组织填充物、带有辅助药物的根管填充物等。
杀灭细菌或预防细菌生长的方法也可以应用于需要这样的抗菌处理的实验装置的表面。
附图说明
图1示出了Triafluocyl对金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌作用。示出了在不同浓度的Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)存在下的生长曲线(A)和活菌计数(B)。
图2示出了Triafluocyl在阶段2对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制。
图3示出了Triafluocyl对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的抑菌和杀菌作用。示出了在不同浓度的Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)存在下的生长曲线(A)和活菌计数(B)。
图4示出了Triafluocyl在阶段2对粪肠球菌生物膜形成的抑制。
图5示出了Triafluocyl对表皮葡萄球菌的抑菌和杀菌作用。在不同浓度的Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)存在下的生长曲线(上图)和活菌计数(下图)。
图6示出了Triafluocyl在阶段2对表皮葡萄球菌生物膜形成的抑制。
图7示出了Triafluocyl对成熟生物膜的破坏(阶段3：24小时生物膜)。用Triafluocyl处理24小时后表皮葡萄球菌生物膜的活菌计数(上图)。生物膜中活细胞的百分比(下图)。
图8示出了与万古霉素和米诺环素(Mynocycline)相比，Triafluocyl对MRSA、GISA和VRE菌株的杀菌活性：
图8A示出了对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀菌曲线。
图8B示出了对于糖肽中等耐药性金黄色葡萄球菌(Glycopeptide intermediate-resistant S.aureus，GISA)的杀菌曲线。
图8C示出了对于耐万古霉素粪肠球菌(VRE)的杀菌曲线。
图9示出了Fluometacyl对金黄色葡萄球菌MRSA的杀菌活性。
图10A和10B分别示出了不同浓度的Fluometacyl对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的抗菌作用。
实施例：
在下文中通过以下非限制性实施例示出本发明。
我们使用金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪肠球菌作为临床相关的革兰氏阳性细菌菌株进行了体外实验。
根据欧洲抗微生物药敏试验委员会(European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing，EUCAST)的建议进行试验。
实施例1：使用(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或Triafluocyl(Cayman，产品编号15425)。
将金黄色葡萄球菌(美国模式培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，ATCC 25904)在胰酶大豆肉汤(TSB)培养基中培养过夜，在新鲜TSB中以1:100稀释，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.25-0.3)。
然后将浓度递增的Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)或赋形剂(DMSO)加入5ml细菌悬浮液中。通过分光光度法(OD600)以及通过将适当的培养物稀释液在TS琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔(20-100分钟)后测量细菌生长。
用Triafluocyl测量抑菌和杀菌作用。在图1中，通过浊度测量(上图)和活菌计数(下图)测量在浓度递增(1μg/ml至20μg/ml)的Triafluocyl存在下金黄色葡萄球菌生长的动力学。数据代表中位数±范围(n＝3)。*p<0.05；**p<0.01，***p<0,001，Triafluocyl相比于赋形剂。
如图1所示，10μg/ml Triafluocyl的浓度能够抑制细菌生长，而20μg/mlTriafluocyl显示出有效的杀菌作用。
实施例2：使用(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或Triafluocyl作为生物膜形成抑制剂。
金黄色葡萄球菌(ATCC 25904)在TSB培养基中培养过夜，然后在新鲜TSB中稀释100倍，并且在37℃有氧温育直至细菌培养物达到OD600为0.6(相当于大约1-3x108CFU/ml)。然后将细菌培养物在新鲜TSB中稀释至1x104CFU/ml。将800μl等分试样的稀释细菌悬浮液分配在24孔板的每个孔中。使细菌在37℃在静态条件下粘附4小时。移除培养基后，用PBS冲洗孔2次以除去浮游细菌，并且用补充有0.5％葡萄糖的TSB重新填充。
然后以所需浓度加入Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)，并且将板在37℃温育20小时。温育后，洗涤孔并且用0.5％(w/v)结晶紫染色30分钟，再次洗涤，并且通过加入20％乙酸(v/v，在水中)溶解染料，然后在595nm处读取吸光度。
在浓度递增的Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)存在下，在聚苯乙烯表面上形成金黄色葡萄球菌生物膜。在图2中，生物膜质量表示为在DMSO存在下获得的值的百分比(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，Triafluocyl相比于DMSO，n＝4)。
在所有测试浓度下，Triafluocyl显著降低金黄色葡萄球菌生物膜形成。在10μg/ml Triafluocyl存在下，聚苯乙烯表面上不会形成生物膜。
实施例3：使用(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)。
将粪肠球菌(ATCC 29212)在脑心浸液(BHI)培养基中培养过夜，在新鲜BHI中以1:100稀释，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.25-0.3)。
然后将浓度递增的Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)或DMSO(作为赋形剂)加入5ml细菌悬浮液中。通过分光光度法(OD600)以及通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔(30-120分钟)后测量细菌生长。
用Triafluocyl测量抑菌和杀菌作用。在图3中，通过浊度测量(上图)和活菌计数(下图)测量在浓度递增(5μg/ml至40μg/ml)的Triafluocyl存在下粪肠球菌生长的动力学。数据代表中位数±范围(n＝3)。
如图3所示，10μg/ml Triafluocyl的浓度能够抑制细菌生长，而20μg/mlTriafluocyl并且更重要的是40μg/ml显示出有效的杀菌作用。
实施例4：Triafluocyl作为生物膜形成抑制剂的用途。
粪肠球菌(ATCC 29212)在BHI培养基中培养过夜，然后在新鲜TSB中稀释100倍，并且在37℃有氧温育直至细菌培养物达到OD600为0.6(相当于大约2-5x108CFU/ml)。然后将细菌培养物在新鲜TSB中稀释至1x104CFU/ml。将800μl等分试样的稀释细菌悬浮液分配在24孔板的每个孔中。使细菌在37℃在静态条件下粘附4小时。移除培养基后，用PBS冲洗孔2次以除去浮游细菌，并且用补充有0.5％葡萄糖的TSB重新填充。
然后以所需浓度加入Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)，并且将板在37℃温育20小时。温育后，洗涤孔并且用0.5％(w/v)结晶紫染色30分钟，再次洗涤，并且通过加入20％乙酸(v/v，在水中)溶解染料，然后在595nm处读取吸光度。
在浓度递增的Triafluocyl或DMSO(作为赋形剂)存在下，在聚苯乙烯表面上形成粪肠球菌生物膜。在图2中，生物膜质量表示为在DMSO存在下获得的值的百分比(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，Triafluocyl相比于DMSO，n＝4)。
在10μg/ml的起始浓度下，Triafluocyl显著降低粪肠球菌生物膜形成。在40μg/mlTriafluocyl存在下，聚苯乙烯表面上不会形成生物膜。
实施例5：Triafluocyl对表皮葡萄球菌的时间-杀灭研究
为了评价Triafluocyl抗菌作用，我们在对数期中在不同Triafluocyl浓度存在下测试了表皮葡萄球菌的液体生长。在这个阶段，细菌通常对具有杀菌活性的药剂高度敏感，因为它们正在快速分裂。
将50ml TSB中的表皮葡萄球菌O/N培养物的1:100接种物培养3小时至其对数期(OD600＝0,26，和≈3x108CFU/ml)。
将细菌分于几个试管中，它们含有不同浓度的DMSO(单独作为赋形剂或与TSB中的Triafluocyl组合)，并且在37℃在220rpm振荡下培养100分钟，每20分钟测量OD600一次。
与DMSO(0,25％)的生长相比，我们观察到表皮葡萄球菌生长在10μg/ml至20μg/mlTriafluocyl之间的剂量依赖性抑制(图5)。在50μg/ml，我们观察到轻微的抑菌活性，这通过80分钟时3x108CFU/ml的活细胞数证实，其等于测定开始时未处理对照中细菌的数量(图5)。
此外，我们已经测试了Triafluocyl对来自表皮葡萄球菌的对数期培养物的低密度接种物(0.08x106CFU/ml)的影响。我们在具有或不具有Triafluocyl的情况下跟踪生长4小时并且测量OD600：与在相同时间点不存在Triafluocyl的生长相比，5μg/ml的Triafluocyl已经将OD降低50％；10μg/ml和20μg/ml抑制生长(OD值等于生长开始时的OD)(数据未显示)。
这意味着接种密度越低，减缓生长或杀灭细菌的Triafluocyl浓度越低。
实施例6：Triafluocyl防止表皮葡萄球菌生物膜形成
为了研究Triafluocyl对生物膜形成的影响，将早期对数期的表皮葡萄球菌(5x108CFU/ml)铺板于24孔板中，并且使其在37℃在静态条件下在孔底部粘附4小时。温育4小时后，除去浮游细菌，并且将粘附细菌在TSB中洗涤两次。将补充有或未补充0.25％葡萄糖的新鲜TSB培养基加入到具有5种不同浓度的Triafluocyl的孔中并且温育24小时。将孔用0.9％NaCl洗涤3次，并且在室温与dH2O中的1％结晶紫溶液温育1小时以将生物膜染色。
将孔用dH20洗涤3次以除去未结合的结晶紫，然后加入400μl 10％乙酸并且在室温温育10分钟。在570nm处一式三份地测量吸光度，反映生物膜的总生物量(活细菌和死细菌)。
Triafluocyl影响生物膜形成(图6)：在不存在葡萄糖的情况下，其在5μg/ml已经抑制生物膜形成达50％，而在存在葡萄糖的情况下，我们仅在20μg/ml Triafluocyl时达到50％生物膜减少。
抑制至少90％生物膜形成的Triafluocyl浓度称为最小生物膜抑制浓度(MBIC)。表皮葡萄球菌的Triafluocyl MBIC在存在和不存在葡萄糖下均为50μg/ml。
实施例7：Triafluocyl破坏表皮葡萄球菌成熟生物膜
在另一个实验中，我们让0.5x108CFU/ml表皮葡萄球菌细胞粘附4小时，并且在0.25％葡萄糖存在下让生物膜形成另外24小时，此时我们在具有0.25％葡萄糖的TSB中用若干浓度的Triafluocyl处理生物膜24小时并且使用BacLight细菌活力试剂盒(MolecularProbes)测定活菌计数(图7)以及活细胞百分比。
对于生物膜分析，我们首先洗涤生物膜以除去所有浮游细菌，然后使用刮棒机械分离生物膜。为了确保来自生物膜的聚集体完全解离，使细胞悬浮液通过针(0.5x16mm)并且将稀释液铺板于TSA板上。
只有最高浓度的Triafluocyl(50μg/ml)对减少生物膜中活细胞的数量有效，减少了几乎3log(从对照中的1.1x108CFU/ml降至1.5x105CFU/ml)。
在同一实验中，我们还测定了活细菌和死细菌的百分比。为此，我们按照Molecular Probes的试剂盒LIVE/DEAD的程序进行。简言之，将生物膜重悬于0.9％NaCl溶液中，并且在黑暗中用SYTO9(绿色荧光)和碘化丙啶(PI)(红色荧光)的混合物将细胞染色15分钟。将染色的细胞转移到96孔板中，并且使用Enspire分光光度计测量荧光，激发波长为470nm并且发射光谱范围为490-700nm。SYTO9染料(绿色荧光500-520nm)穿透所有细胞(死细胞和活细胞)并且与DNA结合，而PI(610-630nm范围内的红色荧光)仅进入具有受损细胞膜的死细胞。当PI和SYTO9在同一细胞中时，绿色荧光强度降低。因此，在具有高百分比的死细胞的细胞群中，绿色荧光的发射光谱减少，因为存在更多的PI染色。将荧光强度的比率(绿色/活细胞)相对于已知百分比的活细胞作图，以获得标准曲线，并且通过外推法获得我们样品中活细胞的百分比(图7)。浓度为20μg/ml和50μg/ml的Triafluocyl分别将活细菌的百分比降低至80％和30％。
实施例8：对表皮葡萄球菌的Triafluocyl抗菌作用：最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
按照EUCAST(欧洲抗微生物药敏试验委员会)的建议，在表皮葡萄球菌(ATCC35984，也称为RP62A)中测定Triafluocyl的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
简言之，将在胰酶大豆琼脂(TSA)板上生长的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在胰酶大豆肉汤(TSB)中培养过夜(O/N)，第二天将Mueller-Hinton肉汤(MHB)中的1:50接种物在有氧条件下温育3小时，并且在存在或不存在1％DMSO(赋形剂)中的不同浓度Triafluocyl的情况下温育1:100稀释(对应于3x105CFU/ml)的接种物。在O/N培养后，在分光光度计中在600nm处测量每种培养物的OD(OD600)。MIC表示不存在可见的细菌生长时的浓度，即600nm处的ΔOD等于零(空白是单独的培养基)。
我们还测定了MBC，即在TSA板上铺展时液体培养物不会产生任何菌落的浓度。
Triafluocyl对表皮葡萄球菌的MIC等于12±3μg/ml，并且MBC为17±3μg/ml(两个生物学重复，检测限10-3)。
按照EUCAST，Triafluocyl杀灭99.9％表皮葡萄球菌的最短持续时间(MDK99,9)为2小时。
实施例9：对金黄色葡萄球菌的Triafluocyl抗菌作用：最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
使用不同的金黄色葡萄球菌菌株(临床相关的革兰氏阳性细菌菌株：ATCC 25904、ATCC 6538，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC BAA-1556，糖肽中等耐药性(GISA)金黄色葡萄球菌Mu-50(ATCC 700695))进行进一步的实验，以测定最低抑菌浓度(MIC)，其作为防止细菌生长所需的最低浓度；最低杀菌浓度(MBC)，其确定抗微生物剂杀灭特定微生物时的最低浓度；和杀灭99.9％细菌的最短持续时间(MDK99,9)，这是根据EUCAST的耐受性度量。
MIC测定：将选自不同金黄色葡萄球菌菌株的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基中培养过夜(O/N)，第二天将Mueller-Hinton肉汤(MHB)中的1:100接种物在有氧条件下温育3小时(OD＝0,08-0,1)，并且在存在或不存在1％DMSO中的不同浓度Triafluocyl的情况下温育1:300稀释(对应于3x105CFU/ml)的接种物。在O/N培养后，在分光光度计中在600nm处测量每种培养物的OD(OD600)。MIC表示不存在可见的细菌生长时的浓度，即600nm处的ΔOD等于零(空白是单独的培养基)。Triafluocyl对金黄色葡萄球菌ATCC 25904、ATCC 6538，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC BAA-1556，糖肽中等耐药性(GISA)和金黄色葡萄球菌Mu-50(ATCC 700695)的MIC分别为20、20、15和20μg/ml。
MBC和MDK99,9测定：将选自不同金黄色葡萄球菌菌株的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基(TSB或BHI)中培养过夜(O/N)，第二天将适当培养基中的1:100接种物在有氧条件下温育2小时。然后用处于MIC浓度或更高浓度的triafluocyl攻击培养物。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。在24小时内杀灭至少99,9％的起始接种物的浓度被定义为MBC。并且所需的实际时间被定义为MDK99,9。Triafluocyl对金黄色葡萄球菌ATCC 25904、ATCC 6538，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC BAA-1556，糖肽中等耐药性(GISA)和金黄色葡萄球菌Mu-50(ATCC 700695)的MBC对于它们中的每一个均为20μg/ml。Triafluocyl对金黄色葡萄球菌ATCC 25904、ATCC 6538，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC BAA-1556，糖肽中等耐药性(GISA)和金黄色葡萄球菌Mu-50(ATCC 700695)的MDK99,9分别为10、6、2和14小时。
实施例10：对粪肠球菌的Triafluocyl抗菌作用：最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
使用不同的粪肠球菌菌株(临床相关的革兰氏阳性细菌菌株：耐万古霉素粪肠球菌(VRE)ATCC BAA-2365，和粪肠球菌ATCC 29212)进行进一步的实验，以测定最低抑菌浓度(MIC)，其作为防止细菌生长所需的最低浓度；最低杀菌浓度(MBC)，其确定抗微生物剂杀灭特定微生物时的最低浓度；和杀灭99.9％细菌的最短持续时间(MDK99,9)，这是根据EUCAST的耐受性度量。
MIC测定：将选自不同粪肠球菌菌株的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基中培养过夜(O/N)，第二天将Mueller-Hinton肉汤(MHB)中的1:100接种物在有氧条件下温育3小时(OD＝0,08-0,1)，并且在存在或不存在1％DMSO中的不同浓度Triafluocyl的情况下温育1:300稀释(对应于3x105CFU/ml)的接种物。在O/N培养后，在分光光度计中在600nm处测量每种培养物的OD(OD600)。MIC表示不存在可见的细菌生长时的浓度，即600nm处的ΔOD等于零(空白是单独的培养基)。Triafluocyl对耐万古霉素粪肠球菌(VRE)ATCC BAA-2365和粪肠球菌ATCC 29212的MIC分别为20和40μg/ml。
MBC和MDK99,9测定：将选自不同粪肠球菌菌株的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基(TSB或BHI)中培养过夜(O/N)，第二天将适当培养基中的1:100接种物在有氧条件下温育2小时。然后用处于MIC浓度或更高浓度的triafluocyl攻击培养物。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。在24小时内杀灭至少99,9％的起始接种物的浓度被定义为MBC。并且所需的实际时间被定义为MDK99,9。Triafluocyl对耐万古霉素粪肠球菌(VRE)ATCC BAA-2365的MBC为20μg/ml。Triafluocyl对耐万古霉素粪肠球菌(VRE)ATCC BAA-2365的MDK99,9为24小时。
实施例11：对无乳链球菌的Triafluocyl抗菌作用：最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
使用无乳链球菌(ATCC 12386)作为临床相关的革兰氏阳性细菌菌株进行进一步的实验，以测定最低抑菌浓度(MIC)，其作为防止细菌生长所需的最低浓度；最低杀菌浓度(MBC)，其确定抗微生物剂杀灭特定微生物时的最低浓度；和杀灭99.9％细菌的最短持续时间(MDK99,9)，这是根据EUCAST的耐受性度量。
MIC测定：将选自不同无乳链球菌(ATCC 12386)菌株的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基中培养过夜(O/N)，第二天将Mueller-Hinton肉汤(MHB)中的1:100接种物在有氧条件下温育3小时(OD＝0,08-0,1)，并且在存在或不存在1％DMSO中的不同浓度Triafluocyl的情况下温育1:300稀释(对应于3x105CFU/ml)的接种物。在O/N培养后，在分光光度计中在600nm处测量每种培养物的OD(OD600)。MIC表示不存在可见的细菌生长时的浓度，即600nm处的ΔOD等于零(空白是单独的培养基)。Triafluocyl对于无乳链球菌(ATCC 12386)的MIC为40μg/ml。
MBC和MDK99,9测定：将选自无乳链球菌(ATCC 12386)的单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当培养基(TSB或BHI)中培养过夜(O/N)，第二天将适当培养基中的1:100接种物在有氧条件下温育2小时。然后用处于MIC浓度或更高浓度的triafluocyl攻击培养物。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。在24小时内杀灭至少99,9％的起始接种物的浓度被定义为MBC。并且所需的实际时间被定义为MDK99,9。Triafluocyl对于无乳链球菌(ATCC12386)的MBC为40μg/ml。Triafluocyl对于无乳链球菌(ATCC 12386)的MDK99,9为1小时。
所有实验的结果示于表1和图8A、B、C中，其中示出了Triafluocyl对诸如以下耐药菌株的作用：MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；GISA：糖肽中等耐药性金黄色葡萄球菌；VRE：耐万古霉素粪肠球菌。
表1MIC：最低抑菌浓度；MBC：最低杀菌浓度(截止值＝CFU减少99,9％)；MDK99,9：杀灭99,9％的起始接种物所需的时间(小时)；nd：未测定。
图8A还示出了Triafluocyl、万古霉素和米诺环素对MRSA的抗菌作用之间的比较。
将金黄色葡萄球菌MRSA(ATCC BAA-1556)在脑心浸液(BHI)培养基中培养过夜，在新鲜BHI中以1:100稀释，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.25-0.3)。
将Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)(20μg/ml)、万古霉素(Sigma，4μg/ml或10μg/ml)、米诺环素(Sigma，8μg/ml)或溶剂(DMSO)加入到5ml的金黄色葡萄球菌MRSA悬浮液中。
通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量金黄色葡萄球菌MRSA的细菌生长。
人们清楚地观察到Triafluocyl早在最初两个小时后就导致金黄色葡萄球菌MRSA活菌计数减少，此时万古霉素和米诺环素的剂量分别等于10倍和8倍MIC，这是无效的。在24小时实验中，万古霉素和米诺环素的杀菌作用相比于Triafluocyl仍然是低效的。
图8B)示出了Triafluocyl和米诺环素对金黄色葡萄球菌GISA的抗菌作用之间的比较。
将金黄色葡萄球菌Mu50GISA在脑心浸液(BHI)培养基中培养过夜，在新鲜BHI中以1:100稀释，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.25-0.3)。
然后将Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)(20μg/ml)、米诺环素(Sigma，8μg/ml)或赋形剂(DMSO)加入到5ml的细菌悬浮液中。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。
此处再一次，Triafluocyl(20μg/ml)比高剂量的米诺环素(10μg/ml)具有更快和更有效的抗菌作用。
图8C示出了Triafluocyl和米诺环素对粪肠球菌VRE的比较。
将粪肠球菌VRE(ATCC BAA-2365)在脑心浸液(BHI)培养基中培养过夜，在新鲜BHI中以1:100稀释，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.2-0.25)。
然后将Triafluocyl(Cayman Chemical，产品编号15425)(20μg/ml)、米诺环素(Sigma，10μg/ml)或赋形剂(DMSO)加入到5ml的细菌悬浮液中。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。
此处，Triafluocyl(20μg/ml)显示出杀菌作用，而高剂量的米诺环素(10μg/ml)仅是抑菌的。
实施例9：对革兰氏阳性细菌菌株：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌的Fluometacyl抗菌作用。
药敏试验：MIC和MBC测定：
按照EUCAST(欧洲抗微生物药敏试验委员会)的建议，对几种革兰氏阳性菌株(表2)测定Fluometacyl的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
对于MIC测定，将单个菌落重悬并且在有氧条件下(37℃，220rpm振荡)在适当的细菌特异性培养基(TSB：胰酶大豆肉汤，用于金黄色葡糖球菌atcc 25904和表皮葡糖球菌；和BHI：脑心浸液培养基，用于所有其他菌株)中培养过夜(O/N)，第二天将1:100接种物在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中在有氧条件下温育3小时(OD600＝0,08-0,1)。在存在或不存在不同浓度Fluometacyl、1％DMSO的情况下，将另外的接种物，即MHB培养物的1:300稀释物(对应于3x105CFU/ml)，在MHB中培养20小时。
对于MBC测定，将O/N培养物(如前所述制备)的1:100接种物在细菌特异性培养基中在有氧条件下温育2小时。然后用处于MIC浓度或更高浓度的Fluometacyl攻击培养物。通过将适当的培养物稀释液在细菌特异性培养基琼脂板上铺板后对菌落形成单位(CFU)计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。在24小时内杀灭至少99,9％的起始接种物的浓度被定义为MBC。
表2：对不同菌株的MIC和MBC测定。MRSA：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；GISA：糖肽中等耐药性金黄色葡萄球菌；VRE：耐万古霉素肠球菌。MIC：最低抑菌浓度；MBC：最低杀菌浓度(截止值＝CFU减少99,9％)。
Fluometacyl对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的时间-杀灭研究
将金黄色葡萄球菌MRSA(ATCC BAA-1556)在BHI培养基中培养过夜，然后在新鲜BHI中稀释1:100接种物，并且在37℃有氧温育直至细菌生长达到对数期(OD600＝0.25-0.3)。将培养物分成两份并且用38μM Fluometacyl(＝18.2μg/ml)或DMSO(对照)攻击。通过将适当的培养物稀释液在BHI琼脂板上铺板后对菌落形成单位计数，在不同时间间隔后测量细菌生长。(N＝2)
实施例10：对生物膜形成的Fluometacyl抗菌作用
金黄色葡萄球菌(ATCC 25904)或表皮葡萄球菌(ATCC 35984)在TSB培养基中培养过夜，然后在新鲜TSB中稀释100倍，并且在37℃有氧温育直至细菌培养物达到OD600为0.6(相当于大约1-3x108CFU/ml)。然后将细菌培养物在新鲜TSB中稀释至1x104CFU/ml。将800μl稀释细菌悬浮液的等分试样分配在24孔板的每个孔中。使细菌在37℃在静态条件下粘附4小时。移除培养基后，用PBS冲洗孔2次以除去浮游细菌，并且用含有补充有0.5％葡萄糖的TSB(其含有所需浓度的Fluometacyl或单独的DMSO(对照))重新填充。将24孔板在37℃温育20小时。然后洗涤孔，并且用0.5％(w/v)结晶紫染色30分钟并且用PBS冲洗4次。通过加入20％乙酸(v/v，在水中)溶解染料，然后在595nm处读取吸光度。图10A和图10B分别示出了在所有测试浓度下对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的Fluometacyl作用。在38μM Fluometacyl的存在下，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌二者都不能形成任何生物膜。
Claims (29)
1.用于治疗或预防需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染的式(I)的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，
其中R1是任选地被一个或多个卤素原子取代的C3-5烷基；R2是任选地被一个或多个卤素原子取代的苯基；R3和R4二者都是羟基；R是XOH，其中X是CH2、OCH2CH2或键；
或其药用盐或溶剂化物，或者这样的盐的溶剂化物，
条件是当X是CH2或键时，R1不是丙基；当X是CH2并且R1CH2CH2CF3、丁基或戊基时，R2处的苯基必须被氟取代；当X是OCH2CH2并且R1是丙基时，R2处的苯基必须是被氟取代。
2.根据权利要求1所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其中R2是被氟原子取代的苯基。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其中R是OH或OCH2CH2OH。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其中R是OH。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，所述衍生物选自：
(1R-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-((3,3,3-三氟丙基)硫基)3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(羟基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)(3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(4-氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇；
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
6.根据权利要求1至3和5中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其是也称为Triafluocyl的(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物，其是也称为Fluometacyl的1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇。
8.式(I)的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物或其药用盐或溶剂化物、或者这样的盐的溶剂化物作为表面上的生物膜形成的抑制剂的用途，
其中R1是任选地被一个或多个卤素原子取代的C3-5烷基；R2是任选地被一个或多个卤素原子取代的苯基；R3和R4二者都是羟基；R是XOH，其中X是CH2、OCH2CH2或键；
条件是当X是CH2或键时，R1不是丙基；当X是CH2并且R1CH2CH2CF3、丁基或戊基时，R2处的苯基必须被氟取代；当X是OCH2CH2并且R1是丙基时，R2处的苯基必须是被氟取代。
9.根据权利要求8所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，其中R2是被氟原子取代的苯基。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，其中R是OH或OCH2CH2OH。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，其中R是OH。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，所述衍生物选自：
(1R-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-((3,3,3-三氟丙基)硫基)3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(羟基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S-(1α,2α,3β(1R*,2*),5β))-3-(7-((2-(3,4-二氟苯基)环丙基)氨基)-5-(丙硫基)(3H-1,2,3-三唑并(4,5d)嘧啶-3-基)5(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(4-氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)；
1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇；
及其药用盐或溶剂化物，或者其溶剂化物或这样的盐的溶剂化物。
13.根据权利要求8至10和12中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，所述衍生物是也称为Triafluocyl的(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)。
14.根据权利要求8至12中任一项所述的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物的用途，所述衍生物是
也称为Fluometacyl的1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇。
15.一种用于治疗在需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染的方法，所述方法包括向所述宿主施用有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物。
16.根据权利要求15所述的用于治疗的方法，其特征在于所述三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或Triafluocyl。
17.根据权利要求15所述的用于治疗的方法，其特征在于所述三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇或Fluometacyl。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的用于治疗的方法，其特征在于向所述宿主施用的有效量低于1.8g/天。
19.一种用于预防在需要这样的治疗的宿主哺乳动物中的细菌感染的方法，所述方法包括向所述宿主施用有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物。
20.根据权利要求19所述的用于预防的方法，其特征在于所述三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)-1,2-环戊烷二醇)或Triafluocyl。
21.根据权利要求19所述的用于预防的方法，其特征在于所述三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物是1S,2R,3S,4R)-4-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-(丙硫基)-3H-1,2,3-三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-1,2,3-环戊烷三醇或Fluometacyl。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的用于预防的方法，其特征在于向所述宿主施用的有效量低于1.8g/天。
23.一种用于生物膜形成中的杀菌或预防细菌生长的方法，所述方法包括通过施用在表面上来使用有效量的根据权利要求8至14中任一项所述的式(I)的三唑并(4,5-d)嘧啶衍生物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有效量为20至100μg/ml。
25.根据权利要求23至24中任一项所述的用于表面上的生物膜形成中的杀菌的方法，其中所述生物膜形成处于包含多于90x106CFU/cm2的成熟步骤3。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述表面属于生物材料。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述生物材料是心血管装置。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述心血管装置是心脏瓣膜。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述心血管装置是起搏器。
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