CN109674040A - 高活性蛋黄发酵物的生产方法及其产品与应用 - Google Patents

高活性蛋黄发酵物的生产方法及其产品与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性蛋黄发酵物的生产方法,包括:步骤一、将禽蛋打蛋分离,得到蛋黄液,加入木醋液,浸泡搅拌,酶水解,得水解蛋黄液;步骤二、将水解蛋黄液水浴加热,加入明胶,加入儿茶素,恒温搅拌,接种酵母、乳酸菌,得蛋黄发酵液;步骤三、将蛋黄发酵液过滤、均质,调节pH,加热,保温,离心分离,静置分层,去除上层油脂和底层沉淀,冷冻,解冻,水浴加热,在超声波辅助下加入环糊精高速分散,混合,包埋处理,低温冷却静置,离心脱除胆固醇,分离液冷冻干燥,得富含卵磷脂多肽的低胆固醇蛋黄发酵物。本发明还公开了一种高活性蛋黄发酵物及其用途。本发明提取物具有更强的生物活性,能够对人体基础性代谢及免疫系统产生积极的影响。

Description

高活性蛋黄发酵物的生产方法及其产品与应用
技术领域
本发明涉及营养功能性食品与生物发酵领域。更具体地说,本发明涉及一种高活性蛋黄发酵物的生产方法及其产品与应用。
背景技术
我国是鸡蛋生产大国,鸡蛋产量居世界首位,但是我国蛋制品加工业相对滞后,工厂规模小,数量少,禽蛋消费以鲜蛋为主。鲜蛋保质期短,容易变质,而且蛋壳容易破损不方便运输,直接应用于食品行业不方便。全蛋粉作为鲜蛋的理想替代品,将蛋黄加工成蛋粉后,具有使用方便、保质期长、无微生物污染等优点,受到了食品加工行业的欢迎。
现有技术中,蛋黄的酶解通常采用自溶酶水解和外源酶水解,自溶酶水解在食品工业上的应用非常有限,而外源性酶水解由于条件温和,不容易降解蛋白质的结构,很难释放具有生物活性的肽片段,存在营养物质提取率低,营养价值不高的缺陷。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种高活性蛋黄发酵物的生产方法及其产品与应用,其提取物具有更强的生物活性,能够对人体基础性代谢及免疫系统产生积极的影响。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种
(待定稿后补充,内容同权利要求书)
本发明至少包括以下有益效果:
本发明通过酸水解、双重酶水解和发酵及包埋等方法不仅提高了蛋黄营养素的释放,经生物降解和转化后提高了吸收利用率,而且脱除了蛋黄的腥味,具有更高的调节血脂,增强体力、增强免疫力、延寿、防衰老,调经美容、提高骨密度和改善骨质疏松、益智、改善睡眠等多种生物活性,可广泛应用于营养功能性食品、特膳特医食品、保健食品等,也可进一步分离提纯相关营养功能性物质,应用于生物医药领域和食品领域的非医药用途方面。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是,下述实施方案中所述试验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
<实例1>
高活性蛋黄发酵物的生产方法,包括:
步骤一、将禽蛋打蛋分离,得到蛋黄液,加入2倍禽蛋重量的木醋液,浸泡3天,搅拌,在超声波辅助下继续水解12个月至全蛋液均匀无结块,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min,加入1/500倍蛋体质量的脂肪酶或磷脂酶及1/300倍蛋体质量的蛋白酶,脂肪酶来源于米曲霉,磷脂酶为磷脂酶A1、C,蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶,继续酶水解3小时,得水解蛋黄液;
步骤二、将水解蛋黄液置于60℃环境中水浴加热,加入0.01倍水解蛋黄液质量的明胶,恒温搅拌,保持6h,加入0.01倍水解蛋黄液质量的儿茶素,恒温搅拌,保持6h,接种酿酒酵母、乳酸菌,乳酸菌为德式乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌,菌液接种量分别为水解蛋黄液体积的3%,在35℃发酵7天,得蛋黄发酵液;
步骤三、将蛋黄发酵液过滤、均质,用柠檬酸调节pH至5,在25℃下保温5min,以2℃/min的速率加热至60℃,保温5min,以1℃/min的速率加热至100℃,保温5min,离心分离,静置分层,去除上层油脂和底层沉淀,置于-20℃冷冻1h,解冻,置于60℃环境中水浴加热,在超声波辅助下加入环糊精,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min,高速分散,混合,包埋处理,0-5℃低温冷却静置,离心脱除胆固醇,分离液冷冻干燥,得蛋黄发酵物。
<实例2>
高活性蛋黄发酵物的生产方法,包括:
步骤一、将禽蛋打蛋分离,得到蛋黄液,加入2倍禽蛋重量的木醋液,浸泡3天,搅拌,在超声波辅助下继续水解12个月至全蛋液均匀无结块,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min,加入1/500倍蛋体质量的脂肪酶或磷脂酶及1/300倍蛋体质量的蛋白酶,脂肪酶来源于米根霉,磷脂酶为磷脂酶A2、D,蛋白酶为来源于黑曲霉和芽孢杆菌的酸性蛋白酶,继续酶水解3小时,得水解蛋黄液;木醋液经过冷冻-解冻预处理具体为:将木醋液置于-20℃,加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,再加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,置于-20℃,冷冻1h,捣碎,以1℃/min的速率加热至0℃,加入0℃的冰水混合物,使木醋液的浓度达到20wt.%,冷藏1h,即得;
步骤二、将水解蛋黄液置于60℃环境中水浴加热,加入0.01倍水解蛋黄液质量的明胶,恒温搅拌,保持6h,加入0.01倍水解蛋黄液质量的儿茶素,恒温搅拌,保持6h,接种酿酒酵母、乳酸菌,乳酸菌为德式乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或费式丙酸杆菌,接种量为,在35℃发酵8天,得蛋黄发酵液;
步骤三、将蛋黄发酵液过滤、均质,用柠檬酸调节pH至5,在25℃下保温5min,以2℃/min的速率加热至60℃,保温5min,以1℃/min的速率加热至100℃,保温5min,离心分离,静置分层,去除上层油脂和底层沉淀,置于-20℃冷冻1h,解冻,置于60℃环境中水浴加热,在超声波辅助下加入环糊精,超声波作用频率为300Hz,超声时间为20min,高速分散,混合,包埋处理,0-5℃低温冷却静置,离心脱除胆固醇,分离液冷冻干燥,得蛋黄发酵物。
<对比例1>
酶解蛋黄粉的生产方法,同现有技术,简述为包括:原料鲜蛋→感官检验→清洗→带壳消毒→晾蛋→半自动打蛋(弃壳弃蛋清)→蛋白酶处理→加热→离心分离→喷雾干燥→筛分→检验及包装→成品。
<对比例2>
蛋黄发酵物的生产方法,包括:
步骤一、将禽蛋打蛋分离,得到蛋黄液,加入2倍禽蛋重量的木醋液,浸泡3天,搅拌,在超声波辅助下继续水解12个月至全蛋液均匀无结块,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min,加入1/500倍蛋体质量的脂肪酶或磷脂酶及1/300倍蛋体质量的蛋白酶,脂肪酶来源于米根霉,磷脂酶为磷脂酶A2、D,蛋白酶为来源于黑曲霉和芽孢杆菌的酸性蛋白酶,继续酶水解3小时,得水解蛋黄液;木醋液经过冷冻-解冻预处理具体为:将木醋液置于-20℃,加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,再加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,置于-20℃,冷冻1h,捣碎,以1℃/min的速率加热至0℃,加入0℃的冰水混合物,使木醋液的浓度达到20wt.%,冷藏1h,即得;
步骤二、将水解蛋黄液置于60℃环境中水浴加热,加入0.01倍水解蛋黄液质量的明胶,恒温搅拌,保持6h,加入0.01倍水解蛋黄液质量的儿茶素,恒温搅拌,保持6h,接种酿酒酵母、乳酸菌,乳酸菌为德式乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或费式丙酸杆菌,菌液接种量分别为水解蛋黄液体积的3%,在35℃发酵8天,得蛋黄发酵液;
步骤三、将蛋黄发酵液过滤、均质,用柠檬酸调节pH至5,以1℃/min的速率加热至100℃,保温5min,离心分离,静置分层,去除上层油脂和底层沉淀,置于60℃环境中水浴加热,在超声波辅助下加入环糊精,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min,高速分散,混合,包埋处理,冷冻干燥,得蛋黄发酵物。
<对比例3>
水煮蛋黄粉的生产方法,同现有技术,简述为包括:原料鲜蛋→感官检验→清洗→带壳消毒→晾蛋→开水煮制→剥壳(弃壳弃蛋清)→研磨→喷雾干燥→筛分→检验及包装→成品。
<木醋液的预处理功效评价试验>
取实例1、2制备的蛋黄发酵物,用李梦龙发表的《热处理对蛋黄卵磷脂提取的影响》中记载的乙醇提取法提取卵磷脂,精密吸取溶剂法制成蛋黄卵磷脂样品溶液,点在薄层板上,点对照品溶液,按标准曲线向下展开,通过标准曲线计算卵磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量。
表1
试验结果表明,实例2的卵磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量均相对于实例1有所提升,且接近鲜蛋蛋黄,这是因为木醋液为经过冷冻-解冻预处理,能够以较快的速度打破脂蛋白键,促进油脂释放,获得富含磷脂的胶状蛋黄油脂,且相对鲜蛋黄损失小。
<胆固醇脱除评价试验>
将甲醇20mL、三氯甲烷100mL混合均匀,制备成提取液,将邻苯二甲醛50mg、冰醋酸溶解并定容至1000mL,制备成试剂,将胆固醇200mg、冰醋酸溶解并定容至100mL,制备成胆固醇标准液,将实例1、实例2、对比例1各取1g,分别与提取液0.02mL混合均匀,超声提取30min,过滤于10mL具有刻度的带塞试管中,定容至10mL,得蛋黄液,将实例1、实例2、对比例1的蛋黄液与鲜蛋黄液各加入3mL试剂、2mL浓硫酸,混合均匀,在之外分光光度计以空白样调0,分别在560nm处进行比色,计算胆固醇的含量。胆固醇的脱除率=(鲜蛋黄液中胆固醇含量-试验组蛋黄液中胆固醇含量)/鲜蛋黄液中胆固醇含量×100%。
表2
试验结果表明,实例1-2的胆固醇脱除率显著高于对比例1,这是因为在发酵前先进行双重水解、双重包埋,利用界面定位效应促使发酵提升代谢产物的累积量,抑制酸性产物对发酵菌的拮抗作用,加速脱除胆固醇,这是常规的蛋白酶水解蛋黄无法实现的。并且在发酵液中添加环糊精经超声波高速分散和包埋处理,低温冷却静置和离心分离,进一步降低胆固醇含量。
<脂肪酸含量检测试验>
将实例2、对比例1、对比例2的蛋黄进行脂肪提取,然后进行脂肪酸的甲酯化,采用气相色谱进行总脂肪酸及游离脂肪酸进行测定,通过与脂肪酸甲酯标准品对照保留时间进行定性,采用外标法计算各脂肪酸的含量。
表3
试验结果表明,实例2检测出来的脂肪种类多于对比例1、对比例2,这是因为梯度控速升温能够产生较强的脂质降解能力降解脂肪,对脂肪层的冷冻解冻使不饱和脂肪酸在该过程中断裂成短的饱和脂肪酸。
<蛋黄发酵物功效评价试验>
1、抗衰老试验
1.1动物试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠70只,饲养一周后,随机分成空白对照组、模型组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。
空白对照组每日皮下注射300mg/(kg·d)生理盐水;模型组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组每日皮下注射D-半乳糖300mg/(kg·d);
空白对照组和模型组灌胃生理盐水的剂量为150mg/(kg·d),酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为300mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)、20mg/(kg·d),各组均每天灌胃1次,连续处理4周。
摘眼球取血,生理盐水灌流后取肝脏。按照试剂盒的使用方法检测小鼠血清和肝脏组织中的总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,及丙二醛(MDA)的含量,结果如表4所示。
表4
试验结果分析:
模型组与空白对照组相比,模型组的小鼠血清、肝脏中的T-SOD、GSH-Px的酶活力均显著下降,MDA含量显著上升,且差异十分显著,说明衰老小鼠模型造模成功。
由表4可知,与模型组相比,高剂量组和中剂量组均能使血清中T-SOD的酶活力显著提高,使MDA含量明显降低;高剂量组、中剂量组、低剂量组均能使血清中GSH-Px酶活力明显提高。
高剂量组在提升小鼠血清中T-SOD方面显著高于低剂量组,GSH-Px酶活力显著高于中剂量组和低剂量组;对于降低MDA水平,高剂量组、中剂量组、低剂量组之间无显著差异。
高剂量组与酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组相比,高剂量组在提升小鼠血清中T-SOD方面显著高于酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组,GSH-Px酶活力显著高于酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组。
由表4可知,与模型组比较,高剂量组、中剂量组、低剂量组均能使肝脏中的T-SOD、GSH-Px的酶活力显著提高,使MDA含量明显降低。高剂量小鼠肝脏中T-SOD、GSH-Px酶活力显著高于低剂量组;MDA含量高剂量组显著低于低剂量组。
高剂量组与酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组比较,高剂量组的小鼠肝脏中T-SOD、GSH-Px酶活力水平高于酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组,肝脏中MDA含量低于酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组,说明蛋黄发酵物的高剂量组在提高体内抗氧化活力方面优于酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组。
1.2人体试验
选取100人,随机分为给药组和空白对照组,每组50人,给药组男性15人,女性35人,年龄最小45岁,最大62岁,平均53.36岁,空白对照组男性15人,女性35人,年龄最小45岁,最大62岁,平均53.14岁,给药组每天口服实例1制备的蛋黄发酵物7.5g,连续口服4周,空白对照组不服用任何药物,分别测定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)指标,结果如表5所示。
表5
试验结果分析:
给药组和空白对照组的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)在第0周均无明显差异。
给药组在第4周,血清SOD的水平由98.21±8.37U/mL增加至111.27±8.36U/mL,显著提升;血清MDA的水平由7.52±0.70nmol/mL降至5.95±0.66nmol/mL,显著降低。试验组血常规、大小便常规、血生化检查结果均无明显异常,亦未见过敏反应。
2、增强体力和免疫力试验
2.1提高体力试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠70只,饲养一周后,随机分成空白对照组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组,每组10只。
空白对照组每日以150mg/(kg·d)的剂量灌胃蒸馏水,酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为300mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)、20mg/(kg·d),优选中剂量组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d),每天1次,连续30天。
将上述各组小鼠进行负重游泳试验,检测游泳时间,检测肝糖原,检测淋巴细胞A值,检测血清溶血素抗体均值,检测红细胞免疫功能,检测结果如表7所示;
检测淋巴细胞A值的方法:刀豆蛋白A(ConA)诱导的脾淋巴细胞转化试验,即MTT法。在无菌条件下取脾脏,用完全培养基制备脾细胞悬液,取2mL分别接种于细胞培养板上,加入浓度为100mg/L的ConA溶液50μL,另作不加入ConA为对照,均置于37℃的CO2培养箱中培养,直至68h后,加入100μLMTT溶液(50mg/L),继续培养4h后,加入酸性异丙醇终止反应,用E960酶标仪测定A值。
检测血清溶血素抗体均值的方法:
采用摘除眼球法取血,离心分离血清,用生理盐水将血清对倍稀释。分别置于90孔U型血凝板内,进行孵育和观察血球凝集反应结果。
红细胞免疫功能的方法:
小鼠眼底静脉丛采血,用日本CC-180型血球自动计数仪测量白细胞(WBC)的含量。取小鼠眼底静脉丛血1滴于2mL生理盐水中,洗涤离心3次,转速为1000转/5min,并用生理盐水配制成1.25×1010/L的红细胞悬液,用注射器取红细胞悬液和C3b致敏酵母菌悬液(1×1011/L),或未致敏酵母菌悬液(1×1011/L)各5滴,于试管内充分混匀,37℃水浴孵育30min,加10滴生理盐水,稀释混匀,再加0.25%的戍二醛2滴固定。混匀,涂片待干后瑞氏染色,湿片观察,在高倍镜下计数200个红细胞,结合2个以上酵母菌的花环细胞数,算出RBC-C3b受体花环率,即致敏酵母菌悬液,RBC-IC花环率,即未致敏酵母菌悬液。
表6
试验结果分析:
低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组与空白对照组比较,小鼠的负重游泳时间均有明显延长。小鼠肝糖原含量的检测结果,低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组与空白对照组比较差异显著。小鼠脾淋巴细胞增殖反应,结果显示各剂量组无论加与不加ConA的情况,低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组的淋巴细胞A值均明显高于空白对照组,且高剂量组最为显著;小鼠血清溶血素含量测定结果显示,低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组的抗体积数均高于空白对照组,差异显著。
糖原是运动时能量的重要来源,提高糖原的储备量有助于增强耐力和运动能力,有利于抵抗疲劳的产生;提高机体免疫水平。
优选中剂量组、中剂量组、高剂量组与空白对照组比较,WBC和RBC-C3b受体花环率显著提升、RBC-IC花环率显著下降,说明优选中剂量组、中剂量组、高剂量组可以抵抗疲劳的产生和提高小鼠的细胞免疫以及体液免疫功能。
2.2、提高免疫力试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠80只,饲养一周后,随机分成空白对照组、模型组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组,每组10只。
空白对照组每日灌胃150mg/(kg·d)的蒸馏水,模型组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组每日皮下注射75mg/(kg·d)环磷酰胺(CY)生理盐水;
酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为300mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)、20mg/(kg·d),优选中剂量组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d),各组均每天灌胃1次。
2.21对环磷酰胺CY所致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
连续处理7天,在第8天每组小鼠腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液,6h后处死小鼠,消毒腹部,注入汉氏液2.5mL,轻揉小鼠腹部,取腹腔液置于玻片上,玻片下铺湿纱布,37℃培养箱中孵育30min,生理盐水冲去浮着的细胞,瑞氏染液染色、冲洗、凉干,显微镜下观察,计算吞噬百分率和吞噬指数,结果见表7。
2.22对环磷酰胺CY所致免疫抑制小鼠溶血素形成的影响
在灌胃的第1天,每组小鼠腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL免疫,第8天眼眶取血,离心分离血清,用生理盐水按体积比1:100稀释后,取1mL,与5%鸡红细胞混悬液0.5mL和10%补体0.5mL混匀,37℃温育30min,冰水中止反应,取上清液于72-1分光光度计540nm处比色,以不加补体的空白管作对照,结果见表7。
2.23对环磷酰胺CY所致免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响
在灌胃的第1天每组小鼠腹腔注射5%的鸡红细胞生理盐水混悬液0.2mL免疫,第8天灌胃后2h,取脾脏,将3个小鼠脾脏放在一起采用匀浆器匀浆,调节脾细胞浓度为5×106个/mL,取脾细胞混悬液0.5mL加0.2%鸡红细胞混悬液和1:10的豚鼠血清各0.5mL,混匀,37℃温育1h,离心,取上清液于72-1分光光度计,比色,以不加补体的空白管调零点,结果见表7。
2.24对环磷酰胺CY所致免疫抑制小鼠外周血中T细胞百分比和淋巴细胞转化的影响
灌胃的第1至3天,每组小鼠肌注PHA10mg/kg,在第8天灌胃2h后,小鼠剪尾取血,推片,自然风干燥后,浸入预热30min的孵育液中孵育3h,水冲去沉渣,滤低吸干水珠,加入1%孔雀绿染色,冲洗凉干,油镜计算T淋巴细胞百分比。小鼠取血涂片,瑞氏染色,油镜计算淋巴细胞转化率,结果见表7。
表7
试验结果分析:
模型组吞噬百分率和吞噬指数均明显降低,低剂量组、中剂量组、高剂量组、优选中剂量组与模型组比较,均显著提高了免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数;
模型组溶血素和溶血空斑形成OD值显著低于空白对照组,高剂量组、优选中剂量组与模型组比较,可以显著促进溶血素和溶血空斑形成;
模型组外周T细胞百分比和淋细胞转化率均显著低于空白对照组,中剂量组、高剂量组、优选中剂量组与模型组比较,均显著提高免疫抑制小鼠外周T细胞百分比和淋细胞转化率;
上述结果表明,蛋黄发酵物对多环节免疫功能有显著的促进作用,可以促进溶血素和溶血空斑形成,及促进淋巴细胞的转化和提高外周T细胞百分比,显著对抗环磷酰胺所致的免疫功能低下。
3、益智试验
3.1避暗试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠50只,饲养一周后,随机分成空白对照组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组,每组10只。
空白对照组灌胃150mg/(kg·d)的蒸馏水,酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),蛋黄发酵物组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为150mg/(kg·d),优选蛋黄发酵物组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d),每天灌胃1次,连续灌胃30d,第31d开始训练,训练期间继续以相同的剂量灌胃,每天1次,试验时将动物面部背向洞口放入明室,同时启动计时器,动物穿过洞口进入暗室受到电击,计时器自动停止,取出小鼠,记录每只动物从明室进入暗室避电击所需时间,此即潜伏期。24h或48h后重作试验,记录每只动物10min进入暗室次数,即错误次数,结果如表8所示。
表8
试验结果分析:蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与空白对照组比较,进入暗室次数,即小鼠错误次数明显减少;
蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组比较,小鼠错误次数显著减少。
3.2水迷宫试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠50只,饲养一周后,随机分成空白对照组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组,每组10只。
空白对照组灌胃150mg/(kg·d)的蒸馏水,酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),蛋黄发酵物组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为150mg/(kg·d),优选蛋黄发酵物组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d),每天灌胃1次,连续灌胃30d,第31d开始训练,训练期间继续以相同的剂量灌胃,每天1次。迷宫泳道水深15cm,水温25℃,时间限定为120s,在120s内未到终点的动物均记为120s。试验时,将动物放于泳道起点处,同时按下启动键,记录动物到达终点时间和到达终点的动物数,结果如表9所示。
表9
试验结果分析:
蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与空白对照组比较,小鼠出迷宫时间明显减少;
蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组比较,小鼠出迷宫时间显著减少。
4、改善睡眠试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠50只,饲养一周后,随机分成空白对照组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组,每组10只。
空白对照组灌胃150mg/(kg·d)的蒸馏水,酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),蛋黄发酵物组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为150mg/(kg·d),优选蛋黄发酵物组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d),每天灌胃1次,连续灌胃30d。
4.1巴比妥钠阈下剂量催眠实验和睡眠潜伏期试验
末次灌胃30min后,按阈下剂量300mg/(kg·BW)腹腔注射巴比妥钠,注射量为0.1mL/(10g·BW),观察受试物对注射阈下巴比妥钠的小鼠入睡率的影响,末次灌胃30min后,按300mg/(kg·BW)腹腔注射巴比妥钠,注射量为0.1mL/(10g·BW),观察受试物对巴比妥钠对小鼠睡眠潜伏期的影响,结果如表10所示:
表10
试验结果分析:蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与空白对照组比较、酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组比较,可显著改善受试小鼠的睡眠状况,增加注射阈下剂量巴比妥钠小鼠的入睡率,显著缩短注射阈下剂量巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期。
4.2戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间试验
末次灌胃30min后,腹腔注射300mg/(kg·d)戊巴比妥钠,注射量为0.1mL/(10g·BW),以翻正反射消失为指标,记录入睡数量和睡眠时间,结果如表11所示。
表11
试验结果分析:蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与空白对照组比较,睡眠时间显著延长,延长率高达130.4%;蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组与酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组比较,小鼠睡眠时间显著延长。
5、调节血脂试验
选用18-22g的雄性昆明小鼠70只,饲养一周后,随机分成空白对照组、模型组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。
空白对照组每日皮下注射300mg/(kg·d)生理盐水;模型组和给药组每日皮下注射D-半乳糖300mg/(kg·d);
空白对照组和模型组灌胃蒸馏水的剂量为150mg/(kg·d),酶解蛋黄粉组灌胃对比例1制备的酶解蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组灌胃对比例3制备的水煮蛋黄粉,剂量为150mg/(kg·d),高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为300mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)、20mg/(kg·d),优选中剂量组灌胃实例2制备的蛋黄发酵物,剂量为150mg/(kg·d)各组均每天灌胃1次,连续处理30d。
第30d检测血清TC、TG、HDL-C,结果如表12所示。
表12
试验结果分析:与空白对照组比较,模型组在第30d的TC、HDL-C、TG均高于空白对照组,说明造成功;
与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组在第30d的TC、HDL-C、TG均低于空白对照组,说明蛋黄发酵物具有降脂的功能。
6、延寿试验
选取1000只果蝇,随机分成空白对照组、酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组,每周200只,空白对照组饲喂基础培养基,酶解蛋黄粉组饲喂添加有对比例1制备的酶解蛋黄粉的基础饲料,剂量为50mg/(kg·d),水煮蛋黄粉组饲喂对比例3制备的水煮蛋黄粉的基础饲料,剂量为50mg/(kg·d),蛋黄发酵物组饲喂实例1制备的蛋黄发酵物的基础饲料,剂量分别为50mg/(kg·d),优选蛋黄发酵物组饲喂实例2制备的蛋黄发酵物的基础饲料,剂量为50mg/(kg·d),于温度为25℃,湿度为65-75%的条件下,每3d更换一次培养基,记录死亡果蝇的数目,直到全部死亡,计算平均寿命、最高寿命、半数死亡时间,结果如表13所示。
表13
试验结果分析:饲喂相同剂量的全蛋粉、醋蛋粉、蛋黄发酵物、优选蛋黄发酵物后,果蝇的平均寿命、半数死亡时间、最高寿命与空白对照组相比都有所延长,平均寿命的延寿率分别为8.0%、6.4%、16.3%、23.5%。饲喂蛋黄发酵物组、优选蛋黄发酵物组的果蝇的平均寿命与空白对照组相比具有极显著性差异。
7、调经试验
选取6名具有月经紊乱症状的女性,每天服用7.5g实例1制备的蛋黄发酵物,连续服用6个月,记录月经周期,检测血常规和激素水平,结果如表14和表15所示。
表14
表15
试验结果分析:服用蛋黄发酵物对6名女性的月经周期在6个月后都恢复正常,平均周期为(28.32±1.65)d,而且较为整齐。Hb、RBC、T、E2、Cr含量在调治后有明显的改善。
8、美容试验
选取200名具有黄褐斑的人员,随机分为4组,每组50人,其中3组分别为酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组,酶解蛋黄粉组、水煮蛋黄粉组、蛋黄发酵物组分别每人每次服用100g/50kg的全蛋粉、醋蛋粉、蛋黄发酵物,每天两次,服用60d,剩余1组为空白对照组,不服用任何蛋粉类食品,检测60天后,人体静脉血的超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA),结果如表16所示。
评价60天后的疗效,疗效评判标准为:肉眼观察,黄褐斑面积消退90%以上,颜色基本消失,为基本治愈;肉眼观察,黄褐斑面积消退60%以上,颜色明显变淡,为显效;肉眼观察,黄褐斑面积消退30%以上,颜色变淡,为好转;其余为无效,评价结果如表16所示。
表16
表17
试验结果分析:与空白对照组比较,蛋黄发酵物组的SOD的活力显著提升、MOD含量显著下降,说明蛋黄发酵物可以提高SOD的活力,防止体内自由基堆积;
与酶解蛋黄粉组和水煮蛋黄粉组,蛋黄发酵物组显著提高了黄褐斑的基本治愈率和有效率。
9、改善骨质疏松、对生长骨骼代谢和骨密度的影响试验
9.1对生长骨骼代谢和骨密度的影响试验
选用出生4周左右的雄性昆明小鼠50只,随机分成空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、钙饲料组,每组10只。空白对照组饲喂基础饲料,高剂量组、中剂量组、低剂量组灌胃实例1制备的蛋黄发酵物,剂量分别为300mg/(kg·d)、150mg/(kg·d)、20mg/(kg·d),钙饲料组饲喂含500mg/100g饲料的钙饲料,空白对照组不灌胃去离子水,其它组灌胃去离子水,饲养90d。
喂养期间定期称重,喂养90d后处死,剥离出右侧股骨,测量股骨长度,于105℃烘箱中烤至恒重,称量骨干重。用骨密度仪测量股骨中点及股骨远心端骨密度。用原子吸收法测量受试动物的骨钙含量,结果如表18、19、20所示.
表18
表19
表20
试验结果分析:
由表18可知,试验期间各组小鼠的体重均有不同程度的增加,但是同一时期各组小鼠的体重无明显差异,说明蛋黄发酵物不会影响小鼠的正常生长发育。
由表19可知,各组小鼠的股骨长度和股骨重量无明显差异,中剂量组和高剂量组与空白对照组比较,骨钙含量显著增加,说明蛋黄发酵物可以提高小鼠的骨钙含量。
由表20可知,高剂量组、中剂量组、低剂量组与空白对照组比较,股骨中心点密度和骨远心端密度均明显提高,说明蛋黄发酵物可以提高小鼠的骨密度。
9.2改善骨质疏松试验
选取50-60岁、60-70岁、70-80岁各10人,并在服用实例1制备的蛋黄发酵物之前进行痛疼评价,并记录,然后每天服用蛋黄发酵物,每日两次,每次80g,30天后再次进行痛疼评价,并记录,结果如表21所示,其中,评价标准:较好改善:疼痛症状基本消失、骨密度显著增加;一般改善:疼痛症状减轻、骨密度轻微增加;无改善:疼痛症状无改善且骨密度没有增加。
表21
试验结果分析:由表21中可知,各组人群的骨质疏松症状均有不同程度的改善,改善率达60-70%。说明本发明的蛋黄发酵物可以改善关节疼痛,消除关节炎症,补充骨骼营养,增加骨密度,从根本上改善老年性骨质疏松。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.高活性蛋黄发酵物的生产方法,其特征在于,包括:
步骤一、将禽蛋打蛋分离,得到蛋黄液,加入2倍禽蛋重量的木醋液,浸泡3天,搅拌,在超声波辅助下继续水解12个月至全蛋液均匀无结块,加入1/500倍蛋体质量的脂肪酶或磷脂酶及1/300倍蛋体质量的蛋白酶,继续酶水解3小时,得水解蛋黄液;
步骤二、将水解蛋黄液置于60℃环境中水浴加热,加入0.01倍水解蛋黄液质量的明胶,恒温搅拌,保持6h,加入0.01倍水解蛋黄液质量的儿茶素,恒温搅拌,保持6h,接种酵母、乳酸菌,菌液接种量分别为水解蛋黄液体积的3%,在35℃发酵7天,得蛋黄发酵液;
步骤三、将蛋黄发酵液过滤、均质,用柠檬酸调节pH至5,在25℃下保温5min,以2℃/min的速率加热至60℃,保温5min,以1℃/min的速率加热至100℃,保温5min,离心分离,静置分层,去除上层油脂和底层沉淀,置于-20℃冷冻1h,解冻,置于60℃环境中水浴加热,在超声波辅助下加入环糊精,高速分散,混合,包埋处理,0-5℃低温冷却静置,离心脱除胆固醇,分离液冷冻干燥,得蛋黄发酵物。
2.如权利要求1所述的高活性蛋黄发酵物的生产方法,其特征在于,超声波作用频率为300Hz,超声时间为15min。
3.如权利要求1所述的高活性蛋黄发酵物的生产方法,其特征在于,脂肪酶来源于米曲霉或米根霉,磷脂酶为磷脂酶A1、A2、C和/或D,蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或来源于黑曲霉和芽孢杆菌的酸性蛋白酶或中性蛋白酶或碱性蛋白酶。
4.如权利要求1所述的高活性蛋黄发酵物的生产方法,其特征在于,酵母为酿酒酵母,乳酸菌为德式乳杆菌保加利亚亚种、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和/或费式丙酸杆菌。
5.如权利要求1所述的高活性蛋黄发酵物的生产方法,其特征在于,步骤一中,木醋液经过冷冻-解冻预处理具体为:将木醋液置于-20℃,加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,再加入0.5倍木醋液重量的0℃的冰水混合物溶解,搅拌,形成冰晶,置于-20℃,冷冻1h,捣碎,以1℃/min的速率加热至0℃,加入0℃的冰水混合物,使木醋液的浓度达到20wt.%,冷藏1h,即得。
6.高活性蛋黄发酵物,其特征在于,由权利要求1-5任一项所述的生产方法制备。
7.含有高活性蛋黄发酵物的食品,其特征在于,包括权利要求6所述的蛋黄发酵物及食品配料或添加剂,可为营养功能性食品、特膳特医食品、保健食品和食品领域的非医药用途方面。
8.如权利要求7所述的含有高活性蛋黄发酵物的食品在制备预防高血脂的产品中的应用。
9.如权利要求7所述的含有高活性蛋黄发酵物的食品在制备增强体力、增强免疫力、延寿、防衰老的产品中的应用。
10.如权利要求7所述的含有高活性蛋黄发酵物的食品在制备调经美容、提高骨密度和改善骨质疏松、益智、改善睡眠的产品中的应用。
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