CN109642241B - 反式剪接RNA（tsRNA） - Google Patents

Abstract

本发明涉及反式剪接RNA(tsRNA)分子，其包括一个或多个非结构化的结合结构域；涉及包括所述tsRNA的细胞或载体；以及采用所述tsRNA杀死细胞或治疗疾病的方法。

Description

反式剪接RNA(tsRNA)

技术领域

本发明涉及反式剪接RNA(tsRNA)分子，其包括一个或多个非结构化的结合结构域；涉及包括所述tsRNA的细胞或载体；以及采用所述tsRNA杀死细胞或治疗疾病的方法。

背景技术

剪接体介导的RNA反式剪接(SMaRT)是通过反式连接两个不同的前体信使RNA(前mRNA)，或其他可剪接RNA，在核内产生嵌合RNA分子的过程，在输出细胞核后，触发细胞质中嵌合蛋白的形成。这项技术能够用于修复缺陷RNA，例如，通过用完好的外显子置换突变的外显子，或者用功能序列标记内源信息。

然而，基于反式剪接的修复很难实现，因为持久修复需要连续地递送反式剪接RNA或者在基因组整合后内源性地表达反式剪接RNA，它还需要对靶标中预期的剪接位点作精确剪接，并且尽管与常规的顺式剪接具有强烈竞争，它必须足够高效地触发治疗表型。

具有功能序列的基于反式剪接的标记涉及，例如，在活细胞中用来监测基因表达的编码荧光蛋白的RNA，或在自杀基因治疗方法中用于选择性地触发表达异常转录物的细胞死亡的死亡信号。异常转录物可以是患病细胞的生物标志物，例如癌症特异性致癌基因的转录物或病毒转录物。死亡信号的触发可通过a)直接信号，例如毒素，例如白喉或霍乱毒素，b)凋亡基因，例如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，或c)酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)，其在共同递送像更昔洛韦(GCV)这样的药物时触发死亡信号。直接毒素a)或凋亡信号b)能立即触发细胞死亡，遗憾的是，这会增加涉及非特异性靶向或脱靶的风险。这使得这些技术的监管批准成为问题。相反，使用两种组分的结合c)，其本身对细胞无毒，代表了更安全的方法。

作为一种疗法，反式剪接触发的细胞死亡比基于反式剪接的修复更容易实现，因为反式剪接构建体仅需要递送到靶细胞中一次，因此不需要长期表达。此外，可变中靶(alternative on-target)反式剪接(即朝向正确的靶标但涉及该靶标的任何剪接位点的反式剪接)并不是不利的，反而有助于靶标特异性的死亡信号，并且反式剪接不需要高度高效地触发强度足以杀死靶细胞的信号。

基于HSVtk/GCV-系统，我们已经发展了一种高效的基于反式剪接的自杀基因治疗方法。我们已经设计了新的反式剪接RNA用于5’和3’外显子置换(ER)，即，将自杀基因或自杀基因系统组分，例如HSVtk，连接到靶标信息的5’末端或3末’端。我们已经研究了RNA的结构设计来提高反式剪接RNA(tsRNA)的中靶活性和特异性。

发明内容

根据第一方面，本发明提供了一种反式剪接RNA分子，其包括：

至少一个对基因的至少一部分特异的结合结构域，所述基因与待治疗疾病相关或是其生物标志物；

编码至少一种自杀蛋白或作为自杀系统组分的蛋白质的核酸；和

至少一个剪接信号；其中，

所述结合结构域包括含至少25个，更优选地35个，甚至更优选地45个，和最优选地55个或更多的连续非结构化的核苷酸(nt)的结合位点，不具有内部结合和/或自互补序列；并且在所述结合位点内或外，所述结合结构域，当其长度为44个核苷酸或更长时，具有至少一个或多个相对于所述基因错配的核苷酸。

在此提及的与待治疗疾病相关或是其生物标志物的基因是指所述疾病的特征基因，因此当所述疾病发生时，它会专有地或优先存在或表达。

在此提及的作为自杀系统组分的蛋白质是指与至少一个其他分子相互作用的蛋白质，以触发或导致表达所述蛋白质的细胞死亡。

本领域技术人员将理解，tsRNA具有与其结合的基因互补的核苷酸，并且因为它是RNA，将包括核苷酸腺苷、鸟苷、胞苷或尿苷，同样地还有各自的碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶或已知的化学修饰。

本领域技术人员知道，RNA是核苷酸链，但是与DNA不同，它在自然界中通常被发现是折叠到其自身上的单链，这是因为自互补序列的存在使得RNA的某些部分与自身折叠和匹配，形成高度结构化的分子。因此，此处提及的非结构化状态是指在所述结合位点内，RNA核苷酸序列以未折叠链的形式存在的状态。这种链可以是弧形的或弯曲的，但不是折叠的；因此，不存在内部结合或自互补序列。

或者，描述非结构化状态的另一种方式是，所述结合位点包括预期不会折叠成稳定的最低自由能二级结构(形成RNA二级结构的吉布斯自由能ΔG≥0kcal/mol)的序列，或至少比可能的结合结构域的平均结构化程度低(ΔG＞ΔG_平均)。虽然RNAfold表明这种结构为开环，但对于ΔG≥0kcal/mol的结构，mfold不会给出任何结果。

在有利的实施方式中，所述结合结构域(或前mRNA)不会与靶基因完全互补，因此所述结合结构域不会与靶基因形成完美的二聚体，而且通常地，不长于200bp，最通常地，不长于100bp。

在本发明的某些实施方式中，所述结合结构域(包括所述结合位点)包括选自列表的核苷酸序列，所述列表包括：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300或更多个核苷酸，或由其组成。

在本发明的另外某些实施方式中，所述结合结构域包括与所述基因的所述一部分至少有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补的核苷酸序列，所述基因与待治疗疾病相关或是其生物标志物。理想地，所述结合结构域中的错配设置为避免任何包括或不包括所述结合位点在内的、与靶标完全互补的45个核苷酸或更长的延伸，而且理想地从5’或3’末端起至少5个核苷酸。我们认为这些特征最有可能通过抑制反义效应起作用，包括A至I编辑(这可能是细胞核内长双链RNA的形成导致的)。这些特征似乎在3’ER中特别有益。

在某些实施方式中，结合结构域与间隔区序列相邻，特别是当它是短的时候，即，包括结合位点在内少于100个核苷酸，这有助于保持结合结构域的非结构化的性质，因此本领域技术人员知道，tsRNA还包括与所述结合结构域相邻的间隔区序列。

本领域技术人员将理解，能够设计与任何疾病的任何生物标志物相结合的所述结合结构域，而且，鉴于它具有上述的性质，将会发生高效的反式剪接。因此，简单地通过靶标结合结构域的交换，就可以容易地重新编程此处描述的自杀基因治疗构建体或序列，以靶向另外的疾病或患病组织。

在本发明的另外某些实施方式中，所述反式剪接RNA分子包括多个与基因的相同或不同部分互补的所述结合结构域，所述基因与待治疗疾病相关或是其生物标志物。当另外的结合结构域用于基因的相同部分时，我们已经发现它显著改善特异性的中靶反式剪接。当另外的结合结构域用于基因的不同部分或甚至是不同的基因时，我们已经发现它增强反式剪接活性并且改善反式剪接的表型。

实际上，我们已经发现通过设计包括多个靶标结合结构域的反式剪接RNA(tsRNA)，反式剪接预期靶标剪接位点的特异性提高了6倍。此外，或作为前述的替代，我们还发现了在tsRNA中，在结合结构域之外，加入至少一个顺式结合或自结合结构域保护了在没有靶标DNA的情况下的反式剪接位点。多个靶标结合结构域和至少一个所述顺式结合结构域的加入使反式剪接的特异性提高了10倍，使反式剪接的活性提高了2倍以上。因此，在某些实施方式中，所述tsRNA还包括至少一个位于所述结合结构域之外的顺式结合结构域。

在某些进一步的实施方式中，所述tsRNA是5’或3’tsRNA。

当非结构化的时候，错配的靶标结合结构域显著改善了5’和3’外显子置换，3’ER或5’ER可通过增加tsRNA 3’末端的热力学稳定性来改善。这是通过创造高度结构化的3’末端来保证的，通过在其中插入由于自互补序列的存在而折叠或与自身配对的RNA核苷酸链，来形成高度结构化的分子。实施例中，用于插入tsRNA的高度结构化的RNA链是锤头状核酶序列、发夹环形成序列或y形结构形成序列，然而，其他这样的结构是本领域技术人员已知的，因此可以用于此目的。相应地，其他的某些实施方式包括至少一个3’端高度结构化的RNA序列。我们认为该特征最有可能通过稳定反式剪接RNA并保护其免受核糖核酸降解而起作用。该特征似乎在5’ER中特别有益。活性的核酶、发夹环或Y形结构的进一步形成通过在核酶和polyA位点之间插入间隔区而支持。

通过插入由顺式切割三级结构稳定的(第二代)锤头状核酶改善了5’ER，插入的位置在结合结构域和多聚腺苷酸化位点之间，或当使用其他高度稳定的RNA链的时候，就在这些稳定的RNA链和多聚腺苷酸化位点之间。该特征去除了反式剪接RNA的多聚A尾(polyAtail)，其随后不能再输出到细胞质中，增加了其核浓度和反式剪接活性。该特征还避免了用于5’ER的反式剪接RNA在没有反式剪接的情况下被输出、翻译并触发表型。

我们的工作表明，这些经优化的tsRNA高效触发HPV-16或AFP-阳性细胞的死亡。因此，剪接体介导的RNA反式剪接代表了充满前景的在自杀基因治疗方法中触发细胞死亡的治疗策略。

在其他的实施方式中，所述疾病是癌症或病毒感染或细菌感染或获得性遗传疾病，所述获得性遗传疾病由转座元件、辐射、化学物质或未知诱导物触发的突变引起。

在第一个例子中，所述癌症从下组中选择，包括：肝细胞癌(HCC)、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌、黑色素瘤包括恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、默克尔细胞癌、肺癌、细胞膀胱癌、乳腺癌、结肠癌或直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病、急性髓细胞性或髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CML)、慢性髓细胞性或髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(P-TLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、口腔或咽喉癌、口咽癌、胃癌、脑瘤、骨癌和干细胞癌，和确实会受益于本发明所公开的治疗的其它癌症。

在第二个例子中，所述病毒感染从下组中选择，包括：乳头瘤病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、流感病毒、肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)和其他病毒。

在第三个例子中，所述细菌感染从下组中选择，包括：汉赛巴尔通体、土拉热弗朗西斯菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌种(species)、伤寒沙门氏菌、布鲁氏菌种、军团菌种、分枝杆菌种、结核分枝杆菌、诺卡氏菌种、红球菌种、耶尔森氏菌种、脑膜炎奈瑟菌和其他细菌。

在最后一个例子中，所述获得性遗传疾病从下组中选择，包括：神经纤维瘤病1型和2型、麦-奥二氏综合征、杜兴肌营养不良症(DMD)、大疱性表皮松解症、范科尼A型和C型综合征、费城染色体、A型和B型血友病、囊性纤维化、马克尔威尔斯综合征、脂质蛋白脂肪酶缺乏症、B-地中海贫血、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症和其他获得性遗传疾病。

在另一方面，本发明提供了一种药品(medicament)，其包括根据本发明所述的tsRNA，和可选地，至少一种有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的所述自杀系统的进一步的组分。

在另一方面，本发明提供了一种药用组合物，其包括根据本发明所述的tsRNA；可选地，至少一种有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的所述自杀系统的进一步的组分；和适用于人用或兽用的载体。

在前面可选的例子中，所述进一步的组分可以是，例如，更昔洛韦，虽然可以使用其他的已知共组分自杀系统用于细胞死亡。实施例为胞嘧啶脱氨酶-5-氟胞嘧啶、细胞色素P450-异环磷酰胺、细胞色素P450-环磷酰胺和硝基还原酶-5-[氮丙啶-1-基]-2,4-二硝基苯甲酰胺。

在另一方面，本发明提供了包含所述tsRNA的细胞或包含所述tsRNA的载体。

在另外的方面，本发明提供了一种杀死细胞的方法，包括将根据本发明的tsRNA或包含tsRNA的载体转染、脂质转染(lipofect)、转导、电穿孔、核转染或转化进所述细胞，并且可选地，将所述细胞暴露于有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的所述自杀系统的至少一种其他组分中。

在该实施方式中，本发明通常在体外实施。

在另一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，包括将tsRNA或根据本发明的包含tsRNA的载体离体(ex vivo)或体内转染、脂质转染、转导、电穿孔、核转染或转化进患病细胞，并且可选地，将所述细胞暴露于有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的所述自杀系统的至少一种其他组分中。

在另一方面，本发明提供了一种靶向患病细胞的方法，包括局部应用(包括乳膏、凝胶、泡沫、乳液、软膏或气溶胶)、鼻内应用、肺泡应用、系统应用、口服应用、静脉应用、肌内应用、皮下应用、皮肤应用、腹膜内应用，或将根据本发明的tsRNA或含有tsRNA的载体体内注射到肿瘤中，并且，以及可选地，将所述细胞暴露于有效杀死所述细胞的所述自杀系统的其他组分。

在本发明的某些方法中，所述细胞是病毒转化的细胞。通常地，细胞是由下组中选择的病毒转化的，包括：乳头瘤病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、流感病毒、肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和人类免疫缺陷病毒2型(HIV-2)。

在本发明的其他方法中，所述细胞是癌细胞，例如肝细胞癌(HCC)细胞、宫颈癌细胞、阴道癌细胞、外阴癌细胞、阴茎癌细胞、皮肤癌细胞、黑色素瘤细胞包括恶性黑色素瘤细胞、鳞状细胞癌细胞、基底细胞癌细胞、默克尔细胞癌细胞、肺癌细胞、细胞膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌或直肠癌细胞、肛门癌细胞、子宫内膜癌细胞、肾癌细胞、白血病细胞、急性髓细胞性或髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞、慢性淋巴性白血病(CML)细胞、慢性髓细胞性或髓性白血病(CML)细胞、毛细胞白血病(HCL)细胞、T细胞幼淋巴细胞白血病(P-TLL)细胞、大颗粒淋巴细胞白血病细胞、成人T细胞白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、甲状腺癌细胞、鼻咽癌细胞、口腔或咽喉癌细胞、口咽癌细胞、胃癌细胞、脑瘤细胞、骨癌细胞和干细胞癌细胞。理想地，所述细胞是哺乳动物的细胞，而且最通常地，是人的细胞。

在后面的权利要求书中或在本发明前面的说明书中，除了上下文由于明确的语言或必要的含义而另外要求，单词“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变形均在使用范围内，即，指定所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方式中存在或添加其他特征。

本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请，均以引用结合到本文中。不承认任何引用构成现有技术。此外，不承认任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。

本发明的每个方面的优选特征可以与任何其他方面结合起来进行描述。

从以下的实施例中，本发明的其他特征将变得明显。一般而言，本发明扩展到本说明书(包括所附权利要求书和附图)中公开的任何一个新特征或任何新特征的组合。因此，结合本发明的特定方面、实施方式或实施例所描述的特征、整体、特性、化合物或化学部分应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。

此外，除非另有说明，否则本文公开的任何特征可以被用于相同或类似目的的另一特征替代。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数形式包含复数形式。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为考虑复数以及单数。

附图说明

现在将仅以举例的方式参考以下附图来描述本发明的实施方式，其中：

图1通过5’ER和3’ER靶向HepG2组织培养细胞中AFP的细胞死亡信号的反式剪接的检测。(a)插图显示两种反式剪接分子设计用于外显子置换，具有对甲胎蛋白(AFP)的HSVtk死亡信号，通过5’外显子置换(5’ER)或3’外显子置换(3’ER)。5’ER构建体包含编码结构域HSVtk基因，接着是带有5’端供体剪接位点的5’端剪接结构域和50个碱基对的识别AFP基因的内含子3的结合结构域。附上自切割HH Rz以从polyA信号中释放BD。3’ER构建体包含靶向AFP内含子5的50个碱基对BD，接着是3’端剪接信号、P2A和HSVtk编码区。反式剪接成功后，附上蛋白水解切割位点P2A，用于从AFP-HSVtk融合蛋白中切除HSVtk。HSVtk，单纯疱疹病毒胸苷激酶；ISE，内含子剪接增强子；BD，结合结构域；HH Rz，锤头状核酶；BP，分支点；Ppy，聚嘧啶束。(b)定量实时RT-PCR显示，在存在过表达的AFP_E3-E6小基因与5’ER(上图)和3’ER(下图)的情况下，引入反式剪接构建体时，顺式剪接和反式剪接的原始阈值循环(Ct)。使用两组TaqMan探针AFP(用于5’ER时结合在外显子4，而用于3’ER时结合外显子6，左图)和HSVtk(用于5’ER时结合在远端部分，而用于3’ER时结合在近端部分，右图)进行检测。β-肌动蛋白用作内部对照。n＝3，平均值±SEM。(c)进行30+30个循环的常规两步PCR来观察5’(上图)和3’(下图)剪接事件，在1％琼脂糖凝胶上有过表达的AFP，并通过测序确认剪接连接点。C，顺式；T，反式。(b)和(c)虚拟_HepG2显示AFP顺式剪接检测的内源水平(b，左图和c，上部和下部的最后泳道)。(d)和(e)显示当活性5’(d)和3’(e)反式剪接构建体与AFP小基因一起引入时，顺式剪接水平的下降。顺式和反式剪接的原始Ct值代表剪接事件的双分子反应的结果。n＝3，平均值±SEM。(f)针对内源性靶标AFP的剪接事件表示为Ct值。n＝3，平均值±SEM。(g)35+35个循环的常规PCR显示在活性3’ER(上图)和5’ER(下图)中内源C和T的水平。

图2高效反式剪接分子的剪接位点活性、BD序列选择和二级结构。与现有的与靶标完全互补的设计序列BD(以绿色突出显示)相比，用于(a)3’ER(左上图)和(b)5’ER(右上图)的BD被设计为50个碱基长并具有两个靶标(蓝色)错配ΔBD(以红色突出显示)。通过改变Δss1中的BP基序和3’端受体ss来突变剪接位点，或者进一步突变Δss2中用于3’ER(左图)和5’ER(右图)的BP序列，通过改变Δss1中的邻接区域使5’端供体ss保持完整，并进一步通过改变Δss2中的供体位点来突变。3’ΔBD和5’ΔBD活性构建体的相对反式剪接活性是针对活性无错配BD构建体和同时具有ΔBD和BD序列设计的ss突变体进行测试的。具有或不具有靶标错配的(c)具有或不具有靶标错配的3’ER(左上图)和(d)5’ER(右上图)活性BD的RNA二级结构预测(mfold)，与具有两个靶标错配(以红色突出显示)的计算选择的结构化的BD设计及具有ΔBD和BD两种设计的3’ER_BD-opt-inv和5’ER_BD-opt-inv_HH的对比。下图显示p3ER_ΔBD-opt(左)和p5ER_ΔBD-opt_HH(右)的改进BD设计之间的相对反式剪接活性，与在序列和结构方面没有经过计算分析的现有技术的BD设计相比。n＝3，平均值±SEM，使用one-way的显着性检验。

图3在RNA的3’末端改进的稳定性改善了与锤头状核酶切割相关的5’反式剪接。(a)使用特异性茎环引物、正向引物和通用TaqMan探针和反向引物检测具有活性GUC基序的HH Rz相对于无活性ACC基序的切割效率。n＝3，平均值±SEM。(b)RNA二级结构预测(mfold)，三级基序反式切割HH Rz连接在5’反式剪接构建体5’末端的ΔBD和3’末端的polyA。茎Ia、Ib和II的保守基序在框中突出显示，而且将茎III设计为与ΔBD的3’末端完全互补，以产生HH Rz结构。切割基序GUC用剪刀图标来表示。(c)设计的5’反式剪接构建体的示意图，其具有反式剪接RNA的3’末端修饰，在3’末端BD之后具有不同程度的二级结构，接着是活性可切割的HH Rz或无活性的不可切割的HH Rz基序或没有HH Rz结构。(d)与修饰的3’末端RNA反式剪接构建体相比，具有活性HH Rz(黑色)的亲本p5ER_ΔBD_HH的相对反式剪接活性。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是的one-way ANOVA和Tukey post-hoc。(e)具有活性/非活性/无HH RZ、能够/不能自身切割和polyA切割的5’构建体的反式剪接活性与总折叠能(ΔG)之间的相关性。R2，相关系数。n＝3，线性回归分析。

图4考察HSV-tk对AFP基因的特异性反式剪接和可变中靶反式剪接。(a)示意图显示AFP靶标(AFP_E3-E6小基因)和5’ER和3’ER事件。实箭头表示特异性中靶反式剪接，虚箭头表示可变中靶反式剪接事件。使用HSVtk探针的TaqMan定量方法来记录这些事件。红色字体的数字表示使用剪接位点预测算法的供体和受体剪接位点的强度。(b)具有其HH突变体(仅对于p5ER)的亲本p5ER构建体(左)和p3ER构建体(右)和它们的无BD构建体的相对特异性反式剪接和可变中靶反式剪接活性。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是two-wayANOVA和Bonferroni post-hoc。(c)示意图显示了额外的BD设计连同原始3’ERΔBD(浅蓝色)能减少3’ER构建体中可变中靶反式剪接的发生。BD E(深蓝色)结合外显子5的5’ss的下游46个碱基，BD F(粉红色)结合外显子3的5’ss，和BD D(绿色)结合p3ER反式剪接分子的Ppy束。(d)与具有设计用于补充原始ΔBD的额外BD相比，具有单个ΔBD的亲本p3ER的特异性和可变中靶反式剪接活性。每个构建体的特异性因子表示为(特异性ts/可变ts)x100％。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是two-way ANOVA和Turkey post-hoc。(e)示意图显示不具有BD和具有额外BD D的构建体能防止不具有结合结构域特异性的反式剪接。

图5当用过表达的或内源性的AFP靶标成功反式剪接的时候，选择性杀死HSVtk阳性细胞。对选定的(a)3’ER构建体和(b)5’ER构建体进行阿尔玛蓝(Alamar Blue)细胞活力测定，在过表达的AFP(左)和内源AFP(右)方面，用100μM剂量的GCV连续处理6天。(c)含有反式剪接基因和GFP基因的pVAX1中对照和反式剪接单质粒系统的克隆设计，GFP基因用于流式细胞术中细胞凋亡的分析。(d)代表性的流式细胞术数据图像，显示了用于检测在反式剪接之后的膜联蛋白V阳性早期和晚期凋亡细胞的设门(gating)策略。该实施例显示用100μMGCV或无药物处理的阳性HSVtk_GFP对照。(e)在100μM GCV处理后48小时，在过表达和内源性AFP靶标水平，选定的3’ER和5’ER构建体中检测到的细胞凋亡。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是two-way ANOVA和Turkey post-hoc。除了图中所提到的显著性，在过表达靶标组中，与阴性对照AFP_E3-E6_GFP相比，所有的样品除了p3ER_ΔBD_Δss1_GFP之外都是显著的(p＝0.0008至<0.0001)。在内源性的靶标组中，与阳性HSVtk_GFP对照相比，所有的样品都是显著的(p＝0.04至<0.0001)。(f)实施单细胞凝胶电泳来检测经100μM GCV处理后24小时的单独的HepG2细胞的DNA损伤。对有/无GCV给药的选定的构建体的150个彗星进行分析，并记录尾矩。右图显示了放大10倍的代表性的彗星图。落在高于Q3+1.5(IQR)区域内的彗星用点来表示(异常值)。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是的one-way ANOVA和Turkey post-hoc。(g)具有双BD的3’ER的多重反式剪接技术，靶向多于一个HCC标志物，包括HCCA2、CD24和VEGF连同AFP。示意图显示BD1和BD2的安排以同时靶向AFP靶标的内含子5和额外靶标的内含子1。(h)阿尔玛蓝细胞活力测定显示，当在靶标的内源背景中用较低剂量的10μM GCV处理时，与单BD系统相比，具有两个BD的构建体中的反式剪接触发细胞死亡的效果。(a)(b)(h)n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是two-way ANOVA和Bonferronipost-hoc，与虚拟_HepG2(mock_HepG2)进行对比。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001以及****p<0.0001。

图6使用3’ER和5’ER通过反式剪接标记HSVtk死亡信号到HPV16阳性细胞。(a)包含6个早期(E)和2个晚期(L)基因的HPV16基因组图谱示意图显示了病毒细胞用于可变剪接的可用的剪接受体(A)和剪接供体(D)。共设计了6种反式剪接RNA(用于5’ER的5’E6和5’E1b)和(用于3’ER的3’E6、3’E1a、3’E2和3’E5)。红色箭头表示用于检测多个反式剪接事件的RP(5’ER)和FP(3’ER)的位置，而蓝色箭头表示在反式剪接构建体中HSVtk区域的引物的位置。(b)在HPV16阳性小鼠细胞系C3(上图)和人细胞系SiHa(下图)中对3’ER(左图)和5’ER(右图)两者，使用实时RT-PCR定量内源性HPV16靶标的反式剪接事件，并记录为ΔCt值，用β-肌动蛋白归一化。图中某些SD和SA的棒条缺失表示未确定的反式剪接。n＝3，平均值±SEM。(c)当用100μM GCV连续处理6天的时候，对在内源性HPV16阳性细胞系SiHa(左上)、C3(右上)和HPV18阳性人细胞系HeLa(左下)和HPV16/18阴性细胞系HepG2(右下)中的选定的反式剪接构建体进行阿尔玛蓝细胞活力测定。n＝3，平均值±SEM，显著性测试使用的是two-wayANOVA和Bonferroni post-hoc，与虚拟进行对比。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001以及****p<0.0001。

图7RNA二级结构显示3’ER构建体的BD。(a)在BD的上游或下游引入间隔区序列以使它非结构化。(b)亲本3’ER优化的和非结构化的结合结构域(“开放的”以蓝色突出显示)被设计为具有两个与AFP靶标的错配(ΔBD)，并与现有BD设计(不具有靶标错配)进行对比。框内显示两种构建体之间的变化区域，RNA折叠保持不变。(c)(d)选定的3’ER_ΔBD struc1(与非结构化的3’ER_ΔBD-opt重叠3个碱基)和3’ER_ΔBD struc2(3’ER_ΔBD-opt上游的67个碱基和3’ER_ΔBD struc1上游的27个碱基)显示封闭的RNA二级结构对于靶标结合不太理想。(e)设计具有ΔBD或BD的p3ER_opt-inv构建体，分别保持原始的ΔBD或BD并将间隔区改变为具有一些错配的反向重复，从而产生完全结构化的长茎结构，降低反式剪接活性。

图8RNA二级结构显示5’ER构建体的BD。(a)具有优化的和非结构化的BD的亲本5’ER构建体，其设计具有两个与靶标的错配(以红框突出显示)。(b)具有优化的和非结构化的BD的亲本5’ER构建体，其设计不具有与靶标的错配(以绿框突出显示)。(c)p5ER_ΔBD-struc1_HH(与非结构化5’ER_ΔBD-opt_HH重叠9个碱基)显示封闭的BD不太适合最佳结合。(d)(e)p5ER_opt-inv_HH构建体具有(d)ΔBD或(e)BD，其间隔区作为亲本BD的反向互补，用于茎-环结构的形成，减少反式剪接。

图9对过表达的或内源性的AFP靶标的反式剪接成功时的HSVtk阳性细胞的选择性杀死。对用10μM剂量的GCV连续处理6天的选定的(a)3’ER构建体和(b)5’ER构建体中在过表达的AFP(左上)和内源性的AFP(右上)时进行阿尔玛蓝细胞活力测定。在所有构建体中，对于过表达的(左下)和内源性的(右下)AFP水平，测试无药物对照。与虚拟_HepG2相比计算显著性。

图10流式细胞术分析显示反式剪接触发细胞凋亡。(a)示意图为在pVAX1质粒中具有AFP小基因、tsRNA构建体的载体和在pEGFP.C2质粒中具有GFP基因的载体，用于HepG2细胞中的共转染，以分析在FACS中的细胞死亡。反式剪接在选定的(b)3’ER和(c)5’ER构建体中经100μM剂量的GCV处理后48小时触发细胞凋亡。阴性AFP小基因、GFP对照和阳性HSVtk对照与等量的pSUPER空质粒而不是活性ts质粒共转染。相对于(b)p3ER_ΔBD-opt和(c)p5ER_ΔBD-opt_HH亲本构建体计算显著性。(d)代表性流式细胞术的数据图像显示用来区分在反式剪接之后的膜联蛋白V阳性凋亡细胞和GFP阳性细胞的设门策略。显示的样品是用100μMGCV或不用药物处理的阳性HSVtk对照。tsRNA和eGFP质粒的共转染显示单个阳性细胞的不同群体，因此得出结论，共转染是选择经历反式剪接触发细胞死亡的转染阳性细胞的非最佳选择。

图11在内源性水平上具有双靶标的反式剪接。(a)热图显示在多种细胞类型中HCC标志基因的前mRNA和mRNA表达水平，所述细胞类型包括转化细胞HCC阳性和阴性细胞系、外周血单核细胞(PBMCs)和对HCC阴性的原代脂肪细胞。(b)阿尔玛测定显示，经100μM剂量的GCV(左)和不经GCV(右)处理的3’ER中，在内源性的基因水平上具有双靶标的反式剪接。

图12阿尔玛蓝测定显示当用10μM、100μM或不用GCV处理时在HPV16阳性和阴性细胞系中的由HSVtk诱导的细胞死亡。在细胞系(a)HPV16阳性人细胞SiHa、(b)HPV16阳性小鼠细胞系C3、(c)HPV18阳性人细胞系HeLa、(d)HPV16和HPV18阴性人细胞系HepG2中测试靶向E1b和E6的两种5’ER tsRNA构建体和靶向E1a、E2、E5和E6的四种3’ER tsRNA构建体，测试GCV诱导的细胞死亡，持续6天，定期补充药物剂量。

图13用哑铃形DNA最小载体(minimal vector)递送RNA反式剪接。(a)通过ELAN方法从tsRNA质粒合成哑铃载体。示意图为具有所述尺寸的质粒和哑铃载体。使用AFP TaqManrtRT-PCR检测系统测试(b)3’ER和(c)5’ER哑铃载体在等质量和等摩尔的时候相对质粒tsRNA构建体的效率。所有数据代表来自三个独立实验的平均值±SEM。显著性测试使用的是two-way ANOVA和Turkey post-hoc。

具体实施方式

方法和材料

RNA设计：设计的反式剪接构建体结合多个已报导的和新的分子特征来提高活性和靶标特异性。3’ERts剪接构建体由CMV启动子(pEGFP-N1,Clontech acc no.U55762)、随后的与靶标AFP内含子5互补的50个碱基的结合结构域(BD)组成。BD在位置18和19包括两个错配，以抑制可由细胞核中较长的dsDNA触发的潜在反义(as)效应。软件“foldanalyze”(HUSAR,DKFZ)用于在可以针对AFP内含子5的完整的反义RNA结构空间内选择短的非结构化的BD。使用软件工具mfold和RNAfold通过RNA2°结构(最小自由能和质心)预测来确认选定的BD的结构。然后，将这些选定的BD与反式剪接RNA的剩余部分融合，确保BD在融合的时候保持非结构化，而且不会参与碱基配对反式剪接或编码结构域，这是通过实施合适的间隔区实现的。设计选定的3’剪接信号(3’ss)与细胞的顺式剪接位点进行功能性竞争，并由内含子剪接增强子(ISE)(McCarthy,et al.,1998；Konczak,et al.,2000；Yeo et al.,2004)、分支点(BP)(Eul,2006)和多聚嘧啶束(Ppt)(Nobel,et al.,1998；Taggart,et al,2012)支持。HSVtk cds前面是在编码蛋白水解切割位点P2A的序列(Kim,et al,2011)，以保证最初在反式剪接过程中产生的AFP-HSVtk融合蛋白中天然的HSVtk的内源释放。HSVtk基因缺乏起始密码子，只能在反式剪接之后使用靶标信息的翻译起始进行翻译。HSVtk基因配备富含A/G的外显子剪接增强子(ESE)，其通过使用不改变HSV-tk氨基酸序列的退化替代(degenerative alternative)的密码子产生(Fairbrother,et al,2002；Jin et al.,2003)(图7a)。将133个碱基的β-球蛋白微型内含子(pCMVTNT^TM,acc num.AF477200.1)在剪接位点共有基序(3’s CAG/G和5’ss MAG)处引入到HSVtk基因中。SV40 polyA序列(pcDNA3.1,Life Technologies)用于转录终止。

设计5’ERts构建体，其具有与p3ER相同的分子特征，但具有不同的方向，包括翻译信号基序以及CMV启动子。包括所有对真核mRNA翻译重要的结构元件：AFP的原始帽(cap)位点(Gibbs,et al.1987)，随后是共有的Kozak序列GCCRGCCAUGG(Kozak,1995,1999,2005)。在翻译起始信号之后立即是编码结构域HSVtk，包括ESE和微型内含子，随后是5’ss信号(Freund,et al.2005)。以类似的方式设计5’BD，以位置24和25的错配来避免as效应。在BD之后，为了增强递送至细胞核内的BD的切割，掺入锤头状核酶(HH Rz)(Saksmerprome,etal.2004)。HH RZ之后是长间隔区，以将polyA与后面跟着SV40 polyA的核酶隔离。

突变设计：设计3’/5’ΔHSVtk以产生具有2个突变点的全长非活性HSVtk蛋白：在位置115由A变成G(甘氨酸到谷氨酸)，在位置649由G突变为A(组氨酸到精氨酸)(Sasadeusz,et al.1997)。设计3/5'Δss以检查具有活性剪接信号的重要性，ss中的突变应导致减少的ts。3’Δss1将保守的分支点从A变为C，3’Δss2使包括BP在内的6/8个核苷酸改变，并且两种ss都具有突变的AG到TC的受体ss。5’Δss1使7/11个碱基改变，共有供体剪接信号GT完整，而5’Δss2使10/11个碱基改变，包括供体ss从GT到AC的突变。5’ΔHH Rz使保守的切割基序GUC改变为ACA以消除或大幅降低核酶的切割效率。

质粒构建：分别命名为p3ER_ΔBD-opt和p5ER_ΔBD-opt_HH的3’和5’亲本外显子置换(ER)构建体是基因合成的(GeneArt,Regensburg)，并且使用SpeI和BbsI克隆进pVAX1(AddGene)中，将用作主载体以亚克隆反式剪接构建体的剩余部分。由来自NCBI(acc numM16110)中的外显子3-6和内含子3和5(AFP_E3-E6)组成的AFP小基因是基因合成的(GeneArt,Regensburg)，并且使用NheI和KpnI克隆进pVAX1中。HSVtk阳性对照使用SacI和BamHI从p3EL和p5EL表达质粒亚克隆。HSVtk基因(NCBI acc num AF057310)的完整的1136个碱基cds是基因合成的，作为反式剪接构建体的一部分。

总共设计了80个构建体，变化区域是基因合成的或PCR扩增的，并且被亚克隆到p3ER_ΔBD-opt和p5ER_ΔBD-opt_HH亲本或主载体中。p3ER_ΔBD-opt_Δss1和p3ER_ΔBD-opt_Δss2是分别用BbvCI和SacI、NheI和PvuI亚克隆到p3ER_ΔBD-opt内的3’剪接位点突变，以代替野生型ss。类似地，p5ER_ΔBD-opt_HH_Δss1是用BssHII和BbsI克隆到p5ER_ΔBD-opt_HH中。使用巢式PCR方法来合成p5ER_ΔBD-opt_HH_Δss2，以产生所需的5’ss突变并用BssHII和KpnI克隆到主载体中。产生较弱的HSVtk蛋白的3’端和5’端取代突变，即p3ER_ΔBD-opt_ΔHSVtk和p5ER_ΔBD-opt_HH_ΔHSVtk，分别用PvuI和PstI、PstI和NheI克隆进它们的亲本载体中。使用巢式PCR方法产生5’HH Rz突变即p5ER_ΔBD-opt_ΔHH，并用KpnI和BbvCI克隆进亲本载体中。用NheI和BbvCI亚克隆p3ER_BD-opt，用KpnI和BbvCI亚克隆p5ER_BD-opt_HH以产生不具有与靶标错配的BD(现有BD)。p3ER_BD(-)是通过使用NheI和BbvCI从p3ER_ΔBD-opt中去除BD并用相同的RE突出物替换小寡聚体(samll oligo)而产生的。然而，p5ER_BD(-)_HH和p5ER_BD(-)_ΔHH是通过用随机8-mer替换5’BD以结合HH Rz的茎III产生的，用KpnI和BbvCI亚克隆到亲本载体中。不具有HH的p5ER_ΔBD-opt_HH(-)是用KpnI和BbvCI亚克隆的。3’端结构化的BD即p3ER_ΔBD-struc1、p3ER_ΔBD-struc2和p3ER_BD-opt-inv是用NheI和BbvCI亚克隆的。5’端结构化的BD即p5ER_ΔBD-struc1_HH和p5ER_ΔBD-opt-inv_HH是用KpnI和BbsI亚克隆的。更多的用来看RNA 3’末端稳定性的5’ER构建体，像p5ER_ΔBD-opt_hp_HH和p5ER_ΔBD-opt_Y_HH，是使用KpnI和BbsI克隆进亲本中的。额外的用于研究在3’ER中中靶和可变反式剪接特异性的BD，即p3ER_ΔBD-opt_D、p3ER_ΔBD-opt_E、p3ER_ΔBD-opt_F、p3ER_ΔBD-opt_EF、p3ER_ΔBD-opt_DEF和p3ER_BD(-)_D，是用NheI和BbvCI克隆进亲本中的。为了进一步研究这些亚最佳反式剪接构建体在剪接突变体背景下的影响，将它们克隆到p3ER_ΔBD-opt_Δss1和p3ER_ΔBD-opt_Δss2中(用于3’组)和p5ER_ΔBD-opt_HH_Δss1和p5ER_ΔBD-opt_HH_Δss2中(用于5’组)。3’结构化的BD(6种不同的构建体：p3ER_ΔBD-struc1/2/opt-inv_Δss1/2)、3’无错配的BD(2种构建体：p3ER_BD-opt_Δss1/2)和3’无BD(2种构建体：p3ER_BD(-)_Δss1/2)是用NheI和BbvCI克隆的。5’结构化的BD(4种不同的构建体：p5ER_ΔBD-struc1/opt-inv_HH_Δss1/2)、5’无错配的BD(2种构建体：p5ER_BD-opt_HH_Δss1/2)、5’无BDs_wt HH(2种构建体：p5ER_BD(-)_ΔHH_Δss1/2)和5’无BD_mut HH(2种构建体：p5ER_BD(-)_ΔHH_Δss1/2)是使用KpnI和BbvCI克隆的。为了研究亚最佳反式剪接构建体在无错配或现有BD背景下的影响，结构化的BD被做成与靶标完全互补，并用NheI和BbvCI克隆进p3ER_ΔBD-opt中(共3种构建体：p3ER_BD-struc1/2/opt-inv)，用KpnI和BbsI克隆进p5ER_ΔBD-opt_HH中(共2种构建体：p5ER_BD-struc1/opt-inv_HH)。

为了改善总体的反式剪接，构建体被设计成在3’ER背景中同时靶向两种前mRNA(一种针对AFP，和另一种针对HCCA2、CD24或VEGF)，p3ER_ΔBD-opt_AFP+HCCA2和p3ER_ΔBD-opt_HCCA2+AFP是用NheI和BbvCI亚克隆进p3ER亲本载体中的。其他的靶标，即p3ER_ΔBD-opt_AFP+CD24和p3ER_ΔBD-opt_AFP+VEGF，是用EcoRI和BbvCI通过取代用作第二BD的HCCA2进一步亚克隆进p3ER_ΔBD-opt_AFP+HCCA2载体中的。类似地p3ER_ΔBD-opt_CD24+AFP和p3ER__ΔBD-opt_EGF+AFP是用EcoRI和NheI通过取代作为第一BD的HCCA2 BD亚克隆进p3ER_ΔBD-opt_HCCA2+AFP载体中的。对于流式细胞术分析，GFP基因(从pEGFP.C2扩增)是用HindIII和XbaI克隆到pGL3-对照中的，来自pGL3质粒的SV40启动子-GFP-SV40 polyA-SV40增强子盒是用BgIII和SaII克隆到pVAX1-反式剪接载体的自生成的MCS位点中的。pVAX1-AFP阴性对照载体中的GFP盒是用KpnI和BamHI直接克隆的。为了产生靶向HPV16基因的反式剪接构建体，用Bam HI和XhoI消化来自亲本载体p3ER_ΔBD-opt的BD，并用BD E1a和E5替换，来分别产生p3ER_ΔBD-opt_E1a和p3ER_ΔBD-opt_E5。类似地BD E2和E6是用XhoI和XbaI通过替换AFP BD克隆进p3ER_ΔBD-opt中的，以产生p3ER_ΔBD-opt_E2和p3ER_ΔBD-opt_E6。对于5’ER，用酶HindIII和BamHI将包含AFP BD的亲本载体p5ER_ΔBD-opt_HH替换为HPV16 BD E1b，以产生p5ER_ΔBD-opt_E1b_HH，并且用HindIII和BamHI将p5ER_ΔBD-opt_HH(-)载体的AFP BD替换为E6 BD，以形成p5ER_ΔBD-opt_E6_HH(-)。

哑铃(db)结构：使用产生db的ELAN方法从质粒载体中生成用于反式剪接的哑铃。核酸酶辅助的酶促连接(ELAN)是一个三步过程，包括从质粒中消化转录盒，在任一侧连接闭合环，然后进行核酸外切酶处理以消除未封闭的db质粒。

(a)茎环引物的磷酸化

由单个RE位点组成的茎环是通过AIT Biotech(Singapore)合成的，并使用表1显示的反应进行磷酸化：

表1：使用多核苷酸激酶(PNK)进行茎环磷酸化的反应设置

茎环引物为Stem loop-SpeI和Stem-loop-BamHI。

(b)ELAN方法

在ELAN环连接法中，从亲本质粒中直接切除基因表达盒。在连接反应中加入多50倍的茎环以确保大多数基因表达盒可以被加帽。副产物如环二聚体被限制性酶切割并在核酸外切酶处理期间被破坏。反应的详细设置如表2所示。

表2：用ELAN环连接策略来产生反式剪接哑铃的反应设置

生成的哑铃在1％琼脂糖凝胶上跑以确认其完整性。

细胞培养：人肝细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞系(Siha，HeLa)和小鼠宫颈癌细胞系(C3)在温度为37℃并且含5％二氧化碳的潮湿培养箱中用达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(HyClone，Thermo Scientific)进行培养，培养基中补充10％的胎牛血清(HyClone)和1％的青霉素-链霉素。细胞按照要求的密度每3-4天传代一次。

质粒DNA的转染：根据制造商的方案，使用Lipofectamine 3000(仅用于FACS研究)或Lipofectamine 2000，(Life Technologies)将～70-90％融合状态的HepG2细胞在6孔板中转染用于蛋白质印迹、在12孔中转染用于FACS分析、在24孔板中转染用于所有其他分析。在过表达研究中以24孔板形式(500ng:500ng的ts构建体:AFP_E3_E6小基因)共转染或转染总共1μg DNA，在内源性的研究中仅使用1μg ts构建体。对于12孔和6孔形式，总DNA的量分别放大至2μg和4μg。对于FACS实验，将500ng pEGFP-C2质粒与ts和AFP小基因载体一起共转染，来和一些3’ER和5’ER质粒和哑铃进行实验，或GFP融合的ts载体与/不与AFP小基因一起分别用于过表达和内源性研究。

总RNA分离：按照制造商的方案，使用RNeasy plus试剂盒(Qiagen)在转染后24小时分离RNA。使用NanoDrop 2000测量RNA浓度。

cDNA转化和实时RT-PCR：用First Strand SuperScript RTIII(Invitrogen)试剂盒将来自所有样品的500ng RNA用200ng随机六聚体和10uM dNTP转化成cDNA。反应条件为25℃5min，然后50℃2h，并在70℃下酶失活15min。20ng cDNA用作实时RT-PCR的模板。通过为每个顺式和反式剪接检测设计特异性探针和引物组，在ABI 7900HT中进行cDNA的TaqMan定量。在AFP区域设计一组探针；即AFP探针外显子5和AFP探针外显子4，以分别检测3’ER和5’ER顺式和反式剪接。与AFP探针一起检测3’ER顺式剪接的引物为FP afp外显子5(组1)和RP afp外显子6，而对于3’ER反式剪接，是FP afp外显子5(组1)和RP HSVtk。与AFP探针一起检测5’ER顺式剪接的引物为FP afp外显子3和RP afp外显子4(组1)，而对于5’ER反式剪接，是FP HSVtk(组1)和RP afp外显子4(组1)。在远端HSVtk区域设计另一组探针来检测3’ER，称为用于3’ER的HSVtk探针，并且在近端HSVtk区域设计探针来检测5’ER，称为单独用于5’ER反式剪接的HSVtk探针。与HSVtk探针一起检测3’ER反式剪接的引物为FP afp外显子5(组2)和RP HSVtk。与HSVtk探针一起检测5’ER反式剪接的引物为FP HSVtk(组2)和RP afp外显子4(组2)。在过表达研究和内源性研究中的循环次数分别为40次和50次。RT-PCR：使用TaqDNA聚合酶(Fermentas)对cDNA样品进行逆转录PCR，进行60个循环的两步PCR(30+30个循环或35+35个循环)以检测3’和5’顺式和反式剪接并在1％琼脂糖凝胶上观察条带。用于检测3’ER顺式剪接和虚拟(mock)的引物为FP afp外显子5(组1)和RP afp外显子6，用于检测3’ER反式剪接的为FP afp外显子5(组1)和RP HSVtk。用于检测5’ER顺式剪接和虚拟的是引物FP afp外显子3和RP afp外显子4(组1)，用于检测5’ER反式剪接的是引物FP HSVtk(组1)和RP afp外显子4(组1)。为了使特异性反式剪接相对于可变中靶反式剪接可视化，对于特异性ts，使用引物FP afp外显子5(组2)和RP HSVtk扩增p3ER_ΔBD和p3ER_BD(-)cDNA，而对于可变中靶ts，用引物FP afp外显子3和RP HSVtk。对于特异性ts，用引物FP HSVtk(组2)和RPafp外显子4(组2)扩增p5ER_ΔBD_HH和p5ER_BD(-)_HH cDNA，而对于可变中靶ts，用引物FPHSVtk(组2)和RP afp外显子6。

阿尔玛测定：为了检查反式剪接的功能活性，在转染后24小时将药物更昔洛韦(GCV)(Sigma)以10μM、100μM和不含GCV(内部阴性对照)的浓度添加到细胞中，然后在加药之后24小时添加alamarBlue

细胞活力试剂(Thermo Scientific)，持续6天，每天在每次阿尔玛读数之后更换新鲜的培养基和药物。在37℃孵育90分钟后，在230/290nm处测量荧光。按照制造商的方案中所述的设计用于测定的阳性和阴性对照。

单细胞凝胶电泳：也称为彗星试验，在转染后24小时进行10μM GCV给药以检查双链DNA的断裂，并且在药物处理后24小时使用碱性裂解法收获细胞(Olive,et al.,2006)。用10μg/ml的碘化丙啶(Life Technologies)对彗星进行染色，并在荧光显微镜下以10X和20X放大倍数进行分析。对大约150-200个彗星进行了评分/取样。

流式细胞术：为了检查细胞凋亡，在100μM GCV处理后48小时收获细胞，并且根据制造商的方案，在膜联蛋白结合缓冲液中用碘化丙啶和Alexa Fluor 647膜联蛋白V(LifeTechnologies)进行染色。这些样本是基于对GFP呈阳性的单个活细胞群体进行设门的。最终的％凋亡值表示为(早期和晚期凋亡+GCV)-(早期和晚期凋亡-GCV)。

蛋白质印迹：为了检测AFP和HSVtk蛋白，转染后24小时收获细胞，并在10％SDS-PAGE中加载总共50μg蛋白质，转移到PVDF膜上并用5％牛奶(w/v)封闭。将各自的一抗(HSV-tk vL-20山羊多克隆Santa Cruz分类号sc-28038，AFP山羊多克隆Santa Cruz分类号sc-8108和β肌动蛋白(内部对照)兔多克隆Santa Cruz分类号sc-130656)在5％牛奶中于4℃孵育过夜，然后与二抗(HSVtk和AFP抗山羊Santa Cruz分类号sc-2020和β肌动蛋白抗兔SantaCruz分类号sc-2357)孵育2小时。使用Pierce ECL Western Blotting底物(ThermoScientific)对印迹进行化学发光，并在显影仪(BioRad)中显影。

剪接位点的预测：使用软件Alternative Splice Site Predictor(ASSP)(Wang，2006)http://wangcomputing.com/assp/overview.html以及Berkeley DrosophilaGenome Project Splice Site Prediction(BDGP SSP)(Reese,et al.,1997)http://www.fruitfly.org/seqtools/splice.html预测剪接位点的强度和性质，使用默认截止值进行剪接位点预测。为了预测HPV16基因组中剪接位点的性质，基于软件产生的总体评分和置信度，用ASSP来记录构成的或隐藏的剪接受体和供体。选择除了记录的剪接位点之外的具有置信度>0.89且得分>5.5的可变剪接位点和置信度>0.1且得分>7.7的构成的剪接位点(Johansson，2013和Schmitt等，2011)用于反式剪接分析。

结果和讨论

从头设计(De novo)的用于5’和3’外显子置换(ER)的反式剪接RNA触发对过表达或内源性的前mRNA靶标的靶向性反式剪接

本发明涉及新的优化的RNA序列和结构，其设计用于获得较高的反式剪接活性和特异性。我们为5’ER或3’ER设计了亲本反式剪接RNA(tsRNA)，包括以下分子特征(图1a)：首先，计算选择的与AFP前mRNA的内含子3或5互补的长度约为50nt的非结构化的结合结构域(BD)，和在tsRNA分子中保留选定的BD结构的间隔区；第二，剪接结构域，对于5’ER，其由内含子剪接增强子(ISE)和共有的剪接供体(SD)位点(CAG/GT)组成，或对于3’ER，其由ISE、共有的YNYURAC(R嘌呤，Y嘧啶，N任何核苷酸)分支点(BP)序列、广泛的多聚嘧啶束(PPT)和共有的剪接受体(SA)位点(AG/G)组成；第三，编码结构域，包括具有新的增强的外显子剪接增强子(ESE)的优化的HSVtk基因和α-球蛋白微型内含子。

此外，我们用三级结构稳定的锤头状核酶(HHRz)布置用于5’ER的tsRNA(Saksmerprome,et al.2004)，其位于BD的下游，将自身与SV40 polyA位点一起剪切，以触发核RNA的保留，并避免与反式剪接无关的HSVtk表达。通过在核酶和polyA位点之间插入间隔区来支持活性核酶结构的形成。另一方面，用于3’ER的tsRNA配置了P2A蛋白水解切割位点(Kim JH,et al.2011)，其位于剪接受体SA位点的紧邻下游，用于触发嵌合融合蛋白中的HSVtk的蛋白水解释放，这是由反式剪接反应导致的。设计的构建体具有最大的活性。

在结合结构域中加入中间的2nt靶标错配(ΔBD)来避免靶标结合产生长双链核RNA，长双链核RNA可能会触发反义效应，包括通过腺苷脱氨酶作用在RNA上的A至I编辑(ADARs)，这会破坏反式剪接策略。那种方式优化的用于3’或5’ER的BD称为p3ER_ΔBD-opt或p5ER_ΔBD-opt_HH。作为对照，我们设计了用于5’和3’ER的每种两个剪接位点突变体(Δss1和Δss2)、部分非活性的HSVtk突变体(在HSVtk基因的位置115的A至G突变和位置649的G至A突变)和用于5’ER的具有非活性HHRz切割位点的对照(图3a)。为了测试tsRNA，我们设计了用于过表达AFP小基因的载体，包含从外显子3到外显子6(E3到E6)的序列，包括内含子3(I3)和5(I5)但缺乏内含子4(I4)(图1a)。在某些被研究的癌细胞系中检测到内源性的AFPmRNA和蛋白表达，包括肝癌细胞系HepG2、PLC/PRF5、SNU495和CL48和非肝细胞系HEK293T。HepG2细胞用500ng tsRNA+500ng AFP小基因转染，在转染24小时之后分离总细胞RNA，并且反式剪接和顺式剪接的RNA水平均通过使用AFP-特异性的TaqMan探针的实时逆转录PCR(rtRT-PCR)进行定量。额外地用HSVtk-特异性的探针检测反式剪接(图1b)。发现顺式剪接比反式剪接更多，并且与亲本的构建体和HSVtk或HHRz切割位点突变体相比，剪接位点突变体显示出降低的反式剪接活性。在PCR扩增cDNA内的剪接连接点(splice junction)的测序证实了由亲本构建体触发的反式剪接和顺式剪接的准确性，两者都具有AFP小基因和内源转录物(图1c)。在AFP小基因转录物或内源性的AFP前mRNA内或针对上述两者的顺式和反式剪接之间的竞争显示，通过反式剪接能够抑制顺式剪接(图1d,e)。我们也能够检测到针对内源性的AFP前mRNA的成功的反式剪接(图1f)，并且通过cDNA测序证实了它的准确性(图1g)。反式剪接触发的HSVtk蛋白表达是通过蛋白质印迹分析来监控的，并且发现与反式剪接RNA的水平良好相关(图7d，e)。用3’ER构建体检测不到嵌合AFP-HSVtk融合蛋白，指向高效的P2A蛋白水解切割。在5’ER的情况下，与亲本构建体相比，剪接位点突变体触发HSVtk表达水平的降低，说明绝大多数的HSVtk蛋白来自反式剪接，而不是来自泄露的与剪接无关的表达。在3’ER之后仅形成42kDa HSVtk亚型(isoform)，而5’ER和阳性对照表达2种(42kDa和44kDa)HSVtk亚型。

结合结构域的序列和结构设计大大改善3’而不是5’外显子置换

我们研究了BD RNA二级结构在RNA反式剪接中的作用。用我们之前描述的软件工具foldanalyse(Senger,et al.1995)，我们鉴定了能靶向AFP前mRNA的长度为约50nt的最低结构化的BD：对3’或5’ER，分别结合内含子5或内含子3的3ER_BD-opt或5ER_BD-opt(图2，图7b,8a)。作为对照，我们鉴定了具有相当长度的高度结构化的结构域(3ER_BD-struc1、3ER_BD-struc2和5ER_BD-struc1)(图7,8)，它们每一个都与非结构化的结构域重叠。最后，我们设计了另外两种BD，3ER_BD-opt-inv和5ER_BD-opt-inv，通过使用内部反向重复，完全包含有利的BD，3ER_BD-opt和5ER_BD-opt，将它们变成结构化的非有利的BD，但保持与靶标剪接位点的距离。通过连接体或间隔区序列将选定的结合结构域与tsRNA其他的结构域融合，确保选定的BD结构在融合的时候不会改变(图7a)。为了抑制RNA编辑，所有这些BD生成为带有中间2nt靶标错配的不完美(imperfect)靶标结合结构域(ΔBD)。为了考察这些错配产生的影响，我们还分别生成了与非结构化的或大部分结构化的BD完全互补的类似物3ER_BD-opt和5ER_BD-opt或3ER_BD-opt-inv和5ER_BD-opt-inv(图2a,2b)。所有的BD和ΔBD都被克隆进亲本反式剪接载体中。HepG2细胞用反式剪接质粒和AFP小基因共转染，并且在转染后24小时监控反式剪接的活性。在3’ER的情况下，与它的具有3ER_BD-opt、3ER_ΔBD-opt-inv或3ER_BD-opt-inv的类似物相比，具有3ER_ΔBD-opt的tsRNA触发强4倍(p＝0.04)、3倍或30倍(p＝0.04)的反式剪接(图2c)。此外，3ER_ΔBD-opt比3ER_BD-struc1或3ER_BD-struc2更有效4或6倍(p＝0.04)。这些数据显示(i)错配的ΔBD比互补的BD更有效，和(ii)非结构化的BD或ΔBD比结构化的更高效。相反，结合结构域内的RNA二级结构形成的程度和靶标互补性不影响5’ER的活性(图2d)。然而，剪接位点突变体损伤所有构建体的3’和5’ER的活性(图2a,b)。

5’外显子置换与tsRNA 3’末端的热力学稳定性相关。

图1b显示，与它的可切割类似物p5ER_ΔBD-opt_HH相比，具有非活性的HHRz切割基序的构建体p5ER_ΔBD-opt_ΔHH触发更强的反式剪接活性。这是令人惊讶的，因为未切割的RNA包括polyA尾并且预期被输出到细胞质中，由此降低它的核浓度和反式剪接速率。我们通过基于茎环引物的rt-RT-PCR的方法，通过对切割的RNA 3’末端进行定量来考察HHRz的切割(图3a)。这个方法被证实能高效区分完美的引物配对和延展的RNA 3’末端。所观察到的6.2个循环差异表明核酶切割率在90％以上，产生具有非结构化3’末端BD的反式剪接RNA(图3a)。反义RNA的非结构化末端已经被报道与快速靶标结合和降解相关。对于5’ER，在核酶切割之后为了稳定反式剪接RNA的3’末端，我们在BD的下游但在HHRz切割位点的上游，设计了具有茎环(p5ER_ΔBD-opt_hp_HH)或Y形(p5ER_ΔBD-opt_Y_HH)结构的构建体和对照，在对照中，BD后接着是polyA位点，但是缺乏核酶和间隔区(p5ER_ΔBD-opt_HH(-))(图3c)。用mfold来预测核酶切割之前和切割之后的RNA二级结构。所有的5’ER构建体的实验研究表明RNA 3’末端的热力学稳定性(即二级结构形成的吉布斯自由能ΔG)与反式剪接活性之间存在正相关(图3d,e)。在具有突变HHRz切割位点的构建体中观察到最强的反式剪接，所述构建体具有由间隔区和SV40 polyA位点形成的稳定的二级结构，接着是带有末端Y形和茎环结构的构建体和带有3’末端BD的亲本构建体。然而，至今所测量到的最低的反式剪接活性是包含polyA位点但在3’末端缺乏稳定结构的构建体。

多个结合结构域增强靶向反式剪接并且抑制可变中靶反式剪接从而提高3’ER的特异性

为了抑制可变中靶反式剪接和提高反式剪接特异性我们设计了新的用于3’ER的RNA，它具有多个靶标和/或自结合结构域(图4c)。作为对快速靶标结合进行了优化的BD-opt的补充，我们实施了(i)BD-E，使期待的反式剪接位点D2和A更彼此接近，(ii)BD-F，以结合和功能性地阻断可变供体剪接位点D1，和(iii)自结合结构域BD-D，其直接置入BD-opt的上游，在不存在靶标结合的时候掩蔽反式剪接RNA的受体剪接位点A的PPT。此外，我们产生了具有多个BD的构建体，除了BD-opt之外，还分别具有BD E和F或BD D、E和F的p3ER_ΔBD-opt_EF或p3ER_ΔBD-opt_DEF。对于所有的构建体，我们测量了特异性(TSspec)和可变中靶反式剪接(TSalt)的相对活性，并使用方程(1)计算了特异性因子S(图4d)：

S＝TSspec/TSalt*100％ (1)

所有的二级BD均增加了反式剪接的特异性，这反映在特异性因子的增加上。BD-F和更明显的BD-D抑制了特异性的和可变的中靶反式剪接，而BD-E以及BD-E和-F的结合增强了特异性的但抑制了可变的中靶反式剪接。然而，最成功的，是所有三个额外的BD D、E和F的结合，增强了特异性的反式剪接约2倍，并且减少了可变剪接约5倍，因此与亲本构建体相比，表现出了高出10倍的反式剪接特异性。在不具有任何靶标结合结构域的构建体中，内部BD-D抑制了针对强剪接供体D1或中等强供体D2的反式剪接20倍或130倍，推断对任何其他细胞脱靶的反式剪接在相似的程度上被抑制。值得注意的是，在具有通过诱变减弱的剪接位点的BD(-)构建体中观察到相当的反式剪接的减少。

针对过表达的或内源性的AFP前mRNA的反式剪接在人肝癌细胞系中触发死亡

我们选择了单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)和前药更昔洛韦(GCV)的组合作为自杀基因系统。反式剪接将以靶标RNA依赖性的方式触发HSVtk表达，其然后催化GCV磷酸化成其单磷酸酯，随后通过细胞激酶转化为其二磷酸和三磷酸衍生物。然后，有毒的GCV-三磷酸充当脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)类似物，因此在复制期间位于DNA链上，导致链终止和细胞死亡。我们用三种不同的测定法考察了由针对过表达的或内源性的AFP前mRNA的5’或3’ER触发的人肝癌细胞HepG2的死亡。首先，是阿尔玛蓝细胞活力测定。细胞经转染并在转染后24小时向培养基中添加10或100μM GCV，在药物处理后24小时添加阿尔玛染料，并在孵育90分钟后测量荧光。在阿尔玛读数之后，补充培养基和药物，并且该过程连续重复6天。细胞死亡的最高水平，即，在100μM GCV的情况下高达80％(图5a,b)或在10μM GCV的情况下为60到70％(图9)，达到阳性对照的水平，是通过针对过表达的AFP信息的亲本构建体的反式剪接在处理的第6天的时候触发的。同样地，用含有所有四种BD的3’ER构建体和具有突变的HHRz切割基序的5’ER构建体观察到高水平的细胞死亡。具有内源性的AFP RNA的3’ER效率略低。正如预期的那样，较低水平的细胞死亡是通过部分非活性HSVtk突变体、剪接位点突变体和缺乏AFP特异性BD的RNA触发的。在没有GCV的情况下，AFP小基因或反式剪接构建体不触发细胞毒性。第二，为了监控由我们的系统触发的细胞死亡的特异性模式，我们应用了膜联蛋白V/碘化丙啶(PI)细胞凋亡测定。因此，将HepG2细胞转染，用100μM GCV处理48小时，并用流式细胞术进行分析。为了只测定转染的细胞，我们最初将EGFP表达载体连同反式剪接载体和AFP小基因共转染(图10)。与部分非活性构建体或对照相比，活性剪接构建体被发现能触发更高水平的细胞凋亡(高达50％)，但大部分(30％)的凋亡细胞不是EGFP阳性的。为了避免任何与共转染多个质粒相关的缺点，我们将SV40启动子驱动的EGFP基因插入到反式剪接载体、AFP小基因载体和HSVtk载体中，使得细胞可以仅用一种(内源性的靶标)或两种(过表达的靶标)质粒转染(图5c,d,e)。具有优化的BD或多个BD的最具活性的3’ER构建体以及具有活性或非活性切割基序的HHRz的最好的5’ER构建体，在超过40％AFP过表达细胞中触发细胞凋亡。在仅表达内源性AFP的细胞中检测到一半的凋亡细胞。具有突变的HHRz切割位点的5’ER构建体是例外，其触发了相当的高水平的凋亡，其具有内源性的和过表达的AFP。该tsRNA代表完全完整稳定的mRNA，其具有5’帽和3’polyA尾，甚至不经历针对靶标的反式剪接。因此，该tsRNA的高细胞死亡活性可能是由于在不存在反式剪接的情况下的核输出和HSVtk翻译，和/或或者是由于高内源性的稳定性和随后的高反式剪接率，这确实在该RNA中被测量(图3d)。HSVtk/GCV触发的细胞死亡的模式主要报道为涉及DNA双链断裂的细胞凋亡。第三，为了证实大部分细胞是被细胞凋亡杀死的，我们进行了彗星试验，该试验使得部分降解的DNA在单细胞凝胶电泳后可视化。因此，HepG2细胞用反式剪接构建体和AFP小基因共转染，在100μM GCV中孵育，并在24小时之后，将DNA断裂记录为尾矩。该结果与在阿尔玛蓝和膜联蛋白V/PI测定中获得的结果一致：大多数DNA断裂由多个BD或亲本3’ER RNA触发，或者对于5’ER，由含有突变的HHRz切割位点和亲本序列的RNA触发(图5f)。

同时靶向两种内源性的肝癌标志物的反式剪接RNA在低10倍的更昔洛韦剂量下触发增强的细胞死亡

与许多其他的人类疾病一样，肝细胞癌(HCC)的发生是一个多因素、多步骤、复杂的过程，而且单个生物标志物不能准确地指示疾病及其阶段。为了提高本方法的HCC特异性和灵敏度，我们考察了使用不同的BD的同时靶向两种HCC生物标志物的双特异性的(双靶标的)tsRNA。在文献中多种HCC生物标志物已被报道，我们测量了在10种不同的细胞系或细胞中的12种对应的前mRNA和mRNA的丰度(图11)。基于我们测试的细胞系中的丰度、HCC特异性和临床意义，我们选择了三种基因：第一，HCCA2(YY1AP1)，在肝癌患者中上调的HCC相关蛋白；第二，CD24，表面标志物糖蛋白及晚期HCC细胞高侵袭性和转移潜能的标志物；和第三，VEGF，在HCC的肿瘤血管生成中发挥重要作用的细胞因子和淋巴结转移标志物。我们设计了双靶标的反式剪接RNA，考虑了AFP和一种二级靶标BD的全部6种组合，用间隔区序列将BD分隔开，还用阿尔玛蓝细胞活力测定法研究了反式剪接介导的只靶向内源性前mRNA的HepG2细胞死亡(图5g,h)。在10μM GCV的浓度下，与只靶向AFP的构建体相比，所有的双靶标构建体触发显著更高水平的细胞死亡(图5h)；然而，在100μM GCV的浓度下，单或双靶标的构建体显示出相当的效果(图11b)。

HPV-16靶向的自杀RNA特异性地杀死HPV-16转化的组织培养细胞

我们的tsRNA的通用设计有助于将BD与间隔区一起置换以靶向任何感兴趣的前mRNA。我们选择了人乳头瘤病毒16型(HPV-16)作为第二种临床相关靶标。HPV在皮肤和粘膜的角质细胞中建立复制性(productive)感染，引起良性乳头状瘤、癌前病变和癌症。HPV感染是世界范围内最常见的通过性传播的疾病，而且两种高风险类型HPV-16和HPV-18导致约70％的宫颈癌病例。在细胞转化之前，HPV-16基因组整合到宿主细胞基因组中，并且没有办法从受感染的个体中清除病毒DNA。然而，通过自杀基因疗法选择性摧毁受感染的细胞可能代表解决该问题的方法。在HPV感染中，可变剪接产生多种病毒mRNA亚型。我们计算选择了5种最有利的非结构化反义BD(opt_E6、_E1a、_E1b、_E2和_E5)，它们可以导向HPV-16转录物，靶向早期病毒基因E6、E1、E2和E5(图6a)。将选定的长度为46至82nt的BD与保留适当结构的间隔区一起克隆到亲本反式剪接载体中，以产生用于3’ER的4种构建体和用于5’ER的两种构建体。得到的5’ER或3’ER tsRNA中的每一个可以募集多个可变病毒剪接受体或供体位点，其已公布或由我们使用剪接位点预测算法ASSP预测。我们使用rtRT-PCR监控了这些剪接位点在HPV-16转化的细胞系SiHa(人，2个病毒基因组拷贝)和C3(小鼠，多个截短的和完整的病毒基因组拷贝)中用于反式剪接的使用(图6b)。在两种细胞系中，HPV-16转录物非常丰富。然后使用阿尔玛蓝细胞活力测定法和浓度为100μM的GCV，测试5’ER载体和两种最具活性的3’ER构建体E1和E6相对于HSVtk表达载体(阳性对照)触发细胞死亡的潜力。细胞死亡选择性地在HPV-16转化的细胞系SiHa和C3中触发，但不在HPV-18转化的HeLa细胞或HPV阴性细胞系HepG2中触发(图6c，图12)。在SiHa细胞中，所有tsRNA触发的细胞死亡的程度与阳性对照相同；在C3细胞中，3’ER比5’ER更高效。

用于反式剪接分子的细胞递送的简约(minimalistic)哑铃形DNA载体

哑铃形DNA最小载体，或哑铃载体，具有相对于传统质粒载体或病毒载体的若干优点。虽然许多病毒载体充满安全风险，但大得多的质粒可引发副作用，包括免疫毒性，并在原代细胞中遭受转基因沉默。哑铃载体没有这些缺点，并且与质粒相比，在细胞递送、核扩散和基因表达方面更高效。我们首次生成哑铃载体来递送RNA反式剪接。这是通过从质粒中切出反式剪接盒并随后通过连接发夹环结构来封闭末端实现的(图13a)。该方法称为ELAN方法。HepG2细胞用AFP小基因质粒共转染，并给予等摩尔或等质量的哑铃载体。在3’ER的情况下，与质粒相比，等摩尔和等质量的哑铃载体触发更高水平的反式剪接(图13b)。在5’ER的情况下，只有等质量的哑铃DNA显示出更高水平的反式剪接(图13c)。

寡核苷酸、探针和引物列表

寡核苷酸、探针和引物列表

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下划线＝限制酶

小写＝间隔/连接序列

Claims (16)

1. 一种反式剪接RNA分子，其中：

所述反式剪接RNA分子包括至少一个对基因的至少一部分特异的结合结构域，所述基因与待治疗疾病相关；和

至少一个剪接信号；其中，

所述结合结构域长度为55-100 nt，所述结合结构域不具有内部结合和/或自互补序列；

所述反式剪接RNA分子是可发生5'外显子置换的反式剪接RNA或可发生3'外显子置换的反式剪接RNA；

所述可发生5'外显子置换的反式剪接RNA在5'至3'方向包括：CMV启动子、AFP的原始帽位点、Kozak序列GCCRGCCAUGG、编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的编码结构域、5’端剪接结构域、间隔区序列、结合结构域、三级结构稳定的锤头状核酶、间隔区序列和多聚A尾；所述剪接结构域由内含子剪接增强子和共有的剪接供体位点CAG/GT组成；所述结合结构域在位置24和25包含2 nt的靶标错配；所述编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的编码结构域包括外显子剪接增强子和球蛋白微型内含子；

所述可发生3'外显子置换的反式剪接RNA在5'至3'方向包括：CMV启动子、结合结构域、间隔区序列、3’端剪接结构域、P2A蛋白水解切割位点、编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的编码结构域和SV40多聚A尾；所述3’端剪接结构域由内含子剪接增强子、共有的YNYURAC分支点序列、广泛的多聚嘧啶束和共有的剪接受体位点AG/G组成；所述结合结构域在位置18和19包含2 nt的靶标错配；所述编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的编码结构域包括外显子剪接增强子和球蛋白微型内含子；

其中，所述Kozak序列GCCRGCCAUGG中的R表示嘌呤；

所述YNYURAC分支点序列中的Y表示嘧啶，R表示嘌呤，N表示A、U、C和G中任一核苷酸。

2.根据权利要求1所述的反式剪接RNA分子，其中所述反式剪接RNA触发靶标3’外显子置换。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的反式剪接RNA分子，其中所述结合结构域与不同的基因互补，所述基因与待治疗疾病相关。

4.根据权利要求3所述的反式剪接RNA分子，其中，在所述结合结构域之外，所述反式剪接RNA包括至少一个顺式结合或自结合的结构域。

5.根据权利要求4所述的反式剪接RNA分子，其中，在所述结合结构域和所述分子的3’端之外，由于自互补序列的存在，所述反式剪接RNA包括折叠的或与自身配对的高度结构化的RNA序列。

6.根据权利要求5所述的反式剪接RNA分子，其中，间隔区位于所述高度结构化的RNA和polyA位点之间。

7.根据权利要求6所述的反式剪接RNA分子，其中，所述高度结构化的RNA是核酶。

8.根据权利要求7所述的反式剪接RNA分子，其中，所述反式剪接RNA触发靶标5’或3’外显子置换。

9.根据权利要求1所述的反式剪接RNA分子，其中，所述疾病为癌症或病毒感染或细菌感染。

10.一种包含根据权利要求1-9中任一项所述的反式剪接RNA的细胞，所述细胞是哺乳动物的细胞。

11.一种包含根据权利要求1-9中任一项所述的反式剪接RNA的载体。

12.权利要求1-9中任一项的反式剪接RNA分子或权利要求11所述的载体在制备用于杀死患病细胞的药物中的用途，包括脂质转染、转导、电穿孔进所述细胞，并且将所述细胞暴露于有效杀死所述细胞的自杀系统的组分中；

所述细胞为哺乳动物细胞；

所述自杀系统的组分为更昔洛韦。

13.权利要求1-9中任一项的反式剪接RNA分子或权利要求11所述的载体在制备用于治疗疾病的药物中的用途，包括脂质转染、转导、电穿孔进患病细胞，并且将所述细胞暴露于有效杀死所述细胞的自杀系统的组分中；

所述细胞为哺乳动物细胞；

所述自杀系统的组分为更昔洛韦；

所述疾病为癌症或病毒感染或细菌感染。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述细胞是人的细胞。

15.一种药品，其包括根据权利要求1-9中任一项所述的反式剪接RNA或根据权利要求11所述的载体，和至少一种有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的自杀系统的进一步的组分；所述自杀系统的所述进一步的组分为更昔洛韦。

16.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-9中任一项所述的反式剪接RNA或根据权利要求11所述的载体；至少一种有效触发表达所述反式剪接RNA的细胞死亡的自杀系统的进一步的组分；和适用于人用或兽用的载体；所述自杀系统的所述进一步的组分为更昔洛韦。

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