CN109642202A

CN109642202A - 用于软骨组织的封闭式系统培养的方法和装置

Info

Publication number: CN109642202A
Application number: CN201780052867.3A
Authority: CN
Inventors: V.凯斯卡; W.B.格里芬; X.张
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: Globegroup Life Technology Consulting America Co ltd
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: WO2018002091A1; US20180002667A1; CN109642202B; US10287548B2; EP3478820A1; JP6987425B2; JP2019522979A

Abstract

本方法涉及一种功能上封闭的生物反应器的设计和使用，该功能上封闭的生物反应器设计成使组织在加载平台上固定化、培养和成熟。生物反应器可配备有用于组织监测的传感器，其连同刚度数据可提供组织成熟的闭环控制。基于软骨刚度与组织成熟度之间的关系，刚度的测量结果可获取并且用作软骨成熟度的替代物，而无需破坏性测试。

Description

用于软骨组织的封闭式系统培养的方法和装置

技术领域

本文中公开的主题涉及组织培养领域，并且更具体而言，涉及软骨组织培养领域。

背景技术

工程化软骨组织可在研究或医学背景下生长，以用于在各种重建手术时使用，包括用于在与半月板（存在于某些关节中）和椎间盘相关的重建手术中使用。用于工程化软骨组织的当前制作过程典型地包括短暂时段的静态培养，后接工程化组织由单轴压缩加载的机械调节。在实践中，市售的加载装置用于研究规模的应用，并且典型地具有缺点，包括但不限于：对组织结构和有机体的实时监测的缺乏；实时的独立样品测量数据的缺乏；用以获取压缩模量测量结果的破坏性测试。此外，在培养过程中涉及的手动样品处理（例如，对介质进行取样，转移样品，将介质添加至器皿等）引入高的污染机会（即，~10％的失效率）。

随着技术的成熟和从工作台到商业化的过渡，用于培养工程化软骨的改进解决方案将为合乎需要的。

发明内容

在下面概括在范围上与最初要求权利的本主题相称的某些实施例。这些实施例不意图限制要求权利的本主题的范围，而是这些实施例仅意图提供可能实施例的简要概括。实际上，本发明可包含可与在下面阐述的实施例相似或不同的各种形式。

在一个实施方式中，提供一种生物反应器系统。在此类实施方式中，生物反应器系统包括：样品支撑台，其构造成保持各自包含一个或多个组织样品的一个或多个柔性器皿；力测量传感器，其定位成使得在相应的柔性器皿在测量位置处定位在样品支撑台上时，相应的柔性器皿倚靠在力测量传感器上；促动器，其构造成在定位在测量位置处时沿着轴线移动以接合和脱离相应的柔性器皿，使得在接合时，促动器生成位移和对应的位移数据，并且力测量传感器测量力并生成力数据，其中数据用于生成组织刚度测量值。

在又一实施方式中，提供一种用于培养组织样品的方法。根据该方法，组织样品在组织保持器上固定化。固定化的组织样品和组织保持器定位在柔性器皿内。培养介质添加至柔性器皿，并且柔性器皿被密封。柔性器皿定位在加载装置的台上。操作线性促动器，以接触柔性器皿的第一侧，以便在与第一侧相对的柔性器皿的第二侧上生成改变的力传感器读数。

在附加的实施方式中，提供一种生物反应器系统。在此类实施方式中，生物反应器系统包括：样品支撑台，其构造成保持包含组织样品的一个或多个柔性器皿；第一力测量传感器，其定位成使得在包含组织样品的相应的柔性器皿在测量位置处定位在样品支撑台上时，组织样品在第一力测量传感器上方；第二力测量传感器，其在样品支撑台的平面中或者平行于该样品支撑台绕着第一力测量传感器设置，其中第一力测量传感器和第二力测量传感器可在使用中时沿垂直于支撑台的平面的第一方向彼此独立地移动；以及线性促动器，其构造成在相应的柔性器皿的组织样品定位在第一力测量传感器上方时沿着第一方向上的轴线移动，并且与相应的柔性器皿接触并移位该相应的柔性器皿。

附图说明

当参照附图阅读下列详细描述时，将更好地理解本发明的这些和其它的特征、方面和优点，其中相似的标记在所有附图中表示相似的部件，其中：

图1描绘根据本公开的方面的在线性促动器的接合之前的用于在组织培养中使用的加载装置的前剖视图；

图2描绘根据本公开的方面的在由线性促动器接合之后的权利要求1的加载装置的前剖视图；

图3描绘根据本公开的方面的用于在组织培养中使用的加载装置的视图，其具有装置的分开的线性促动器和力传感器的插入放大视图；

图4描绘根据本公开的方面的组织保持器组件的分解视图；

图5描绘根据本公开的方面的组织保持器组件的备选分解视图；

图6描绘根据本公开的方面的组织放置过程的过程流；

图7描绘根据本公开的方面的示出使用线性回归方法确定初始加载位置的图表；

图8描绘根据本公开的方面的组织加载调度器的屏幕的实例；

图9描绘根据本公开的方面的用于构造测量方案的屏幕的实例；

图10描绘根据本公开的方面的用于测量模量的一对同心力传感器的剖视侧和俯视图；

图11描绘根据本公开的方面的用于接触模量测量的参数；

图12描绘根据本公开的方面的剪切模量定义的方面；

图13描绘根据本公开的方面的变换剪切模量定义的方面；

图14描绘根据本公开的方面的用于剪切模量测量的参数；

图15描绘根据本公开的方面的在柔性器皿内的组织样品的正常加载；

图16描绘根据本公开的方面的接触模量测量构造；以及

图17描绘根据本公开的方面的剪切模量测量构造。

具体实施方式

将在下面描述一个或多个特定实施例。为了提供这些实施例的简明描述，可不在说明书中描述实际实施方式的所有特征。应当认识到，在任何这种实际实施方式的开发中，如在任何工程或设计项目中，必须进行许多特定实施决定以实现开发者的特定目的，诸如符合系统相关且商业相关的约束，这可从一个实施方式变化到另一个实施方式。此外，应当认识到，这种开发努力可为复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的普通技术人员而言，将不过是设计、制作和制造的例行工作。

当介绍本发明的各种实施例的元件时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意图表示存在元件中的一个或多个。用语“包括”、“包含”和“具有”意图是包含的，并且表示可存在除了列出的元件之外的附加元件。此外，以下论述中的任何数值实例意图是非限制性的，并且因此附加的数值、范围和百分比在公开的实施例的范围内。

随着与软骨培养相关联的技术的成熟以及从工作台到商业化的过渡，用于封闭式、自动化组织成熟（具有用于更好且更快组织再生的过程中软骨建造的非侵入性评估）的备选解决方案将为有用的。本方法通过并入封闭或功能上封闭的生物反应器来提供对现有软骨培养技术的各种改进，该封闭或功能上封闭的生物反应器设计成使软骨组织在设有刚度测量能力的加载平台（即，构造成将力或负载施加至组织样品的平台）上固定化、培养和成熟。如本文中所使用，用语功能上封闭应当理解为意味着采用的一次性套件可不明确地密封，如在本文中提供的某些实例中更详细地示出的那样。例如，与套件相关联的器皿和/或管可具有端口，其可用于转移液体材料或气体。在液体材料的情况下，端口可支持具有有限或最小风险的材料添加/撤回（例如，无针可擦洗的分解端口或者使用0.2um过滤器）。在入口/出口气体的情况下，可使用0.2um的过滤器。然而，出于本论述的目的，此类端口或其它进入场地的存在与室、导管、袋或理解为功能上封闭的其它套件一致。

生物反应器还可构造成在标准组织培养箱内起作用，或者作为备选，可设计为用于台式培养的“独立”系统。因此，组织成熟可完全自动化，以减少劳动力和由于开放过程而产生的污染的机会。此外，生物反应器可配备有用于组织监测的传感器，其连同刚度数据可提供组织成熟的自动或半自动控制。软骨刚度的原位感测可通过采集样品用于细胞检测、生化测试、成像等而与组织成熟度有关。基于软骨刚度与组织成熟度之间的关系，刚度的测量结果可获取并且用作软骨成熟度的替代物，因此消除对破坏性测试的需要。考虑到这一点，本方法的方面涉及软骨组织在配备有原位刚度测量能力的单轴加载生物反应器中的封闭式系统培养。

经由实例，根据某些实施方式，提供功能上封闭的单轴加载生物反应器系统，其设计用于针对移植手术所设计的软骨组织的培养和成熟，如与关节或背部重建、修复或治疗相关的那些。系统本身包括两个构件——功能上封闭的柔性器皿（例如，具有至少柔性侧壁的容器或袋），其搁置在旋转台上，该旋转台为单轴加载和测量装置（在本文中被称为“加载装置”，其构造成沿着单轴的方向施加负载或加载力）的部分。在一个实施方式中，功能上封闭的无菌器皿具有介质和气体交换端口，以及用于促进内部生长环境的闭环控制的各种传感器，如pH传感器、氧气传感器、温度传感器等。柔性器皿也可设计成允许在培养期间的软骨组织固定化。取决于应用，柔性器皿可设计成提供保持一个（或更多个）患者样品用于自体疗法或者保持多个样品用于同种异体应用的灵活性。

在一个实施方式中，加载装置不仅能够将单轴压缩负载施加至软骨组织，而且还能够测量组织刚度。以该方式，对培养的组织的非破坏性监测可利用仍然在功能上封闭的柔性器皿中的样品执行。这与当前的软骨生物反应器不同，该当前的软骨生物反应器在组织的机械加载期间缺乏原位刚度测量能力。以该方式，独立的样品刚度数据可在样品成熟时获得。分开的线性促动器和力传感器构造（其中力传感器不与线性促动器位移端部搭配）连同工程化一次性柔性器皿，通过最小化柔性器皿的偏转以及其膜刚度的影响来确保精确的刚度测量。生物反应器系统可设计成以便为足够紧凑的，以配合在标准组织培养箱内，但是也可构造成调节一次性柔性器皿内的温度和气体供应的独立台式系统。

如下面更详细地论述的那样，在本方法的某些实施方式中，用户使组织样品在柔性器皿内固定化。在一个实施方式中，组织样品可通过如下来提供在器皿中：（1）使样品3D打印并且将样品放置到独立的组织保持器中；或者（2）将组织直接3D打印到独立的组织保持器上。如本文中所使用，应当理解的是，3D打印包含适合于以增材方式的样品生成（如多层或三维样品的生成）的任何增材制造或沉积方法。在其它实施方式中，组织样品可由其它手段（包括但不限于压缩成型脱细胞基质或其它合适的方法）提供在器皿中。

柔性器皿接着被密封，通过端口填充有所需量的培养介质并且定位到旋转台上。在一个实施方式中，组织样品可在一组径向位置之间移动或旋转，该一组径向位置中的一个构成其中获取线性力和力测量结果的测量位置（即，其中加载样品用于测量的位置）。在一个此类实例中，组织样品可通过使用螺线管将关联的支撑台升高至定位高度并且将台旋转至下一个顺序的样品位置来在位置之间顺序地移动或旋转（如下面更详细地论述），在这一点，台可降低至测量高度。即，在降低时，组织样品倚靠在位于台下方的力传感器（例如，负载单元）上，同时允许组织袋倚靠在台上。将认识到的是，可备选地采用其它位置和移动方案。具体而言，本领域技术人员将认识到的是，除了本文中论述的那些之外，存在多种方法，以用于实现将样品定位在力传感器上且在线性促动器与力传感器之间的作用线中所需的自由度。

在一个实施方式中，线性促动器接着向下移动。取决于实施例，线性促动器可为压电助行器或堆叠型线性马达、音圈型线性马达、液压促动器、导螺杆驱动系统、齿条和小齿轮等。在线性促动器接触组织之前，力传感器（例如，负载单元）读数保持不变。因此，力传感器读数的改变指示使用线性促动器加载组织的开始。该位置记录为初始加载位置。线性促动器接着根据用户输入（例如，加载时间、频率、幅度以及偏移量）循环地加载组织。在加载期间的位移和力可被记录并且用于计算实时刚度。样品在移动至下一个样品之前加载达任何指定的时间段（用户或计算机输入）。过程自身接着重复。

考虑到前面的概述，以下部分提供本方法的某些相关方面的附加详细论述。

加载装置。关于加载装置，在一个实施方式中，加载装置100具有线性促动器102和力传感器104，在加载之前（图1）和在加载之后（图2）的柔性器皿106的背景下，线性促动器102和力传感器104彼此分开并且定位在相对侧上，如图1和图2中所示。在图1和图2的描绘的实例中，线性促动器102与一次性柔性器皿106的顶部加载器盖109接合，并且接着压缩柔性器皿106以施加组织样品的负载。尽管未在图1和图2（或下面论述的图3和图4）中示出，但是可提供控制器（基于处理器和/或呈一个或多个专用集成电路的形式），其与线性促动器102、力传感器104和/或台110中的一个或两个通信，以操作这些构件（如本文中所论述），并且以处理由线性促动器102和力传感器104生成的数据，以计算测量结果和/或导出值（如本文所论述）。

在一个实施方式中，收纳组织和培养介质的一次性柔性器皿106用柔性乙烯-乙酸乙烯酯（EVA）/聚乙烯膜材料构成。其它合适的器皿材料包括但不限于仅EVA以及其它柔性生物相容性膜材料。此外，尽管本实例描述使用基于膜的材料形成的器皿106，但是在其它实施方式中，柔性器皿106可使用吹塑过程、热成型过程或压缩成型过程替代地形成。柔性器皿106的结构在柔性器皿106在来自线性促动器102的压缩之下时允许变形，如图2中所示。柔性器皿106的顶部表面的变形将其反作用力传递至其四侧，其进一步传递到台110上，如由图2中的向下箭头所示。以该方式，柔性器皿106的刚度不影响力传感器读数。力传感器104将仅响应于在顶部加载器108与组织样品132接触时的事件，并且由此组织在压缩之下变形。因此，力传感器读数将为组织上的真实加载力。

具有分开的线性促动器102和力传感器104（例如，负载单元）构造的加载装置100的实施方式在图3中示出，包括示出线性促动器102、力传感器104以及构造成将组织样品保持在柔性器皿106（未示出）内的组织保持器116的放大图示的插图。在图3的描绘的实例中，力传感器104（例如，负载单元）与力传感器刚性延伸杆118相关联，力传感器刚性延伸杆118构造成将施加至组织保持器116的力传输至力传感器。此外，图3描绘旋转马达120（例如，步进马达）和螺线管122组件，其用于在操作期间提升、旋转和降低台110，如本文中所论述。

在一个实施方式中，线性促动器102具有在0.1μm-5μm范围内的分辨率，如0.2μm分辨率。力传感器104可具有在18.0-200mV/N范围内的灵敏度，如90.9mV/N灵敏度。经由实例，与具有90.9mV/N灵敏度的力传感器104结合使用的具有0.2μm分辨率的线性促动器102可精确地测量从10kPa到200kPa范围内的组织刚度，其在典型应用中的在它们的成熟过程中覆盖不同组织类型的范围。如本文中所论述，加载装置100能够实时使用刚度数据来改变加载模式，以便满足设定的目标刚度，例如，加载和卸载时间、频率、幅度以及偏移量。

具有用于软骨组织的组织保持器组件的一次性柔性器皿设计。虽然前面涉及加载装置100，但是现在更详细地论述柔性器皿106。如本文中所论述，在某些实施方式中，单独的组织保持器可收纳一个或多个组织样品。根据某些构造，各个样品可具有组织保持器116，其倚靠在通用板保持器130上，通用板保持器130继而定位在通用板保持器盖131上，如图4和图5中的分解视图中所示。

柔性器皿106（在图6的过程流中示出）在三侧上密封，其中一侧保持开放，以用于组织保持器116插入。在实践中，一次性柔性器皿106及其对应的组织保持器116两者预先γ灭菌。在此类无菌实施方式中，用户将典型地使生物安全柜中的γ灭菌的柔性器皿和组织保持器开放。用户接着将软骨组织132放置在组织保持器116上并且由组织夹134固定其角。与细胞直接接触的柔性器皿106和/或组织保持器116的所有构件将典型地使用生物相容性材料来制作。一旦组织132固定在组织保持器116上，用户就将组织保持器116插入到一次性柔性器皿106中，其步骤在图6的过程流中示出。

在一个实施方式中，如图4和图5中所示，通用板保持器130的不锈钢（例如，不锈钢316）定位销140与组织保持器116中的对应孔对准。可采用嵌入在组织保持器116中的磁体，以附接于通用板保持器130上的钢销，以使组织保持器116相对于板保持器130固定化。在一个实施方式中，嵌入式磁体和钢销两者用环氧树脂（例如，Loctite M-21HP环氧树脂）覆盖，以防止培养物暴露于钢销和磁体。

在一个实施方式中，底部膜材料具有对应的孔，以允许通用板保持器盖131供给穿过底部膜材料。通用板保持器盖131配合到通用板保持器130上的孔中。可应用环氧树脂（例如，M-21 HP环氧树脂），以粘合通用板保持器130、膜，以及通用板保持器盖131。环氧树脂（在存在时）还在膜与通用板保持器盖131之间提供适当的密封。顶部加载器盖109、顶部膜以及顶部加载器108可使用相同或相当的方法粘合在一起。

在组织组件放置在一次性柔性器皿106内之后，用户用条（加热）密封器密封柔性器皿106的开放侧，从而产生密封端部142，如图6的最后步骤中所示。在某些实施方式中，各个一次性柔性器皿106具有至少一个气体交换端口和一个介质交换端口。组织132浸没在介质中（无论是否加载），以允许细胞生长。

如本文中所论述，一次性柔性器皿106具有附接于柔性器皿106的底部表面的一个或多个磁体。这些磁体有助于将柔性器皿保持到台110上。柔性器皿的底板与台110中的孔对准。这确保组织132相对于线性促动器102和力传感器104处于正确的位置。台110将旋转，使得多个组织可关于线性促动器102和力传感器104的固定轴向位置按顺序加载。

如图3中所示，在一个实施方式中，台110由螺线管促动器122提升，螺线管促动器122控制台110的上下运动。台110由旋转马达（例如，步进马达）120旋转，旋转马达120使台110（以及组织搁置在其中的一次性柔性器皿106）在旋转位置之间旋转，如旋转至加载位置。在处于加载位置时，如所示，台110降低，这允许一次性柔性器皿的底板通过力传感器延伸杆118倚靠在力传感器104上。在加载时段（用于组织成熟）期间，线性促动器102下降并且与组织顶部加载器盖109接合，组织顶部加载器盖109与顶部加载器108结合。线性促动器102继续移动组织顶部加载器108，直到其与组织132接触并且施加循环负载。顶部加载器108在卸载时段期间与组织132分离。

经由实例，更详细地描述特定实施例的一个实施方式。在该实例中，存在至少两个空气阻尼器，其用于使否则会高的螺线管122的加速和减速平滑。这确保台110以平缓的方式升高或降低，因此最小化对内部的柔性器皿106和组织132的机械冲击。在将台110降低到位之前，可使用霍尔传感器来验证台110相对于力传感器和线性促动器作用线处于正确的旋转位置。经由实例，在一个实施方式中，存在与组织132所定位的位置的数量相同数量的、嵌入在台110下方的磁体。在给定磁体定位在霍尔传感器（其可固定在静止台基部124中）旁边时，其可确定台110是否移动至正确的位置或者是否被阻止到达正确的位置。在台110被阻止到达正确位置的情况下，将顺序地发生以下事件：（1）霍尔传感器输出将不处于预期状态，（2）程序将被停止，以及（3）程序将输出错误消息以通知用户。滑环连接器可用于在旋转螺线管122（固定至台110）与静止台基部124之间进行电连接。

虽然前述的霍尔传感器实施方式为用于在操作期间使台110旋转的方法的一个实例，但是其它方法也为可能的。例如，代替在各个位置处使用霍尔传感器，可替代地采用具有联接于旋转平台（即，台110）的绝对编码器的旋转马达120。以该方式，即使运动被阻止或者台110被阻止到达最终位置，控制器也将知道。

在一个实施方式中，螺线管驱动器实施峰值保持驱动器电流策略，以降低其功率消耗，并且因此在螺线管促动器122通电时避免过多的热量生成。关于线性促动器102，该促动器可使用自对准特征（如半球107和顶部加载器盖109中的匹配凹陷）与柔性器皿106的顶部加载器盖109联接，这允许在促动器102与柔性器皿106之间的小的未对准。

组织加载器100的起始位置可由多种方法确定，其中的两个实例在本文中论述，但其它方法可同样适合。经由实例，一种方法在本文中被称为“触点”方法。与“触点”方法相关联的步骤如下。首先，用户指定力传感器104输出的阈值电压。线性促动器102以恒定的低速驱动顶部加载器108。利用适当选择的阈值电压，柔性器皿106随着加载器接合柔性器皿而变形，但是只要顶部加载器不触碰组织，变形就将不使力传感器读数超过阈值。一旦顶部加载器108与组织132接触，力传感器104电压就开始增加。在力传感器104输出（或输出的变化）到达用户指定的阈值时，线性促动器102停止，并且该位置存储为该特定组织样品的起始加载位置。“触点”方法可经受由于在力传感器104读数超过阈值时和在线性促动器102位置被记录时之间的延迟而产生的某些误差。

本文中描述的第二种方法称为“回归”方法。在该方法中，由线性促动器102驱动的顶部加载器108驱动至组织132，如“触点”方法中描述的那样。接下来，线性促动器102继续压缩组织样品132，即使力传感器104输出超过用户指定的阈值。存储小的位移上的各个组织样品的线性促动器102和力传感器104输出的位置，并且在力传感器104输出到达指定的上限（可设定为大于阈值）时，线性促动器102停止。线性拟合的斜率和y交叉使用线性促动器位置（x）及其对应的力传感器输出（y）来计算，如图7的线性回归实例中所示。假设组织在加载开始时具有恒定的刚度，在该斜率和y交叉的情况下，计算组织样品132的零加载位置，并且该位置存储为该特定组织样品的起始加载位置。与“触点”方法相比，“回归”方法可由于采用多个力传感器读数及其对应的线性促动器位置并且假设在初始组织偏转期间的线性刚度而具有减小的误差。由于时间延迟而产生的随机误差的可能性可因此降低。

组织加载调度器。虽然前面描述了本方法的各种机械、结构以及操作方面，但待描述的又一方面为调度构件。在一个实施方式中，用户使用组织加载调度器来调度加载顺序和模式，该组织加载调度器以计算机存储和执行的加载应用程序的形式提供。用于一个此类应用的样品屏幕的实例在图8和图9中提供。在该实例中，第一窗口150（图8中示出）最初显示并且在程序运行时提示用户输入。经由这些屏幕和窗口，用户可调度待在某个时间加载的任何特定样品。在描绘的实例中，时间按顺序调度。换句话说，较早的时间将调度在以后时间的前面。在调度应用的控制之下，台110将在到达指定时间时使对应的组织样品132移动至线性促动器102和力传感器104所定位的轴线（即，加载位置）。接着，如果加载被调度，则程序将利用用户输入（频率、幅度以及偏移量）（如果提供的话），并且命令线性促动器102以对应的正弦函数加载组织132。加载停止，并且线性促动器102缩回。在时间到达下一个调度时间时，台110接着将下一个样品移动至加载位置，并且过程重复。

图9示出主程序的显示器152（例如，编程或专用装置的前面板显示器）的附加实例。在一个实施方式中，在程序运行时，用户可中断程序并且执行测量。在一个实施例中，用户可指导系统获得由组织的周期性加载（例如，正弦加载）导出的组织刚度的计算值。附加或备选方案还可用于使用其它加载方案来获取指定数量的测量结果，并且程序将在以调度顺序的加载时段期间自动地存储针对线性促动器102位置和力传感器104输出的至少一部分数据。其它测量方案的实例包括应力松弛和频率扫描。例如，在应力松弛测量背景下，可允许用户为各个应力松弛测量指定给定数量的步骤（例如，三个步骤）、它们相应的位置以及保持时间。在一个实例中，位置和力数据将在整个测量期间自动地记录。类似地，可允许用户为各个频率扫描测量指定一些最大数量（例如，三个）的频率、它们相应的幅度、扫描时间以及偏移量。同样，位置和力数据可在整个测量期间自动地保存。

非破坏性软骨组织模量测量。考虑到前述内容，描述了与非破坏性组织模量测量相关的另外的方面。

确定材料的模量的传统方法包括切割已知的几何样品，并且测试已知几何样品的应力-应变特性。这典型为破坏性的，因为需要特定的样品大小并且因此其通常需要与样品的剩余部分隔离的事实。根据本方法，样品的局部杨氏模量和泊松比在不准备特定样品尺寸的情况下替代地测量，由此避免测试样品与较大样品的物理隔离。根据本方法，杨氏模量和泊松比通过使用接触模量测量结果和剪切模量测量结果两者来确定。在一个实施方式中，两个测量结果可使用设为同心圆柱体的力传感器104A、104B来获取，如图10中所示。具体而言，在描绘的实例中，第一力传感器104A设为嵌套在第二圆柱形力传感器104B内的圆柱形单元104A，第二圆柱形力传感器104B在构造方面为环形的，即，圆柱形环。

参照图10，为了测量接触模量，第一力传感器104A的顶部表面（即，测量表面）保持与第二力传感器104B的顶部表面齐平。线性促动器102使样品132变形，并且第一力传感器104A测量压缩力。

为了测量剪切模量，圆柱形第一力传感器104A相对于台110的表面和第二力传感器104B向下移动。以该方式，凹部相对于第二力传感器104B的测量表面形成，这可由此用于测量剪切力。杨氏模量和泊松比可使用这两个力测量结果导出。在一个实施方式中，测量可例如在不通过膜材料与样品132直接接触的情况下执行。

关于这些值及其计算，接触模量可由以下参数限定，参照图11，以用于描述的背景的图解说明。在该背景下，d为与凹部相关联的竖直位移或距离，并且a为第一力传感器104A的半径，并且v为泊松比。轴向力F_a的定义：

（1）

其中，E*为接触模量：

（2）。

对于钢（此处表示线性促动器触头102）而言，E₁ = 200GPa，v₁ = 0.3，而对于组织样品132而言，E₂ = 10~200kPa，v₂≈0.4。项目比项目低几个数量级。因此，等式（2）可近似为。将代入到（1）中得出：

（3）。

将E₂编写为E并且将v₂编写为v，得出：

（4）。

对于剪切模量的定义，并且参照图12：

（5）

其中G为剪切模量，F_s为剪切力，并且其余参数对应于图12中示出的测量值和概念，如，A对应于样品132的表面面积，F_s对应于剪切力，Δx对应于变形，并且l对应于样品高度。

考虑到这一点，设想将标准剪切构造围绕x轴线回转360°，如图13中所示。在该实例中，图13示出变换的剪切模量，其假设在x轴线上的固定长度（或在x轴线上的零变形）。如果固定轴线变成具有半径为a的固定圆柱体，则剪切模量定义可如图14中示出地构造。剪切模量G可接着由该构造确定。

定义：

（6）。

通过将等式（5）代入到等式（6）中并且提供A = 2πa∙h：

（7）。

求解等式（4）和（7），以用于泊松比ν，得出：

（8）。

将等式（8）代入到等式（7）中，得出：

（9）。

考虑到前述内容，如果构造为已知的（即，如果l、d和h为已知的），则通过测量轴向力F_a、剪切力F_s以及变形Δx，人们可从等式（8）和（9）计算泊松比ν和杨氏模量E。考虑到这一点，并且如以上所提及，轴向力F_a和剪切力F_s可分别从第一圆柱形力传感器104A和第二圆柱形力传感器104B读取。

此外，根据某些实施方式，模量可通过膜材料（即，柔性器皿106）测量，而不与样品132直接接触。例如，图15示出一次性柔性器皿106内的组织样品132的正常加载的构造。如在前述的实例中，组织样品132搁置在组织保持器116上。在描绘的实例中，顶部加载器108连同顶部柱塞170（两者由联接器103A接合）下降并且加载组织132，而不影响组织保持器116下方的力测量。第一力传感器104A和第二力传感器104B的组合读数为总加载力，其可用于确定组织刚度，如以上描述的那样。在某些实施例中，一次性柔性器皿106内的构件由生物相容性材料制成。如可从描绘的实例认识到，在此类实施方式中，膜（即，柔性器皿106）位于组织保持器116和顶部加载器108外，同时仍然能够提供密封。

为了测量组织模量，轴向力（F_a）和剪切力（F_s）两者需要在压缩和剪切构造中测量，如以上论述的那样。轴向力和剪切力在已知构造中的测量结果允许人们生成两个等式（8）和（9），并且求解两个未知数（组织模量和泊松比）。此外，加载和测量部分应当为可移动的，以便分别在已知的区域或长度上施加轴向力和剪切力。为了实现这一点，在一个实施方式中，顶部加载器108的部分（即，顶部可缩回柱塞170）与顶部加载器108的其余部分脱离。同样，在一个此类实施方式中，组织保持器116的部分（即，底部可缩回柱塞172）与组织保持器116的其余部分脱离。在一个此类实施方式中，顶部可缩回柱塞170与线性促动器102的联接器103B接合，并且可与顶部加载器108单独地移动柱塞170。以该方式，随着联接器改变，可能的是，施加轴向力（F_a）和剪切力（F_s）（如以上论述的那样），或者施加组织的正常加载，以用于成熟。顶部可缩回柱塞170至联接器103B的接合可由磁体控制（如图中的北（N）和南（S）极标记所指示）。联接器103B和顶部可缩回柱塞170中的磁体之间的吸引力确保顶部可缩回柱塞170移动，连同由线性促动器102生成的运动。顶部膜106的柔性允许顶部加载器108与顶部可缩回柱塞170之间的相对运动。

为了获得压缩力测量结果，如图16中所示，第一线性促动器102与和正常加载（联接器103A）中的不同的工具（联接器103B）接合，这允许第一线性促动器102仅在顶部可缩回柱塞170上推动。在此类构造中，第一力传感器104A和第二力传感器104B读数的变化可等于轴向力F_a。因此，顶部柱塞170的区域和线性102的位移，结合轴向力F_a，接着用于部分地完成等式（8），其中组织模量和泊松比仍然未知。

如图17中所示，对于剪切测量而言，底部可缩回柱塞172由第一力传感器104A的缩回而向下拉，第一力传感器104A与第二线性促动器102B联接。该布置允许第二力传感器104B测量剪切力F_s。再次，剪切线长度（即，底部可缩回柱塞172所配合的、组织保持器116中的开口的周长）、第一线性促动器102的位移以及剪切力F_s接着用于部分地完成等式（9），其中组织模量和泊松比仍然未知。

在获得两个力测量结果连同其它几何尺寸之后，可使用等式（8）和（9）来计算泊松比和杨氏模量，如以上论述的那样。尽管未在图15-17中示出，但是可提供控制器（基于处理器和/或呈一个或多个专用集成电路的形式），其与线性促动器102、力传感器104和/或台110中的一个或两个通信，以操作这些构件（如本文中论述的那样），并且以处理由力传感器104生成的数据，以计算测量结果和/或导出值（如本文中论述的那样）。应当注意的是，许多实验可以以与本文中描述的类似的方式完成，以获得不同组的测量数据。可应用平均算法来减少单个测量误差并且获得统计上显著的值。

本发明的技术效果包括功能上封闭的生物反应器，其设计成使软骨组织在设有实时刚度测量能力的加载平台（即，构造成将力或负载施加至组织样品的平台）上固定化、培养和成熟。生物反应器可构造成在标准组织培养箱内起作用，或者作为备选，可设计为用于台式培养的“独立”系统。组织成熟可完全自动化，以减少劳动力和由于开放过程而产生的污染的机会。此外，生物反应器可配备有用于组织监测的传感器，其连同实时刚度数据可提供组织成熟的闭环控制，以及以非破坏性方式监测或测量组织成熟度。软骨刚度的在线感测可通过采集样品用于细胞检测、生化测试、成像等而与组织成熟度有关。基于软骨刚度与组织成熟度之间的关系，刚度的测量结果可获取并且用作软骨成熟度的替代物，因此消除对破坏性测试的需要。本方法的方面涉及软骨组织在配备有实时刚度测量能力的单轴加载生物反应器中的封闭式系统培养。

该书面的描述使用实例以公开本发明（包括最佳模式），并且还使本领域技术人员能够实践本发明（包括制造和使用任何装置或系统并且执行任何并入的方法）。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这些其它实例具有不与权利要求的字面语言不同的结构元件，或者如果这些其它实例包括与权利要求的字面语言无显著差别的等同结构元件，则这些其它实例意图在权利要求的范围内。

Claims

1.一种生物反应器系统，包括：

样品支撑台，其构造成保持各自包含一个或多个组织样品的一个或多个柔性器皿；

力测量传感器，其定位成使得在相应的柔性器皿在测量位置处定位在所述样品支撑台上时，所述相应的柔性器皿倚靠在所述力测量传感器上；以及

促动器，其构造成在定位在所述测量位置处时沿着轴线移动以接合和脱离所述相应的柔性器皿，使得在接合时，所述促动器生成位移和对应的位移数据，并且所述力测量传感器测量力并生成力数据，其中所述数据用于生成组织刚度测量值。

2.根据权利要求1所述的生物反应器系统，促动器构造成在操作期间将压缩负载施加至所述柔性器皿内的组织样品。

3.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述样品支撑台包括旋转台，其构造成在所述力测量传感器上方相继地移动多个组织样品。

4.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，至少一个柔性器皿包含多个离散的组织样品，其中所述生物反应器系统能够将各个离散的组织样品单独地定位在所述力传感器上方。

5.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述力测量传感器包括至少一个负载单元。

6.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述线性促动器构造成接合和脱离各个柔性器皿的顶部加载器部分，其中所述顶部加载器部分构造成在由所述线性促动器接合时与组织样品接触。

7.根据权利要求1所述的生物反应器系统，还包括样品位移机构，其构造成旋转所述样品支撑台并且沿着促动器运动轴线线性地升高和降低所述样品支撑台或在所述样品支撑台近侧的所述生物反应器系统的构件。

8.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，由所述线性促动器施加的加载模式基于针对相应的组织样品生成的所述组织刚度测量值而变化。

9.一种用于培养组织样品的方法，包括：

使组织样品在组织保持器上固定化；

将固定化的组织样品和组织保持器定位在柔性器皿内；

将培养介质添加至所述柔性器皿并且密封所述柔性器皿；

将所述柔性器皿定位在加载装置的台上；以及

操作线性促动器以接触所述柔性器皿的第一侧以便在与所述第一侧相对的所述柔性器皿的第二侧上生成改变的力传感器读数。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述柔性器皿包括柔性器皿保持器，其构造成便于所述柔性器皿相对于所述加载装置的自动提升和移动。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述台构造成相对于测量位置移动多个样品。

12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述线性促动器响应于命令输入而与所述柔性器皿接合以生成位移数据和力数据。

13.根据权利要求12所述的方法，包括，基于所述位移数据和力数据来计算组织刚度测量值。

14.根据权利要求9所述的方法，包括，使用增材制造方法来生成放置到所述组织保持器上的所述组织样品或者直接在所述组织保持器上生成所述组织样品。

15.一种生物反应器系统，包括：

样品支撑台，其构造成保持包含组织样品的一个或多个柔性器皿；

第一力测量传感器，其定位成使得在包含组织样品的相应的柔性器皿在测量位置处定位在所述样品支撑台上时，所述组织样品在所述第一力测量传感器上方；

第二力测量传感器，其在所述样品支撑台的平面中或者平行于所述样品支撑台绕着所述第一力测量传感器设置，其中所述第一力测量传感器和第二力测量传感器可在使用中时沿垂直于所述支撑台的平面的第一方向彼此独立地移动；以及

线性促动器，其构造成在所述相应的柔性器皿的组织样品定位在所述第一力测量传感器上方时沿着所述第一方向上的轴线移动并且与所述相应的柔性器皿接触并移位所述相应的柔性器皿。

16.根据权利要求15所述的生物反应器系统，其中，所述第一力测量传感器包括具有圆柱形几何形状的第一力传感器，并且所述第二力测量传感器包括具有圆柱形环几何形状的第二力传感器，使得所述第一力传感器配合在由所述第二力传感器限定的所述圆柱形环内。

17.根据权利要求15所述的生物反应器系统，其中，在所述生物反应器系统的第一测量模式中，所述第一力测量传感器保持与所述样品表面支撑台齐平。

18.根据权利要求17所述的生物反应器系统，其中，在所述第一测量模式中，所述线性促动器构造成将所述组织样品压缩抵靠至少所述第一力测量传感器，以生成压缩力测量值。

19.根据权利要求18所述的生物反应器系统，其中，在所述生物反应器系统的第二测量模式中，所述第一力测量传感器相对于所述样品表面支撑台的顶部表面和所述第二力测量传感器压下以形成凹部。

20.根据权利要求19所述的生物反应器系统，其中，在所述第二测量模式中，所述线性促动器构造成压缩所述组织样品以生成剪切力测量值。

21.根据权利要求20所述的生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统构造成使用所述剪切力和压缩力来计算杨氏模量和泊松比两者。

22.根据权利要求15所述的生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统构造成非破坏性地确定相应的组织样品的杨氏模量和泊松比，而不直接接触所述相应的组织样品。