CN109640986A

CN109640986A - 用于治疗癌症的硫代乙内酰脲雄激素受体拮抗剂

Info

Publication number: CN109640986A
Application number: CN201780051671.2A
Authority: CN
Inventors: G.C.比格南
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2019-04-16
Also published as: KR20190040030A; RU2019108092A; JP2019528290A; AU2017316756A1; RU2019108092A3; WO2018037342A1; CA3034449A1; MA45992A; EP3500259A1; US20190209539A1; BR112019003406A2; MX2019002097A

Abstract

本发明公开了用于治疗和/或改善有需要的受试者包括哺乳动物和/或人中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的化合物、组合物和方法，所述受试者已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)化合物，由上述组成和/或基本上由上述组成，其中R₁、G、R₁₀和R₁₁如本文定义。

Description

用于治疗癌症的硫代乙内酰脲雄激素受体拮抗剂

相关申请的交叉引用

本专利申请以引用方式并入提交于2012年8月30日的美国专利申请13/579,009，其作为美国专利9,108,944授权，该专利为提交于2011年2月16日的专利申请号PCT/US2011/025106的国家阶段，其要求提交于2010年9月30日的美国临时申请号61/388,457、提交于2010年4月28日的61/329,023、提交于2010年2月16日的61/305,082的权益，这些专利中的每一个以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及如本文所定义的式(I)化合物在对其有需要的受试者中治疗和/或改善与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的用途。

背景技术

前列腺癌是男性中最常见的非皮肤恶性肿瘤，也是西方世界癌症中男性死亡的第二大原因(Jemal A,Siegel R,Xu J,Ward E.，“Cancer Statistics”，Cancer J Clin，2010年；第60卷，第277-300页)。作为男性性器官，前列腺的发育受雄激素、AR和雄激素依赖基因的产物的高度调节。在前列腺癌进展的所有阶段期间，该疾病仍然依赖于雄激素。包括AR拮抗剂在内的抗雄激素在治疗上用于逆转肿瘤对雄激素作用的依赖性(Scher H,SawyersC.，“Biology of progressive,castration-resistant prostate cancer:directedtherapies targeting the androgen-receptor signaling axis.”J Clin Oncol(临床肿瘤学杂志)2005；第23卷，第8253-8261页；Tran C,Ouk S,Clegg N,Chen Y,Watson P,AroraV等人，“Development of a second-generation antiandrogen for treatment ofadvanced prostate cancer.”Science 2009；第324卷，第787-790页；Scher H,Fizazi K,Saad F,Taplin M,Sternberg C,Miller K等人，“Increased survival withenzalutamide in prostate cancer after chemotherapy.”N Engl J Med 2012(13)：367：1187-1197)。遗憾的是，甚至第二代高效AR拮抗剂如MDV-3100(恩杂鲁胺，)的功效在许多患者中是短暂的。

AR拮抗剂通过靶向肿瘤细胞信号传导中的关键节点来改变患者护理。然而，与其他针对不同肿瘤适应症的分子靶向癌症治疗一样，通过治疗靶标突变产生的获得性抗性并不少见。这是伊马替尼治疗的慢性粒细胞白血病患者的最好例证，其中ABL激酶突变使白血病细胞对伊马替尼具有抗性。此后开发了多种下一代ABL抑制剂来规避突变并在此环境中具有活性(Gorre M,Mohammed M,Ellwood K,Hsu N,Paquette R,Rao P,Sawyers C.，“Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCRABL gene mutationor amplification.”Science，2001年；第293卷，第876-880页；O’Hare T,Deininger MW,Eide CA,Clackson T,Druker BJ.，“Targeting the BCR-ABL signaling pathway intherapy-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemia.”Clin Cancer Res，2011年，17：212–21)。

重要的是，第二代和第三代AR抑制剂的活性表明该疾病仍然对失调的驱动因素“上瘾”。这导致了在不同抗性状态下靶向相同驱动癌基因的顺序疗法的范例，并且在本文中适用于AR的靶向和AR信号传导的谱系依赖性。

引起受体混杂和这些抗雄激素展现激动剂活性的能力的AR突变可至少部分地解释这一现象。例如，羟基氟他胺和比卡鲁胺分别在T877A和W741L/W741C AR突变体中充当AR激动剂。

在通过AR的过表达导致去势抵抗性的前列腺癌细胞的情况中，已证实某些抗雄激素化合物诸如比卡鲁胺具有混合的拮抗剂/激动剂属性(Tran C,Ouk S,Clegg N,Chen Y,Watson P,Arora V等人，“Development of a second-generation antiandrogen fortreatment of advanced prostate cancer.”Science 2009；第324卷，第787-790页)。这种激动剂活性帮助解释被称为抗雄激素戒断综合征的临床观察结果，因为该综合征，使用AR拮抗剂仍进展的男性中约有30％当治疗停止时经历了血清PSA的下降(Scher,H.I.andKelly,W.K.，J Urol，1993年3月；149(3):607-9)。抗雄激素戒断后前列腺特异性抗原下降：氟他胺戒断综合征。

积累的证据表明，去势抵抗性前列腺癌(CRPC)仍然依赖于通过AR信号传导再激活的AR信号传导(Yuan X,Balk S.，“Mechanisms mediating androgen receptorreactivation after castration.”Urol Oncol 2009；第27卷，第36-41页；Linja M,Savinainen K,O,Tammela T,Vessella R,Visakorpi T.，“Amplification andoverexpression of androgen receptor gene in hormone-refractory prostatecancer.”Cancer Res，2001年，第61卷，第3550-3555页；Chen C,Welsbie D,Tran C,BaekS,Chen R,Vessella R,Rosenfeld M,Sawyers C.，“Molecular determinants ofresistance to antiandrogen therapy.”NatMed 2004，10(1):33-9)。AR的配体结合结构域(LBD)中的点突变占抗性的10％-20％，其特征在于抗雄激素药物的受体活化而非抑制(Beltran H,Yelensky R,Frampton G,Park K,Downing S,MacDonald T等人，“Targetednext-generation sequencing of advanced prostate cancer identifies potentialtherapeutic targets and disease heterogeneity.”Eur Urol 2013；第63卷第5期，第920-926页；Bergerat J,C é raline J.，“Pleiotropic functional properties ofandrogen receptor mutants in prostate cancer.”Hum Mutat 2009；30(2):145-57)。这些突变中的许多突变扩大了配体特异性，并且一些通过将AR拮抗剂转化为突变体受体的激动剂来赋予抗性(Veldscholte J,Ris-Stalpers C,Kuiper GG,Jenster G,Berrevoets C,Claassen E,van Rooij HC,Trapman J,Brinkmann AO,Mulder E.，“A mutation in theligand binding domain of the androgen receptor of human LNCaP cells affectssteroid binding characteristics and response to anti-androgens.”BiochemBiophys Res Commun.1990年；第173卷，第534-540页；Haapala K,Hyytinen E,Roiha M,Laurila M,Rantala I,Helin H,Koivisto P.，“Androgen receptor alterations inprostate cancer relapsed during a combined androgen blockade by orchiectomyand bicalutamide.”Lab Invest，2001年；第81卷第12期，第1647-1651页；Hara T,Miyazaki J,Araki H,Yamaoka M,Kanzaki N,Kusaka M,Miyamoto M.，“Novel mutationsof androgen receptor:a possible mechanism of bicalutamide withdrawalsyndrome.”Cancer Res，2003年；第63卷第1期，第149-153页)。

最近显示，一种突变，即在AR的第876位从苯丙氨酸变为亮氨酸(F876L)，响应于在临床前模型和接受ARN-509治疗的患者中的MDV-3100和ARN-509而出现(Clegg N,Wongvipat J,Joseph J,Tran C,Ouk S,Dilhas A等人，“ARN-509:a novel antiandrogenfor prostate cancer treatment.”Cancer Res，2012年；第72卷第6期，第1494-1503页；Balbas M,Evans M,Hosfield D,Wongvipat J,Arora V,Watson P等人，“Overcomingmutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.”Elife，2013年，2:e00499；Korpal M,Korn J,Gao X,Rakiec D,Ruddy D,Doshi S等人，“An F876Lmutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance toMDV3100(enzalutamide).”Cancer Discov，2013年；第39卷，第1030-1043页；Joseph JD,LuN,Qian J,Sensintaffar J,Shao G,Brigham D,Moon M,Maneval EC,Chen I,Darimont B,Hager JH.，“A clinically relevant androgen receptor mutation confersresistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.”Cancer Discov，2013年；第3卷，第1020-1029页)。

AR F876L赋予对MDV-3100和ARN-509的抗性。综合生物学研究表明，当用任一化合物处理时，携带该突变的前列腺癌细胞继续生长。体外报告分子测定证实了抗性并证明了两种化合物和在工程化表达AR F876L的肿瘤中的激动剂转化，两者都没有化合物控制肿瘤生长。此外，在具有累进CRPC的ARN-509治疗的患者中检测到AR F876L突变体。在29名符合评估条件的患者中，有3名接受纵向分析的患者的血浆DNA中检测到突变。所有3名患者均为18名前列腺特异性抗原(PSA)增加，同时服用药物患者，表明疾病进展(Joseph 2013)。

与MDV-3100结合的野生型(WT)和F876L突变的AR的结构模型表明，螺旋11和12差异性地被置换。在F876L突变体中的AR的LBD内，螺旋12不像在WT AR中那样被MDV-3100置换，并且这允许MDV 3100起激动剂的作用。将本文所述的化合物设计作为拮抗剂(第三代)，其中第二代化合物无活性。

因此，本发明的一个目的是提供在受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中，使用治疗有效量的包含式(I)化合物的药物组合物，治疗和/或改善与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法。

一种用于治疗和/或改善有需要的受试者包括哺乳动物和/或人中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，所述受试者已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺(化合物80)，

或其药学上可接受的盐形式，由上述组成和/或基本上由上述组成。

发明内容

本发明涉及治疗和/或改善有需要的受试者包括哺乳动物和/或人中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，所述受试者已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)化合物

或其对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐形式、由上述组成和/或基本上由上述组成；

其中

R₁为甲基、二氟甲基或三氟甲基；

G选自未取代的1H-吲唑-5-基、未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基、未取代的萘基和苯基取代基g1；

其中

R³选自氢、氟、甲基、三氟甲氧基、羟甲基、苯氧基、甲氧基或氰基；

R⁵为氢、氟或甲氧基，使得R³和R⁵中的至少一者为氢；

R⁴选自氢、氰基、氟、羟基、甲氧基、甲基、三氟甲基、甲基氨基磺酰基、三氟甲氧基、吡咯烷-1-基羰基、哌嗪-1-基、(4-甲基)哌嗪-1-基(C_1-3)烷基、四氢吡喃-4-基和i)至v)的取代基；

i)-C(＝O)NH(R_A)；其中R_A为选自氢的取代基；C_1-6烷基；2-羟基-2-甲基-丙基；环戊基甲基；3-羟丙基；氰甲基苯乙烯；甲氧基(C_2-3)烷基；3-(环戊基(N-甲基)氨基)丙基；乙氧羰基(C_1-3)烷基；3-(吡咯烷-1-基)丙基；吗啉-4-基(C_2-3)烷基；4-甲基哌嗪-1-基(C_2-3)烷基；3-(2-吡咯烷-1-基)丙基；噻吩；噻唑-2-基；2-甲基吡唑-3-基；呋喃基(C_0-3)烷基，其中所述呋喃基任选被甲基取代基取代；苯基(C_0-3)烷基，其中所述苯基任选被氯或氟取代基取代；吡啶基(C_0-2)烷基，其中吡啶基任选被甲基或氟取代基取代；吡嗪-2-基甲基；(1-甲基)哌啶-4-基；以及四氢吡喃-4-基(C_0-1)烷基；

ii)其中W选自NH、N(甲基)、N(乙基)、N(2-羟基乙基)、N(SO₂CH₃)、S、O或SO₂；

iii)-O(C_2-3)烷基-R_b；其中R_b为选自甲氧基、哌嗪-1-基、4-甲基哌嗪-1-基、哌啶-1-基、吡啶-2-基、嘧啶-2-基和吡咯烷-1-基的末端取代基；

iv)-OR_c其中R_c是苯基、吡啶-2-基、嘧啶-2-基、嘧啶-5-基或嘧啶-4-基；

和

v)选自嘧啶-5-基、呋喃基和吡啶-3-基的杂芳基；其中所述吡啶-3-基任选被甲基或氟取代基取代；和其中所述呋喃基任选被甲基取代基取代；

R₁₀和R₁₁各自为甲基取代基；或者R₁₀和R₁₁合在一起以形成环丁基或环戊基环。

本发明涉及如本文所定义的式(I)化合物治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中疾病、综合征、病症或障碍的用途，其中所述疾病、综合征、病症或障碍受一种或多种雄激素受体类型的拮抗影响，诸如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

本发明还涉及药物组合物治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中疾病、综合征、病症或障碍的用途，所述药物组合物包含药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式、由上述组成和/或基本上由上述组成，其中所述疾病、综合征、病症或障碍受一种或多种雄激素受体类型的拮抗影响，诸如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

本发明还涉及本文所述的化合物的任一种在制备药物中的用途，其中制备所述药物以用于治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中的疾病、综合征、病症或障碍，其中所述疾病、综合征、病症或障碍受一种或多种雄激素受体类型的拮抗影响，诸如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

举例来说，本发明是治疗由一种或多种雄激素受体类型介导的疾病、综合征、病症或障碍的方法，所述疾病、综合征、病症或障碍选自前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌，所述方法包括向对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者施用治疗有效量的本发明所述的任何化合物或药物组合物，由上述组成和/或基本上由上述组成。

在另一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其用于在已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的患者中治疗和/或改善受一种或多种雄激素受体类型的拮抗影响的疾病、综合征、病症或障碍，所述疾病、综合征、病症或障碍选自前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

具体实施方式

关于取代基，术语“独立地”是指当可能存在多于一个的取代基时，所述取代基可彼此相同或不同的情况。

术语“烷基”无论是单独使用或作为取代基的部分使用，均是指具有1至8个碳原子的直链或支化的碳链。因此，指定的碳原子数(例如C_1-8)独立地指烷基部分中的碳原子数目或指较大的含烷基的取代基的烷基部分中的碳原子数目。在具有多个烷基的取代基如(C_1-6烷基)₂氨基-中，该二烷基氨基的C_1-6烷基可相同或不同。

术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中术语“烷基”如上文所定义。

术语“烯基”和“炔基”是指具有2至8个碳原子的直链和支化的碳链，其中烯基链含有至少一个双键并且炔基链含有至少一个三键。

术语“环烷基”是指具有3至14个碳原子的饱和或部分饱和的、单环的或多环的烃环。此类环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和金刚烷基。

术语“杂环基”是指具有3至10个环成员的非芳族单环体系或二环体系，所述环成员包括至少1个碳原子和1至4个杂原子，所述1至4个杂原子独立地选自N、O和S。包括具有5至7个成员的非芳族环状环(其中1至2个成员为N)、或具有5至7个成员的非芳族环状环(其中0、1或2个成员为N，并且至多2个成员为O或S，并且至少一个成员必须为N、O或S)包括于术语杂环基内；其中任选地，所述环含有0至1个不饱和键，并且任选地，当所述环具有6或7个成员时，其含有至多2个不饱和键。形成杂环的碳原子环员可以是完全饱和的或部分饱和的。术语“杂环基”也包括桥接形成二环的两个5元单环杂环烷基。此类基团不视为是完全芳族的，并且不称它们为杂芳基。当杂环是二环时，杂环的两个环是非芳族的并且至少其中一个环含有杂原子环成员。杂环基的示例包括且不限于吡咯啉基(包括2H-吡咯、2-吡咯啉基或3-吡咯啉基)、吡咯烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基和哌嗪基。除非另外指明，否则杂环在可得到稳定结构的任何杂原子或碳原子上与其侧基连接。

术语“芳基”是指具有6至10个碳成员的不饱和芳族单环或二环。芳环的示例包括苯基和萘基。术语“杂芳基”是指具有5至10个环成员，并含有碳原子和1至4个杂原子的单环芳族环系或二环芳族环系，所述杂原子独立地选自N、O和S。具有5或6个成员的芳族环(其中所述环由碳原子组成并具有至少一个杂原子成员)包括在术语杂芳基内。合适的杂原子包括氮、氧和硫。在5元环的情况下，杂芳基环优选地含有氮、氧或硫中的一个成员，此外还含有至多3个附加的氮。在6元环的情况下，杂芳基环优选含有1至3个氮原子。对于其中6元环具有3个氮原子的情况，最多2个氮原子是相邻的。杂芳基的示例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基和喹唑啉基。除非另外指明，否则杂芳基在导致稳定结构的任何杂原子或碳原子上与其侧基连接。

术语“卤素”或“卤”是指氟、氯、溴和碘原子。

术语“羧基”是指基团–C(＝O)OH。

术语“甲酰基”是指基团–C(＝O)H。

术语“氧代基”或“氧化物”是指基团(＝O)。

当术语“烷基”或“芳基”或其前缀词根的任一者出现于取代基(例如，芳基烷基、烷基氨基)的名称中时，该名称应解释为包括上述对“烷基”和“芳基”给予的那些限制。碳原子的指定数目(如C₁-C₆)独立地指烷基部分、芳基部分中或其中烷基以其前缀词根出现的较大取代基的烷基部分中的碳原子的数目。对于烷基和烷氧基取代基，碳原子的指定数目包括所规定的给定范围内的所有独立成员。举例来说，C_1-6烷基单独地包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基，以及它们的子组合(例如，C_1-2、C_1-3、C_1-4、C_1-5、C_2-6、C_3-6、C_4-6、C_5-6、C_2-5等)。

一般来讲，在本公开全部内容中使用的标准命名法下，指定侧链的终端部分首先描述，随后是朝向连接点的邻接官能团。因此，例如，“C₁-C₆烷基羰基”取代基是指下式表示的基团：

在立构中心处的标记“R”指明该立构中心仅具有R-构型，如本领域中所定义；同样，标记“S”意指立构中心仅具有S-构型。如本文所用，在立构中心处的标记“*R”或“*S”用于指明立构中心具有纯的但未知的绝对构型。如本文所用，标记“RS”是指以R-和S-构型的混合物存在的立构中心。

未划有立体键标号的含有一个立构中心的化合物是两种对映体的混合物。含有两个未划有立体键标号的立构中心的化合物为四种非对映体的混合物。具有均标记“RS”且划有立体键标号的两个立构中心的化合物为具有如所划的相对立体化学性的两种对映体的混合物。具有均标记“*RS”且划有立体键标号的两个立构中心的化合物为具有单个但未知的相对立体化学性的两种对映体的混合物。

未划有立体键标号的未标记立构中心为R-和S-构型的混合物。对于划有立体键标号的未标记立构中心，相对和绝对立体化学性是如所叙述的。

除非另外指明，否则认为分子中特定位置处的任何取代基或变量的定义独立于其在该分子中其他位置处的定义。应当了解，本发明化合物上的取代基和取代模式可由本领域的普通技术人员选择，以提供化学上稳定且可通过本领域已知技术及本文所示的那些方法容易合成的化合物。

术语“受试者”是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。

术语“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。

术语“组合物”指包括有时治疗有效量的规定成分的药物产品，以及直接或间接地由规定量的规定成分的组合产生的任何产品。

如本文所用，术语“雄激素受体”旨在包括野生型雄激素受体以及与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体。

术语“AR介导的”是指在雄激素受体不存在时可能发生但在雄激素受体存在时能够发生的任何疾病、综合征、病症或障碍。合适的示例包括但不限于前列腺癌、去势难治性前列腺癌和转移性去势难治性前列腺癌。

术语“雄激素依赖性障碍”是指可受益于雄激素刺激减少的任何障碍，并且包括依赖于雄激素刺激的病理状况。“雄激素依赖性障碍”可由睾酮或其他雄激素的过度积累、雄激素受体对雄激素的敏感性增加或雄激素刺激的转录增加引起。

“雄激素依赖性障碍”的示例包括前列腺癌和障碍，例如痤疮、脂溢性皮炎、多毛症、脱发和化脓性汗腺炎。

如本文所用，术语“抗雄激素”是指能够预防或抑制雄激素对体内正常反应性组织的生物学效应的一类激素受体拮抗剂化合物。在一些实施方案中，抗雄激素为小分子。在一些实施例中，抗雄激素是AR拮抗剂。在一些实施例中，抗雄激素是AR完全拮抗剂。在一些实施方案中，抗雄激素是第一代抗雄激素。在一些实施例中，抗雄激素是第二代抗雄激素。在一些实施方案中，抗雄激素是第三代抗雄激素。

如本文所用，术语“AR拮抗剂”或“AR抑制剂”可互换使用，是指抑制或降低AR多肽的至少一种活性的药剂。示例性AR活性包括但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核转位。

如本文所用，“完全拮抗剂”是指在有效浓度下基本上完全抑制AR多肽的活性的拮抗剂。如本文所用，“部分拮抗剂”是指能够部分抑制AR多肽的活性，但甚至在最高浓度下也不是完全拮抗剂的拮抗剂。所谓“基本上完全”意指AR多肽活性的至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高被抑制。

如本文所用，术语“第一代抗雄激素”是指表现出野生型AR多肽的拮抗剂活性的药剂。然而，第一代抗雄激素与第二代抗雄激素的不同之处在于第一代抗雄激素可能在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中充当激动剂。示例性第一代抗雄激素包括但不限于氟他胺、尼鲁他胺和比卡鲁胺。

如本文所用，术语“第二代抗雄激素”是指表现出野生型AR多肽的完全拮抗剂活性的药剂。第二代抗雄激素与第一代抗雄激素的不同之处在于第二代抗雄激素在表达升高水平的AR的细胞中例如在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中，充当完全拮抗剂。示例性第二代抗雄激素包括4-[7-(6-氰基-5-三氟甲基吡啶-3-基)-8-氧代-6-硫代-5,7-二氮杂螺[3.4]辛-5-基]-2-氟代-N-甲基苯甲酰胺(也称为ARN-509；CAS号956104-40-8)；4-(3-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代咪唑烷-1-基)-2-氟-N-甲基苯甲酰胺(也称为MDV3100或恩扎鲁胺；CAS号915087-33-1)和RD162(CAS号915087-27-3)。在一些实施方案中，第二代抗雄激素在AR多肽的配体结合位点处或附近结合到AR多肽。

如本文所用，术语“第三代抗雄激素”是指对野生型AR多肽和AR多肽的突变形式表现出完全拮抗剂活性的药剂，所述AR多肽的突变形式具有在如下文所示的AR多肽的配体结合结构域(LBD)中产生的突变。第三代抗雄激素与第一代抗雄激素保有的区别之处在于第三代抗雄激素在表达升高水平的AR的细胞中例如在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中，充当完全拮抗剂。

如本文所用，术语“突变体”是指改变的(与参照相比)核酸或多肽，或指含有或表达此类改变的核酸或多肽的细胞或生物。

除非另外指出，如本文所用，术语“影响”或“受影响的”(当涉及受AR拮抗作用影响的疾病、综合征、病症或障碍)包括所述疾病、综合征、病症或障碍的一种或多种症状或临床表现的频率和/或严重性的降低；和/或包括防止所述疾病、综合征、病症或障碍的一种或多种症状或临床表现的发展或者所述疾病、综合征、病症或障碍的发展。

本发明的化合物在用于治疗或改善受一种或多种AR受体的拮抗影响的疾病、综合征、病症或障碍的方法中是有用的。此类方法包括以下步骤、由以下步骤组成和/或基本上由以下步骤组成：将治疗有效量的式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐施用给受试者，受试者已证实对第一代或第二代AR具有抗性，受试者包括需要此类治疗、改善和/或预防的动物、哺乳动物和人。

本发明的一个实施方案涉及在对其有需要的受试者(包括需要这种治疗的动物、哺乳动物和人，已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中治疗雄激素受体依赖性或雄激素受体介导的疾病或病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式(I)化合物。

在另一个实施方案中，雄激素受体依赖性或雄激素受体介导的疾病或病症选自良性前列腺增生、多毛症、痤疮、前列腺的腺瘤和肿瘤、含有雄激素受体的良性或恶性肿瘤细胞、超多毛症、脂溢性皮炎、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征、雄激素源性脱发、性腺机能减退、骨质疏松症、抑制精子形成、性欲、恶病质、厌食症、对年龄相关的降低睾酮水平的雄激素补充、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、子宫癌、潮热、和肯尼迪病、肌无力和萎缩、皮肤萎缩、骨质疏松、贫血症、动脉硬化、心血管疾病、能量损失、健康丧失、2型糖尿病或腹部脂肪堆积。

具体地讲，式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式可用于治疗或改善疾病、综合征、病症或障碍，诸如前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

更具体地讲，式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或其药学上可接受的盐形式可用于治疗或改善前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌，包括将治疗有效量的如本文定义的式(I)的化合物或其对映体、非对映体、溶剂化物或其药学上可接受的盐形式施用给对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)化合物

其中，

AA)R₁为甲基或三氟甲基；

BB)G选自未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基、未取代的萘基和苯基取代基g1；

其中

R³选自氢、氟、甲基、苯氧基或甲氧基；

R⁵为氢；

R⁴选自氢、羟基、甲氧基、甲基、甲基氨基磺酰基、三氟甲氧基、吡咯烷-1-基羰基、哌嗪-1-基、(4-甲基)哌嗪-1-基(C_1-3)烷基和i)至v)的取代基；

i)-C(＝O)NH(R_A)；其中R_A为选自下列的取代基：C_1-6烷基；2-羟基-2-甲基-丙基；环戊基甲基；3-羟丙基；甲氧基(C_2-3)烷基；3-(环戊基(N-甲基)氨基)丙基；乙氧羰基(C_1-3)烷基；吗啉-4-基(C_2-3)烷基；3-(2-吡咯烷-1-基)丙基；噻吩；噻唑-2-基；2-甲基吡唑-3-基；呋喃基(C_0-3)烷基，其中所述呋喃基任选被甲基取代基取代；苯基(C_0-3)烷基，其中所述苯基任选被氯或氟取代基取代；未取代的吡啶基(C_0-2)烷基；吡嗪-2-基甲基；以及四氢吡喃-4-基(C_0-1)烷基；

ii)其中W选自NH、N(甲基)、N(乙基)、N(2-羟基乙基)、S或SO₂；

iii)-O(C_2-3)烷基-R_b；其中R_b为选自4-甲基哌嗪-1-基、嘧啶-2-基、吡啶-2-基和吡咯烷-1-基的末端取代基；

iv)-OR_c其中R_c是嘧啶-4-基；

和

v)选自呋喃基和吡啶-3-基的杂芳基；其中所述呋喃基任选被甲基取代基取代；

CC)G选自未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基、未取代的萘基和苯基取代基g1；

其中

R³选自氟、甲基或苯氧基；

R⁵为氢；

R⁴选自甲基、甲基氨基磺酰基、三氟甲氧基、哌嗪-1-基、(4-甲基)哌嗪-1-基(C_1-3)烷基和i)至iv)的取代基；

i)-C(＝O)NH(R_A)；其中R_A为选自下列的取代基：C_1-6烷基；2-羟基-2-甲基-丙基；环戊基甲基；3-羟丙基；甲氧基(C_2-3)烷基；乙氧羰基(C_1-3)烷基；吗啉-4-基(C_2-3)烷基；3-(2-吡咯烷-1-基)丙基；噻吩；2-甲基吡唑-3-基；呋喃基(C_0-3)烷基，其中所述呋喃基任选被甲基取代基取代；苯基(C_0-3)烷基，其中所述苯基任选被氟取代基取代；未取代的吡啶基(C_0-2)烷基；以及四氢吡喃-4-基(C_0-1)烷基；

ii)其中W选自NH、N(甲基)、S或SO₂；

iii)-O(C_2-3)烷基-R_b；其中R_b为选自4-甲基哌嗪-1-基和吡啶-2-基的末端取代基；

和

iv)吡啶-3-基；

DD)G选自未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基或苯基取代基g1；

其中

R³选自氢、氟或甲基；

R⁵为氢；

R⁴选自哌嗪-1-基和i)至iv)的取代基；

i)-C(＝O)NH(R_A)；物质R_A为选自未取代的吡啶基(C_0-2)烷基和四氢吡喃-4-基(C_0-1)烷基的取代基；

ii)其中W选自N(甲基)、S或SO₂；

iii)-O(C_2-3)烷基-R_b；其中R_b为4-甲基哌嗪-1-基；

和

iv)作为吡啶-3-基的杂芳基；

EE)R⁴选自2-(吡啶-2-基)乙基氨基羰基、2-(吡啶-4-基)乙基氨基羰基、四氢噻喃-4-基氧基、甲基氨基羰基、(2-氟苯基)氨基羰基、2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基、哌嗪-1-基、(1,1-二氧噻-4-基)氧基、(1-甲基-哌啶-4-基)氧基、四氢吡喃-4-基甲基氨基羰基和四氢吡喃-4-基氨基羰基；

FF)R₁₀和R₁₁各自为甲基取代基；或者R₁₀和R₁₁合在一起以形成环丁基环；

以及上面实施方案AA)至FF)的任何组合，前提条件是应该理解，其中将相同取代基的不同实施方案进行组合的组合结构排除在外。

其中，

R₁为甲基、二氟甲基或三氟甲基；

G选自未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基、未取代的萘基和苯基取代基g1；

其中

R³选自氢、氟、甲基、苯氧基或甲氧基；

R⁵为氢；

ii)其中W选自NH、N(甲基)、N(乙基)、N(2-羟基乙基)、S或SO₂；

iv)-OR_c其中R_c是嘧啶-4-基；

和

其中，

R₁为甲基、二氟甲基或三氟甲基；

其中

R³选自氟、甲基或苯氧基；

R⁵为氢；

ii)其中W选自NH、N(甲基)、S或SO₂；

和

iv)吡啶-3-基；

其中，

R₁为甲基或三氟甲基；

G选自未取代的异喹啉-7-基、未取代的吡啶-3-基和取代基g1；

其中

R³选自氢、氟或甲基；

R⁵为氢；

R⁴选自哌嗪-1-基和i)至iv)的取代基；

ii)其中W选自N(甲基)、S或SO₂；

iii)-O(C_2-3)烷基-R_b；其中R_b为4-甲基哌嗪-1-基；

和

iv)吡啶-3-基；

R₁₀和R₁₁各自为甲基取代基；或者R₁₀和R₁₁合在一起以形成环丁基环。

其中，

R₁为甲基或三氟甲基；

G选自未取代的吡啶-3-基、未取代的异喹啉-7-基和取代基g1；

其中

R³选自氢、氟或甲基；

R⁵为氢；

R⁴选自2-(吡啶-2-基)乙基氨基羰基、2-(吡啶-4-基)乙基氨基羰基、四氢噻喃-4-基氧基、甲基氨基羰基、(2-氟苯基)氨基羰基、2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基、哌嗪-1-基、(1,1-二氧噻-4-基)氧基、(1-甲基-哌啶-4-基)氧基、四氢吡喃-4-基甲基氨基羰基和四氢吡喃-4-基氨基羰基；

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)化合物、由上述组成和/或基本上由上述组成，式(I)化合物如下表1的列表中所举例说明的。

表1.

本发明的另一个实施方案涉及治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的式(I)化合物

或其药学上可接受的盐形式、由上述组成和/或基本上由上述组成，

化合物选自

化合物1：5-[4,4-二甲基-3-[4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物2：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-四氢吡喃-4-基-苯甲酰胺；

化合物3：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛烷-8-基]-2-氟-N-(四氢吡喃-4-基甲基)苯甲酰胺；

化合物4：3-甲基-5-[8-[4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛烷-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物5：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-N,2-二甲基-苯甲酰胺；

化合物6：5-[8-[4-(1,1-二氧代噻-4-基)氧苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物7：5-[8-(7-异喹啉基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物8：5-[5-氧代-8-(4-哌嗪-1-基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈

化合物9：5-[5-氧代-8-(3-吡啶基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物10：3-甲基-5-[8-[4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物11：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-氟苯基)苯甲酰胺；

化合物12：4-[3-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺；

化合物13：3-甲基-5-[5-氧代-8-(4-四氢噻喃-4-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物14：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[2-(4-吡啶基)乙基]苯甲酰胺；

化合物15：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[2-(2-吡啶基)乙基]苯甲酰胺；

化合物16：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺；

化合物17：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-羟基-2-甲基-丙基)苯甲酰胺；

化合物18：5-[8-(2-萘基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物19：5-[4,4-二甲基-3-[4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-2-硫代-咪唑烷-1-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物20：5-[5-氧代-8-(3-苯氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物21：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-N-(环戊基甲基)-2-氟-苯甲酰胺；

化合物22：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-吗啉代乙基)苯甲酰胺；

化合物23：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-异丙基-苯甲酰胺；

化合物24：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-甲氧基丙基)苯甲酰胺；

化合物25：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-N-甲基-苯磺酰胺；

化合物26：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛烷-8-基]-2-氟-N-[(5-甲基-2-呋喃基)甲基]苯甲酰胺；

化合物27：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-异戊基-苯甲酰胺；

化合物28：5-[8-[3-氟-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物29：3-甲基-5-[5-氧代-8-(对-甲苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物30：5-[8-[4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物31：N-[(2-氯苯基)甲基]-4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物32：5-[8-[3-氟-4-[2-(2-吡啶基)乙氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物33：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-噻吩基甲基)苯甲酰胺；

化合物34：5-[8-(1-萘基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物35：5-[5-氧代-8-[4-(4-哌啶氧基)苯基]-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物36：N-苄基-4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物37：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[3-(2-氧代吡咯烷-1-基)丙基]苯甲酰胺；

化合物38：5-[5-氧代-7-硫代-8-[4-(三氟甲氧基)苯基]-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物39：4-[6-[6-氰基-5-(二氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺；

化合物40：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-羟丙基)苯甲酰胺；

化合物41：2-[[4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰基]氨基]乙酸乙酯；

化合物42：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-苯乙基-苯甲酰胺；

化合物43：5-[8-[4-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物44：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-吡啶基甲基)苯甲酰胺；

化合物45：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-甲基吡唑-3-基)苯甲酰胺；

化合物46：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-甲氧基乙基)苯甲酰胺；

化合物47：5-[8-(2-氟-4-羟基-苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物48：5-[8-(4-羟基苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物49：5-[8-[2-氟-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物50：3-甲基-5-[8-[4-(5-甲基-2-呋喃基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物51：5-[8-[4-[[1-(2-羟乙基)-4-哌啶基]氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物52：5-[8-[3-氟-4-(吡咯烷-1-羰基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物53：N-[(4-氯苯基)甲基]-4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物54：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(吡嗪-2-基甲基)苯甲酰胺；

化合物55：5-[8-[3-氟-4-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物56：5-[8-[3-氟-4-(2-嘧啶-2-基乙氧基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物57：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-苯基丙基)苯甲酰胺；

化合物58：N-丁基-4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物59：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-噻吩基甲基)苯甲酰胺；

化合物60：5-[8-[4-[[1-(2-羟乙基)-4-哌啶基]氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物61：5-[8-[4-[(1-乙基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物62：3-甲基-5-[5-氧代-8-(4-嘧啶-4-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物63：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-噻唑-2-基-苯甲酰胺；

化合物64：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-N-[3-[环戊基(甲基)氨基]丙基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物65：4-[7-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-6-氧代-8-硫代-7,9-二氮杂螺[4.4]壬-9-基]-2-氟-N-甲基-苯甲酰胺；

化合物66：5-[8-[3-氟-4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物67：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-吡啶基甲基)苯甲酰胺；

化合物68：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-丙基-苯甲酰胺；

化合物69：5-[8-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物70：5-(5-氧代-8-苯基-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基)-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物71：5-[5-氧代-8-(4-嘧啶-4-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物72：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-吗啉代丙基)苯甲酰胺；

化合物73：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-苯基-苯甲酰胺；

化合物74：N-(4-氯苯基)-4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物75：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(6-甲基-3-吡啶基)苯甲酰胺；

化合物76：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(2-呋喃基甲基)苯甲酰胺；

化合物77：5-[8-(4-羟基苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物78：N-(3-氯苯基)-4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物79：5-[8-(3-氰基苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物80：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物81：5-[8-[3-(羟甲基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物82：4-[[4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰基]氨基]丁酸乙酯；

化合物83：3-甲基-5-[5-氧代-8-[4-(4-哌啶氧基)苯基]-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物84：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(4-氟苯基)苯甲酰胺；

化合物85：5-[8-[4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物86：5-[8-[4-(2-呋喃基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物87：3-甲基-5-[5-氧代-8-(4-四氢吡喃-4-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物88：5-[5-氧代-8-(4-嘧啶-5-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物89：5-[5-氧代-8-(4-四氢吡喃-4-基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物90：5-[8-(3-氟苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物91：5-[8-[2-氟-4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物92：5-[8-(1H-吲唑-5-基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物93：3-甲基-5-[5-氧代-8-(4-嘧啶-5-基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物94：5-[8-(4-氟-2-甲氧基-苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物95：N-[(3-氯苯基)甲基]-4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺；

化合物96：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[2-(3-吡啶基)乙基]苯甲酰胺；

化合物97：5-[5-氧代-7-硫代-8-[3-(三氟甲氧基)苯基]-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物98：5-[5-氧代-7-硫代-8-[4-(三氟甲基)苯基]-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物99：5-[5-氧代-8-(4-苯氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物100：5-[8-[3-氟-4-(2-甲氧基乙氧基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物101：3-甲基-5-[5-氧代-8-(4-四氢吡喃-4-基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物102：5-[8-(4-氟苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物103：5-[5-氧代-8-[4-(2-吡啶氧基)苯基]-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2腈；

化合物104：5-[8-[4-(5-氟-3-吡啶基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物105：5-[8-[3-氟-4-(2-哌嗪-1-基乙氧基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物106：5-[8-(2,3-二氟苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物107：5-[5-氧代-8-(4-嘧啶-2-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物108：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]苯甲酰胺；

化合物109：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛烷-8-基]-2-氟-N-(1-甲基-4-哌啶基)苯甲酰胺；

化合物110：5-[4,4-二甲基-5-氧代-3-(对甲苯基)-2-硫代-咪唑烷-1-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物111：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺；

化合物112：5-[5-氧代-8-(4-四氢吡喃-4-基氧基苯基)-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物113：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(5-氟-3-吡啶基)苯甲酰胺；

化合物114：3-甲基-5-[8-[4-(5-甲基-3-吡啶基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物115：5-[8-(3-氟-4-甲基-苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物116：5-[8-[3-氟-4-[(1-甲基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-甲基-吡啶-2-甲腈；

化合物117：4-[6-(6-氰基-5-甲基-3-吡啶基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-甲氧基-N-甲基-苯甲酰胺；

化合物118：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-(3-吡咯烷-1-基丙基)苯甲酰胺；

化合物119：3-甲基-5-[8-[4-(2-甲基-3-吡啶基)苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]吡啶-2-甲腈；

化合物120：5-[8-(4-氰基苯基)-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈；

化合物121：4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-N-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基]苯甲酰胺；

和

化合物122：5-[8-[4-[(1-甲基磺酰基-4-哌啶基)氧基]苯基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-6-基]-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈。

对于在医学上的使用，式(I)的化合物的盐是指无毒性的“药学上可接受的盐”。然而，其他盐也可用于制备式(I)的化合物或其药学上可接受的盐形式。式(I)的化合物的合适药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸加成盐可例如通过将所述化合物的溶液与诸如盐酸、硫酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸的药学上可接受的酸溶液混合而形成。此外，如果式(I)的化合物含有酸性部分，则其合适的药学上可接受的盐可包括碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐(如钙盐或镁盐)，以及与适宜的有机配体形成的盐(如季铵盐)。因此，代表性药学上可接受盐包括：醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对α-羟乙酰氨基苯砷酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、双羟萘酸盐(扑酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。

可用于制备药学上可接受的盐的代表性酸和碱包括以下酸，所述酸包括乙酸、2,2-二氯乙酸、乙酰化氨基酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、(+)-樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基-乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、L-谷氨酸、α-氧代-戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸、乳糖酸、马来酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸和十一碳烯酸；以及碱，包括氨、L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星、氢氧化钙、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)-乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明、1H-咪唑、L-赖氨酸、氢氧化镁、4-(2-羟乙基)-吗啉、哌嗪、氢氧化钾、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、氢氧化钠、三乙醇胺、氨基丁三醇和氢氧化锌。

本发明的实施方案包括式(I)的化合物的前药。一般来讲，这种前药会是化合物的官能衍生物，其在体内可容易地转化成所需的化合物。因此，在本发明的治疗或预防实施方案的方法中，术语“施用”涵盖了用具体公开的化合物或未具体公开的化合物治疗或预防所述的多种疾病、病症、综合征和障碍，但所述未具体公开的化合物在施用至患者后会于体内转化成指定化合物。例如，在“Design of Prodrugs(《前药设计》)”，H.Bundgaard编辑，Elsevier(爱思唯尔)，1985年中描述了用于选择和制备适宜的前药衍生物的常规工序。

根据本发明实施方案的化合物具有至少一个手性中心时，它们可相应地作为对映体存在。如果化合物具有两个或更多个手性中心，则它们另外可以非对映体形式存在。应当理解，所有的此类异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。此外，化合物的某些结晶形式可作为多晶型物存在，并因此也旨在包括在本发明内。此外，某些化合物可与水形成溶剂化物(即水合物)或与普通有机溶剂形成溶剂化物，并且这类溶剂化物也旨在涵盖于本发明的范围内。技术人员将理解，本文所使用的术语化合物旨在包括溶剂化的式(I)的化合物。

当用于制备根据本发明某些实施方案的化合物的方法产生立体异构体的混合物时，这些异构体可通过常规技术如制备性色谱法分离。所述化合物可以外消旋形式制备，或者可通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单独的对映体。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸(诸如(-)-二对甲苯酰-d-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-l-酒石酸)形成盐来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱，来将化合物拆分成它们的组分对映体。所述化合物也可通过形成非对映体酯或酰胺，然后进行色谱分离并除去手性助剂来拆分。另选地，可使用手性HPLC柱拆分所述化合物。

本发明的一个实施方案涉及一种组合物，包括药物组合物，其包含式(I)的化合物的(+)-对映体、由其组成和/或基本上由其组成，其中所述组合物基本上不含所述化合物的(-)-异构体。在本发明的上下文中，基本上不含意指少于约25％，优选少于约10％，更优选少于约5％，甚至更优选少于约2％，并且甚至更优选少于约1％的(-)-异构体，其计算方式如下：

本发明的另一个实施方案为一种组合物，包括药物组合物，其包含式(I)化合物的(-)-对映体、由其组成和基本上由其组成，其中所述组合物基本上不含所述化合物的(+)-异构体。在本发明的上下文中，基本上不含意指少于约25％，优选少于约10％，更优选少于约5％，甚至更优选少于约2％，并且甚至更优选少于约1％的(+)-异构体，其计算方式如下：

在用于制备本发明多个实施方案的化合物的任何工艺过程中，可能有必要和/或期望保护所关注的任何分子上的敏感性或反应性基团。这可使用常规保护基团实现，例如在如下文献中描述的那些：Protective Groups in Organic Chemistry(第二版)，J.F.W.McOmie,Plenum Press,1973；T.W.Greene&P.G.M.Wuts,Protective Groups inOrganic Synthesis,John Wiley&Sons,1991；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis(第三版)，John Wiley&Sons,1999。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段除去保护基团。

尽管本发明实施方案的化合物(包括它们的药学上可接受的盐和药学上可接受的溶剂化物)可单独施用，但它们一般与药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂(根据施用途径和标准药用或兽医实践而选择)混合施用。因此，本发明的具体实施方案涉及药用和兽医用组合物，其包含式(I)的化合物和至少一种药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的稀释剂。

举例来说，在本发明实施方案的药物组合物中，可将式(I)的化合物与任何合适的粘合剂(一种或多种)、润滑剂(一种或多种)、助悬剂(一种或多种)、包衣剂(一种或多种)、增溶剂(一种或多种)以及它们的组合混合。

视情况而定，含有本发明化合物的固体口服剂型(如片剂或胶囊剂)可一次以至少一种剂型施用。也可按持续释放制剂的方式施用化合物。

其中可施用本发明化合物的其他口服剂型包括酏剂、溶液剂、糖浆和混悬剂；每种剂型任选地含有调味剂和着色剂。

另选地，式(I)的化合物可通过吸入(气管内或鼻内)给予或者以栓剂或阴道栓剂形式给予，或者它们可以洗剂、溶液剂、霜膏、油膏剂或扑粉的形式局部给予。例如，可将它们混入霜剂中，该霜剂包含聚乙二醇或液态石蜡的水乳液、由其组成和/或基本上由其组成。它们也可以所述霜膏的介于约1重量％至约10重量％之间的浓度混入油膏剂中，所述油膏剂包含蜡或软石蜡基以及任何稳定剂和防腐剂(有可能需要)、由其组成和/或基本上由其组成。替代的施用手段包括通过使用皮肤贴剂或透皮贴剂来透皮施用。

本发明的药物组合物(以及单独的本发明化合物)也可通过非肠道注射，例如海绵体内、静脉内、肌内、皮下、皮内或鞘内注射。在这种情况下，该组合物还将包括合适载体、合适赋形剂和合适稀释剂中的至少一种。

对于非肠道施用，本发明的药物组合物最好以无菌水溶液形式使用，其可含有其他物质，例如足够的盐和单糖以制备与血液等渗的溶液。

对于颊面或舌下施用，本发明的药物组合物可以片剂或锭剂形式施用，所述片剂或锭剂可以常规方式配制。

举个另外的例子，含有至少一种式(I)化合物作为活性成分的药物组合物可根据常规药用混合技术，通过将化合物与药学上可接受的载体、药学上可接受的稀释剂和/或药学上可接受的赋形剂混合而制备。载体、赋形剂和稀释剂可采用各种各样的形式，这取决于所需施用途径(例如口服、非肠道施用等)。因此对于诸如混悬剂、糖浆、酏剂和溶液剂的液体口服制剂，适宜的载体、赋形剂和稀释剂包括水、二元醇、油、醇类、调味剂、防腐剂、稳定剂、着色剂等；对于诸如散剂、胶囊剂和片剂的固体口服制剂，适宜的载体、赋形剂和稀释剂包括淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。固体口服制剂也可任选地用糖等物质包衣，或包肠溶衣，以便调节吸收和崩解的主要部位。对于非肠道施用，载体、赋形剂和稀释剂通常包括无菌水，并且可加入其他成分以增加组合物的溶解度和可保存性。注射用混悬剂或溶液剂也可使用含水载体与适当的添加剂(如增溶剂和防腐剂)一起制备。

在平均(70kg)的人的每日约1至约4次的给药方案中，治疗有效量的式(I)的化合物或其药物组合物包含约0.1mg至约3000mg，或其中的任何特定量或范围，具体地约1mg至约1000mg，或其中的任何特定量或范围，或更具体地约10mg至约500mg，或其中的任何特定量或范围的剂量范围的活性成分；但是，对于本领域的技术人员显而易见的是：式(I)的化合物的治疗有效量将随着进行治疗的疾病、综合征、病症和障碍而变化。

对于口服施用，药物组合物优选以含有约1.0、约10、约50、约100、约150、约200、约250和约500毫克式(I)的化合物的片剂形式提供。

有利的是，式(I)的化合物可以单次日剂量施用，或者每日总剂量可以每日两次、三次和四次的分剂量施用。

待施用的式(I)化合物的最佳剂量可容易确定，并且将随所使用的具体化合物、施用模式、制剂强度以及疾病、综合征、病症或障碍的进程而变化。此外，与待治疗的具体受试者相关的因素(包括受试者性别、年龄、体重、饮食和施用时间)将导致需要调整剂量以实现适当的治疗水平和所需的疗效。因此，上述剂量为一般情况的示例。当然，可能会存在其中较高或较低剂量范围是有益的个别情况，并且这类情况也在本发明的范围内。

式(I)的化合物可以在任何上述组合物和给药方案中施用，或者借助于本领域已确立的那些组合物和给药方案施用，只要式(I)的化合物的使用是需要它的受试者所要求的。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明方法的化合物和组合物可使用有效用于治疗癌症或另一种增殖性疾病、障碍或病症的任何量和任何施用途径来施用。在一些实施方案中，癌症或其他增殖性疾病、障碍或病症是前列腺癌。

在一些实施方案中，癌症或其他增殖性疾病、障碍或病症是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些实施方案中，癌症或其他增殖性疾病、障碍或病症是在AR中具有突变的去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些实施方案中，AR中的突变是苯丙氨酸(Phe)876的突变。

在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为亮氨酸。在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为异亮氨酸。在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为缬氨酸。在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为丝氨酸。在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为半胱氨酸。在一些实施方案中，AR中的突变是Phe876突变为酪氨酸。

在一些实施方案中，癌症或其他增殖性疾病、障碍或病症是由于突变而对任何AR疗法具有抵抗性的前列腺癌。

在一些实施方案中，癌症或其他增殖性疾病、障碍或病症是对使用第二代AR拮抗剂(包括但不限于恩杂鲁胺或ARN-509)的治疗具有抵抗性的前列腺癌。

本发明包括以下认识：AR多肽中的突变可使AR多肽对抗雄激素具有抗性或将抗雄激素转化为雄激素激动剂。在一些实施方案中，本发明提供了尽管存在此类突变，但可用于实现抗雄激素作用的化合物。

本文描述的AR多肽的氨基酸序列可存在于突变体AR中或可被修饰以产生突变体AR多肽变体，该突变体AR含有至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)野生型氨基酸残基的添加、取代或缺失。

在一些实施方案中，本文所述的AR多肽变体导致一种或多种抗雄激素对AR活性的抑制丧失为0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％至高达100％。在一些实施方案中，本文所述的AR多肽变体将抗雄激素转化为雄激素受体激动剂。

可在AR突变体中修饰的特异性非限制性氨基酸残基包括例如AR多肽的E566、E589、E669、C687、A700、N772、H777、C785、F877、K911。这些氨基酸残基可被任何氨基酸或氨基酸类似物取代。例如，所述位置的取代可用任何天然存在的氨基酸(例如丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)。在特定情况下，氨基酸取代是E566K、E589K、E669K、C687Y、A700T、N772S、H777Y、C785R、F877C、F877I、F877L、F877S、F877V、F877Y和/或K911E。

在一些实施方案中，如本文所述的AR突变体可包括本领域先前描述的AR多肽的附加修饰，包括但不限于例如A597T、S648G、P683T、D696E、R727H、N728I、I738F、W741L、W741C、W741L、M743V、G751S、A871V、H874Y、T878A、T878S和P914S。

在一些实施方案中，根据本发明的方法的化合物和组合物可使用有效用于治疗骨疾病、障碍或病症的任何量和任何施用途径来施用。在一些实施方案中，骨疾病、障碍或病症为骨质疏松症。

本发明涉及式(I)化合物治疗和/或改善受试者(包括其中所述疾病、综合征、病症或障碍受雄激素受体的拮抗影响的动物、哺乳动物和人，以及已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中疾病、综合征、病症或障碍的用途，所述疾病、综合征、病症或障碍选自前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌和转移性去势抵抗性前列腺癌。

在某些实施方案中，式(I)化合物或其组合物可与AR的另一种调节剂、激动剂或拮抗剂联合施用。在一些实施方案中，式(I)化合物或其组合物可与一种或多种其他治疗剂联合施用。

在一些实施方案中，AR调节剂、激动剂或拮抗剂包括但不限于促性腺激素释放激素激动剂或拮抗剂(例如，Lupron、Zoladex(Goserelin)、Degarelix、Ozarelix、ABT-620(Elagolix)、TAK-385(Relugolix)、EP-100或KLH-2109)；非甾体抗雄激素、氨鲁米特、恩杂鲁胺、比卡鲁胺、尼鲁他胺、氟他胺、甾体抗雄激素、非那雄胺、度他雄胺、贝氯特来、艾宗特来、妥罗雄脲、爱普列特、5-α还原酶的其他抑制剂、3,3'-二吲哚甲烷(DIM)、正丁基苯磺胺(NBBS)；或CYP17抑制剂，如醋酸阿比特龙、TAK-700(orteronel)、TOK-001(galeterone)或VT-464。

本发明的另一个实施方案涉及包含式(I)化合物和醋酸阿比特龙、由其组成和/或基本上由其组成的药物组合物用于治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)的与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的用途，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物，由上述组成和/或基本上由上述组成。

本发明的另一个实施方案涉及包含式(I)化合物和醋酸阿比特龙以及任选的泼尼松或地塞米松、由其组成和/或基本上由其组成的药物组合物用于治疗和/或改善受试者(包括哺乳动物和/或人、对其有需要的受试者、已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的受试者)中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的用途，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物，由上述组成和/或基本上由上述组成。

在某些实施方案中，式(I)化合物或其药物组合物可与PI3K途径抑制剂联合施用。

在一些实施方案中，PI3K途径抑制剂(PI3K、TORC或双PI3K/TORC抑制剂)包括但不限于依维莫司、BEZ-235、BKM120、BGT226、BYL-719、GDC0068、GDC-0980、GDC0941、GDC0032、MK-2206、OSI-027、CC-223、AZD8055、SAR245408、SAR245409、PF04691502、WYE125132、GSK2126458、GSK-2636771、BAY806946、PF-05212384、SF1126、PX866、AMG319、ZSTK474、CallO1、PWT33597、LY-317615(enzastaurinhydrochloride)、CU-906、或CUDC-907。

在某些实施方案中，式(I)化合物或其组合物可与放射疗法联合施用。术语“放射疗法”或“电离辐射”包括所有形式的辐射，包括但不限于α、β和γ辐射以及紫外线。

在一些实施方案中，放射疗法包括但不限于直接插入肿瘤或体腔中的放射性植入物(近距离放射疗法、间质放射疗法和腔内放射疗法是内部放射疗法的类型)、放射性药物(例如Alpharadin(Radium-223Chloride)、177Lu-J591PSMA共轭物)、或外部束辐射疗法(包括质子束)。

在某些实施方案中，式(I)化合物或其药物组合物可与免疫疗法联合施用。

在一些实施方案中，免疫疗法包括但不限于Provenge、Prostvac、Ipilimumab、CTLA-4抑制剂或PD-1抑制剂。

具体实施例

本发明的化合物80可见于2015年8月18日授权的名称为“Androgen ReceptorModulators and Uses Thereof”的美国专利US 9,108,944，该专利要求于2010年2月16日提交的美国临时专利申请号61/305,082的权益，该申请据此以引用方式并入。

实施例1

4-(7-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-8-氧代-6-硫代-5,7-二氮杂螺[3.4]辛-5-基)-2-氟苯甲酰胺，化合物80

化合物80的以下制备最初在美国专利9,108,944中公开为实施例34、化合物231(柱245)。

向4-(7-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-8-氧代-6-硫代-5,7-二氮杂螺[3.4]辛-5-基)-2-氟代苯甲酸(500mg，1.08mmol)在DCM中的悬浮液加入DMF(催化剂，0.1mL)，然后加入草酰氯(0.14mL，1.61mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时，然后真空浓缩以产生黄色残余物，将该残余物在高真空泵上进一步干燥。将氨(0.5M的二氧杂环己烷溶液，40mL，20mmol)直接加入残余物中，然后将混合物在室温下搅拌过夜。加入MeOH，将混合物吸附在硅胶上，通过快速色谱法(50％至100％EtOAc/己烷)纯化，得到不纯的期望产物，该产物通过反相HPLC(乙腈/水:TFA)再纯化。合并包含所需化合物的级分，真空除去乙腈，然后用饱和碳酸氢钠溶液处理剩余的水层。用DCM(3x)萃取水层，合并有机物，经硫酸钠干燥，蒸发至干，得到100mg 4-(7-(6-氰基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-8-氧代-6-硫代-5,7-二氮杂螺[3.4]辛-5-基)-2-氟苯甲酰胺，为白色固体。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.21(s,1H),8.75(s,1H),7.95(s,1H),7.87(t,1H),7.80(s,1H),7.46(dd,1H),7.37(dd,1H),2.69-2.62(m,2H),2.55-2.47(m,2H),2.00(m,1H),1.58(m,1H)。

生物学实施例

如本文所用，术语“生物样品”包括但不限于细胞培养物或其提取物；从哺乳动物或其提取物中获得的活检材料；以及血液、唾液、尿液、粪便、精液、泪液或其他体液或其提取物。

生物样品中受体的拮抗作用可用于本领域技术人员已知的各种目的。此类目的的示例包括但不限于生物测定、基因表达研究和生物学靶标鉴定。

本发明的某些实施方案涉及通过拮抗需要这种治疗并且已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性的患者或受试者中的AR来治疗的方法，该方法包括向所述患者施用本发明的式(I)化合物或包含所述化合物的组合物的步骤。

可在体外或体内测定式(I)化合物作为AR拮抗剂或用于治疗AR介导的疾病、障碍或病症的活性。可使用AR介导的疾病、障碍或病症的动物模型，例如啮齿动物或灵长类动物模型，对本发明化合物的功效进行体内评估。体内评估可进一步定义为雄激素依赖性器官发育(Hershberger)测定或肿瘤异种移植物模型。可使用例如从表达野生型或突变体AR的组织分离的细胞系进行基于细胞的测定。另外，可进行基于生物化学或机理的测定，例如使用纯化蛋白质的转录测定、Northern印迹、RT-PCR等。

体外测定包括确定细胞形态、蛋白质表达和/或细胞毒性、酶抑制活性和/或用本发明化合物处理细胞的后续功能结果的测定。可使用替代或另外的体外测定来定量抑制剂与细胞内的蛋白质或核酸分子结合的能力。

抑制剂结合可通过在结合前放射性标记抑制剂、分离抑制剂/靶分子复合物并确定结合的放射性标记的量来测量。可替选地或另外地，抑制剂结合可通过进行竞争实验来确定，其中新的抑制剂与纯化的蛋白质或与已知放射性配体结合的核酸温育。用于测定本发明的式(I)化合物作为AR拮抗剂的示例性系统的详细条件在下面的生物学实施例中列出。

此类测定是示例性的，并非旨在限制本发明的范围。本领域技术人员可以理解，可以对常规测定进行修改以开发可用于比较地评估活性或以其他方式表征如本文所述的化合物和/或组合物的等同或其他测定。

体外分析

生物学实施例1

化合物与AR、GR和ER的放射性配体结合

用如下所述细胞提取物和配体进行放射性配体结合测定。完整的方法包含在所引用的出版物中。K_d值由非特异性温育检测方法确定。

受体

GR(人)(激动剂放射性配体)IM-9细胞(胞质溶胶)

[³H]地塞米松1.5nM 1.5nM曲安奈德(10μM)6h4℃闪烁计数(Clark，A.F等人，(1996)Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.,37:805-813)。

ER(非选择性)(人)(激动剂放射性配体)MCF-7细胞(胞质溶胶)[³H]雌二醇0.4nM0.2nM17-β-雌二醇(6μM)20h 4℃闪烁计数(Parker,G.J等人，2000年，J.Biomol.Screen.,5:77-88)。

AR(人)(激动剂放射性配体)LNCaP细胞(胞质溶胶)

[³H]甲基三烯酮1nM 0.8nM米波龙(1μM)24小时，4℃闪烁计数。

Zava,D.T等人(1979)Endocrinology,104:1007-1012。

结果表示为对照特异性结合测量的特异性结合的百分比*100对照特异性结合和对照特异性结合的抑制百分比100-(测量的特异性结合*100)在化合物存在下获得的对照特异性结合。

通过使用希尔方程曲线拟合用平均重复值产生的竞争曲线的非线性回归分析来确定IC₅₀值(引起对照特异性结合的半数最大抑制的浓度)和希尔系数(nH)。

Y＝D+[A-D]

1+(C/C50)nH

其中Y＝特异性结合，A＝曲线的左渐近线，D＝曲线的右渐近线，C＝化合物浓度，C50＝IC₅₀，nH＝斜率因子。该分析使用在Cerep(Hill软件)开发的软件进行，并通过与用于的商业软件SigmaPlot 4.0(由SPSS Inc.提供的1997)生成的数据进行比较来验证。

使用Cheng Prusoff方程计算抑制常数(Ki)：

Ki＝IC50(1+L/KD)

其中L＝测定中放射性配体的浓度，KD＝放射性配体对受体的亲和力。scatchard图用于确定KD。表2示出了结果数据。

表2.

对于AR、GR和ER，分别使用[³H]-甲基三烯醇酮、[³H]-地塞米松和[³H]-雌二醇确定放射性配体结合抑制和亲和力计算。对于ER，无法确定抑制或亲和力，并且未示出数据。

AR＝雄激素受体，ER＝雌激素受体，GR＝糖皮质素受体

生物学实施例2

AR(WT或F876L)报告基因测定的拮抗作用

通过转导每种细胞系产生LNCaP AR(cs)和LNCaP F876L荧光素酶细胞系(细胞系生成描述Joseph JD、Lu N、Qian J、Sensintaffar J、Shao G、Brigham D、Moon M、ManevalEC、Chen I、Darimont B、Hager JH。“A clinically relevant androgen receptormutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamideand ARN-509.”Cancer Discov，2013年；第3卷，第1020-1029页)，其遵循制造商说明书(Qiagen)使用雄激素反应元件萤火虫荧光素酶慢病毒构建体，MOI(感染复数)为50。使用1:10,000v/v的嘌呤霉素(Life Technologies)选择产生稳定的混合群体细胞系。以下方案用于两种细胞系并用于测试本发明的式(I)化合物。

使LNCaP细胞生长至约80％的汇合度，除去培养基并在用0.05％胰蛋白酶EDTA从板中分离之前在Hank平衡盐溶液中冲洗细胞。在完整的CSS(活性炭解吸附血清)培养基中提取出细胞并消除胰蛋白酶。在测定前将CSS维持在细胞上24小时，此时将5,000个细胞/20μL接种在Greiner 384孔白色/白色组织培养物处理的板中，并在37℃、5％CO₂下再温育1-2小时，然后加入10μL的4x测试化合物(本文所述的化合物)或测定对照(均在含有10％css的完全培养基中稀释)。然后加入另外10μL的4x R-1881激动剂测试(拮抗剂测定)或缓冲液(激动剂测定)(均在含有10％CSS的完全培养基中稀释)。对于WT测定，激动剂测试为400pM，并且对于F876L测定为600pM。将含有细胞和本文化合物的板在37℃、5％CO₂下再温育20-24小时，然后加入40μL/孔的Steady-Glo荧光素酶测定系统试剂(Promega#E2520)。1小时后，在BMG Pherastar上读取板的发光。

激动剂测试：R-1881(Metribolone)-激动剂

拮抗剂对照(低对照)：5-(5-(4-((1-甲基哌啶-4-基)氧基)苯基)-8-氧代-6-硫代-5,7-二氮杂螺[3.4]辛-7-基)-3-(三氟甲基)吡啶-2-甲腈(WO2011/103202，实施例19，化合物129，CAS#1332390-06-3)。

计算和公式：

RLU结果从Pherastar收集并直接用于数据计算。

测定的最大值和抑制百分比：

抑制％：

(1-(样品RLU-平均低控制RLU[10μM拮抗剂对照])/(平均高控制RLU[400pM R-1881]-平均低对照RLU[10μM拮抗剂对照]))*100。

1μM R-1881激动剂最大％：

((样品RLU-平均低控制RLU[DMSO/缓冲液])/(平均高控制RLU[1μMR-1881]-平均低控制RLU[DMSO/缓冲液]))*100。

利用计算的RLU数据和数据拟合宏实现EC/IC50计算。

使用最小二乘法将数据拟合为以下公式：

其中

Y_{[低化合物]}＝非活性化合物的Y值

Y_{[高化合物]}＝具有完全活性化合物效应子的Y值

Hill＝Hill系数

EC/IC₅₀＝效果为50％的化合物浓度

表3示出了结果数据。

表3：

如本文所用：

pIC₅₀定义为–Log₁₀(IC₅₀以[摩尔]表示)。

pEC₅₀定义为–Log₁₀(EC₅₀以[摩尔]表示)。

MAX％Inh定义为在测试浓度范围内对化合物观察到的R1881对照响应的最大抑制％。

MAX％Stim定义为在测试浓度范围内对化合物观察到的最大％刺激(激动剂反应)。

LNCaP-AR-wt ANT是指使用雄激素反应元件萤火虫荧光素酶慢病毒构建体和野生型雄激素受体(AR-wt)以拮抗剂模式稳定转染的LNCaP细胞的报告基因测定。

LNCaP-AR-wt AG是指使用雄激素反应元件萤火虫荧光素酶慢病毒构建体和野生型雄激素受体(AR-wt)以激动剂模式稳定转染的LNCaP细胞的报告基因测定。

LNCaP-AR-F876L ANT是指使用雄激素反应元件萤火虫荧光素酶慢病毒构建体和F876L突变体雄激素受体(AR-F876L)以拮抗剂模式稳定转染的LNCaP细胞的报告基因测定。

LNCaP-AR-F876L AG是指使用雄激素反应元件萤火虫荧光素酶慢病毒构建体和F876L突变体雄激素受体(AR-F876L)以激动剂模式稳定转染的LNCaP细胞的报告基因测定。

生物学实施例3

在Cell Western Assay中的AR

将LNCaP细胞(8,000/孔)涂板在含有10％活性炭葡聚糖解吸附血清的RPMI培养基中，该培养基在涂有聚-d-赖氨酸的板中。24小时后，用30μM至0.0003μM的化合物处理细胞。在化合物添加后20小时，将细胞固定(30％甲醛的PBS溶液)持续20'。将细胞在PBS 0.1％Triton中透化(50μL/孔，每次5μL三次)并用LiCor封闭缓冲液(50μL/孔，90')封闭。然后将孔在4℃下与在LiCor封闭缓冲液/0.1％Tween-20中以1:1000稀释的兔IgG雄激素受体抗体(AR-N20，Santa Cruz抗体)一起温育过夜。用0.1％Tween-20/PBS(50μL/孔，各5μl)洗涤孔，然后在黑暗(90')中在0.2％Tween-20/0.01％SDS/LiCor封闭缓冲液中稀释的山羊抗兔IRDye<^TM>800CW(1:1000)和DRAQ5 DNA染料(1:10,0000，5mM)中温育。在0.1％Tween-20/PBS中洗涤细胞(50μL/孔，各5')。去除洗涤缓冲液，并使用LiCor Odyssey读取板。

生物学实施例4

LNCaP AR定位测定

将LNCaP细胞在第1天接种于板中并在37℃下温育过夜，然后加入20μL预稀释的化合物或DMSO(基础，载体对照)。将板在37℃下温育1-2小时，然后加入20μL配体溶液(拮抗剂模式，高对照)或CSS培养基(激动剂模式，未刺激的对照)并孵育细胞+/-24小时。

将细胞固定在140μL的10％甲醛(5％最终)中，并且将板在室温下温育15-20分钟。加入100μL 100％冰冷的甲醇(储存在-20℃)以使细胞透化，启动抗体染色方案并准备用于成像的板。使用间接免疫荧光测定进行染色：对于AR，初级抗体是特异性小鼠抗AR抗体(ab49450，Abcam)，然后是携带alexa 488荧光团的二级山羊抗小鼠抗体；对于PSA，初级抗体是特异性兔抗PSA抗体(5365S，Cell Signaling Technology)，然后是携带alexa 568荧光团的二级山羊抗兔抗体。对细胞进行用Hoechst复染细胞核，细胞质染色细胞质染色。将板洗涤并在4℃下保持在PBS中直至进一步处理。

使用Opera(Perkin Elmer)上的20xW镜头对板进行成像，然后应用以下计算从该测定中获得报告的数据。

LC＝低对照值的中值＝最小易位

＝CSS培养基中的细胞(0.5％DMSO)并显示出最小的易位

HC＝高对照值的中值＝最大易位

＝含有1nM R1881配体(0.5％DMSO)的CSS培养基中的细胞

％EFFECT＝(样品-LC)/(HC-LC)*100

％CTL＝高对照的％＝(样品/HC)*100

计算了几个特征，但包括：

Ratio_Nuc2Cell_AR_TotalIntBC.median：细胞核中总AR的百分比，计算为单细胞水平上的“总核AR强度”/“总细胞AR强度”，然后报告所有细胞的中位数[％效果]

Cell_AR_MeanIntBC.median：整个细胞中的AR水平[％效果]

Cyto_AR_meanIntBC.median：细胞质中的AR水平[％效果]

Nuc_AR_MeanIntBC.median：核中的AR水平[％效果]

Cell_Rpt_MeanIntBC.median：全细胞PSA水平[％效果]

CellCount_AllDetected：细胞数

生物学实施例5

前列腺癌细胞活力测定-VCAP

对VCaP细胞计数并接种到黑色的384孔板中，其含有透明底部物，在含有10％活性炭解吸附血清的无酚红DMEM中浓度为125,000个细胞/mL。每孔加入16μL悬浮液并温育48小时以使细胞粘附。48小时后，将每种化合物的12点连续半对数稀释液以16μL加入细胞中，最终浓度为100μM至0.0003μM。式(I)化合物也使用30pM R1881以拮抗剂模式进行实验，其中将8μL化合物加入细胞中，然后加入8μL R1881。在37℃温育5天后，向细胞中加入16μLCellTiter-Glo(Promega)，并使用Envision测定每个孔的相对发光单位(RLU)。测定每个样品的刺激百分比和抑制百分比并用GraphPadPrism作图。表5示出了结果数据。

表5.

化合物	IC<sub>50</sub>(nM)
		85	76

生物学实施例6

LNCaP增殖测定

LNCaP细胞在T150烧瓶中的RPMI 10％FBS中扩增。用0.25％胰蛋白酶去除细胞，在完全培养基中洗涤，离心(300g，3分钟)，吸出上清液。将细胞重悬于具有1％活性炭解吸附血清(CSS)的不含酚红的RPMI培养基中，并且使用ViCELL(Beckman-Coulter)计数。将7500个细胞加入白色光学底部384孔板的每个孔中，并在37℃、5％CO₂下温育2天。使用50mM储备溶液在RPMI CSS中制备化合物稀释液，并单独加入细胞(激动剂模式)或与0.1nM R1881(拮抗剂模式)组合。将板温育4天，然后加入CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability试剂盒试剂(Promega)。将板以3000rpm放置在振荡器上10分钟，然后使用发光测定默认设置在EnVision读板仪(Perkin Elmer)上读数。分析数据，归一化至0.1nM R1881刺激，并绘制在GraphPad Prism中。表6示出了结果数据。

表6.

生物学实施例7

荧光素酶转录报告分析(WT和突变AR)

将HepG2细胞维持在补充有10％FBS的EMEM中。转染前一天，将培养基更换为10％CSS的EMEM。在OptiMEM中使用120μLLipofectamine2000(Life Technologies)瞬时转染T-150烧瓶，30μg突变cDNA(表达载体)-测试的突变cDNA是L701H、T877A、W741C和H874Y-和40μg4XARE-荧光素酶(报告载体)并且将烧瓶温育过夜。然后将细胞用胰蛋白酶消化、计数并以500,000个细胞/mL重悬。对于激动剂模式，将式(I)化合物连续稀释，并且每孔加入50μl化合物。向每个孔中加入50μL细胞并温育48小时。对于拮抗剂模式，将最终浓度为90pM的R1881加入稀释的化合物中并温育48小时。然后使用SteadyGlo测定板并在Envision上读数。使用GraphPad Prism确定和分析刺激和抑制百分比。表7示出了结果数据。

表7.AR突变体报告基因测定中式(I)化合物的拮抗剂活性IC₅₀的汇总。

总结了报道分子测定中使用的每种AR cDNA的拮抗作用(IC₅₀)值。NT为未测试，*表示不完全抑制(否则为100％)。

所有值均相对于R1881诱导的雄激素受体活性(n≥3)的活性进行计算。

生物学实施例8

AR-VP16 DNA粘结测定

将HepG2细胞维持在补充有10％FBS的EMEM中。转染前一天，将培养基更换为10％CSS的EMEM。在OptiMEM中使用120μLLipofectamine2000(Life Technologies)、24.5μgAR-VP16或F876L-VP16(表达载体)和49μg4XARE-荧光素酶(报道载体)瞬时转染T-150烧瓶，并将烧瓶温育过夜。然后将细胞用胰蛋白酶消化、计数并以500,000个细胞/mL重悬。对于激动剂模式，将化合物连续稀释，每孔加入50μL化合物。向每个孔中加入50μL细胞并温育48小时。对于拮抗剂模式，将最终浓度为90pM(VP16 AR)或1nM(VP16 F876L)R1881加入板中并温育48小时。然后使用SteadyGlo测定板并在Envision上读数。使用GraphPad Prism确定和分析刺激和抑制百分比。表8示出了结果数据。

表8.

生物学实施例9

GABA门控Cl通道拮抗剂放射性配体结合试验

根据以下方法，在CEREP中进行GABA门控Cl通道测定。在不存在或存在测试化合物的情况下，在含有50mM Na₂HPO₄/KH₂PO₄(pH 7.4)和500mM NaCl的缓冲液中，将大脑皮质的膜匀浆(120μg蛋白质)在22℃下与3nM[³⁵S]-TBPS一起温育120分钟。非特异性结合是在20μm的木防己苦毒宁存在下测定的。温育后，将样品在真空下通过预先用0.3％PEI浸泡的玻璃纤维过滤器(GF/B，Packard)快速过滤，并使用96-样品细胞收集器(Unifilter，Packard)用冰冷的50mM Tris-HCl冲洗几次。将滤膜干燥，然后使用闪烁混合物(Microscint 0，Packard)在闪烁计数器(Topcount，Packard)中计数放射性。结果表示为对照放射配体特异性结合的抑制百分比。标准参考化合物是木防己苦毒宁，其在每个实验中以几种浓度进行测试以获得竞争曲线，由此计算其IC₅₀。在该测定法中，本文所公开的下列代表性化合物在GABA门控Cl-通道结合测定中记录了10μm单点浓度下的活性。表9示出了结果数据。

表9.

体内测定

生物学实施例V1

Hershberger测定

使用Hershberger测定评估AR拮抗剂对体内雄激素依赖性信号传导的影响。在该测定中，在睾酮(0.4mg/kg丙酸睾酮)存在并且测量雄激素依赖性器官的重量的情况下，向青春期阉割的雄性SD大鼠施用本文所述的AR拮抗剂。继续给药10天，并在最后一次给药后24小时进行测量。通过与去势对照比较评估AR的拮抗程度和随后的器官生长抑制。将式(I)化合物口服给药QD，并通过5个雄激素敏感器官(ASO)的重量变化进行端值评估：配对考珀氏腺(CG)、具有液体和凝固腺体的精囊(SVCG)、阴茎头(GP)、腹侧前列腺(VP)和提肛肌海棉球肌联合体(Levator Ani-Bulbocavernosus Complex,LABC)。根据测定指导，对于待分类为抗雄激素的化合物，5个器官中的2个需要统计上显著的ASO抑制(通过t检验/Mann-Whitney进行分析)。

本文定义的化合物以指定剂量(mg/kg)和氟他胺(FT)，阳性对照，以3mg/kg施用。所有化合物与丙酸睾酮(TP，0.4mg/kg)、未治疗的对照共同施用，丙酸睾酮也单独施用，(仅阉割的大鼠被用作完全雄激素阻断的对照)。在5个器官中的至少2个中实现的ASO的统计学显着变化表明活性化合物。在所有5个器官中，施用化合物43导致ASO对TP对照的显著降低(p≤0.05)。对于所有研究报道了具有液体和凝固腺体的精囊(SVCG)和腹侧前列腺(VP)的生长抑制数据(平均器官重量(TP对照的％)±SD(n＝6))。表10示出了结果数据。

表10.

生物学实施例V2

去势抵抗前列腺癌异种移植研究

阉割6至7周龄的雄性SCID无毛远交小鼠(SHO，Charles Rivers Laboratories)用作异种移植研究的宿主菌株。在宿主小鼠中建立LNCaP SRα F876L肿瘤，并测定本文所定义的化合物的抗肿瘤活性。当肿瘤达到100mm³至200mm³时开始给药，并将动物随机分配至每个试验组(载体(HP-β-CD)，10mg/kg、30mg/kg或50mg/kg化合物)。将化合物口服给药，QD，持续28天，并且每周两次测量肿瘤大小以及体重测量。在研究结束时，使用初始肿瘤体积和最终肿瘤体积测量计算TGI。TGI：100-(治疗/对照*100)。研究结束时收集肿瘤并且贮存供进一步分析。表11示出了结果数据。

表11.

尽管上述说明通过提供的实施例进行说明来指出了本发明的原理，但应当理解，本发明的实践涵盖以下权利要求书及其等同形式的范围内的所有一般变型形式、改变形式和/或修改形式。

Claims

1.一种用于治疗和/或改善有需要的受试者包括哺乳动物和/或人中与去势抵抗性前列腺癌相关的AR突变体受体相关联的疾病、综合征、障碍或病症的方法，所述受试者已证明对第一代或第二代AR拮抗剂具有抗性，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的4-[6-[6-氰基-5-(三氟甲基)-3-吡啶基]-5-氧代-7-硫代-6,8-二氮杂螺[3.4]辛-8-基]-2-氟-苯甲酰胺(化合物80)，