CN109613137A - 一种水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的高效液相色谱-同位素稀释质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水产品中3‑氨基苯甲酸乙酯含量的高效液相色谱‑同位素稀释质谱检测方法。本发明利用高效液相色谱‑同位素稀释质谱实现对水产品中3‑氨基苯甲酸乙酯快速准确测定，解决以往水产品中3‑氨基苯甲酸乙酯在测定过程中内标物选择不合适导致测定不准确的技术难题，将促进3‑氨基苯甲酸乙酯同位素稀释质谱测定技术进步，也为水产品中3‑氨基苯甲酸乙酯含量水平准确测定提供技术方法。

Description

一种水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的高效液相色谱-同位 素稀释质谱检测方法

技术领域

本发明涉及一种水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的高效液相色谱-同位素稀释质谱检测方法，属于食品质量安全检测技术领域。

背景技术

近几年来，北京某水产市场用麻醉剂运输活鱼，经媒体曝光之后，麻醉剂的安全问题被沸沸扬扬。MS-222(3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)化学名是3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐，cas号886-86-2，分子式为C₁₀H₁₅NO₅S，结构式如式a所示。MS-222是一种被美国、加拿大和挪威等国批准可以在水产行业中使用的渔用麻醉剂。但是，相关研究表明，水产品中残留的MS-222通过生物迁移在人体蓄积后将对人体健康产生潜在风险，如过敏反应、造血紊乱、可能致癌等。目前，该类麻醉剂在我国水产行业中的使用和残留问题已经引起了关注。尤其是在2013和2015年年北京某水产市场连续被媒体曝光使用麻醉剂运输活鱼后,水产品中麻醉剂的食用安全性问题更是引起社会各界的广泛关注。因此，研究水产品中MS-222的准确测定技术对于规范MS-222的使用，保证食品安全有重要意义。

用来检测3-氨基苯甲酸乙酯的主要检测技术有高效液相色谱法、分光光度法和高效液相色谱质谱(HPLC-MS)法。高效液相色谱法和分光光度法的检测限高，故很少使用。而质谱作为目前发展最快的检测技术，凭借其能够同时提供定性和定量信息的优点在各类残留检测中的应用越来越广泛，已经成为实验室必备的分析和确证仪器。

稳定同位素稀释质谱法是采用与被测物质具有相同分子结构的稳定同位素标记的化合物作为内标物质，用HPLC-MS进行检测，通过质谱仪测量加入的稳定同位素标记的化合物的量及质谱检测的目标物及其同位素标记的丰度比来计算目标物含量以达到准确定量的目的。在目标物与其稳定同位素标记物达到平衡后，同位素的丰度比既已恒定，混合后的样品在提取、净化等操作过程中即使发生目标物损失，由于同位素丰度比不变可以有效降低测量误差。稳定同位素内标的这种特性与HPLC-MS的高灵敏度和处理复杂样品的能力结合起来，使得色谱-同位素稀释质谱技术被公认为是一种测量微量及痕量有机物的基准方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的高效液相色谱-同位素稀释质谱检测方法。该方法克服了现有的方法采用3-氨基苯甲酸乙酯结构类似物作为内标带来的测量不准确的问题，并将3-氨基苯甲酸乙酯-D₅作为同位素标记内标应用于鱼中3-氨基苯甲酸乙酯的检测分析。

本发明要求保护一种3-氨基苯甲酸乙酯-D₅作为同位素内标在检测水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量中的应用。

本发明还要求保护一种利用稳定同位素稀释质谱法检测水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的方法，该方法包括：

1)将作为供试试料的水产品制成糜状物；

其中，所述方法还包括：

2)将所述糜状物用3-氨基苯甲酸乙酯-D₅溶液浸润后，用乙腈进行提取，将所得提取液进行冷冻除脂和净化，得到净化液；

3)用所述净化液制得进样溶液，与标准溶液等体积进样进行HPLC-MS/MS检测，记录保留时间和峰面积，以m/z 138为3-氨基苯甲酸乙酯的定量离子，以m/z139为3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的定量离子，以峰面积按照内标法进行HPLC-MS/MS定量测定，即由所述供试试料的峰面积得到所述供试试料中3-氨基苯甲酸乙酯的含量；

所述标准溶液中含有3-氨基苯甲酸乙酯。

上述方法中，所述步骤1)中，将待测水产品制成糜状物的可为各种现有方法；

所述步骤2)中，所述3-氨基苯甲酸乙酯-D₅溶液中和标准溶液中，溶剂均为甲醇或乙腈。

所述步骤2)用乙腈进行提取包括：用提取溶液和QuEChERS试剂盒一进行涡旋振荡，再超声提取，得到提取液；

所述提取溶液中含有乙腈。

具体的，所述提取溶液由乙腈和醋酸钠缓冲液组成；所述乙腈和醋酸钠缓冲液的体积比具体为7：3；所述醋酸钠缓冲液的pH值具体为4.0；

所述提取溶液与所述糜状物的用量比为10-20ml：2.0g；

所述QuEChERS试剂盒一由无水硫酸镁和氯化钠组成；具体的，所述无水硫酸镁和氯化钠的质量比为3:1；更具体为由3g无水硫酸镁和1g氯化钠组成。

所述涡旋振荡步骤中，转速为450-550rpm；具体为500rpm；用提取溶液涡旋振荡的时间为4-6min；具体为5min；用QuEChERS试剂盒一进行涡旋振荡的时间为0.5-1.5min；具体为1min；

所述超声提取步骤中，超声功率为150-250W；具体为200W；时间为8-12min；具体为10min。

所述步骤2)冷冻除脂包括：冷冻所述提取液，离心收集上清液；

具体的，所述冷冻步骤中，温度为-20--40℃；具体为-20℃；时间为30-60min；具体为30min；

所述步骤2)净化步骤中，净化方法为MSPD(也即基质分散固相萃取净化)法；

具体为用QuEChERS试剂盒二进行涡旋振荡，离心收集上清液即为所述净化液；

所述QuEChERS试剂盒二具体为由300mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂组成；所述固相吸附剂具体为PSA；所述固相吸附剂的粒径具体为40-63μm；孔径具体为 可购于上海安谱实验科技股份有限公司；

所述涡旋振荡步骤中，转速为450-550rpm；具体为500rpm；时间为1-2min。

所述步骤3)中，用所述净化液制得进样溶液包括：将所述净化液干燥后复溶，得到进样溶液；

具体的，所述干燥步骤中，干燥方法为氮气吹干；

所述复溶步骤中，所用溶剂为由甲酸、甲醇和水组成的混合液；其中，甲醇和水的体积比为1：1；甲酸在混合液中的体积百分浓度为0.1％。

所述方法还包括：在所述HPLC-MS/MS检测步骤之前，将所述进样溶液用0.22μm有机相滤膜过滤。

所述步骤3)HPLC-MS/MS检测步骤中，HPLC检测条件如下：

所用色谱柱为C₁₈反相色谱柱；所述C₁₈反相色谱柱的内径具体为2.1mm；长度具体为50mm；填料粒径具体为3.5μm；

柱流速为0.3mL/min；

梯度洗脱条件为：

0-1.5min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从60％到10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从40％到90％；

1.51min起-2.0min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为90％；

2.01min起-2.01min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从10％到60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从90％到40％；

2.02min起-3.51min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为40％；

所述流动相0.1％甲酸水中，0.1％代表甲酸水溶液中甲酸的体积百分浓度；

所述0.1％甲酸甲醇溶液中，0.1％代表甲酸甲醇溶液中甲酸的体积百分浓度；

柱温度为40℃；

进样体积为5μL；

不分流进样。

所述3-氨基苯甲酸乙酯和3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的保留时间分别为1.08min、1.06min。

所述质谱条件如下：选用ESI电离和多反应监测模式(MRM)；雾化气流速为2.0mL/min；干燥气流速为10mL/min；加热气流速为10mL/min；加热块温度为400℃；曲型脱溶剂管温度为250℃。

本发明的原理是利用乙腈提取水产品中3-氨基苯甲酸乙酯，利用冷冻除脂肪和MSPD相结合净化提取液，利用干扰物质和目标物在色谱柱中的保留时间不同，经色谱柱分离后有选择性的将3-氨基苯甲酸乙酯及3-氨基苯甲酸乙酯-D₅转移到离子源中电离，从而避免了干扰物对3-氨基苯甲酸乙酯测定的影响；然后根据3-氨基苯甲酸乙酯及其同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅丰度比测定水产品中的真实值。

上述方法中，所用稳定同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅，如式I所示，

制备所述稳定同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的方法，包括：

以稳定同位素标记乙醇-D₆为同位素标记前体，与3-氨基苯甲酸经双分子酯化反应而得。

上述方法中，所述3-氨基苯甲酸和稳定同位素标记乙醇-D₆的摩尔比为1：(23～30)；具体为1：26。

所述双分子酯化反应步骤中，时间为1～5h；具体为2h；温度为室温。

所述双分子酯化反应在有机溶剂中进行。具体的，所述有机溶剂选自丙酮、乙腈、二氧六环中至少一种。

所述方法还包括：在所述双分子酯化反应步骤之后，将反应体系浓缩，用萃取剂萃取。

具体的，所述浓缩步骤中，浓缩方法为旋转蒸发；

所述萃取剂选自乙酸乙酯、乙醚和乙酸甲酯中至少一种。

更具体的，所述方法还包括：将反应体系浓缩，向浓缩所得体系中加水，用萃取剂萃取，合并萃取液，水洗，再次浓缩，硅胶柱层析。

与3-氨基苯甲酸乙酯结构类似物相比，采用稳定同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯作为内标对水产品中MS-222的含量进行测定显然更合适。特别对不同基质(如鱼、虾、蟹等)中含量低、需要准确定量的水产品检测，采用3-氨基苯甲酸乙酯结构类似物作为内标可能引起严重的误判。而本发明建立的方法简单、快速、准确。该发明面向国内外从事水产品中3-氨基苯甲酸乙酯高效液相色谱-同位素稀释质谱分析的高等院校和研究院所，各食品检测机构，将促进3-氨基苯甲酸乙酯同位素稀释质谱测定技术进步，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为3-氨基苯甲酸乙酯及其同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅多反应监测模式色谱质谱图。

图2为不同种类实际阴性水产品进行标准添加并测定的多反应监测模式色谱质谱图(添加浓度4.0μg/kg)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例所用稳定同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅可按照如下方法制得：量取5mL(85.6mmol)乙醇-D₆(DOCD₂CD₃)和0.5g(3.3mmol)3-氨基苯甲酸依次加入到圆底烧瓶中；将圆底烧瓶置于冰浴中，磁力搅拌条件下，逐滴加入0.5mL氯化亚砜；完毕后，将圆底烧瓶置于室温环境，持续磁力搅拌2h；反应完毕后，旋蒸浓缩至体积约为1mL；冷却至室温，加入150mL水；加入10mL乙酸乙酯萃取，重复萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液；加入50mL水洗涤乙酸乙酯萃取液，重复洗涤三次；旋蒸浓缩后采用硅胶层析柱进行分离纯化，即得到稳定同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅。

实施例1

1材料方法

1.1仪器

20At高效液相色谱仪(Shimadzu)，8060三重四级杆质谱仪(Shimadzu)等。

1.2试剂

乙腈(色谱纯，购于德国merck公司)，氯化钠和无水硫酸镁(分析纯，购于北京化工厂)，PSA(40-63μm,购于上海安谱实验科技股份有限公司)，3-氨基苯甲酸乙酯(进口，纯度>98％)，3-氨基苯甲酸乙酯和3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的标准溶液均配制在甲醇中。

1.3色谱条件

a)色谱柱：Kromasil C₁₈反相色谱柱((2.1mm×50mm,3.5μm)；

b)流动相及梯度洗脱条件：

0-1.5min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从60％到10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从40％到90％；

1.51min起-2.0min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为90％；

2.01min起-2.01min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从10％到60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从90％到40％；

2.02min起-3.51min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为40％；

所述流动相0.1％甲酸水中，0.1％代表甲酸水溶液中甲酸的体积百分浓度；

所述0.1％甲酸甲醇溶液中，0.1％代表甲酸甲醇溶液中甲酸的体积百分浓度；

c)进样量：5μL；

d)柱温：40℃；

e)流动相流速：0.3mL/min。

1.4质谱条件

电离方式为ESI电离；多反应监测模式参数见表1；雾化气压力：2.0mL/min；干燥气压力：10mL/min；加热气压力：10mL/min；加热块温度：400℃；曲型脱溶剂管温度250℃。

1.5样品前处理

鱼体解剖、匀浆，得到鱼糜样品，-20℃冰箱中低温保存；称取2.0g鱼糜样品，室温下融解后于50mL具盖离心试管中，加100μL同位素标记内标3-氨基苯甲酸乙酯-D₅溶液(0.2mg/mL)充分浸润，浸润温度为室温，时间为2min；

加入10mL乙腈和醋酸钠缓冲液(pH4.0)混合溶液(体积比7：3)提取，500rpm漩涡振荡5min，；加入3g无水硫酸镁和1g氯化钠，500rpm涡旋振荡1min后，超声(200W)提取10min；-20℃环境中冷冻30min，10000rpm离心10min；将上清液转移到含有300mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂(PSA(粒径为40-63μm；孔径具体为购于上海安谱实验科技股份有限公司)的15mL离心管中，500rpm涡旋振荡2min，10000rpm离心10min；将上清液转移到15mL离心管中，氮吹至干，1mL流动相(由甲酸、甲醇和水组成的混合液；其中，甲醇和水的体积比为1：1；甲酸在混合液中的体积百分浓度为0.1％)复溶，经0.22μm有机相滤膜过滤后进行HPLC-MS分析。

2.结果与分析

2.1保留时间确定

本文采用乙腈作为提取溶剂和定容溶剂，将3-氨基苯甲酸乙酯和3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的标准品置于自动进样器，取5μL注入HPLC-MS进行测定，得到3-氨基苯甲酸乙酯和3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的多反应监测模式离子图，具体见图1。由图可知，3-氨基苯甲酸乙酯和3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的保留时间分别为1.08min、1.06min。

表1.3-氨基苯甲酸乙酯及其同位素标记3-氨基苯甲酸乙酯-D₅信息及多反应监测模式参数

2.2水产品中3-氨基苯甲酸乙酯测定再现性及精密度

采用标准添加法在不同种类水产品中添加不同浓度3-氨基苯甲酸乙酯，将净化好的试样溶液和相应的标准工作液，等体积进样测定，记录保留时间和峰面积，以m/z138为3-氨基苯甲酸乙酯的定量离子，以m/z139为内标物3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的定量离子，以峰面积按内标法进行定量测定。根据以上条件进行灵敏度、日内和日间多次重复测定考察再现性及精密度。不同种类水产品中3-氨基苯甲酸乙酯的方法定量限为4.0μg kg-1,日内和日间精密度(相对标准偏差)具体结果见表2：

表2、不同水产品中不同添加浓度的测定结果

从表2可见，对于不同水产品中3-氨基苯甲酸乙酯的不同添加浓度在连续多次测定，日内和日间相对标准偏差RSD<4％，表明精密度很好。

从表2可见，对于不同种类水产品中3-氨基苯甲酸乙酯的不同添加浓度在连续多次测定，不同添加浓度回收率均在92.08-97.50％。结果表明，检测方法再现性很好。

2.3水产品中3-氨基苯甲酸乙酯测定

选择实际阴性水产品进行标准添加并测定，添加浓度均为4.0μg/kg，多反应监测模式色谱质谱图见图2。

从图2可见，水产品分析3-氨基苯甲酸乙酯及3-氨基苯甲酸乙酯-D₅峰对称均匀，与其他杂峰明显分离，不存在杂峰干扰。

Claims (10)

1.3-氨基苯甲酸乙酯-D₅作为同位素内标在检测水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量中的应用。

2.一种利用稳定同位素稀释质谱法检测水产品中3-氨基苯甲酸乙酯含量的方法，包括：

1)将作为供试试料的水产品制成糜状物；

其特征在于：所述方法还包括：

2)将所述糜状物用3-氨基苯甲酸乙酯-D₅溶液浸润后，用乙腈进行提取，将所得提取液进行冷冻除脂和净化，得到净化液；

3)用所述净化液制得进样溶液，与标准溶液等体积进样进行HPLC-MS/MS检测，记录保留时间和峰面积，以m/z 138为3-氨基苯甲酸乙酯的定量离子，以m/z139为3-氨基苯甲酸乙酯-D₅的定量离子，以峰面积按照内标法进行HPLC-MS/MS定量测定，即由所述供试试料的峰面积得到所述供试试料中3-氨基苯甲酸乙酯的含量；

所述标准溶液中含有3-氨基苯甲酸乙酯。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述3-氨基苯甲酸乙酯-D₅溶液中和标准溶液中，溶剂均为甲醇或乙腈。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)用乙腈进行提取包括：用提取溶液和QuEChERS试剂盒一进行涡旋振荡，再超声提取，得到提取液；

所述提取溶液中含有乙腈。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述提取溶液由乙腈和醋酸钠缓冲液组成；所述乙腈和醋酸钠缓冲液的体积比具体为7：3；所述醋酸钠缓冲液的pH值具体为4.0；

所述提取溶液与所述糜状物的用量比为10-20ml：2.0g；

所述QuEChERS试剂盒一由无水硫酸镁和氯化钠组成；

所述涡旋振荡步骤中，转速为450-550rpm；用提取溶液涡旋振荡的时间为4-6min；用QuEChERS试剂盒一进行涡旋振荡的时间为0.5-1.5min；

所述超声提取步骤中，超声功率为150-250W；时间为8-12min。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)冷冻除脂包括：冷冻所述提取液，离心收集上清液；

具体的，所述冷冻步骤中，温度为-20--40℃；时间为30-60min。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)净化步骤中，净化方法为MSPD法；

具体为用QuEChERS试剂盒二进行涡旋振荡，离心收集上清液即为所述净化液；

所述QuEChERS试剂盒二具体为由300mg N-丙基乙二胺键合固相吸附剂组成；所述固相吸附剂具体为PSA；

所述涡旋振荡步骤中，转速为450-550rpm；时间为1-2min。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，用所述净化液制得进样溶液包括：将所述净化液干燥后复溶，得到进样溶液；

具体的，所述干燥步骤中，干燥方法为氮气吹干；

所述复溶步骤中，所用溶剂为由甲酸、甲醇和水组成的混合液；其中，甲醇和水的体积比为1：1；甲酸在混合液中的体积百分浓度为0.1％。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)HPLC-MS/MS检测步骤中，HPLC检测条件如下：

所用色谱柱为C₁₈反相色谱柱；所述C₁₈反相色谱柱的内径具体为2.1mm；长度具体为50mm；填料粒径具体为3.5μm；

柱流速为0.3mL/min；

梯度洗脱条件为：

0-1.5min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从60％到10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从40％到90％；

1.51min起-2.0min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为10％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为90％；

2.01min起-2.01min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比从10％到60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比从90％到40％；

2.02min起-3.51min末，流动相0.1％甲酸水溶液的体积百分比为60％，流动相0.1％甲酸甲醇溶液的体积百分比为40％；

所述流动相0.1％甲酸水中，0.1％代表甲酸水溶液中甲酸的体积百分浓度；

所述0.1％甲酸甲醇溶液中，0.1％代表甲酸甲醇溶液中甲酸的体积百分浓度；

柱温度为40℃；

进样体积为5μL；

不分流进样。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)HPLC-MS/MS检测步骤中，所述质谱条件如下：选用ESI电离和多反应监测模式；雾化气流速为2.0mL/min；干燥气流速为10mL/min；加热气流速为10mL/min；加热块温度为400℃；曲型脱溶剂管温度为250℃。