CN108760947A - 三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水产品中七种麻醉剂分析快速检测方法，属于检验技术领域。本发明利用三重四级杆气质联用质谱(GC‑MS/MS)筛选、定量和确证的原理，采用硅胶固相萃取柱，HP‑5MS UI毛细管柱为分析柱，在电喷雾正离子多反应监测模式(MRM)下建立测定水产品中丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、乙酸丁香酚酯、甲基异丁香酚、乙酸异丁香酚酯和三卡因7种麻醉剂的方法。该检测方法较传统仪器分析方法更为简单快捷，且线性相关性良好、检出限低至2.0μg/kg、具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的特点。

Description

三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法
技术领域
本发明属于产品安全与检测技术领域，具体涉及一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种渔用麻醉剂的方法。
背景技术
鲜活水产品受到我国消费者的普遍喜爱,由于水产品种分布的多样性，鲜活水产品跨地区、长时间的运输已成为常态。因此，在长途运输中对水产品进行有效地保活就显得更为重要。麻醉剂具有镇静、安眠作用，是一种降低伤亡、避免水产鲜度和品质下降的有效方法，越来越广泛的使用到水产流通领域。因而随着渔业的发展，渔用麻醉剂在国内水产养殖业的应用成为一种必然的趋势。目前,常用的渔用麻醉剂主要有MS-222(Tricaine，三卡因，间氨基苯甲酸乙酯)、丁香酚类化合物、二氧化碳等。其中丁香酚以其高效、低价、代谢快，近年来受到广泛关注，但其对肝细胞具有一定毒性。关于丁香酚对人体的危害及作为渔用麻醉剂的安全性在国际上仍具有一定的争议，日本、韩国、澳大利亚、新西兰、智利等国认为丁香酚是合法的渔用麻醉剂。然而，在最近的研究中，美国国家毒理学计划(NTP)通过对丁香酚类化合物的毒理作用进行研究表明，啮齿动物食用丁香酚后在一段时间内能导致其机体产生癌细胞或者是是潜在的致癌物；美国食品药品监督管理局(FDA)也禁止丁香酚化合物作为活鲜食用水产品的麻醉剂和镇定剂；国际癌症研究机构(IARC)的报告表明，丁香酚可导致小鼠肝细胞癌的发病率增加，并将其列为致癌第三种类型。MS-222作为水生动物麻醉剂具有易处理、效力迅速、安全性高等的特性，是美国FDA批准在指定种类水产品中使用的麻醉剂，但要经过21天停药期才能上市销售。
目前，中国对丁香酚类、MS-222等麻醉剂在水产品中的使用并没有制定相关的政策法规和限量标准。国内对各类渔用麻醉剂尚缺少有效的法规规范，缺少使用标准，但事实上部分品种已经在市面普遍使用。因为监管制度的滞后，缺乏对渔用麻醉剂使用安全性的权威判定，如不及时加以引导和监管，可能会越来越多的引起公众对渔用麻醉剂安全性的担忧和恐慌，影响社会安定，同时也不利于渔业经济的健康发展。因此对于安全性尚未定论或有潜在应用价值的渔用麻醉剂，应深入进行安全性研究，开发制定快速高效的并且适合我国国情的检测方法至关重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，包括下列步骤：
第一步：从水产品中提取麻醉剂并进行净化，得到待测样液；
第二步：对第一步得到的待测样液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
优选的技术方案为：从水产品中提取麻醉剂的方法包括：将水产品样品置于第一离心管中，先加内标/替代物混标，然后加入无水硫酸钠、正己烷和陶瓷均质子，涡旋混匀后超声提取10～20min，再8000rpm下离心4～6min，离心结束后移取上清液至一第二离心管中，再向第一离心管加入正己烷混匀后超声提取10～20min，再8000rpm下离心4～6min，获得的上清液加入第二离心管中，待固相萃取净化。
优选的技术方案为：所述内标/替代物混标为丁香酚-D3与3-氨基苯甲酸甲酯的混合物。
优选的技术方案为：所述固相萃取净化包括下列步骤：
S1、将上清液全部加入硅胶柱中，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S2、抽干，然后正己烷淋洗，正己烷淋洗时流速小于或等于1.0mL/min；
S3、抽干后加乙酸乙酯洗脱，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S4、收集液在小于或等于45℃条件下，氮气吹至3mL，然后用乙腈定容至5mL，涡旋混合后过0.22μm有机微孔滤膜，得到的滤液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
优选的技术方案为：所述硅胶柱为Waters Sep-Pak，规格500mg/6cc，硅胶柱在使用之前用正己烷活化。
优选的技术方案为：气相色谱分析条件为：色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.5mL/min；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度为80℃，保持0.5min，然后以8℃/min升至152℃，保持0min，再以2℃/min升至160℃，并保持0min，以60℃/min升至270℃，保持4min；进样方式：不分流；进样体积：1.0μL。
优选的技术方案为：三重四级杆质谱分析条件为：多反应监测模式；离子源：EI源；离子源温度：230℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：5.0min；四级杆温度：150℃；传输线温度：260℃；淬灭气：高纯氦气，2.25mL/min；碰撞气：高纯氮气，1.5mL/min。
附图说明
图1为三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的总离子流图(鱼肉中加标)。
图2为MRM模式下七种麻醉剂及其内标的质谱图(由左至右、由上至下分别为三卡因、丁香酚、乙酸异丁香酚酯、乙酸丁香酚酯、异丁香酚、甲基丁香酚、甲基异丁香酚、丁香酚-D3、3-氨基苯甲酸甲酯)。
图3三卡因的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图4丁香酚的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图5乙酰基异丁香酚酯的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图6乙酸丁香酚酯的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图7异丁香酚的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图8甲基丁香酚的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图9甲基异丁香酚的标准曲线(1.0～50μg/L)。
图10不同色谱柱中七种麻醉剂的色谱图。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明提供一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，是一种高效的前处理方法和全新的分析方法。
2、本发明对水产品中多种麻醉剂进行了固相萃取前处理和用三重四级杆气质联用仪进行多反应监测分析，方法简便快速，能够准确检测出水产品中七种麻醉剂含量，填补了水产品中麻醉剂检测方法的空缺。
3、本发明同时对水产品中七种麻醉剂进行固相萃取，前处理简单快捷，净化效果较好；水产品中七种麻醉剂采用三重四级杆气质联用仪进行分析，具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的特点。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
下述实施例中所用的器材、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法
1材料与方法
(1)仪器与试剂
气相色谱-质谱/质谱仪(Agilent 7890B-7000C)；氮吹仪(Organomation N-EVAP)；涡旋混合器(IKA)；超纯水器Milli-Q(Milliporeco)；离心机(湘仪)；电子天平(METTLER)。
标准品:丁香酚(Eugenol，纯度99.5％)，甲基丁香酚(Methyl eugenol，纯度99.5％)，异丁香酚(Isoeugenol，纯度98.8％)购自Dr.Ehrenstorfer；丁香酚-D3(Eugenol-D3，纯度98.8％)购自AccuStandard；3-氨基苯甲酸甲酯(3-Aminobenzoic acid methyl，纯度98.0％)购自TCI；乙酸丁香酚酯(Eugenyl acetate，纯度98.0％)，甲基异丁香酚(Methylisoeugenol，纯度98.0％)和三卡因(MS-222，纯度97.0％)均购自CNW；乙酸异丁香酚酯(Acetisoeugenol，纯度98.0％)购自ChromaDex。乙腈、正己烷、乙酸乙酯和丙酮为色谱纯，无水硫酸钠为分析纯(经550℃干燥4h)，所有用水均为超纯水。
硅胶柱(500mg/6cc，Sep-Pak)，PRiME HLB小柱(200mg/6cc，Oasis)，HLB小柱(500mg/6cc，Oasis)和MCX小柱(60mg/3cc，Oasis)均购自Waters公司。Dispersive SPE(15mL)购自Agilent公司，Cleanert MAS-Q购自迪马公司。
(2)溶液的配制
标准储备溶液(1000μg/mL)：准确称取丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、三卡因、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酸异丁香酚酯、丁香酚-D3、3-氨基苯甲酸甲酯标准品各10mg，分别用乙腈溶解后定容至10mL，配置成1000μg/mL标准储备溶液，置于-18℃冰箱冷藏保存。
标准稀释溶液(10.0μg/mL)：准确吸取100μL丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、三卡因、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酸异丁香酚酯七种麻醉剂标准储备溶液，用乙腈定容至10mL，配置成10.0μg/mL标准稀释溶液，置于4℃冰箱冷藏保存。
内标稀释溶液(10.0μg/mL)：准确吸取100μL丁香酚-D3、3-氨基苯甲酸甲酯两种麻醉剂标准储备溶液，用乙腈定容至10mL，配置成10.0μg/mL内标稀释溶液，置于4℃冰箱冷藏保存。
(3)前处理方法
称取5.00g样品，置于50mL离心管中，加入5g无水硫酸钠、10mL正己烷及两粒陶瓷均质子，涡旋混匀1min，超声提取15min，8000rpm下离心5min，移取上清液至干净离心管中，再用加入5mL正己烷重复提取一次，合并上清液，待固相萃取净化。
将制备好的样品溶液全部加入硅胶柱(6mL正己烷活化)中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，2mL正己烷淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干后加8mL乙酸乙酯洗脱，控制流速小于0.5mL/min，收集液在低于45℃条件下，氮气吹至3mL，然后用乙腈定容至5mL，涡旋混合1min，过0.22μm有机微孔滤膜，滤液供GC-MS/MS测定。
(4)仪器条件
GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.5mL/min；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度为80℃,保持0.5min，然后以8℃/min升至152℃，保持0min，再以2℃/min升至160℃,并保持0min,以60℃/min升至270℃，保持4min。进样方式：不分流；进样体积：1.0μL；色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)；
MS-MS条件：离子源：EI源；离子源温度：230℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：5.0min；四级杆温度：150℃；传输线温度：260℃；淬灭气：高纯氦气，2.25mL/min；碰撞气(用于MRM)：高纯氮气，1.5mL/min。监测离子参数如表1所示。
表1七种麻醉剂及其内标的离子监测参数。
注：*为定量离子Note:*Quantitative Ion。
2、结果
2.1总离子流图
在上述仪器条件下，七种麻醉剂的总离子流图见图1。从图中可以看出目标化合物不仅达到完全分离，峰形良好，而且保留时间合理，在目标物出峰处无杂质干扰。
2.2专属性分析
七种麻醉剂和两种内标在多反应监测(MRM)模式下的质谱图见图2。在本实验条件下，13min内所有目标化合物均已出峰，可以有效的提高样品分析速度，13min后运行程序升温，使样品中高沸点的杂质残留流出，保证20min分析一个样品，且保护色谱柱避免惰性杂质干扰目标物分析。此外，质谱数据采用分段多反应监测模式，根据目标物出峰时间分成四段，缩短扫描所需的循环时间，使每个峰上得到的数据点数增多，大大提高了分析通量，确保了结果的稳定性和灵敏度。
由各物质的MRM图谱可以看出，色谱保留时间接近的化合物由于采集的离子不一样，可以明显的区分出不同目标物。虽然丁香酚和异丁香酚、甲基丁香酚和甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙酸异丁香酚酯两两互为同分异构体因此分子量相同，但是它们的子离子和色谱保留时间相差较大，可以明显区别开，不影响相互之间的定性和定量。
2.3线性关系和检出限、定量限
标准溶液按(2)中的仪器条件进行进样分析，以目标物浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数(详见表2)。其相关系数R2均大于0.999，说明在0～50μg/kg范围内七种麻醉剂的浓度和峰面积线性关系良好。
依据定性、定量离子色谱峰的信噪比(S/N)大于3为检出限(LOD)，S/N大于10为定量限(LOQ)，确定本方法七种麻醉剂的检出限为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg。
表2鱼肉中七种麻醉剂线性回归方程及其相关系数。
2.4准确度及精密度
在空白样品中添加待测物，使之理论含量为5.0、10.0和50.0μg/kg，经上述实验步骤处理后，对3个水平进行回收率测试(见表3)，每个浓度平行测定6次，分别考察3天，以相对标准偏差(RSD)计算批内和批间精密度。结果表明，方法的回收率在73.93～119.97％之间，且相对标准偏差满足GB/T 27404-2008要求，说明本方法的准确度和精密度较高，可以满足日常检测需求。
表3鱼肉中七种麻醉剂的回收率和精密度。
2.5实际样品分析
分别检测南美白对虾、基围虾、鳗鱼、黄鱼和多宝鱼等样品，考察实验结果，列举南美白对虾、基围虾的检测结果。南美白对虾样品中乙酸异丁香酚酯含量为23.5μg/kg、丁香酚含量为3.8μg/kg。基围虾的乙酸异丁香酚酯含量为12.4μg/kg、异丁香酚含量为18.2μg/kg。且各样品中目标物的出峰位置附近并没有杂质峰干扰且峰型良好，因此能够进行定性及定量。
丁香酚主要存在于丁香油、樟脑油、肉桂叶油、肉豆蔻油中，常温下为淡黄色黏稠油状液体，呈强烈的丁香气息和特殊辛辣味，微溶于水而易溶于有机溶剂。MS-222为白色微细粉末状晶体，溶解度约11％，易溶于水，水溶液为无色澄清酸性液体，见光易变成黄褐色。两种类型麻醉剂的理化特性完全不同，分离提取是个难点，本实验考察了不同固相萃取柱和分散固相萃取方式，实验结果表明：HLB小柱净化后六种丁香酚类化合物损失严重，MS-222的回收率偏低；六种丁香酚类化合物在MCX小柱回收率优于HLB小柱，但结果偏低；PRiMEHLB小柱和硅胶柱处理后，六种丁香酚类化合物回收率可以满足检测要求，但是MS-222经PRiME HLB小柱处理后损失较大，而硅胶柱对所有目标物都有较好的保留；此外，尝试两种不同分散固相萃取方法，Dispersive SPE和Cleanert MAS-Q，回收率可以满足要求，但是后期实验发现分散固相萃取方法的净化效果没有硅胶柱好，因此，实验前处理采用硅胶柱进行富集净化。
参照相关资料，并考虑方法的通用性，本实施例首先选用固定相为甲基聚硅氧烷的气质常用毛细管色谱柱DB-5MS，七种麻醉剂在该色谱柱的分离效果如图10所示，丁香酚、异丁香酚和MS-222出现明显的拖尾，且化合物出峰时间集中在4min内，分离效果不理想；而改用HP-5MS UI毛细管柱后，在相同仪器条件下，目标物的峰宽均小于0.12min，拖尾现象得到改善，基线噪音显著降低，分离得到的目标化合物峰型对称且其分离度和灵敏度均有所提高。
目前国内外对于丁香酚残留测定方法研究的报道集中于药品、化妆品和中草药等领域，而关于水产品中丁香酚残留的检测和分析的报道很少，主要检测方法有：液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法。对于MS-222残留检测，较常见的是液相色谱-质谱联用法和气相色谱-质谱联用法。
比对了液相色谱-质谱联用法、气质联用法和三重四级杆气质联用法。液相色谱-质谱联用法仅适用于MS-222残留检测，而丁香酚类由于挥发性太强、沸点低，在液质上碎片离子较小容易受干扰，所以液质联用检测丁香酚的结果不稳定。气质联用法能同时分析七种麻醉剂，但是检出限较高，基质干扰明显。丁香酚和其同位素内标丁香酚-D3打碎后得到的相同特征碎片离子由于保留时间相同，在气质中无法区分，而在三重四级杆气质中，两物质的前级离子不同，即使其产物离子和保留时间均一致，也可以完全区分开；且三重四级杆气质的灵敏度较高，七种麻醉剂检出限可达到2μg/kg，使用普通气质测定时，目标物测定低限为10μg/kg。
在选定的色谱条件下，通过分析七种麻醉剂标准溶液(50μg/L)的单杆全扫描(MS1Scan)质谱得到每种物质的总离子流图，选择m/z和相对丰度较高的一级碎片为目标化合物的母离子，确定保留时间和前级离子；在产物离子扫描(Product Ion)模式下，设定合适的碰撞电压，使目标物母离子与碰撞气体(高纯氮气)进行碰撞诱导解离，进一步裂解产生碎片离子得到二级质谱图，分别选取丰度较强且基质干扰较小的碎片离子作为定量和定性子离子；选择多反应监测(MRM)模式，进一步优化碰撞能量，使特征碎片离子产生的离子对强度均达到最大，各目标物的最佳碰撞电压列于表1。
本实施例基于气相色谱联用三重四级杆质谱技术，建立的GC-MS/MS检测方法，采用多反应监测模式，根据保留时间、特征离子对及其丰度比可对鱼虾等水产品中七种麻醉剂同时进行筛选、定量和确证，具有灵敏度高、抗基质干扰、高准确性和高稳定性的特点，能满足水产品中丁香酚类和MS-222麻醉剂残留量的检测要求，对保障消费者的健康,维护我国水产品的正常进出口贸易具有一定的意义。
实施例二：三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法
一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，所述方法包括以下步骤：
1)从水产品中提取并净化丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、乙酸丁香酚酯、甲基异丁香酚、乙酸异丁香酚酯和三卡因7种麻醉剂；
2)将步骤1)净化提取后的待测样液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于所述步骤1)中样品提取方法如下：称取5.00g样品，置于50mL离心管中，加50μL内标/替代物1mg/L混标，加入5g无水硫酸钠、10mL正己烷及两粒陶瓷均质子，涡旋混匀1min，超声提取15min，8000rpm下离心5min，移取上清液至干净离心管中，再用加入5mL正己烷重复提取一次，合并上清液，待固相萃取净化。
所加入的内标/替代物混标为丁香酚-D3以及3-氨基苯甲酸甲酯的混合物。
所述步骤1)中固相萃取净化方法如下：将制备好的样品溶液全部加入硅胶柱(6mL正己烷活化)中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，2mL正己烷淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干后加8mL乙酸乙酯洗脱，控制流速小于0.5mL/min，收集液在低于45℃条件下，氮气吹至3mL，然后用乙腈定容至5mL，涡旋混合1min，过0.22μm有机微孔滤膜，滤液供GC-MS/MS测定。
硅胶柱为Waters Sep-Pak，规格500mg/6cc。
所述步骤2)中，气相色谱分析条件为：色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.5mL/min；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度为80℃,保持0.5min，然后以8℃/min升至152℃，保持0min，再以2℃/min升至160℃,并保持0min,以60℃/min升至270℃，保持4min。进样方式：不分流；进样体积：1.0μL。
所述步骤2)中，三重四级杆质谱分析条件为：多反应监测模式(MRM)；离子源：EI源；离子源温度：230℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：5.0min；四级杆温度：150℃；传输线温度：260℃；淬灭气：高纯氦气，2.25mL/min；碰撞气(用于MRM)：高纯氮气，1.5mL/min。监测离子参数如下
实施例三：三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法
一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，包括下列步骤：
第一步：从水产品中提取麻醉剂并进行净化，得到待测样液；
第二步：对第一步得到的待测样液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
从水产品中提取麻醉剂的方法包括：将水产品样品置于第一离心管中，先加内标/替代物混标，然后加入无水硫酸钠、正己烷和陶瓷均质子，涡旋混匀后超声提取20min，再8000rpm下离心6min，离心结束后移取上清液至一第二离心管中，再向第一离心管加入正己烷混匀后超声提取20min，再8000rpm下离心6min，获得的上清液加入第二离心管中，待固相萃取净化。
所述内标/替代物混标为丁香酚-D3与3-氨基苯甲酸甲酯按照1：1的质量比例构成的混合物。
所述固相萃取净化包括下列步骤：
S1、将上清液全部加入硅胶柱中，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S2、抽干，然后正己烷淋洗，正己烷淋洗时流速小于或等于1.0mL/min；
S3、抽干后加乙酸乙酯洗脱，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S4、收集液在小于或等于45℃条件下，氮气吹至3mL，然后用乙腈定容至5mL，涡旋混合后过0.22μm有机微孔滤膜，得到的滤液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
所述硅胶柱为Waters Sep-Pak，规格500mg/6cc，硅胶柱在使用之前用正己烷活化。
气相色谱分析条件为：色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.5mL/min；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度为80℃，保持0.5min，然后以8℃/min升至152℃，保持0min，再以2℃/min升至160℃，并保持0min，以60℃/min升至270℃，保持4min；进样方式：不分流；进样体积：1.0μL。
三重四级杆质谱分析条件为：多反应监测模式；离子源：EI源；离子源温度：230℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：5.0min；四级杆温度：150℃；传输线温度：260℃；淬灭气：高纯氦气，2.25mL/min；碰撞气：高纯氮气，1.5mL/min。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (7)

1.一种三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：包括下列步骤：
第一步：从水产品中提取麻醉剂并进行净化，得到待测样液；
第二步：对第一步得到的待测样液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：从水产品中提取麻醉剂的方法包括：将水产品样品置于第一离心管中，先加内标/替代物混标，然后加入无水硫酸钠、正己烷和陶瓷均质子，涡旋混匀后超声提取10～20min，再8000rpm下离心4～6min，离心结束后移取上清液至一第二离心管中，再向第一离心管加入正己烷混匀后超声提取10～20min，再8000rpm下离心4～6min，获得的上清液加入第二离心管中，待固相萃取净化。
3.根据权利要求2所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：所述内标/替代物混标为丁香酚-D3与3-氨基苯甲酸甲酯的混合物。
4.根据权利要求2所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：所述固相萃取净化包括下列步骤：
S1、将上清液全部加入硅胶柱中，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S2、抽干，然后正己烷淋洗，正己烷淋洗时流速小于或等于1.0mL/min；
S3、抽干后加乙酸乙酯洗脱，控制流速小于或等于0.5mL/min；
S4、收集液在小于或等于45℃条件下，氮气吹至3mL，然后用乙腈定容至5mL，涡旋混合后过0.22μm有机微孔滤膜，得到的滤液采用三重四级杆气质联用仪进行分析。
5.根据权利要求4所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：所述硅胶柱为Waters Sep-Pak，规格500mg/6cc，硅胶柱在使用之前用正己烷活化。
6.根据权利要求2所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：气相色谱分析条件为：色谱柱：HP-5MS UI毛细管柱(30m×0.320mm×0.25μm)；GC条件：载气：高纯氦气(99.9995％)，恒流流速1.5mL/min；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度为80℃，保持0.5min，然后以8℃/min升至152℃，保持0min，再以2℃/min升至160℃，并保持0min，以60℃/min升至270℃，保持4min；进样方式：不分流；进样体积：1.0μL。
7.根据权利要求2所述的三重四级杆气质联用检测水产品中多种麻醉剂的方法，其特征在于：三重四级杆质谱分析条件为：多反应监测模式；离子源：EI源；离子源温度：230℃；离子化能量：70eV；溶剂延迟：5.0min；四级杆温度：150℃；传输线温度：260℃；淬灭气：高纯氦气，2.25mL/min；碰撞气：高纯氮气，1.5mL/min。
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