CN109609567A - 一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的l-色氨酸绿色生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于氨基酸发酵技术领域，公开了一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L‑色氨酸绿色生产方法，将菌体从色氨酸发酵液中分离出来，经过预处理后采用胰蛋白酶进行酶水解，在发酵过程中使用菌体蛋白酶解液作为有机氮源制备发酵培养基，发酵生产L‑色氨酸。本发明提高了菌体生长速度，提高了遗留菌体蛋白效价，大大降低了生产成本，在工业上具有较高的实用推广价值。

Description

一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产 方法

技术领域

本发明属于L-色氨酸生产领域，尤其是一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸。近年来L-色氨酸的生产技术在不断革新，生产成本不断下降，使其逐渐成为继L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸之后的第四大氨基酸添加剂。

L-色氨酸的生产最早主要依靠蛋白质水解法和化学合成法，但是随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法又可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法，目前L-色氨酸生产主要以微生物发酵法生产为主。微生物发酵法具有原料价格低廉、工艺控制简单、产品质量可靠等优点。但随着发酵工业的快速发展，发酵法生产L-色氨酸对培养基营养成分和发酵调控的合理性提出了更高的要求。优良的L-色氨酸生产菌株、合理的培养基组成和适当的发酵调控策略有利于提高L-色氨酸的产酸水平。

在生产成本方面，目前生产色氨酸主要利用微生物直接发酵法，生产过程中的培养基的质量决定了生产成本。以酵母粉作为L-色氨酸发酵培养基，存在着酵母粉色素杂质多、内毒素毒害菌体和价格较高等不足，在副产品方面，发酵遗留菌体是其中最主要的副产物。一般的菌体处理方法都是将菌体经过简单处理后用作有机肥料，这样不仅降低了其产品附加值，还造成了资源的极大浪费。因此为了降低生产成本和实现绿色生产，需要对L-色氨酸发酵生产工艺进行改进，以实现资源的循环利用和绿色生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有色氨酸发酵生产技术的不足之处，提供了一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案。

一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法，其特征在于，使用菌体酶解液作为有机氮源制备发酵培养基，进行L-色氨酸发酵。

进一步地，所述菌体酶解液的制备方法为：取色氨酸发酵液中的大肠杆菌菌体，用水稀释至干菌体浓度为10-20g/L的菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的盐酸溶液，混匀，在90-100℃下处理1-2h，然后添加胰蛋白酶进行水解，得到菌体蛋白酶解液。

进一步地，所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为5h。

进一步地，所述方法包括如下步骤：以10-15%接种量将L-色氨酸工程菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，流加消泡剂消泡；当罐内系统残糖浓度＜0.1g/L时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，发酵时间为38-42h，即得L-色氨酸发酵液。

进一步地，所述发酵培养基为：葡萄糖7-8g/L、菌体酶解液200-300mL/L、柠檬酸4-6g/L、硫酸铵1-3g/L、磷酸氢二钾5-10g/L、硫酸亚铁50-100mg/L、硫酸镁1-2g/L、生物素0.1-0.3 mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

进一步地，所述菌体酶解液为250mL/L。

进一步地，所述营养液为：葡萄糖的浓度为100-500g/L，吲哚的浓度为1-2g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。

优选地，所述盐酸溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。

优选地，所述胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，添加量为：酶与底物干质量比为4%。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本方法以L-色氨酸发酵菌体蛋白为原料，经胰蛋白酶水解后代替酵母粉作为L-色氨酸作为有机氮源制成发酵培养基，原料来自发酵后遗留菌体，成本低廉，与用做饲料相比，蛋白效价更高，效益更好，可以直接降低工业成本，提高产品效益。

本方法中的酶解过程操作简便，且处理条件温和，无需更改现有的设备和工艺条件，适合全面推广。

采用本方法发酵生产色氨酸，提高了菌体的生长速度和菌体生物量，L-色氨酸产量和糖酸转化率也有一定提高，在工业生产方面有较大的实用价值。

色氨酸合成途径复杂，受较多因素的影响，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养物质改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升；为解决菌体早衰和产酸效率低，提高中后期菌体活力，选择流加葡萄糖、吲哚和肌醇，提高菌体细胞产酸能力，进一步提高色氨酸产量。随着发酵时间的增加，大肠杆菌能够产生部分丝氨酸，通过流加吲哚，从而可以利用大肠杆菌色氨酸合成酶催化丝氨酸和吲哚合成色氨酸，提高色氨酸的产量；适量的肌醇可以强化CO2 固定反应, 促进氨基酸的积累，提高发酵转化率；多种因素相互协同，提高了色氨酸的发酵产量。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法，使用菌体酶解液作为有机氮源制备发酵培养基，进行L-色氨酸发酵，具体步骤如下：

配制发酵培养基：葡萄糖8g/L、菌体酶解液300mL/L、柠檬酸4.6g/L、硫酸铵1.8g/L、磷酸氢二钾9g/L、硫酸亚铁65mg/L、硫酸镁1.6g/L、生物素0.2 mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

所述菌体酶解液的制备方法为：取色氨酸发酵液中的大肠杆菌菌体，用水稀释至干菌体浓度为18g/L，在菌悬液中添加相同体积的浓度为0.4mol/L的盐酸溶液，混匀，在100℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶在其最适条件下进行水解，即得到蛋白质含量为255mg/g（干菌体）、总游离氨基酸含量为312.69 mg/g（干菌体）的菌体蛋白酶解液。

所述的胰蛋白酶的最适处理条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为5h；所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，最佳添加量为：酶与底物干质量比为4%。

配制营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1g/L，肌醇的浓度为0.5g/L，115℃下灭菌15min；

控制发酵工艺条件：所用菌株为L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，以10%接种量将L-色氨酸种子液（OD₆₀₀值为12）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，通过一定脉冲比流加消泡剂消泡；当罐内系统残糖浓度＜0.1g/L时，以适当脉冲将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.8g/L；直至发酵结束，发酵时间为40h，即得富含L-色氨酸发酵液。

实施例2

一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸生产方法，使用菌体酶解液作为有机氮源制备发酵培养基，进行L-色氨酸发酵，具体步骤如下：

配制发酵培养基：葡萄糖7.5g/L、菌体酶解液250mL/L、柠檬酸4.0g/L、硫酸铵1.2g/L、磷酸氢二钾8.5g/L、硫酸亚铁58mg/L、硫酸镁1.6g/L、生物素0.1 mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

所述菌体酶解液的制备方法为：取色氨酸发酵液中的大肠杆菌菌体，用水稀释至干菌体浓度为20g/L，在菌悬液中添加相同体积的浓度为0.6mol/L的盐酸溶液，混匀，在95℃下处理1h，之后添加胰蛋白酶在其最适条件下进行水解，即得到蛋白质含量为263mg/g（干菌体）、总游离氨基酸含量为318.21 mg/g（干菌体）的菌体蛋白酶解液。

所述的胰蛋白酶的最适处理条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为6h；所述的胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，最佳添加量为：酶与底物干质量比为4%。

配制营养液：葡萄糖的浓度为100g/L，吲哚的浓度为1.5g/L，肌醇的浓度为0.8g/L，115℃下灭菌15min。

控制发酵工艺条件：所用菌株为L-色氨酸工程菌大肠杆菌(E. coli) TRTH，以10%接种量将L-色氨酸种子液（OD₆₀₀值为11）接入发酵培养基中，培养温度36.8～37.0 ℃，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0～7.2之间，通过一定脉冲比流加消泡剂消泡；当罐内系统残糖浓度＜0.1g/L时，以适当脉冲将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度1g/L；直至发酵结束，发酵时间为38h，即得富含L-色氨酸发酵液。

实施例3

菌体酶解液对菌体生物量、色氨酸产量以及糖酸转化率的影响。

设置对照组，对照组1：采用10g/L的酵母粉来替代菌体酶解液，其余同实施例1；对照组2:采用5g/L的酵母粉替代一半量的菌体酶解液，其余同实施例1；实验组：实施例1。具体结果见表1：

表1

组别	实验组	对照组1	对照组2
				菌体生物量g/L	45.6	43.1	44.7
色氨酸产量g/L	50.8	43.2	46.9
				糖酸转化率%	23.3	19.1	21.4

结论：如表1所示，现有的发酵培养基（对照组1）的同期技术指标为：发酵周期内菌体生物量最高为43.1g/L；产色氨酸产量为43.2g/L，糖酸转化率为19.1%。通过数据对比可以发现，采用本发明的培养基，最高菌体生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率均有所提高，可以说明本发明培养基在L-色氨酸发酵生产中是非常可行的，而且实现废物利用和绿色发酵生产，节能减排，减少了发酵成本。

二、营养液组分对发酵液中菌体生物量、色氨酸产量以及糖酸转化率。

设置对照组，其中，对照组1：营养液中不添加吲哚和肌醇，其余同实施例1；对照组2：营养液中不添加吲哚，其余同实施例1；对照组3：营养液中不添加肌醇，其余同实施例1；实验组为实施例1。具体见表2：

表2

组别	实验组	对照组1	对照组2	对照组3
					菌体生物量g/L	45.6	42.6	45.1	43.9
色氨酸产量g/L	50.8	41.3	46.2	44.7
					糖酸转化率%	23.3	19.5	21.8	21.2

结论：色氨酸的合成途径较为复杂，通过代谢工程手段改造大肠杆菌积累色氨酸时，往往会出现生长问题，本研究通过优化营养因子，逐步改善了细胞代谢途径，色氨酸积累得到提升。在发酵的中后期添加吲哚和肌醇，两种组分相互协同，能够提高菌体生物量和色氨酸产量；综合对照组2和对照组3的实验结果可知，吲哚对菌体生物量影响较小，对色氨酸的产量有一定的促进作用，而肌醇对菌体生物量和色氨酸产量均起到正向调节作用；吲哚和肌醇协同性能较好，能够提高色氨酸的产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用菌体蛋白酶解液代替酵母粉的L-色氨酸绿色生产方法，其特征在于，使用菌体酶解液作为有机氮源制备发酵培养基，进行L-色氨酸发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌体酶解液的制备方法为：取色氨酸发酵液中的大肠杆菌菌体，用水稀释至干菌体浓度为10-20g/L的菌悬液，往菌悬液中添加相同体积的盐酸溶液，混匀，在90-100℃下处理1-2h，然后添加胰蛋白酶进行水解，得到菌体蛋白酶解液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的胰蛋白酶的水解条件为：pH为8、温度为37℃、水解时间为5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以10%-15%接种量将L-色氨酸工程菌种子液接入发酵培养基中，培养温度36.8-37.0 ℃，通过数控自动流加25%氨水维持罐内系统pH在7.0-7.2之间，流加消泡剂消泡；当罐内系统残糖浓度＜0.1g/L时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为0.5-1g/L；直至发酵结束，发酵时间为38-42h，即得L-色氨酸发酵液。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：葡萄糖7-8g/L、菌体酶解液200-300mL/L、柠檬酸4-6g/L、硫酸铵1-3g/L、磷酸氢二钾5-10g/L、硫酸亚铁50-100mg/L、硫酸镁1-2g/L、生物素0.1-0.3 mg/L；pH控制在6.5-7.0，在115℃下灭菌15min。

6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述菌体酶解液为250mL/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述营养液为：葡萄糖的浓度为100-500g/L，吲哚的浓度为1-2g/L，肌醇的浓度为0.5-1g/L，115℃下灭菌15min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述盐酸溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的酶活力为4000U/g，添加量为：酶与底物干质量比为4%。