重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒
技术领域
本发明属于基因治疗领域,更具体地,涉及一种重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法、系统及重组杆粒。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点,是基因治疗领域最具应用前景的载体之一。
目前利用杆状病毒表达系统大规模制备rAAV的方法主要有三种:两杆状病毒系统(Two Bac system)、依赖包装细胞系的一杆状病毒系统(One Bac system)、不依赖包装细胞系的基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(One Bac system)。两杆状病毒系统的主要流程是,将AAV的Rep基因和Cap基因通过穿梭质粒介导的Tn7重组整合在一个杆状病毒基因组中,将ITR核心表达元件通过穿梭质粒介导的Tn7重组整合到另外一个杆状病毒基因组中,然后将上述两种重组杆状病毒BEV共同感染宿主细胞,产生出rAAV(Smith等,2009,Mol.Ther.17:1888-1896)。依赖包装细胞系的一杆状病毒系统的主要流程是,先建立诱导表达Rep基因和Cap基因的包装细胞系,这种包装细胞系整合了Rep基因和Cap基因表达元件,Rep基因和Cap基因分别置于杆状病毒晚期基因表达强启动子PH调控下,在PH启动子的上游加入了hr2增强子序列和AAV的Rep蛋白结合序列。在感染整合了携带外源目的基因(GOI)的ITR核心表达元件的重组杆状病毒BEV-(ITR-GOI)后,包装细胞系中的Rep基因和Cap基因被诱导表达,进而产生rAAV(Aslanidi等,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,206:5059-5064)。基于穿梭质粒的一杆状病毒系统的主要流程是:把AAV的Cap基因、Rep基因和ITR核心表达元件一起构建到一个穿梭质粒上,通过Tn7转座子介导的重组将穿梭质粒上携带的rAAV包装元件整合到一个杆状病毒基因组中,然后将这一种重组杆状病毒BEV感染宿主细胞从而产生rAAV(Yang等,2018,Mol Ther Methods Clin Dev.2018Jul 4;10:38-47.)。
然而,前者由于两种杆状病毒共同感染细胞效率较低,无法充分利用每个细胞的产能,而且感染是个随机的过程,容易产生不含核酸的空壳缺陷rAAV颗粒,制备工艺条件优化起来比较复杂,不同批次制备的rAAV质量不稳定。后者由于依赖诱导表达Rep基因和Cap基因的包装细胞系,构建复杂,优良包装细胞系的筛选难度大,制备不同血清型的rAAV,就需要建立表达相应血清型Cap基因的包装细胞系,灵活性和通用性较差,难以推广。第三种方法的难点主要在于穿梭质粒的构建,制备含有一种rAAV核心表达元件的不同血清型的rAAV就需要制备相应血清型的穿梭质粒,同时携带了Cap基因、Rep基因和ITR核心表达元件的穿梭质粒构建难度大。当用作基因治疗药物时,需要针对每一基因治疗片段,构建多种血清型的穿梭质粒,合成成本过高,限制了其实际应用。更重要的是,由于rAAV包装元件都是构建在单个穿梭质粒上通过Tn7转座子集中整合在多角体(Polyhedron,polh)基因座中,产生的BEV传代稳定性受到影响,甚至不如Two Bac系统的BEV病毒,因此并不适合于对稳定性要求高的大规模批量化的生产和应用。另一方面,该系统的兼容性有待提高,因此用于生产基因治疗载体药物仍然有很大的改进需求。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法、系统及重组杆粒,其目的在于,通过将携带异源功能性基因片段的rAAV ITR核心表达元件包含于穿梭质粒中,产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框分置包含于穿梭质粒和杆状病毒基因组上,从而降低穿梭质粒的构建难度,提高基因治疗载体制备系统整体的稳定性、兼容性和灵活性,由此解决现有的重组腺相关病毒的杆状病毒制备系统的穿梭质粒构建难度较大、系统灵活性和通用性较差,病毒稳定性差、难以推广的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种rAAV的制备方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
所述穿梭质粒至少包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件;
所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒包含其他产生重组腺相关病毒所必需的功能蛋白组分的表达框;
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
优选地,所述rAAV的制备方法,其步骤(1)所述穿梭质粒相应重组杆粒为非必需基因Chia基因和/或Cath基因缺失的杆状病毒基因组。
优选地,所述rAAV的制备方法,其所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必需基因Chia(105,353bp-107,008bp)、Cath(107,054bp-108,025bp)、Ac124(103,864bp-104,607bp)、p10(118,911bp-119,915bp)、p26(118,116bp-118,838bp)、p74(119,207bp-121,144bp)、ctx(2085bp-2246bp)、egt(11,427bp-12,947bp)、39k(29,371bp-30,198bp)、orf51(43,312bp-44,268bp)、gp37(51,417bp-52,325bp)、iap2(61,150bp-61,899bp)和odv-e56(129,080bp-130,210bp)基因座的一个或多个基因座中。
优选地,所述rAAV的制备方法,其所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必须基因Chia和/或Cath基因座中。
优选地,所述rAAV的制备方法,其步骤(1)所述的含有杆状病毒基因组的重组杆粒按照如下方法制备:
通过Red重组将所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框插入到所述非必需基因的基因座中。
优选地,所述rAAV的制备方法,其所述穿梭质粒基于pfast.Bac.Dual质粒,其包含AAV的Rep基因或Cap基因的表达框。
优选地,所述rAAV的制备方法,其所述重组杆粒源自于杆状病毒AcMNPV的基因组,其至少包含产生rAAV所必需的AAV Cap基因和/或Rep基因的表达框,产生腺相关病毒所必需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控。
按照本发明的另一个方面,提供了一种rAAV的制备系统,所述系统包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
所述穿梭质粒至少包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件;
所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒包含其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框。
优选地,所述rAAV的制备系统,其所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒为Chia和/或Cath基因缺失的杆状病毒基因组。
优选地,所述rAAV的制备系统,其所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必需基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。
优选地,所述rAAV的制备系统,其所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必须基因Chia和/或Cath基因座中。
优选地,所述rAAV的制备系统,其所述穿梭质粒基于pfast.Bac.Dual质粒,其包含AAV的Rep基因或Cap基因的表达框。
优选地,所述rAAV的制备系统,其所述重组杆粒源自于杆状病毒AcMNPV的基因组,其至少包含的产生rAAV所必需的AAV Cap基因和/或Rep基因的表达框,产生腺相关病毒所必需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控。
按照本发明的另一个方面提供了一种用于制备rAAV的重组杆粒,所述重组杆粒至少包含一种产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框;所述产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自非必须基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。
优选地,所述用于制备rAAV的重组杆粒,其Chia和/或Cath基因缺失。
优选地,所述用于制备rAAV的重组杆粒,其产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自非必须基因Chia和/或Cath基因座中。
优选地,所述用于制备rAAV的重组杆粒,其源自于杆状病毒AcMNPV的基因组。
优选地,所述用于制备rAAV的重组杆粒,其产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,能够取得下列有益效果:
本发明提供的rAAV的制备方法及系统,通过在穿梭质粒和含有杆状病毒基因组的重组杆粒上分别负载rAAV的核心表达元件及其他产生rAAV的功能蛋白表达框,使得本发明一方面具备灵活性和兼容性,即对于制备不同的携带有异源功能性基因片段的rAAV,只需要构建一种相应含有ITR核心表达元件的穿梭质粒,而无需重新构建多种穿梭质粒;另一方面提高了含生产所述rAAV全部功能元件的重组杆状病毒基因组的BEV的传代稳定性。同时,对于现有的rAAV的杆状病毒制备系统兼容性良好。
附图说明
图1是本发明制备rAAV的杆状病毒系统策略及相应构成组件示意图。A.rAAV包装元件在pFBD穿梭质粒与AcMNPV重组杆粒的中分配的原理图;B.rAAV主要包装元件的构建策略;C.pFBD穿梭质粒图;D.AcMNPV重组杆粒及其主要非必须基因座示意图,其中杆状病毒AcMNPV基因组为双链环状DNA,的全长133,966bp,序列和图谱参考(Maghodia等,2014,Genome Announc.,2(6):e01202-14.),AcMNPV Bacmid(bMON14272)的结构参考(Luckow等,J Virol,1993.67(8):4566-79.);
图2是实施例1中重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-Rep感染Sf9细胞制备rAAV的结果。A.重组杆粒Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-Rep构建示意图;B.BEV感染Sf9细胞活性检测;C.制备纯化的rAAV感染HEK293细胞活性检测;D.制备纯化的rAAV病毒粒子电镜检测;
图3是实施例2中重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-Cap感染Sf9细胞制备rAAV的结果。A.重组杆粒Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-Cap构建示意图;B.BEV感染Sf9细胞活性检测;C.纯化的rAAV感染HEK293细胞活性检测;D.纯化的rAAV病毒粒子电镜检测;
图4是实施例3中重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-Cap感染Sf9细胞制备rAAV的结果。A.重组杆粒Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-Cap构建示意图;B.BEV感染Sf9细胞活性检测;C.制备纯化的rAAV感染HEK293细胞活性检测;D.制备纯化的rAAV病毒粒子电镜检测;
图5是实施例4中重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-Cap感染Sf9细胞制备rAAV的结果。A.重组杆粒Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-Cap构建示意图;B.BEV感染Sf9细胞活性检测;C.制备纯化的rAAV感染HEK293细胞活性检测;D.制备纯化的rAAV病毒粒子电镜检测;
图6是实施例5中重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-Rep感染Sf9细胞制备rAAV的结果。A.重组杆粒Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-Rep构建示意图;B.BEV感染Sf9细胞活性检测;C.制备纯化的rAAV感染HEK293细胞活性检测;D.制备纯化的rAAV病毒粒子电镜检测;
图7是实施例1、2、3、4、5中相应的重组杆状病毒BEV感染Sf9细胞所制备rAAV的产率,单位是VG/cell。每组实验3个重组,标准偏差用误差线表示;
图8是实施例1、2、3、4、5中相应的重组杆状病毒BEV的稳定性分析图。各实施例中相应的P1-P8代BEV以MOI=3感染Sf9细胞后,利用蛋白免疫印迹检测感染的Sf9细胞中AAV的Rep和Cap蛋白的表达水平。A.基于穿梭质粒的一杆状病毒系统的重组杆状病毒BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Cap2-Rep2的稳定性分析图(参考Yang等,2018,Mol Ther Methods ClinDev.2018Jul 4;10:38-47.);B.实施例1中BEV稳定性分析图。C.实施例2中BEV稳定性分析图。D.实施例3中BEV稳定性分析图。E.实施例4中BEV稳定性分析图。F.实施例5中BEV稳定性分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的重组腺相关病毒(rAAV)的制备方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
所述穿梭质粒至少包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件;
所述穿梭质粒优选为pFBD质粒,其包含所述穿梭质粒至少包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件;其亦可包含部分产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框。功能蛋白组分的表达框可以是AAV功能蛋白组分的表达框或者是其他功能蛋白组分的表达框。
所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒包含其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框;
腺相关病毒功能蛋白组分的表达框,包括Rep基因和Cap基因,可都被包含在所述杆状病毒的重组杆粒基因组上。如此,则所述穿梭质粒仅包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件。则对于不同的异源功能性基因片段,仅需将其构建到穿梭质粒,而配合相应的含有杆状病毒基因组的重组杆粒。而相应的重组杆粒的类型仅与AAV功能蛋白组分的类型相关。另一方面,本发明实现的一杆状病毒系统(One Bac system),与依赖包装细胞系的一杆状病毒系统不同,不依赖包装细胞系;与基于穿梭质粒的一杆状病毒系统相比,一方面通用性、兼容性强,另一方面穿梭质粒的负载大大降低,因此重组杆状病毒BEV的稳定性大大提高。
现有的大多数制备rAAV的杆状病毒系统中,携带外源基因(AAV的Rep基因、Cap基因或ITR核心表达元件)的重组杆状病毒采用的都是被插入到杆状病毒的非必须基因多角体基因(Polyhedron,polh)位点,选择插入这个基因座通常能够获得很高的表达水平;为了便于重组杆状病毒的构建,通常利用商业化的Bac-to-Bac系统。Bac-to-Bac系统的原理是:首先将外源基因构建到穿梭质粒中,接着将重组穿梭质粒转化含有重组杆粒的大肠杆菌,通过Tn7转座子介导的细菌水平重组将重组穿梭质粒携带的外源基因整合到重组杆粒中。然后将从上述大肠杆菌中抽提获得的重组杆粒DNA转染昆虫细胞后拯救出携带有外源基因的重组杆状病毒BEV。该系统中这种既能在大肠杆菌中进行复制增殖又能在昆虫细胞中进行复制并包装出重组杆状病毒的大分子环状DNA被称为杆粒(Bacmid)。因为杆粒携带有细菌复制原点、抗生素抗性基因、重组杆状病毒基因组和Tn7重组克隆位点。该系统最早的开发者Luckow等就是选用多角体基因(polh)位点作为Tn7重组克隆位点的(Luckow等,1993,J.Virol.67(8):4566-4579)。
虽然单一基因座也可以同时插入多种外源基因序列,但单一位点插入容易造成病毒基因组的不稳定,在插入外源基因的种类数量方面存在明显限制因素。因此需要摸索其他适合负载rAAV包装元件的位点。
在杆状病毒基因组中已经发现了多种允许异源基因高表达的其他非必须基因的基因座。例如:Noad等发现了ctx、egt、39k、orf51、pg37、iap2、odv-e56非必须基因座(Noad等,2009,BMC Molecular Biology10:87)。Kaba等研究表明,几丁质酶(Chitinase,Chia)基因和组织蛋白酶(Cathepsin,Cath)基因的敲除对胞内和分泌型重组蛋白稳定性有增强效果(kaba等,2004,Journal of Virological Methods,122,113-118)。Hitchman等研究表明,Chitinase、Cathepsin、P10、P26和P74基因的缺失能够提高外源蛋白的表达水平(Hitchman等,2009,Cell Biol Toxicol,26:57-68)。Liang等的研究表明,Ac124基因的敲除对于AcMNPV的增殖没有明显影响(Liang等,2015,Arch Virol,160(1):275-84.)。
然而,上述研究都没有表明缺失或替换这些杆状病毒的非必须基因座是否对于制备多蛋白复合体、rAAV或其他重组病毒载体有效,而这些基因座是否能负载AAV的功能蛋白组分的表达框,由于rAAV的复杂性及其制备中存在诸多困难,需要进一步的实验验证。
本发明实验显示:非必须基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座能成功负载并正常表达产生rAAV所必需的AAV Rep和Cap基因表达框。即优选方案,产生rAAV所必需的AAV Rep和Cap基因表达框同时都整合在所述重组杆粒中,其表达框被插入到所述杆状病毒选自非必须基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。该方案仅需要在上述重组杆粒的基础上将携带了rAAV ITR核心表达元件的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)通过Tn7转座子介导的重组获得整合了所有rAAV包装元件的一种重组杆状病毒基因组。其优势是,可以兼容现有的Three Bac、Two Bac以及依赖Sf9/Rep-Cap包装细胞系的OneBac系统,即其所构建的通用穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)可以直接与整合了AAV的Rep和Cap基因表达框的重组杆粒进行重组,获得一种能够制备rAAV的新型重组杆状病毒。该方案与基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(One Bac system)相比,降低了穿梭质粒的构建难度,将ITR核心表达元件与Rep和Cap基因表达框的空间间隔加大,使得新的重组杆状病毒BEV的稳定性有所提高,整体上提高了新系统的稳定性。
更优选方案,所述穿梭质粒相应的重组杆粒为非必须基因Chia基因和/或Cath基因缺失的杆状病毒基因组。所述其他产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必须基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。
优选地,所述其他产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自非必须基因Chia和/或Cath基因座中。
实验显示:Chia、Cath基因缺失后对rAAV的功能蛋白的稳定性有增强作用,Chia、Cath基因是蛋白酶基因,对AcMNPV在Sf9细胞中的复制和病毒产生是非必须基因。本研究发现确实这两个基因对rAAV病毒的产量没有负面作用。
同时,Chia基因和Cath基因座是紧密相邻的两个基因。在操作上优选利用同源重组的方法,使得在插入AAV Rep和/或Cap表达框的同时就可以缺失Cath和Chia基因。所以Cath、Chia基因位点本身就是可以用来插入,故优选Cath、Chia基因座作为插入位点。
因此以上方案中采用的重组杆状病毒优选按照如下方法制备:
通过Red重组将所述其他产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框替换非必须基因座上的基因片段。
利用Tn7转座子介导的重组是一种快速高效的将外源基因构建到重组杆状病毒基因组上的方法,但是该方法有很大局限性。首先是需要先在重组杆状病毒基因组上引入Tn7转座子识别序列;另外,不适合同时或多次在多个不同位点进行重组。目前,对重组杆状病毒基因组进行高效改造仍然是比较复杂和繁琐的工作。
Red重组是一种细菌水平的高效重组方法,能够在一定程度上用来快速改造重组杆状病毒基因组,Red重组是利用λ噬菌体Red重组酶(由Exo、Beta和Gam这3种蛋白质组成)将导入细胞的线性DNA片段与基因组的特定靶序列进行同源重组,从而实现目的基因的替换(参考Doublet等,2008,J Microbiol Methods.,75(2):359-61)。
优选地,所述重组杆粒源自于AcMNPV E2(基因组序列如:Genbank accessionNo.KM667940.1),AcMNPV Bacmid(bMON14272)的结构参考文献(Luckow等,J Virol,1993.67(8):4566-79.),产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控。
rAAV的包装主要需要3种主要的元件:rAAV的基因组即ITR核心表达元件、AAV的Rep功能基因、以及AAV的Cap功能基因。另外还包括AAP等其他功能蛋白组分,AAP基因对增加包装效率有一定的促进作用。
本发明提供的rAAV的制备方法,将带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件(ITR-GOI)和其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框分别置于穿梭质粒和重组杆粒上,从而分担携带异源基因片段的穿梭质粒的负载压力,提高重组杆状病毒的稳定性和该系统的兼容性与灵活性。
尤其是当负载的功能蛋白组分的表达框是具有多种不同血清型的Cap基因时,可有效的降低穿梭质粒以及相应杆状病毒的复杂程度。具体如当制备rAAV时,产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框包括Rep基因表达框和Cap基因表达框。制备不同血清型的rAAV,通常可以选用2型Rep基因,但对于决定AAV感染范围和靶向特异性的Cap基因来说,就必须选用特定血清型的Cap基因。而有多少种AAV血清型,就有多少种特定血清型的Cap基因,迄今已经开发出100多种AAV血清型和突变型。现有的基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在穿梭质粒上同时含有Rep基因和Cap基因,因此对于特定的异源功能性基因片段,为了制备不同种类AAV血清型的重组杆状病毒,需要制备多种不同的穿梭质粒,构建难度非常大,同时穿梭质粒本身基因组较小,同时容纳Rep基因、Cap基因和ITR核心表达元件,稳定性较差。有研究数据表明上述高度整合的重组杆状病毒BEV只能够稳定传代4代,第5代后BEV制备rAAV的产率会显著降低(参考Yang等,2018,Mol Ther Methods Clin Dev.2018Jul 4;10:38-47.)。
优选方案之一,穿梭质粒上含有ITR-GOI的同时还含有Cap基因表达框pFBD-Cap-(ITR-GOI),相应的重组杆粒则需要整合了Rep基因表达框和其他功能蛋白组分表达框。这种情况下,各种ITR-GOI与各种血清型Cap基因,可以根据需要,灵活的组合在pFBD穿梭质粒上。而只需要一种整合了Rep2基因表达框的重组杆粒,就能满足各种不同血清型和携带不同异源功能性基因片段的rAAV的制备。保持了基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(One Bacsystem)的灵活性,一定程度上降低了穿梭质粒的构建难度,将ITR-GOI核心表达元件与Rep基因表达框的空间间隔加大,使得新的重组杆状病毒的稳定性有所提高,一定程度上提高了新系统的稳定性。
优选方案之二,穿梭质粒上含有ITR-GOI的同时还含有Rep基因表达框pFBD-Rep-(ITR-GOI)时,相应的重组杆粒则需要整合了Cap基因表达框和其他功能蛋白组分表达框。这种情况下,需要构建相应的多种整合了不同血清型Cap基因表达框的重组杆粒,才能满足携带不同异源功能性基因片段和各种不同血清型rAAV的制备。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(One Bac system),一定程度上降低了穿梭质粒的构建难度,将ITR-GOI核心表达元件与Cap基因表达框的空间间隔加大,使得新的重组杆状病毒的稳定性有所提高,一定程度上提高了新系统的稳定性,但是系统的灵活性有所降低。
优选方案之三,穿梭质粒上仅含有ITR-GOI,相应的重组杆粒则需要整合了Rep基因表达框、Cap基因表达框和其他功能蛋白组分表达框。这种情况下,需要构建整合了Rep2基因表达框和相应的多种不同血清型Cap基因表达框的重组杆粒,才能满足携带不同异源功能性基因片段和各种不同血清型的rAAV的制备。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统(One Bac system),最大程度地降低了穿梭质粒的构建难度,将ITR-GOI核心表达元件与Rep和Cap基因表达框的空间间隔加大,使得新的重组杆状病毒的稳定性有所提高,整体上提高了新系统的稳定性。另外,还能够与之前的多种Bac系统的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)很好的兼容。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
具体地,利用穿梭质粒携带Tn7转座子与重组杆粒上特定位点进行重组的方式整合携带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件。
穿梭质粒可将ITR核心表达元件整合到杆状病毒基因组上,优选多角体基因(polh)位点,然而穿梭质粒自身的基因组较小,能够携带的外源基因片段大小有限。此前,为了达到仅采用一种重组杆状病毒感染普通昆虫细胞系制备rAAV的目的,将AAV的Rep基因和Cap基因和ITR核心表达元件都插入到穿梭质粒上,造成穿梭质粒构建困难,整合后的重组杆粒在单一位点上负载较大量的外源性基因片段,因此稳定性较差。
本发明提供的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,由于ITR核心表达元件和Rep基因、Cap基因分别负载在不同位点,显著提高了重组杆粒及其所制备的重组杆状病毒BEV的稳定性。尤其是Rep基因和/或Cap基因插入在Chia和/或Cath基因座中时,整体稳定性得到明显提高。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
具体地,将步骤(2)中获得的重组杆粒转染相应宿主细胞系后制备所述rAAV,包括但不限于以下方式:
抽提转染:将含有所述重组杆粒DNA从大肠杆菌中抽离纯化,再转染到宿主细胞系中;
直接感染:将含有所述重组杆粒转染到宿主细胞系后获得重组杆状病毒BEV,再用BEV直接感染相应宿主细胞系;
抽提转染产毒速度快,适合制备早期BEV病毒种子库;直接感染的感染效率高,适合大量扩增BEV病毒用于大量制备rAAV。
本发明提供的重组腺相关病毒的制备系统,所述系统包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
所述穿梭质粒至少包含带有异源功能性基因片段的rAAV核心表达元件;所述穿梭质粒优选基于pfast.Bac.Dual质粒;作为本发明的优选方案,其所述穿梭质粒包含AAV的Rep基因或Cap基因的表达框。
所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒包含其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框。所述含有杆状病毒基因组的重组杆粒为Chia基因和/或Cath基因缺失的杆状病毒。所述其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述重组杆粒选自非必需基因Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。
优选方案,所述其他产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自Chia和/或Cath基因座中。
如上所述Chia和/或Cath基因的缺失,使得rAAV功能蛋白的稳定性增强,Cath和Chia基因为相邻基因座,负载能力强、操作方便。
本发明提供的用于制备rAAV的重组杆粒,所述重组杆粒至少包含一种产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框;所述其他产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv-e56基因座的一个或多个基因座中。
优选方案所述产生rAAV所需的功能蛋白组分的表达框被插入到所述杆状病毒选自Chia和/或Cath基因座。
优选地,所述杆状病毒基因组源自于AcMNPV,其至少包含的产生rAAV所必需的AAVCap基因和/或Rep基因的表达框,产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框位于P10或PH启动子下游受其调控。
以下为实施例:
实施例1.利用DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-Rep制备rAAV
当穿梭质粒pFBD上含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI和AAV的Cap基因表达框时,相应的重组杆粒则整合了AAV的Rep基因表达框和其他功能蛋白组分表达框(图2A)。
一种rAAV的制备系统,包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;所述穿梭质粒,基于pfast.Bac.Dual质粒,其多克隆位点插入有ITR-GOI序列及Cap基因,Cap基因置于P10启动子的下游;所述杆状病毒基因组的重组杆粒,为非必需基因Chia基因和Cath基因缺失的AcMNPV E2,其基因序列如:Genbank accession No.KM667940.1,其(位点范围105,353bp-108,025bp)内Chia和Cath基因缺失,Chia和Cath基因座上插入有Rep基因表达框。
利用本实施例提供的rAAV的制备系统,制备rAAV的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
1.1构建含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI和AAV的Cap基因表达框穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)-Cap。首先,我们利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac中的pFast.Bac.Dual(pFBD)穿梭质粒。实例中基于2型AAV的Cap基因依据核糖体泄露扫描原理进行了密码子优化(参考Smith等,2009,Mol.Ther.17:1888-1896),Cap基因置于P10启动子的调控之下,实现VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白以接近天然比例(1:1:10)的功能性表达。ITR核心表达元件,实例中ITR选用2型AAV的ITR核酸序列,ITR的核心表达元件采用了绿色荧光蛋白(GFP)表达框,由CMV启动子控制GFP的表达,便于检测rAAV的活性。ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与Cap基因的表达框或载体骨架相连(相应的Cap基因、ITR及其连接片段的序列参考见中国专利CN106916793A)。
1.2构建相应的缺失非必须基因Chia和Cath基因,同时在Chia和Cath基因座插入AAV Rep基因表达框的重组杆粒。
野生型AcMNPV杆粒中的Chia和Cath基因相邻,本实施例采用同时缺失Chia和Cath基因的优选方案。为了便于重组克隆操作,我们利用Red重组技术,使用转化有pKD46质粒并含有AcMNPV杆粒的大肠杆菌DH10Bac菌株,通过同源臂基因重组的方法来改造杆粒基因组。pKD46质粒是温度敏感型低拷贝质粒,在20~25℃条件下,加入阿拉伯糖可以诱导Exo、Beta和Gam这3种蛋白(即Red重组酶)的表达,能够将携带有同源臂的外源基因与细菌中的杆粒基因组进行高效的特异性重组(参考Doublet等,2008,J Microbiol Methods.,75(2):359-61)。为了便于重组子的筛选,引入两侧带有Frt序列的氯霉素(Chloromycetin,Chlo)抗性基因(用引物Frt-Chlo-F(SEQ ID NO.9)和Frt-Chlo-R(SEQ ID NO.10)从PKD3质粒上扩增片段P1-FRT-Chlo-P2),便于随后通过Flp重组酶的作用去除该抗性基因,可用于在杆粒基因组中连续多次利用Chlo抗性基因进行一系列的基因缺失或插入。我们利用Invitrogen公司的Bac-to-Bac系统中的pFBD穿梭质粒为骨架进行构建。在pFBD质粒的BsrGI酶切位点处引入上游同源臂Chia-up和氯霉素抗性基因片段P1-FRT-Chlo-P2。在pFBD质粒的AvrII酶切位点处引入下游同源臂Cath-Down。在pFBD质粒的PH启动子和/或P10启动子下游插入Rep基因和/或Cap基因,构成Rep基因和/或Cap基因的表达框。
本实例中基于2型AAV的Rep基因依据核糖体泄露扫描原理进行了密码子优化参考(Smith等,2009,Mol.Ther.17:1888-1896),Rep基因置于PH启动子的调控之下,实现Rep72、Rep52复制蛋白的功能性表达(相应的Rep基因序列参考见中国专利CN 106916793A)。
所述用于制备rAAV的重组杆粒按照如下方法制备:我们首先需要构建质粒pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down,步骤如下:
首先,我们以野生型AcMNPV杆粒DNA为模版,采用引物Chia-up-F(SEQ ID NO.1)和Chia-up-R(SEQ ID NO.2)扩增上游同源臂Chia-up片段;以引物Cath-down-F(SEQ IDNO.3)和Cath-down-R(SEQ ID NO.4)扩增下游同源臂Cath-Down片段;
我们将上游同源臂Chia-up片段和含氯霉素抗性基因的DNA片段P1-FRT-Chlo-P2用同源重组的方法克隆到psimple-T质粒上,构建psimple-T1-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2质粒。
然后,我们采用同源重组方法先将下游同源臂Cath-Down片段插入到pFBD质粒的AvrII酶切位点,构建pFBD-Cath-Down质粒。再通过同源重组的方法将片段Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2插入到pFBD-Cath-Down质粒的BsrG酶切位点,构建pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒。然后,将Rep基因插入到pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒的BamH1和Xba1酶切位点之间,使之位于PH启动子的调控之下,最终获得pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down质粒。
将pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down质粒用BsrGI和AvrII双酶切,电泳回收Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down核酸片段。然后,将该DNA片段电转化DH10Bac/pKD46感受态细胞,涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。电转48h后,挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定,筛选阳性克隆,测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源治疗性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备BEV,将重组穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)-Cap2转化含有相应的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2进行Tn7转座酶介导的同源重组,获得含有整合了全部rAAV包装元件的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Cap2-Δ(Chia-Cath)-Rep2。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV,大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE),用荧光显微镜可以观察大明显的绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图2B)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液,其中含有大量BEV,即为第1代BEV(P1),同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV(P1)以感染复数(MOI=3)感染悬浮培养的Sf9细胞,感染72小时后,将细胞培养液3000rpm离心5min,分别收集培养上清和细胞沉淀。细胞培养上清液,即为第2代BEV(P2)。
该系统所产生rAAV的纯化与病毒特性检测
将BEV感染后收集的Sf9细胞(约1×108cells),加入10ml裂解缓冲液(50mM Tris-Cl,150mM NaCl,2mM MgCl2,pH 8.0),反复冻融3次裂解,5000rpm离心10min收集上清,在上清中加入核酸酶(Benzonase)在37℃水浴处理60min,处理后5000rpm离心10min。收集的上清液用碘克沙醇密度梯度离心分离纯化(方法参考Aslanidi等,2009,Proc.NatlAcad.Sci.USA,206:5059-5064)。rAAV的滴度测定采用荧光定量PCR的方法,滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。实验结果表明,本实例中所获得的BEV感染Sf9细胞后,单个Sf9细胞rAAV的产量可达2.40×105VG(图7)。
将纯化的rAAV梯度稀释,感染96孔板中培养的HEK293细胞。感染2天后,用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。实验结果表明,该系统制备出的rAAV具有较高的体外感染活性(图2C)。
纯化后的rAAV用透射电子显微镜观察病毒颗粒形态。完整的实心rAAV颗粒,呈六角形均匀颗粒,空心无核酸的缺陷rAAV颗粒中间被染成深色。电镜照片统计结果表明,rAAV颗粒具有很高的完整率(图2D)。
本实施例制备的BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Cap2-Δ(Chia-Cath)-Rep2经过连续传代后感染Sf9细胞。通过蛋白免疫印迹实验检测Rep和Cap蛋白的表达的情况,测试重组杆状病毒BEV的稳定性。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在P1-P5代,Rep和Cap蛋白的表达水平较高,P5代后都逐渐降低,BEV稳定性在P5代后逐渐显著下降(图8A)。本实施例制备的BEV在P1-P8代Cap蛋白表达水平在P1-P4较稳定,P5代之后出现显著下降,而Rep蛋白表达水平在P1-P8代都较稳定(图8B)。综上,本实施例构建的BEV稳定性得到了一定程度的提高。
实施例2.利用DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-Cap制备rAAV
当穿梭质粒pFBD上含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI和AAV的Rep基因表达框时,相应的重组杆粒则需要整合了AAV的Cap基因表达框和其他功能蛋白组分表达框(图3A)。
一种rAAV的制备系统,包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;所述穿梭质粒,基于pfast.Bac.Dual质粒,其多克隆位点插入有ITR-GOI序列及Rep基因,Rep基因置于PH启动子的下游;所述杆状病毒基因组的重组杆粒,为非必需基因Chia和Cath基因缺失的AcMNPV E2,其基因序列如:Genbank accession No.KM667940.1,其(位点范围105,353bp-108,025bp)内Chia和Cath基因缺失,Chia和Cath基因座上插入有Cap基因表达框。
利用本实施例提供的rAAV的制备系统,制备rAAV的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
1.1构建含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI和AAV的Rep基因表达框的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)-Rep。首先,我们利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac中的pFast.Bac.Dual(pFBD)穿梭质粒。本实例中基于2型AAV的Rep基因依据核糖体泄露扫描原理进行了密码子优化(参考Smith等,2009,Mol.Ther.17:1888-1896),Rep基因置于PH启动子的调控之下,实现Rep72、Rep52复制蛋白的功能性表达。ITR核心表达元件,实例中ITR选用2型AAV的ITR核酸序列,ITR的核心表达元件采用了绿色荧光蛋白(GFP)表达框,由CMV启动子控制GFP的表达,便于检测rAAV的活性。ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与Rep基因的表达框或载体骨架相连(相应的Rep基因、ITR及其连接片段的序列参考实施例1)。
1.2构建相应的缺失非必须基因Chia和Cath基因,同时在Chia和Cath基因座插入AAV Cap基因表达框的重组杆粒。
野生型AcMNPV杆粒中的Chia和Cath基因相邻,本实施例采用同时缺失Chia和Cath基因的优选方案(参考实施例1进行Chia和Cath基因座的缺失的操作)。本实例中基于2型AAV的Cap基因序列参考实施例1。
所述用于制备rAAV的重组杆粒按照如下方法制备:
我们首先需要构建质粒pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down,步骤如下:
构建pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒(参考实施例1的方法)。然后,将Cap基因插入pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒的Sma1和Nhe1酶切位点之间,使之位于P10启动子的调控之下,最终获得pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down质粒。
将pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down质粒用BsrGI和AvrII双酶切,电泳回收Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down核酸片段。然后,将该DNA片段电转化DH10Bac/pKD46感受态细胞,涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。电转48h后,挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定,筛选阳性克隆,测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源治疗性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备BEV,将重组穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)-Rep2转化含有相应的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2进行Tn7转座酶介导的同源重组,获得含有整合了全部rAAV包装元件的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep2-Δ(Chia-Cath)-Cap2。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV,大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE),用荧光显微镜可以观察大明显的绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图3B)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液,其中含有大量BEV,即为第1代BEV(P1),同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。传代制备BEV(P2)的方法参考实施例1。
该系统所产生rAAV的纯化与病毒特性检测
将BEV感染Sf9细胞制备的rAAV进行纯化(参照实施例1中的方法步骤)。实验结果表明,本实例中所获得的BEV感染Sf9细胞后,单个Sf9细胞rAAV的产量可达1.85×105VG(图7)。
将纯化的rAAV梯度稀释,感染96孔板中培养的HEK293细胞。感染2天后,用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。实验结果表明,该系统制备出的rAAV具有较高的体外感染活性(图3C)。
纯化后的rAAV用透射电子显微镜观察病毒颗粒形态。完整的实心rAAV颗粒,呈六角形均匀颗粒,空心无核酸的缺陷rAAV颗粒中间被染成深色。电镜照片统计结果表明,rAAV颗粒具有很高的完整率(图3D)。
本实施例制备的Tn7-(ITR-GOI)-Rep2-Δ(Chia-Cath)-Cap2经过连续传代后感染Sf9细胞。通过蛋白免疫印迹实验检测Rep和Cap蛋白的表达的情况,测试重组杆状病毒BEV的稳定性。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在P1-P5代,Rep和Cap蛋白的表达水平较高,P5代后都逐渐降低,BEV稳定性在P5代后逐渐显著下降(图8A)。本实施例制备的BEV在P1-P8代Rep蛋白表达水平在P1-P4较稳定,P5代之后出现显著下降,而Rep蛋白表达水平在P1-P8代都没有显著降低(图8C)。综上,本实施例构建的BEV稳定性得到了一定程度的提高。
实施例3.利用DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-Cap制备rAAV
当穿梭质粒pFBD上仅含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI时,相应的重组杆粒则整合了AAV的Rep基因表达框、Cap基因表达框和其他功能蛋白组分表达框(图4A)。
一种rAAV的制备系统,包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;所述穿梭质粒,基于pfast.Bac.Dual质粒,其多克隆位点插入有ITR-GOI序列;所述杆状病毒基因组的重组杆粒,为非必需基因Cath基因和Chia基因缺失的AcMNPV E2,其基因序列如:Genbank accession No.KM667940.1,其(位点范围105,353bp-108,025bp)内Chia和Cath基因缺失,Chia和Cath基因座上插入有Cap基因和Rep基因表达框。
利用本实施例提供的rAAV的制备系统,制备rAAV的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒
1.1构建含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)。首先,我们利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac中的pFast.Bac.Dual(pFBD)穿梭载体。ITR核心表达元件,实例中ITR选用2型AAV的ITR核酸序列,ITR的核心表达元件采用了绿色荧光蛋白(GFP)表达框,由CMV启动子控制GFP的表达,便于检测rAAV的活性。ITR核心表达元件通过5’端连接核酸片段和3’端连接核酸片段与载体骨架相连(相应的ITR及其连接片段的序列参考实施例1)。
1.2构建相应的缺失非必须基因Chia和Cath基因,同时在Chia和Cath基因座插入AAV Rep基因表达框和Cap基因表达框的重组杆粒。
野生型AcMNPV杆粒中的Chia和Cath基因相邻,本实施例采用同时缺失Chia和Cath基因的优选方案(参考实施例1进行Chia和Cath基因座的缺失的操作)。本实例中基于2型AAV的Rep基因和基于2型AAV的Cap基因序列参考实施例1。
所述用于制备rAAV的重组杆粒按照如下方法制备:
我们首先需要构建质粒pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down,步骤如下:
构建pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒(参考实施例1的方法)。然后,将Rep基因插入到pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒的BamH1和Xba1酶切位点之间,使之位于PH启动子的调控之下;将Cap基因插入pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down质粒的Sma1和Nhe1酶切位点之间,使之位于P10启动子的调控之下,最终获得pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Down质粒。
将pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Down质粒用BsrGI和AvrII双酶切,电泳回收Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down核酸片段。然后,将该DNA片段电转化DH10Bac/pKD46感受态细胞,涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。电转48h后,挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定,筛选阳性克隆,测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源治疗性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备BEV,将重组穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)转化含有相应的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2进行Tn7转座酶介导的同源重组,获得含有整合了全部rAAV包装元件的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV,大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE),用荧光显微镜可以观察大明显的绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图4B)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液,其中含有大量BEV,即为第1代BEV(P1),同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。传代制备BEV(P2)的方法参考实施例1。
该系统所产生rAAV的纯化与病毒特性检测
将BEV感染Sf9细胞制备的rAAV进行纯化(参照实施例1中的方法步骤)。实验结果表明,本实例中所获得的BEV感染Sf9细胞后,单个Sf9细胞rAAV的产量可达3.60×105VG(图7)。
将纯化的rAAV梯度稀释,感染96孔板中培养的HEK293细胞。感染2天后,用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。实验结果表明,该系统制备出的rAAV具有较高的体外感染活性(图4C)。
纯化后的rAAV用透射电子显微镜观察病毒颗粒形态。完整的实心rAAV颗粒,呈六角形均匀颗粒,空心无核酸的缺陷rAAV颗粒中间被染成深色。电镜照片统计结果表明,rAAV颗粒具有很高的完整率(图4D)。
本实施例制备的BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2经过连续传代后感染Sf9细胞。通过蛋白免疫印迹实验检测Rep和Cap蛋白的表达的情况,测试重组杆状病毒BEV的稳定性。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在P1-P5代,Rep和Cap蛋白的表达水平较高,P5代后都逐渐降低,BEV稳定性在P5代后逐渐显著下降(图8A)。本实施例制备的BEV在P1-P8代Rep和Cap蛋白的表达水平都较稳定(图8D)。综上,本实施例构建的BEV稳定性得到了很大程度的提高。
实施例4.利用DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-Cap制备rAAV
一种rAAV的制备系统,包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;所述穿梭质粒,基于pfast.Bac.Dual质粒,其多克隆位点插入有ITR-GOI序列;所述杆状病毒基因组的重组杆粒,为非必需基因Chia基因、Cath基因以及Ac124基因缺失的AcMNPV E2,其基因序列如:Genbank accession No.KM667940.1,其(位点范围105,353bp-108,025bp)内Chia和Cath基因缺失,其(位点范围103,864bp-104,607bp)内Ac124基因缺失,Chia和Cath基因座上插入有Rep基因表达框,Ac124基因组上插入有Cap基因表达框(图5A)。
本实施例在实施例1的含有重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2菌株的基础上,通过其他的非必须基因座插入Cap基因表达框。本实施例中优选非必须基因Ac-124(参考Liang等,2015,Arch Virol,160(1):275-84.)。
利用本实施例提供的rAAV的制备系统,制备rAAV的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;
1.1构建含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI),参考实施例3中的方案。
1.2构建相应的缺失非必须基因Chia和Cath基因,同时在Chia和Cath基因座插入AAV Rep基因表达框;和缺失非必须基因Ac-124基因,同时在Ac-124基因座插入AAV Cap基因表达框的重组杆粒。
我们需要去除实施例1中大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2中重组杆粒基因组上的氯霉素(Chloromycetin,Chlo)抗性基因,以便从非必须基因Ac-124基因座进行新一轮的Red重组。pCP20质粒是一种温度敏感诱导表达FLP重组酶的质粒(参考Doublet等,2008,J Microbiol Methods.,75(2):359-61)。首先将pCP20质粒转化DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep菌,涂卡那霉素、四环素、氨苄青霉素抗性的LB平板,30度培养48小时,挑菌落用FLP引物进行PCR鉴定筛选,筛选出阳性菌。然后,将转化了pCP20质粒的DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2菌在卡那霉素、四环素、氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中,42度培养8小时诱导FLP重组酶基因表达,剪切去除Frt元件中的Chlo基因。挑取失去氯霉素抗性的菌进行PCR鉴定,该菌株命名为:DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChlo。
为了便于重组克隆操作,我们利用Red重组技术,使用转化有pKD46质粒的DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChlo菌株,通过同源臂基因重组的方法来改造杆粒基因组(原理和方法参考实施例1)。在pFBD质粒的BsrGI酶切位点处引入上游同源臂Ac124-up和氯霉素抗性基因片段P1-FRT-Chlo-P2。在pFBD质粒的AvrII酶切位点处引入下游同源臂Ac124-Down。在pFBD质粒的PH启动子和/或P10启动子下游插入Rep基因和/或Cap基因,构成Rep基因和/或Cap基因的表达框。本实例中基于2型AAV的Cap基因序列参考实施例1。
所述用于制备rAAV的重组杆粒按照如下方法制备:
我们首先需要构建质粒pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down,步骤如下:
首先,我们以野生型AcMNPV杆粒DNA为模版,采用引物Ac124-up-F(SEQ ID NO.5)和Ac124-up-R(SEQ ID NO.6)扩增上游同源臂Ac124-up片段;以引物Ac124-down-F(SEQ IDNO.7)和Ac124-down-R(SEQ ID NO.8)扩增下游同源臂Ac124-Down片段;
我们将上游同源臂Ac124-up片段和含氯霉素抗性基因的DNA片段P1-FRT-Chlo-P2用同源重组的方法克隆到psimple-T质粒上,构建psimple-T-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2质粒。
然后,我们采用同源重组方法先将下游同源臂Ac124-Down片段插入到pFBD质粒的AvrII酶切位点,构建pFBD-Ac124-Down质粒。再通过同源重组的方法将片段Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2插入到pFBD-Ac124-Down质粒的BsrGI酶切位点,构建pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down质粒。
然后,将Cap基因插入pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down质粒的Sma1和Nhe1酶切位点之间,使之位于P10启动子的调控之下,最终获得pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down质粒。
将pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down质粒用BsrGI和AvrII双酶切,电泳回收Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down核酸片段。然后,将该DNA片段电转化DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChlo/pKD46感受态细胞,涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。电转48h后,挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定,筛选阳性克隆,测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源治疗性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备BEV,将实施例4中所构建的重组穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)转化含有相应的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2进行Tn7转座酶介导的同源重组,获得含有整合了全部rAAV包装元件的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV,大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE),用荧光显微镜可以观察大明显的绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图5B)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液,其中含有大量BEV,即为第1代BEV(P1),同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。传代制备BEV(P2)的方法参考实施例1。
该系统所产生rAAV的纯化与病毒特性检测
将BEV感染Sf9细胞制备的rAAV进行纯化(参照实施例1中的方法步骤)。实验结果表明,本实例中所获得的BEV感染Sf9细胞后,单个Sf9细胞rAAV的产量可达2.27×105VG(图7)。
将纯化的rAAV梯度稀释,感染96孔板中培养的HEK293细胞。感染2天后,用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。实验结果表明,该系统制备出的rAAV具有较高的体外感染活性(图5C)。
纯化后的rAAV用透射电子显微镜观察病毒颗粒形态。完整的实心rAAV颗粒,呈六角形均匀颗粒,空心无核酸的缺陷rAAV颗粒中间被染成深色。电镜照片统计结果表明,rAAV颗粒具有很高的完整率(图5D)。
本实施例制备的BEV经过连续传代后,感染本实施例制备的BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2经过连续传代后感染Sf9细胞。通过蛋白免疫印迹实验检测Rep和Cap蛋白的表达的情况,测试重组杆状病毒BEV的稳定性。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在P1-P5代,Rep和Cap蛋白的表达水平较高,P5代后都逐渐降低,BEV稳定性在P5代后逐渐显著下降(图8A)。本实施例制备的BEV在P1-P8代Rep和Cap蛋白的表达水平都较稳定(图8E)。综上,本实施例构建的BEV稳定性得到了很大程度的提高。
实施例5.利用DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-Rep制备rAAV
一种rAAV的制备系统,包括:穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒;所述穿梭质粒,基于pfast.Bac.Dual质粒,其多克隆位点插入有ITR-GOI序列;所述杆状病毒基因组的重组杆粒,为非必需基因Chia基因、Cath基因以及Ac124基因缺失的AcMNPV E2,其基因序列如:Genbank accession No.KM667940.1,其(位点范围105,353bp-108,025bp)内Chia和Cath基因缺失,其(位点范围103,864bp-104,607bp)内Ac124基因缺失,Chia和Cath基因座上插入有Cap基因表达框,Ac124基因组上插入有Rep基因表达框(图6A)。
本实施例在实施例2的含有重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2菌株的基础上,通过其他的非必须基因座插入Rep基因表达框。本实施例中优选非必须基因Ac-124(参考Liang等,2015,Arch Virol,160(1):275-84.)。
利用本实施例提供的rAAV的制备系统,制备rAAV的方法,包括以下步骤:
(1)分别制备穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒
1.1构建含有rAAV的核心表达元件ITR-GOI的穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI),参考实施例3中的方案。
1.2构建相应的缺失非必须基因Chia和Cath基因,同时在Chia和Cath基因座插入AAV Cap基因表达框;和缺失非必须基因Ac-124基因,同时在Ac-124基因座插入AAV Rep基因表达框的重组杆粒。
我们需要去除实施例2中大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2中重组杆粒基因组上的氯霉素(Chloromycetin,Chlo)抗性基因,以便从非必须基因Ac-124基因座进行新一轮的Red重组。菌株DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChlo的构建参考实施例4中的方法。
为了便于重组克隆操作,我们利用Red重组技术,使用转化有pKD46质粒的DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChlo菌株,通过同源臂基因重组的方法来改造杆粒基因组(原理和方法参考实施例1)。在pFBD质粒的BsrGI酶切位点处引入上游同源臂(Ac124-up)和氯霉素抗性基因片段(P1-FRT-Chlo-P2)。在pFBD质粒的AvrII酶切位点处引入下游同源臂(Ac124-Down)。在pFBD质粒的PH启动子和/或P10启动子下游插入Rep基因和/或Cap基因,构成Rep基因和/或Cap基因的表达框。本实例中基于2型AAV的Rep基因序列参考实施例1。
所述用于制备rAAV的重组杆粒按照如下方法制备:
我们首先需要构建质粒pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down,步骤如下:
构建pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down质粒(参考实施例4的方法)。然后,将Rep基因插入pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down质粒的BamH1和Xba1酶切位点之间,使之位于PH启动子的调控之下,最终获得pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down质粒。
将pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down质粒用BsrGI和AvrII双酶切,电泳回收Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down核酸片段。然后,将该DNA片段电转化DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChlo/pKD46感受态细胞,涂卡那霉素、四环素、氯霉素三种抗性的LB平板。电转48h后,挑取蓝斑摇菌。小提杆粒DNA进行PCR鉴定,筛选阳性克隆,测序验证。我们将筛选出来的阳性菌株命名为DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2。
(2)利用步骤(1)中获得的穿梭质粒及其相应含有杆状病毒基因组的重组杆粒,将带有异源治疗性基因片段的rAAV核心表达元件与其他产生rAAV所必需的功能功能蛋白组分的表达框整合,获得包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒;
按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备BEV,将实施例5中所构建的重组穿梭质粒pFBD-(ITR-GOI)转化含有相应的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2进行Tn7转座酶介导的同源重组,获得含有整合了全部rAAV包装元件的重组杆粒的大肠杆菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2。
(3)将步骤(2)中获得的包含生产所述rAAV的重组杆状病毒基因组的重组杆粒,转染到宿主细胞系培养。
抽提该重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV,大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显病变现象(CPE),用荧光显微镜可以观察大明显的绿色荧光蛋白(GFP)的表达(图6B)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液,其中含有大量BEV,即为第1代BEV(P1),同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。传代制备BEV(P2)的方法参考实施例1。
该系统所产生rAAV的纯化与病毒特性检测
将BEV感染Sf9细胞制备的rAAV进行纯化(参照实施例1中的方法步骤)。实验结果表明,本实例中所获得的BEV感染Sf9细胞后,单个Sf9细胞rAAV的产量可达2.80×105VG(图7)。
将纯化的rAAV梯度稀释,感染96孔板中培养的HEK293细胞。感染2天后,用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。实验结果表明,该系统制备出的rAAV具有较高的体外感染活性(图6C)。
纯化后的rAAV用透射电子显微镜观察病毒颗粒形态。完整的实心rAAV颗粒,呈六角形均匀颗粒,空心无核酸的缺陷rAAV颗粒中间被染成深色。电镜照片统计结果表明,rAAV颗粒具有很高的完整率(图6D)。
本实施例制备的BEV经过连续传代后,感染本实施例制备的BEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2经过连续传代后感染Sf9细胞。通过蛋白免疫印迹实验检测Rep和Cap蛋白的表达的情况,测试重组杆状病毒BEV的稳定性。相比基于穿梭质粒的一杆状病毒系统,在P1-P5代,Rep和Cap蛋白的表达水平较高,P5代后都逐渐降低,BEV稳定性在P5代后逐渐显著下降(图8A)。本实施例制备的BEV在P1-P8代Rep和Cap蛋白的表达水平都较稳定(图8F)。综上,本实施例构建的BEV稳定性得到了很大程度的提高。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。