CN109601487B - 一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用 - Google Patents
一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种黑腹果蝇肿瘤模型在研究环境污染物单世代及多世代致癌毒性方面的应用，利用黑腹果蝇肿瘤模型对确认致癌物或有潜在致癌效应的环境污染物质进行单世代或持续多世代暴露，从而检测该污染物对生物体的致癌效应变化的方法。本发明确定了环境污染物应用于果蝇模型以评价致癌效应的可行性，在暴露剂量上更接近实际环境浓度，并且比较单世代暴露与多世代暴露的世代间致癌效应差异，获得该污染物对果蝇致癌毒性的强弱、毒性传递能力等效应。本发明弥补了现有对致癌毒性评价方法的单一性和伦理学限制，拓展了对污染物传统毒性评价的指标，具有可操作性，对模拟污染物低浓度、长期暴露于生物体的毒性评价进行了创新和补充。
Description
技术领域
本发明涉及生态毒理学、环境保护、生态风险评价等技术领域，尤其是涉及采用黑腹果蝇肿瘤模型对污染物进行单世代及多世代的致癌风险评价方法。
背景技术
黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)是一种理想的模式生物，具有个体小、繁殖力强、生长周期短、易于饲养和操作等优势，广泛用于遗传学研究，也是开展多世代研究的优势生物。但是在传统毒理学领域，黑腹果蝇并未常用于毒性效应的评价。尽管如此，黑腹果蝇与哺乳动物在肿瘤信号通路上高度保守，约有75％的人类疾病基因能在果蝇体内找到同源基因。因此，黑腹果蝇被认为是评价污染物低浓度、持久性致癌毒性的有效载体。
利用黑腹果蝇肿瘤模型判断基因对肿瘤增长、迁移或抑制的调控已有相应研究，但尚缺乏环境污染物刺激对肿瘤组织影响的相关成果。而已有的污染物的致癌效应往往基于流行病学统计或哺乳动物实验得到，其通常存在暴露条件不能反映实际环境、污染物多世代毒性的评价难以开展、污染物致癌毒性评价与机制研究方法比较匮乏的问题。已有研究证明了污染物能够影响黑腹果蝇肿瘤模型中肿瘤细胞迁移率，此方法为全面评价污染物在更贴近真实环境水平条件下对生物体单世代和多世代及不同性别的致癌毒性的效应提供基础。
CN108184770A公开了一种黑腹果蝇RasV12；Snail肿瘤迁徙模型的建立方法。利用UAS-Snail74b果蝇品系和Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，这个专利技术仅从生物学角度构建了肿瘤迁移模型，以此探索肿瘤迁移发生的基因层面的机制。上述肿瘤迁移模型虽然有助于阐述肿瘤迁移发生机制、强调理论研究，但并不能突出污染物诱发癌症、不能指示污染物暴露的实际健康风险；而且上述肿瘤迁移模型没有考虑世代以及性别的影响。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了黑腹果蝇肿瘤模型在研究环境污染物单世代及多世代致癌毒性方面的应用。本发明补充了传统污染物毒性评价指标，确定其致癌毒性效应，并通过黑腹果蝇模型模拟低浓度、全周期、多世代、分性别的污染物致癌效应。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的采用黑腹果蝇肿瘤模型研究环境污染物单世代和多世代致癌毒性的方法包括以下几个步骤：
(1)污染物应用于黑腹果蝇肿瘤模型品系的单世代致癌毒性效应：污染物需要提前配制梯度浓度和设置空白对照。未经污染物添加的培养基包含红糖、玉米粉、酵母、琼脂和丙酸，每配制1L培养基需量取红糖135g和琼脂粉7g，加水溶解，将混合液倒入电锅中加热至微沸状态，加入溶解后的85g玉米粉溶液，不断搅拌，防止结块粘锅。待其再次微沸，稍冷至60-70℃，倒入溶解的8g活性酵母和4mL丙酸。所有溶解所用的水均来自量取的1L超纯水。
污染物暴露后的培养基即在普通培养基冷却凝固前，用量杯准确称量一定量倒入灭菌后的玻璃管，每100g培养基加入2mL暴露液，对照组加入同体积的纯水或污染物稀释液搅拌混匀，可分装至10个玻璃管，每管10g，加棉花塞或海绵塞备用。
黑腹果蝇肿瘤模型包含的两类品系分别为：yw，ey-Flp；tub-Gal80，FRT40A；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP(185)和w；lgl4FRT40A UAS-Rasv12/Cyo；Sb/TM6B Tb(186)，我们将其编号为185和186，均来自Bloomington Drosophila Stock Centre(USA)实验室。为叙述方便，下面说明以编号代称。
185和186亲本果蝇分开品系转入暴露体系内，记为F0代。将通CO2气体的气枪枪头沿棉花塞与玻璃管口间隙插入管内，向管内通入一定量CO2，使果蝇被麻醉，而后转移至持续通CO2的果蝇麻醉盒上。利用显微镜2倍视野和镊子分别挑选F0代185的处女蝇和F0代186的雄蝇各五只为一组，转移至冷却凝固后含污染物的同一管培养基中，在其表面洒少许活酵母，放于25℃恒温，60％恒湿的培养箱内储存，每隔24h转管一次，使两品系在24h内充分杂交。保证每个浓度有10个以上平行组。
F0代185和186成虫杂交后产下的后代幼虫记为T0代。其中携带肿瘤的个体仅能生长至幼虫，无法进一步发育。在25℃下培养约3-4天，待T0代长至三龄幼虫后，用镊子挑取污染物暴露后和对照组的三龄幼虫放置于添加了PBS的解剖墨盘上，在显微镜3倍视野下用解剖镊从幼虫全长靠近头部的1/3处截断，将头部表皮反向剥离，暴露出内部组织于PBS中。
小心剥离幼虫眼部、脑部和脑腹神经索(VNC)。若形成了肿瘤组织，则组织分化不明显，将整团肿瘤组织单独剥离即可。在荧光显微镜6.3X放大倍数下，观察肿瘤组织发生绿色荧光的位置与强度，进行实时拍摄。在荧光显微镜下进一步将VNC与其他组织分离，单独拍摄。肿瘤迁移率作为致癌毒性的评价指标，以VNC组织中出现绿色荧光标记为迁移标志，统计发生迁移的个数，迁移率计算公式为：
(2)污染物连续暴露于果蝇肿瘤模型亲本品系的多世代致癌效应：将步骤(1)中暴露于污染物体系的F0代185和186分别转入含同浓度污染物的培养基体系中，进行同步骤(1)相同的培养方法。将F0代转入新的含污染物的培养基中，待原管中产下的后代发育为成虫后，第二代185及第二代186成虫，记为F1。将185及186品系的F1代成虫继续分品系放入同样浓度的含污染物培养基内，同上述的培养方式，得到其子代，即第三代，记为F2。以此类推，得到185和186的F3、F4......Fn成虫。
在2X放大倍数显微镜视野下，用CO2麻醉185品系的F1代处女蝇与186品系的F1代雄蝇，选取185品系的F1代处女蝇与186品系的F1代雄蝇各五只为一组在含同浓度污染物的培养基中，按照步骤(1)的方法进行杂交并培养。其产生的子代幼虫记为T1。F2、F3、F4等多世代185雌蝇及其同代186雄蝇交配产生的后代幼虫依次记为T2、T3、T4......Tn。T1-Tn代幼虫重复步骤(1)的方法解剖、观察、拍摄和统计肿瘤迁移率。
步骤(2)的符号标记总结为下图关系：
(3)雌雄性别对污染物产生致癌效应的影响检测：用CO2麻醉果蝇，并在2X显微镜放大倍数下挑取经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和未经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计。而后挑选连续暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的未经暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雌性个体连续暴露于污染物，但雄性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交。对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测。
挑取未经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计。而后挑选始终未暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的连续暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雄性个体连续暴露于污染物，但雌性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交。对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测。
(4)按照上述步骤(1)的操作步骤中获得的果蝇T0代各污染物浓度与对照组之间肿瘤迁移率的指标显著性差异，得到污染物对生物单世代致癌毒性的效应。根据步骤(2)的操作获得的果蝇T0-Tn代之间同一污染物浓度暴露下肿瘤迁移率的差异，得到污染物对生物多世代致癌毒性效应评价。根据步骤(3)不同性别果蝇单独暴露和步骤(1)所有性别一同暴露的指标差异结果，得到性别在污染物对生物产生单世代和多世代致癌效应上的影响。
将污染物的致癌毒性分为：不具有明确的致癌毒性(T0-Tn代暴露组与对照组之间不具备肿瘤迁移率显著性差异)、有可修复的致癌毒性(T0代暴露组与对照组间肿瘤迁移率有显著性差异，但随着代际增加，差异逐渐弱化甚至无显著差异)、有延迟性的致癌毒性(T0或前几代并未显现出暴露组与对照组肿瘤迁移率的显著性差异，但随着代际增加，肿瘤迁移率上升)和有不可修复的致癌毒性(T0-Tn代暴露组与对照组之间始终具有肿瘤迁移率显著性差异)。
按性别分为污染物仅通过雌性个体即可产生致癌毒性(雌蝇单世代与多世代暴露而雄蝇始终未经暴露即可使T0-Tn产生与对照组之间肿瘤迁移率的显著性差异)、污染物仅通过雄性个体即产生致癌毒性(雄蝇单世代与多世代暴露而雌蝇始终未经暴露即可使T0-Tn产生与对照组之间肿瘤迁移率的显著性差异)、污染物需通过两种性别个体才可产生致癌毒性(仅在雌雄个体都经历污染物暴露才使T0-Tn产生与对照组之间肿瘤迁移率的显著性差异)及污染物产生致癌毒性与性别无关(无论哪种性别个体暴露，其T0-Tn代幼虫的肿瘤迁移率与对照组均无显著性差异，或差异保持同一水平)。
本发明有益的技术效果在于：
与现有技术相比，本发明首次引入环境污染物应用于相似的果蝇肿瘤模型之中，确定了环境污染物应用于果蝇模型以评价致癌效应的可行性，重点在于污染物的致癌效应评价创新。
本发明在暴露剂量上更接近实际环境浓度，补充了多世代的长期暴露毒性和考虑性别对毒性的影响，并且比较了单世代暴露与多世代暴露的世代间致癌效应差异，获得该污染物对果蝇致癌毒性的强弱、毒性传递能力等效应。
本发明弥补了现有对致癌毒性评价方法的单一性和伦理学限制，拓展了对污染物传统毒性评价的指标，与传统污染物毒性效应评价相比，补充了致癌毒性的生物学评价方法。
本发明利用果蝇肿瘤模型评价污染物，不仅拓宽了受试生物，也实现了多世代致癌毒性评价的可操作性和便捷性。
本发明具有可操作性，对模拟污染物低浓度、长期暴露于生物体的毒性评价进行了创新和补充。并且考虑了生物性别对污染物的致癌毒性效应的影响。本方法保持了更贴近实际环境浓度的条件，也实现了全生命周期的覆盖。
附图说明
图1为黑腹果蝇肿瘤模型示意图；
图2为肿瘤迁移率随林丹浓度的变化图；
图3为林丹暴露下肿瘤迁移效果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
1、污染物应用于黑腹果蝇肿瘤模型品系的单世代致癌毒性效应：首先配制污染物梯度浓度和空白对照。配制0.1、10、1000μg/L林丹梯度浓度和1个空白对照组，即含0.1％体积的二甲基亚砜水溶液。
无污染物培养基包含红糖、玉米粉、酵母、琼脂和丙酸，每配制1L培养基需量取红糖135g和琼脂粉7g，加水溶解，将混合液倒入电锅中加热至微沸状态，加入溶解后的85g玉米粉溶液，不断搅拌，防止结块粘锅。待其再次微沸，稍冷至60-70℃，倒入溶解的8g活性酵母和4mL丙酸。所有溶解所用的水均来自量取的1L超纯水。
含林丹的培养基的配制是在普通培养基未凝固前，量取100g培养基加入2mL林丹溶液或0.1％体积的二甲基亚砜水溶液，搅拌混匀，可分装至10个玻璃管，每管10g，加棉花塞或海绵塞备用。
黑腹果蝇肿瘤模型包含的两类品系分别为：yw，ey-Flp；tub-Gal80，FRT40A；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP(185)和w；lgl4FRT40A UAS-Rasv12/Cyo；Sb/TM6B Tb(186)，我们将其编号为185和186，均来自Bloomington Drosophila Stock Centre(USA)实验室，果蝇肿瘤模型示意图如图1。为叙述方便，下面说明以编号代称。
185与186分别培养于含林丹的固体培养基中。将185或186第一代培养于含林丹的培养基中的亲本记为F0代。将通CO2气体的气枪枪头沿棉花塞与玻璃管口间隙插入管内，向管内通入一定量CO2，使果蝇被麻醉，而后转移至持续通CO2的果蝇麻醉盒上。利用显微镜挑选F0代185的处女蝇和F0代186的雄蝇各五只为一组，转移至冷却凝固后含林丹的培养基中，在其表面洒少许活酵母，放置于25℃恒温，60％恒湿的培养箱内。每隔24h转管一次，保证每个浓度有10个以上平行组。
F0代185和F0代186成虫杂交后产下的后代幼虫记为T0代。其中携带肿瘤的个体仅能生长至幼虫，无法进一步发育。在25℃下发育3-4天后，待T0代长至三龄幼虫后，用镊子挑取暴露组或对照组的三龄幼虫放置于添加PBS的解剖墨盘上，在显微镜下用解剖镊从幼虫全长靠近头部的1/3处截断，将头部表皮反向剥离，暴露出内部组织于PBS中。小心剥离幼虫眼部、脑部和脑腹神经索(VNC)。若形成了肿瘤组织，则组织分化不明显，将整团肿瘤组织单独剥离即可。
在荧光显微镜6.3X放大倍数下，观察肿瘤组织发生绿色荧光的位置与强度，进行实时拍摄。在荧光显微镜下进一步将VNC与其他组织分离，单独拍摄。肿瘤迁移率作为致癌毒性的评价指标，以VNC组织中出现绿色荧光标记为迁移标志，统计发生迁移的个数，迁移率计算公式为：
即完成林丹对单世代果蝇致癌效应的影响结果，得到对照组的肿瘤迁移率为50％，暴露组的肿瘤迁移率结果见图2，迁移效果图见图3。
2、污染物连续暴露于果蝇肿瘤模型亲本品系的多世代致癌效应：将步骤1中分别培养的F0代185和F0代186成虫分别转入含同浓度林丹的培养基体系中，进行同步骤1相同的培养方法。F0代转入新鲜的含林丹培养基中。待原管中产下的第二代185或186长至成虫，记为F1。将185或186品系的F1成虫继续分品系放入同样浓度的含林丹培养基内，同上述的培养方式，得到其子代，即第三代，记为F2。以此类推，得到185(或186)的F3、F4......Fn成虫。
在2X放大倍数显微镜视野下，用CO2麻醉F1代成虫，选取185品系的F1代处女蝇与186品系的F1代雄蝇各五只为一组放入含同浓度林丹的培养基中，按照步骤1的方法进行杂交并培养。其产生的子代幼虫记为T1。F2、F3、F4等多世代185雌蝇及其同代186雄蝇交配产生的后代幼虫依次记为T2、T3、T4......Tn。
T1-Tn代幼虫重复步骤1的方法解剖、观察、拍摄和统计肿瘤迁移率，得到T1-Tn的对照组肿瘤迁移率依然保持在50％左右，但T1-T2代肿瘤迁移率随代际逐渐增加，0.1μg/L林丹暴露下的肿瘤迁移率平均水平即可达到70％，100μg/L林丹高浓度下该指标甚至可以达到80％。T3-Tn代肿瘤迁移率逐渐回落，T3代的肿瘤迁移率在各林丹浓度下均低于T2水平，T5代各浓度暴露下基本恢复与T0代水平相近，如图2。这表明林丹在生物暴露初期有增强致癌效应，而后随着机体的适应和代谢，致癌毒性逐渐削弱，呈现可修复的致癌毒性。
3、雌雄性别对污染物产生致癌效应的影响检测：
(a)用CO2麻醉果蝇，并在2X显微镜放大倍数下挑取经林丹暴露的F0代185品系处女蝇和未经林丹暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无林丹的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤1所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计。只有雌性经过林丹暴露的杂交体系，T0代肿瘤迁移率在0.1、10、1000μg/L林丹梯度浓度水平下分别达到53％、62％和75％。
而后挑选连续暴露于林丹体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的未经暴露的186品系雄蝇分别杂交于无林丹体系中，完成雌性个体连续暴露于林丹，但雄性个体始终未经暴露的多世代杂交。对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤1的指标检测。得到T1-Tn代幼虫肿瘤迁移率与雌雄均暴露于林丹的后代肿瘤迁移率表现出变化一致性，每一代的肿瘤迁移率平均水平与全性别多世代暴露的水平相吻合，说明只要雌性个体经过污染物暴露即会造成污染物致癌毒性的变化。
(b)挑取未经林丹暴露的F0代185品系处女蝇和经林丹暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无林丹的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤1所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计。只有雄性经过林丹暴露的杂交体系，T0代肿瘤迁移率在0.1、10、1000μg/L林丹梯度浓度水平下分别达到52％、48％和54％，与空白对照组水平相近。
而后挑选始终未暴露于林丹体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的连续暴露的186品系雄蝇分别杂交于无林丹体系中，完成雄性个体连续暴露于林丹，但雌性个体始终未经暴露的多世代杂交。对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤1的指标检测。得到T1-Tn代幼虫肿瘤迁移率在各个浓度刺激下均保持在50％的水平，与对照组均无显著性差异，说明雄性个体的暴露并不会增强污染物的致癌效应。
Claims (7)
1.一种黑腹果蝇肿瘤模型在研究环境污染物单世代及多世代致癌毒性方面的应用，其特征在于具体步骤如下：
(1)黑腹果蝇肿瘤模型品系单世代在含有污染物的培养基体系内暴露后杂交，观察其杂交后代幼虫在污染物作用下肿瘤迁移率的变化，指示和评价污染物单世代暴露的生物致癌毒性效应；
(2)连续暴露条件下，将果蝇肿瘤模型亲本品系各自在含有污染物的培养基体系内暴露，将其子代也同样连续暴露在相同的暴露体系下；多世代连续暴露后的黑腹果蝇肿瘤模型在污染物环境中杂交，进行同步骤(1)的观察操作，指示和评价污染物多世代暴露的生物致癌毒性效应；
(3)固定黑腹果蝇肿瘤模型中一种品系的雌蝇进行单世代和多世代暴露于含有污染物的培养基体系中，另一品系的雄蝇在无污染物培养基中完成单世代及多世代的培养；将同一代的两品系果蝇在无污染物培养基内杂交，对杂交后代进行同步骤(1)的观察；
而后交换两品系的培养环境，即交换含有污染物的培养基与无污染物培养基，进行同样的后续操作；通过比较不同性别生物暴露于污染物后得到的致癌指标变化，指示和评价污染物对不同性别生物的单世代和多世代致癌毒性效应；
所述黑腹果蝇肿瘤模型包含两类品系，分别为：yw，ey-Flp；tub-Gal80，FRT40A；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP(185)和w；lgl4FRT40A UAS-Rasv12/Cyo；Sb/TM6B Tb(186)，分别将其编号为185和186；
将185与186分别培养于含有污染物的培养基体系内以及无污染物培育基内；第一代投入含有污染物的培养基体系中或者无污染物培育基内暴露的185和186各自的亲本果蝇记为F0代。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤所述185和186均来自BloomingtonDrosophila Stock Centre USA实验室。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述含有污染物的培养基体系是指污染物梯度浓度组，其配制方法为：
首先配制无污染物培养基，其包含红糖、玉米粉、酵母、琼脂和丙酸；然后在无污染物培养基配制完成但尚未凝固前，在每100g无污染物培养基中加入2mL暴露液，分装至10个玻璃管；而后冷却凝固于灭菌后的玻璃管内，加塞备用；
在观察时需同时观察空白对照组的培育情况，所述空白对照组的配制方法为：在无污染物培养基配制完成但尚未凝固前，在每100g无污染物培养基中加入2mL加入纯水或污染物稀释液。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)的操作方法为：
用CO2气体使果蝇被麻醉，而后转移至持续通CO2的果蝇麻醉盒上；分别挑选185的F0代处女蝇和186的F0代雄蝇各五只为一组，将其转移至同一个含有污染物的培养基中，在其表面洒少许活酵母，放置于25℃恒温，60％恒湿的培养箱内，每隔24h转管一次，使两品系果蝇在24h内进行杂交，保证每个污染物浓度有10个以上平行组，F0代185和F0代186成虫杂交后产下的后代幼虫记为T0代，其中携带肿瘤的个体仅能生长至幼虫，无法进一步发育；
在25℃下培养3-4天，待T0代长至三龄幼虫后，用镊子挑取污染物暴露后的或对照组的三龄幼虫放置于添加了PBS的解剖墨盘上，剥离幼虫眼部、脑部和脑腹神经索VNC；若形成了肿瘤组织，则组织分化不明显，将整团肿瘤组织单独剥离即可；
在荧光显微镜GFP下，观察肿瘤组织发生绿色荧光的位置与强度，进行实时拍摄；在荧光显微镜下进一步将VNC与其他组织分离，单独拍摄；肿瘤迁移率作为致癌毒性的评价指标，以VNC组织中出现绿色荧光标记为迁移标志，统计发生迁移的个数，迁移率计算公式为：
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(2)的具体操作方法为：
将培养于含有污染物的培养基体系内的F0代185和F0代186分别转入含同浓度污染物的培养基中，待产下的后代发育为成虫后，为第二代185或186成虫，记为F1；
将185或186品系的F1代成虫继续分品系放入含同浓度污染物的培养基内，同上述的培养方式，得到其子代，即第三代，记为F2；以此类推，得到185或186的F3、F4......Fn成虫，以此完成果蝇肿瘤模型亲本品系的多世代连续污染物暴露；
选取185品系的F1代处女蝇与186品系的F1代雄蝇各五只为一组在含同浓度污染物的培养基中，按照权利要求1的方法进行暴露并杂交，其产生的子代幼虫记为T1F2、F3、F4......Fn多世代185雌蝇及其同代186雄蝇交配产生的后代幼虫依次记为T2、T3、T4......Tn；T1-Tn代幼虫重复步骤(1)的方法解剖、观察、拍摄和统计，即完成了污染物连续暴露的多世代致癌毒性效应检测。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(3)的具体操作方法为：
挑取经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和未经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计；
而后挑选连续暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的未经暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雌性个体连续暴露于污染物、但雄性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交；对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测；
挑取未经污染物暴露的F0代185品系处女蝇和经污染物暴露的F0代186品系雄蝇各五只，将其培养于无污染物的培养体系中进行杂交，杂交操作与条件同步骤(1)所述，收取后代T0幼虫进行肿瘤迁移率的观察统计；
而后挑选始终未暴露于污染物体系中的F1-Fn代185品系处女蝇和相同代际的连续暴露的186品系雄蝇分别杂交于无污染物体系中，完成雄性个体连续暴露于污染物、但雌性个体始终未经暴露的单世代与多世代杂交；对每一代的杂交后代幼虫进行同步骤(1)的指标检测。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
按照步骤(1)的操作步骤中获得的果蝇T0代各污染物浓度与空白对照组之间肿瘤迁移率的指标显著性差异，得到污染物对生物单世代致癌毒性的效应；
根据步骤(2)的操作获得的果蝇T0-Tn代之间同一污染物浓度暴露下肿瘤迁移率的差异，得到污染物对生物多世代致癌毒性效应评价；
根据步骤(3)不同性别果蝇单独暴露和步骤(1)与(2)所有性别一同暴露的指标差异结果，分别得到性别在污染物对生物产生单世代和多世代致癌效应上的影响；
将污染物的致癌毒性分为：不具有明确的致癌毒性、有可修复的致癌毒性、有延迟性的致癌毒性和有不可修复的致癌毒性；
按性别分为污染物仅通过雌性个体即可产生致癌毒性、污染物仅通过雄性个体即产生致癌毒性、污染物需通过两种性别个体才可产生致癌毒性及污染物产生致癌毒性与性别无关。
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