CN113100178A - 一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 - Google Patents
一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113100178A CN113100178A CN202110372534.7A CN202110372534A CN113100178A CN 113100178 A CN113100178 A CN 113100178A CN 202110372534 A CN202110372534 A CN 202110372534A CN 113100178 A CN113100178 A CN 113100178A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drosophila
- uas
- ras
- dorsal
- female
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 title claims abstract description 28
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 claims abstract description 89
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 claims description 38
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 22
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 22
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 6
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000032669 eclosion Effects 0.000 claims description 5
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 3
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 abstract description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002547 new drug Substances 0.000 abstract description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003596 drug target Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 108700002304 Drosophila can Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101150003160 X gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037237 body shape Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，该方法为将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，本发明方法成功构建黑腹果蝇Dorsal.H;RasV12肿瘤侵袭模型，技术人员利用此模型可在果蝇全基因组范围内进行筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物中对其同源物进行功能验证，也可进行化学合成物、中药复方/单味药/单体的大规模药物筛选，以期为癌症的临床治疗提供新的药物、药靶和治疗方案。
Description
技术领域
本发明属于生物遗传学技术领域，具体涉及一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法。
背景技术
现有的果蝇遗传学操作系统包括GAL4/UAS双表达系统和FLP/FRT系统。其中，(一)GAL4/UAS双表达系统：GAL4/UAS系统是果蝇中最为常用的转基因技术体系，可以让外源基因或RNAi在特定细胞或组织选择性表达。半乳糖调节上游启动子元件(galactose-regulated upstream promoter element 4)，缩写GAL4，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列UAS(upstream activate sequense)，是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。GAL4通过与UAS相结合，调节与半乳糖代谢相关基因的表达，GAL4/UAS双表达系统示意图如图1所示。1993年，科学家将目的基因X连接在UAS之后，通过转基因技术建立UAS-X果蝇品系，然后与特定的GAL4果蝇品系杂交，在后代中就可以得到同时具有Y-Gal4和UAS-X的果蝇，从而实现特异性的在Y组织表达X基因(参考文献1， Brand A. H. and Perrimon N.,Targeted gene expressionas a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.Development,1993,118:401-15)。因为果蝇基因组不编码GAL4转录因子，所以在果蝇体内过量表达GAL4，不会对果蝇的发育产生显著的影响。同样，在果蝇体内插入UAS调控序列，也不会对果蝇产生影响。这个系统的建立为利用果蝇作为研究模型的科学家在实验设计上提供了有利、便捷、高效的遗传操作工具。
(二)FLP/FRT系统：FLP是酵母中的一种重组酶，它可以识别两个700bp的同源靶位点FRT(FLP recombination targets，FRTs)，如果两个FRT片段位于果蝇一对同源染色体的相同位点，热击诱导的FLP表达可以介导这两个位点进行有丝分裂重组，产生重组远端纯合的子细胞(如图2所示)(参考文献2，Zhang S. P. and Xue L.,[Progress on cell lineage analysis in Drosophila melanogaster].Yi Chuan,2012,34:819-28)。研究发现FRT介导的有丝分裂重组效率远高于其他方式，重组发生的位点也可以人为控制。此外，热击对细胞的伤害也较小。因此，研究者可以通过FLP/FRT技术探究少量基因改变的细胞在野生型细胞环境下的生长情况，从而进一步研究细胞竞争的分子机制。
果蝇作为研究人类疾病的模式生物，与哺乳动物不仅在基本的生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似，而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。近年来的研究表明，果蝇和人类在肿瘤发生信号通路等方面的保守性很高，而且果蝇具有很强的遗传学可操作性，是肿瘤学研究有效的模型之一，可用于研究人类肿瘤发生、发展、转移等分子机制。近年来研究人员已经建立了很多用于研究特定的果蝇模型，但是新的特定的果蝇肿瘤侵袭模型的建立对阐明癌症等相关疾病发生的分子机制起到重要作用，将会为临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。因此，建立新的特定的果蝇肿瘤侵袭模型是本领域技术人员亟待解决的技术问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，该方法为将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，所述的杂交流程包括如下步骤：
(1)将UAS-Dorsal.H果蝇品系和Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo；UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇；然后将获得的UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇和+/Cyo；UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Cyo；UAS-RasV12/Sb雄性果蝇；将得到的UAS-Dorsal.H/Cyo；UAS-RasV12/Sb雄性果蝇和基因型为Sp；Sb/SM6B-TM6B.Tb品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb的果蝇建成能够传代保存的果蝇品系；
(2)观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移腹部神经节的果蝇品系，即为黑腹果蝇Dorsal.H；RasV12肿瘤迁徙模型。
作为一种优选技术方案：步骤(2)的详细过程为：将ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP(简写为ey-Flp,GFP)果蝇品系和步骤(1)中最终获得的UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey-Flp,GFP/UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/+的三龄幼虫，表型为头部复杂组织(Cephalic Complex,CC)处有GFP、体型正常非短粗，解剖果蝇的两个大脑半球和腹部神经节(Ventral nerve cord，VNC)后，能够观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移果蝇的腹部神经节，即为黑腹果蝇Dorsal.H；RasV12肿瘤迁徙模型。
进一步优选的：将ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP果蝇品系和步骤(1)中最终获得的UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交时，杂交的亲本雌雄可互换。
作为一种优选技术方案：所述杂交的培养基的配方为：红糖13.5％(13.5g/100ml)，琼脂0.7％(0.7g/100ml)，玉米粉8.5％(8.5g/100ml)，酵母0.8％(0.8g/100ml)，丙酸0.4％(v/v)。
作为一种优选技术方案：于温度25℃，湿度50％-60％的条件下进行培养。
所述雌性处女蝇的选取方法为：将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇，放入培养瓶中备用，由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，能够看到腹腔内的黑色消化道，因此，可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。
本发明的有益效果：
本发明方法成功构建黑腹果蝇Dorsal.H；RasV12肿瘤侵袭模型，技术人员利用此模型可在果蝇全基因组范围内进行筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物中对其同源物进行功能验证，也可进行化学合成物、中药复方/单味药/单体的大规模药物筛选，以期为癌症的临床治疗提供新的药物、药靶和治疗方案。
附图说明：
图1为GAL4/UAS双表达系统示意图。
图2为FLP/FRT系统作用原理示意图。
图3为果蝇雌雄辨别示意图。
图4为Dorsal.H；RasV12肿瘤侵袭模型构建杂交流程图。
图5为Dorsal和Ras共表达可诱导肿瘤侵袭。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1
一、果蝇的饲养及实验条件
1、果蝇培养基的配制
实验用的果蝇品系及杂交实验均将果蝇饲养于标准的红糖-玉米粉-酵母培养基上，其中培养基的配方如下：
配制过程：
(1)将称量好的红糖和琼脂一起倒入电饭锅中，加入适量水，充分搅拌；
(2)加热至沸腾；
(3)将已用水充分溶解好的玉米粉缓慢倒入锅中，持续搅拌；
(4)加热至沸腾；
(5)待混合物冷却至80℃左右，加入提前用温水溶解好的酵母，充分搅拌，所用酵母为英联马利(AB/MAURITM)所产的梅山高活性干酵母，500g/包；
(6)加入适量丙酸溶液，充分搅拌；
(7)将培养基分装于灭菌的玻璃管中；
(8)塞上棉花后，置于阴凉处存放。
2、实验条件
温度25℃恒温，湿度50％-60％，杂交一般饲养于恒温恒湿的培养箱或果蝇房中。
3、果蝇雌雄的鉴别
(1)体型：雌果蝇体型较大，雄的较小。
(2)腹部末端：雌果蝇腹部椭圆末端稍尖，雄果蝇末端钝圆。
(3)腹部背面：雌果蝇有明显5条黑色条纹，雄果蝇的有3条，前2条细，后1条宽，至腹面，肉眼可见腹部末端有一明显黑点。
(4)腹部腹面：雌果蝇有较明显的6个腹片，雄果蝇有4个腹片。
(5)性梳：雄果蝇第一节足底侧最上部附足前端表面有黑色鬃毛－性梳。
(6)交尾器：判断雌雄果蝇的最主要的区别。
果蝇雌雄辨别示意图如图3所示。
4、果蝇的麻醉及杂交
果蝇的麻醉方法是二氧化碳(CO2)气体麻醉法。用作杂交实验的亲本果蝇，不能过度麻醉，否则会影响果蝇的生活力。果蝇的麻醉状态和麻醉后死亡的区别以翅膀是否外展为依据。麻醉状态的果蝇两个翅膀仍然重叠在背腹上，而死亡的果蝇翅膀离开腹部呈外展状态。
将果蝇麻醉后，可以在通有CO2的平板上进行挑选雌雄、杂交、观察表型等操作。由于雌果蝇生殖器官中有储精囊，一次交配后可储存大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇，否则实验结果是不可靠的。选取方法：将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇，放入培养瓶中备用。由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，可以看到腹腔内的黑色消化道。因此，可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。
二、一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法
1、建立模型所需果蝇品系
(1)w1118，野生型果蝇，购自美国Bloomington Drosophila Stock Center，编号BL3605。
(2)ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP，位于二号染色体，不能纯合，具体基因型为：w1118；ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP/Cyo，购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。
(3)UAS-Dorsal.H，为野生型Dorsal，位于二号染色体，该品系果蝇眼睛为黄色，可以纯合，具体基因型为：w1118；UAS-Dorsal.H，购于美国Bloomington Drosophila StockCenter，编号BL9319。
(4)UAS-RasV12，位于三号染色体，可以纯合，具体基因型为：w；UAS-RasV12，购自美国Bloomington Drosophila Stock Center，编号BL64159。
(5)Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb，为二号三号染色体平衡子(Balancer)工具果蝇品系，购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。
(6)Sp；Sb/SM6B-TM6B.Tb，为二-三号染色体连接的工具果蝇品系，购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。
2、结果基因型如下
图5A：ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP/+
图5B：ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP/+；UAS-RasV12/+
图5C：ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP/UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/+
图5D：ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP/UAS-Dorsal.H
3、实验方法
(1)将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，果蝇杂交流程见图4，详细步骤如下：
A.将UAS-Dorsal.H果蝇品系和Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo；Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo；UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇；然后将获得的UAS-Dorsal.H/Sp；+/Sb雄性果蝇和+/Cyo；UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Cyo；UAS-RasV12/Sb雄性果蝇；接下来，将得到的UAS-Dorsal.H/Cyo；UAS-RasV12/Sb雄性果蝇和基因型为Sp；Sb/SM6B-TM6B.Tb品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb的果蝇，雌雄适量，建成可以传代保存的果蝇品系。
B.将ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP(简写为ey-Flp,GFP)果蝇品系和步骤A中最终获得的UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey-Flp,GFP/UAS-Dorsal.H；UAS-RasV12/+的三龄幼虫，表型为头部复杂组织(CephalicComplex,CC)处有GFP、体型正常非短粗，解剖果蝇的两个大脑半球和腹部神经节(Ventralnerve cord，VNC)后，可以观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移果蝇的腹部神经节，即为黑腹果蝇Dorsal.H；RasV12肿瘤迁徙模型。同时，ey-Flp,GFP的果蝇品系分别与w1118、UAS-RasV12和UAS-Dorsal.H果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型分别为ey-Flp,GFP/+、ey-Flp,GFP/+；UAS-RasV12/+和ey-Flp,GFP/UAS-Dorsal.H的三龄幼虫，表现型均为CC处有GFP、体型正常非短粗。其中，ey-Flp,GFP/+的果蝇为野生型对照组，ey-Flp,GFP/+；UAS-RasV12/+的果蝇为肿瘤细胞只原位生长不迁移的对照组，ey-Flp,GFP/UAS-Dorsal.H的果蝇为单独过表达Dorsal.H既不诱发肿瘤原位增殖也不引起迁移的对照组。
(2)收集杂交后代中的目标果蝇，对果蝇三龄幼虫头部复杂组织及腹部神经节进行解剖并置于体式荧光显微系统下拍照。
4、模型简介
图5A-D为果蝇三龄幼虫期的头部复杂组织(Cephalic complex,CC)解剖图，其中EA代表眼成虫盘(eye-antennal discs)，BH代表果蝇的两个大脑半球，VNC代表腹部神经节(Ventral nerve cord，VNC)。
选用FLP-FRT介导的有丝分裂重组并结合GAL4/UAS系统，与正常组对照相比(图5A，A’)，我们发现特异性地在眼成虫盘中持续表达高度活化的癌基因Ras(RasV12)，可以促进肿瘤细胞的原位过度生长(图5B，B’)。在此基础上，共表达人类NF-κB同源因子-Dorsal时，能协同诱导肿瘤生长，并且这些肿瘤细胞会向腹部神经节产生侵袭(肿瘤细胞已用GFP绿色荧光蛋白标记，图5C，C’)，而单独表达Dorsal则不会有侵袭表型(图5D，D’)。表明Dorsal.H；RasV12肿瘤侵袭模型因此成功建立(图5为Dorsal和Ras共表达可诱导肿瘤侵袭)。
研究者利用此模型可在果蝇全基因组范围内进行筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物中对其同源物进行功能验证，也可进行化学合成物、中药复方/单味药/单体的大规模药物筛选，以期为癌症的临床治疗提供新的药物、药靶和治疗方案。
Claims (6)
1.一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：该方法为将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，所述的杂交流程包括如下步骤：
（1）将UAS-Dorsal.H果蝇品系和Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Sp;+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇；然后将获得的UAS-Dorsal.H/Sp;+/Sb雄性果蝇和+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇；将得到的UAS-Dorsal.H/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇和基因型为Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Dorsal.H;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb的果蝇建成能够传代保存的果蝇品系；
（2）观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移腹部神经节的果蝇品系，即为黑腹果蝇Dorsal.H;RasV12肿瘤迁徙模型。
2.根据权利要求1所述的黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：步骤（2）的详细过程为：将ey-Flp act>y+>GAL4 UAS-GFP果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS-Dorsal.H;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey-Flp,GFP/UAS-Dorsal.H;UAS-RasV12/+的三龄幼虫，表型为头部复杂组织处有GFP、体型正常非短粗，解剖果蝇的两个大脑半球和腹部神经节后，能够观察到GFP标记的眼部组织的肿瘤细胞已经迁移果蝇的腹部神经节，即为黑腹果蝇Dorsal.H;RasV12肿瘤迁徙模型。
3.根据权利要求2所述的黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：将ey-Flpact>y+>GAL4 UAS-GFP果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS-Dorsal.H;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交时，杂交的亲本雌雄可互换。
4.根据权利要求1所述的黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：所述杂交的培养基的配方为：红糖13.5%，琼脂0.7%，玉米粉8.5%，酵母0.8%，丙酸0.4%。
5.根据权利要求1所述的黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：所述杂交的饲养条件为：于温度25℃，湿度50%-60%的条件下进行培养。
6.根据权利要求1所述的黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法，其特征在于：所述雌性处女蝇的选取方法为：将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇，放入培养瓶中备用，由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，能够看到腹腔内的黑色消化道，因此，可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110372534.7A CN113100178A (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110372534.7A CN113100178A (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113100178A true CN113100178A (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=76714321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110372534.7A Pending CN113100178A (zh) | 2021-04-07 | 2021-04-07 | 一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113100178A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114885900A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-08-12 | 甘肃中医药大学 | 一种体内化疗药物副作用研究模型的构建和评价方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101712959A (zh) * | 2008-10-08 | 2010-05-26 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种新的人细胞生长抑制基因thap11及其应用 |
| KR20100098766A (ko) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | 서강대학교산학협력단 | 항-슈도모나스 애루지노사 항생제에 대한 스크리닝 방법 |
| CA2796520A1 (en) * | 2011-11-18 | 2013-05-18 | Thelial Technologies S.A. | Method for identifying cancer drug candidates in drosophila |
| CN103251959A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-21 | 上海大学 | 果蝇基因lk6的新用途 |
| CN108184770A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-06-22 | 华北理工大学 | 一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法 |
| CN109601487A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-12 | 同济大学 | 一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用 |
-
2021
- 2021-04-07 CN CN202110372534.7A patent/CN113100178A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101712959A (zh) * | 2008-10-08 | 2010-05-26 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种新的人细胞生长抑制基因thap11及其应用 |
| KR20100098766A (ko) * | 2009-03-02 | 2010-09-10 | 서강대학교산학협력단 | 항-슈도모나스 애루지노사 항생제에 대한 스크리닝 방법 |
| CA2796520A1 (en) * | 2011-11-18 | 2013-05-18 | Thelial Technologies S.A. | Method for identifying cancer drug candidates in drosophila |
| CN103251959A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-08-21 | 上海大学 | 果蝇基因lk6的新用途 |
| CN108184770A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-06-22 | 华北理工大学 | 一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法 |
| CN109601487A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-04-12 | 同济大学 | 一种黑腹果蝇肿瘤模型及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 魏慧敏等: "葱蝇Dorsal基因的克隆？表达及生物信息学分析", 《安徽农业科学》, no. 17, 10 June 2012 (2012-06-10), pages 9332 - 9335 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114885900A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-08-12 | 甘肃中医药大学 | 一种体内化疗药物副作用研究模型的构建和评价方法 |
| CN114885900B (zh) * | 2022-03-03 | 2023-08-22 | 甘肃中医药大学 | 一种体内化疗药物副作用研究模型的构建和评价方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108184770B (zh) | 一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法 | |
| US20220015342A1 (en) | Gene editing of reproductive hormones to reduce fertility in ictalurus punctatus | |
| Driever et al. | Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development | |
| Stuart et al. | Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos | |
| WO2018177351A1 (zh) | 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法 | |
| CN108271741B (zh) | 一种黑腹果蝇GMR>Snail细胞死亡模型的建立方法 | |
| Wang et al. | Nile tilapia: a model for studying teleost color patterns | |
| CN107426986A (zh) | 一种培育雄性不育库蚊的方法 | |
| KR20160012735A (ko) | Dyrk1aa 유전자가 결실된 제브라피쉬 모델 및 이를 이용한 혈관 발생 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법 | |
| CN113088521A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法 | |
| Casco‐Robles et al. | Simple and efficient transgenesis with I‐SceI meganuclease in the newt, Cynops pyrrhogaster | |
| CN111485003A (zh) | 一种视网膜血管疾病模型的构建方法及其应用 | |
| CN113100178A (zh) | 一种黑腹果蝇肿瘤侵袭模型的建立方法 | |
| Chaverra-Rodriguez et al. | CRISPR-Cas9-Mediated Mutagenesis of the Asian Citrus Psyllid, Diaphorina citri | |
| Collin et al. | Zebrafish as a research organism: Danio rerio in biomedical research | |
| US20080148418A1 (en) | Novel Zebrafish | |
| LU505264B1 (en) | Establishment Method of a Tumor Invasion Model in Drosophila melanogaster | |
| Venken et al. | Multiplexed transgenic selection and counterselection strategies to expedite genetic manipulation workflows using Drosophila melanogaster | |
| CN114342883B (zh) | 一种果蝇器官间通讯双系统肿瘤筛选模型的构建方法及应用 | |
| CN110592122B (zh) | 斑马鱼naalad2基因启动子及其应用 | |
| CN112011540A (zh) | 敲低Seroin1基因的家蚕双元转基因系统及家蚕纯裸蛹品种的制备方法 | |
| CN114763557A (zh) | Ddx5在抗病毒和调节免疫反应中的应用 | |
| CN112956453B (zh) | 一种黑腹果蝇胰岛素抵抗糖尿病模型的建立方法 | |
| CN109897867B (zh) | 基因改造方法 | |
| Trezise et al. | In vivo gene expression: DNA electrotransfer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wu Chenxi Inventor after: Zhang Jingxuan Inventor after: Jiang Chunhua Inventor after: Gao Xiujuan Inventor after: Ding Xiang Inventor before: Jiang Chunhua Inventor before: Wu Chenxi Inventor before: Zhang Jingxuan Inventor before: Gao Xiujuan Inventor before: Ding Xiang |