CN109601248A - 一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法，包括以下几个步骤：1）对扩繁基质进行消毒。将基质土壤均匀铺平，暴露于太阳光下，并喷洒50%多茵灵可湿性粉剂，暴晒直至完全干透。2）将丛枝菌根真菌与扩繁宿主种子共同制为丸衣化种子，接种于消毒后的基质。3）养护3~4个月后即可收获基质作为菌剂。本发明将种子包衣技术与丛枝菌根接种技术有机结合，简化了接种过程，使实际操作更为简便，且该技术的应用使菌剂与种子接触更紧密，可以节约丛枝菌根菌剂的施用。

Description

一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法
技术领域
本发明属于菌根真菌扩繁技术领域，特别是一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法。
背景技术
丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizae,AM）真菌是土壤共生真菌中分布最为广泛的一类真菌。丛枝菌根真菌具有能够提升宿主植物的生物学功能指标，并增强宿主植物对逆境的耐受能力，因此常被用作生态恢复技术的材料。目前培养丛枝菌根真菌的方法主要有以下几类：
单孢培养法，是一种利用半水培技术和湿筛分离技术分离出纯净的孢子，并再次接种于扩繁宿主幼苗根部以获得单一菌种纯净菌系的方法。其优点为获得的菌种为单一孢子繁殖而来，为单一纯系，但其对于无菌环境及无菌操作要求较高，并且难以大批量进行，因此只适用于对菌剂需求量较少的实验性扩繁。
根器官培养法，即采用两室培养系统同时进行根器官和丛枝菌根真菌的培养。两室培养系统可以阻隔两边培养基之间的物质交换，使菌根室中仅能培养植物根及丛枝菌根真菌孢子，菌丝室中则只有菌丝，没有根器官。这种方法的优势在于可以原位观察丛枝菌根真菌的生长状况，但也受到了量的局限。
分室玻璃珠培养法，利用尼龙网将器皿隔为几室，中间填充玻璃珠，使菌丝可以穿过尼龙网进入玻璃珠室，阻隔了除菌丝外其它污染物的进入。该方法简化了纯净菌丝的收集，但由于装置的复杂性难以大规模的收集菌剂。
诱集培养法，将野外采集到的包含丛枝菌根真菌的土样，或进行单孢分离后的培养物和扩繁宿主一起接种于沸石、河沙混合基质，浇灌霍格兰茨营养液，养护后可获得其加富培养物。这种方法较为简便，但通常利用盆栽法在无菌室内进行，且由于基质粒径较大，保水性能差，对于人工养护的要求也比较高。
尽管丛枝菌根真菌在生态修复技术中具有明显优势，但由于其扩繁培养方式的局限，常常难以满足实际工程的需要。因此，研究出一种可以大批量生产，适用于工程应用的扩繁方法对于丛枝菌根修复技术的普及化十分重要。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题，提供一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法，环境和技术要求较低，且能获得大批量丛枝菌根菌剂，可满足实际工程应用的需要。
本发明技术方案：
一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法，所述方法包括如下步骤：
1）将基质土壤过2mm筛后平铺于硬质地面，直接暴露于阳光下，将50%多茵灵可湿性粉剂喷洒于基质土壤，边喷洒边翻拌；使其良好渗透。
2）将暴晒后完全干透的基质土壤在通风透气环境下放置一周左右后，将其铺于试验田，深度为20~25cm；
3）丛枝菌根真菌接种：利用丛枝菌根菌剂制丸衣剂，对扩繁宿主种子进行接种处理；
4）将接种处理后种子均匀播撒在基质土壤上，并覆土2~3cm；
5）养护3~4个月后，收获的基质土壤及扩繁宿主植物根系即为野外扩繁所得菌剂。
优选地，所述步骤1）基质土壤为河沙：田间土按照质量比为1:1-1.5混合的沙壤土。
优选地，所述步骤3）所述扩繁宿主种子为：玉米Zea mays Linn.或高粱Sorghum bicolor (L.) Moench。
优选地，所述步骤3）丛枝菌根菌剂的菌种为摩西球囊霉Glomus mosseae和根内球囊霉Glomus intraradices。
优选地，所述步骤4）所述接种方法为丸衣化接种。
进一步优选地，所述丸衣化接种的丸衣剂成分包括丛枝菌根真菌菌剂、有机矿质材料、黏结剂、保水剂、农用稀土、分散剂、耦合剂和微量元素,所述丛枝菌根真菌菌剂裸种与丸衣剂的重量比为1:4-6。
更进一步优选地，所述丸衣剂成分包括按照重量份计的以下组分：有机矿质材料100份，黏结剂10-30份，保水剂10-30份，农用稀土0-15份，分散剂1-10份，耦合剂1-10份，微量元素10-20份，丛枝菌根真菌菌剂50份。
所述有机矿质材料为凹凸棒、高岭土或膨润土或其组合；
所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或聚丙烯酸钠；
所述保水剂为丙烯酰胺保水剂或丙烯酸/丙烯酰胺共聚保水剂中或其组合；
所述农用稀土为“益植素”；
所述分散剂为水性分散剂；
所述耦合剂为钛酸酯偶联剂；
所述微量元素液成分为碘化钾0.8-0.9mg·L-1、硼酸6-6.5mg·L-1、硫酸锰22-22.5mg·L-1、硫酸锌8.3-8.8mg·L-1、钼酸钠0.2-0.3mg·L-1、硫酸铜0.02-0.03mg·L-1、氯化钴0.02-0.035mg·L-1。
更进一步优选地，所述微量元素液成分为碘化钾0.84mg·L-1、硼酸6.2mg·L-1、硫酸锰22.3mg·L-1、硫酸锌8.6mg·L-1、钼酸钠0.25mg·L-1、硫酸铜0.025mg·L-1、氯化钴0.025mg·L-1。
进一步优选地，所述步骤5）养护方式遵循人为控水，保证干湿交替，辅助喷施霍格兰茨营养液。
本发明有益效果如下：
1、操作简便，耗费人力、物力资源较少，对操作环境和操作手段的要求较低，可以满足短期内获得大量扩繁菌剂的要求，可满足丛枝菌根菌剂的大批量生产，有利将丛枝菌根真菌应用于生态恢复工程的实际操作。
2、采用沙土混合物作为扩繁基质，比传统河沙、沸沙基质具有更好的保水效果，减少水资源施用及人工养护频率。
3、将种子包衣技术与丛枝菌根接种技术有机结合，简化了接种过程，使实际操作更为简便，且该技术的应用使菌剂与种子接触更紧密，可以节约丛枝菌根菌剂的施用。
4、对基质土壤的消毒操作更环保；节约接种所需丛枝菌根菌剂，简化接种步骤，可短期内大批量获得丛枝菌根菌剂；扩繁系统具有较好的保水性能，降低人工养护的要求，节约物力、人力，同时能满足结果的优质高效。
5、利用丸衣化技术，简化大批量种子和丛枝菌根菌剂的分层播撒过程。利用暴晒消毒，降低灭菌剂对土壤造成的不良效果，更加环保。利用野外大田扩繁，相同周期内可获得大批量丛枝菌根菌剂。
6、在丸衣剂配方中，加入稀土元素，增加种子活力，促进作物种子萌发，提高种子的出苗率；增加幼苗叶绿素含量，调节植物生长；增强植物抗逆能力；增加根系生长，有益于真菌侵染宿主根系，提高丛枝菌根侵染率。
7、在丸衣剂配方中，加入分散剂，使各材料按配比均匀分散混合，并使难溶有机物得以分散，使丛枝菌根菌剂与其它丸衣剂材料可均匀附着于宿主种子表面，使真菌与种子充分接触，提高丛枝菌根真菌的侵染效率。
8、在丸衣剂配方中，加入耦联剂，使配方中有机成分和无机营养物质的相容性得到改善，提高材料的抗冲击强度，提高丸衣化种子质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1 摩西球囊霉的扩繁方法
将基质土壤过2mm筛后平铺于硬质地面，直接暴露于阳光下，将50%多茵灵可湿性粉剂喷洒于基质土壤，边喷洒边翻拌。将暴晒后完全干透的基质土壤在通风透气环境下放置一周左右后，将其铺于试验田，深度为20~25cm；所述基质土壤为河沙：田间土按照质量比为1:1混合的沙壤土。
将凹凸棒100份、羧甲基纤维素钠10份、丙烯酰胺保水剂10份、水性分散剂8份、钛酸酯偶联剂10份粉碎并过1mm筛，与摩西球囊霉菌剂30份、微量元素液10份、“益植素”10份充分混合，制为丸衣剂（所述比例均为质量比，下同）。将丸衣剂用3倍体积水制为可喷胶体，加入高粱种子，利用种子造粒机进行丸衣化。丸衣化种子制备至粒径为3~8mm时即造粒完毕。
基质浇透水后，将丸衣化种子均匀播撒在基质土壤上，播种密度为25粒·m-1，并覆土2~3cm；
出苗后人工控制浇水频率，保证干湿交替，出苗20天后每周施加霍格兰茨营养液一次，每次500mL·m2，霍格兰茨营养液按如下比例配置：四水硝酸钙945mg·L、硝酸钾506mg·L、硝酸铵80mg·L、磷酸二氢钾136mg·L、硫酸镁 493mg·L、铁盐溶液（七水硫酸亚铁5.56g·L、乙二胺四乙酸二钠7.46g·L）2.5ml·L，调至pH=6.0。
养护至30天、90天时分别取部分宿主根系测菌根侵染率，测得该方法扩繁至30天、90天时的菌根侵染率分别为72.8%、87.3%。养护4个月后，除掉地上部分，收获的基质土壤及扩繁宿主植物根系并将其均匀混合打碎，取得的菌土混合物即为扩繁菌剂。测得该方法扩繁得到的菌剂孢子密度为35~90个·g-1。
优选地方案，羧甲基纤维素钠改为魔芋葡聚糖，养护至30天、90天时分别取部分宿主根系测菌根侵染率，测得该方法扩繁至30天、90天时的菌根侵染率分别为84.6%、92.6%。养护4个月后，除掉地上部分，收获的基质土壤及扩繁宿主植物根系并将其均匀混合打碎，取得的菌土混合物即为扩繁菌剂。测得该方法扩繁得到的菌剂孢子密度为55~120个·g-1。魔芋葡聚糖不仅可以作为黏结剂，形成的大分子网络结构，使丛枝菌根菌剂与其它丸衣剂材料可均匀附着于宿主种子表面，使真菌与种子充分接触，提高丛枝菌根真菌的侵染效率，另外还可以作为丛枝菌根真菌的生长原料，在侵染的过程中被分解回收，不会给土壤环境带来影响。
实施例2 根内球囊霉的扩繁方法
将基质土壤过2mm筛后平铺于硬质地面，直接暴露于阳光下，将50%多茵灵可湿性粉剂喷洒于基质土壤，边喷洒边翻拌。将暴晒后完全干透的基质土壤在通风透气环境下放置一周左右后，将其铺于试验田，深度为20~25cm；；所述基质土壤为河沙：田间土按照质量比为1:1混合的沙壤土。
将膨润土50份、高岭土50份、羧甲基纤维素钠20份、丙烯酸/丙烯酰胺共聚保水剂30份、水性分散剂8份、钛酸酯偶联剂10份粉碎并过1mm筛，与根内球囊霉菌剂50份、微量元素液20份、“益植素”10份充分混合，制为丸衣剂。将丸衣剂用3倍体积水制为可喷胶体，加入玉米种子，利用种子造粒机进行丸衣化。丸衣化种子制备至粒径为3~8mm时即造粒完毕。
基质浇透水后，将丸衣化种子均匀播撒在基质土壤上，播种密度为25粒·m-1，并覆土2~3cm；养护方式同实施例1。
养护至30天、90天时分别取部分宿主根系测菌根侵染率，测得该方法扩繁至30天、90天时的菌根侵染率分别为63.9%、81.0%。养护4个月后，除掉地上部分，收获的基质土壤及扩繁宿主植物根系并将其均匀混合打碎，取得的菌土混合物即为扩繁菌剂。测得该方法扩繁得到的菌剂孢子密度为30~80个·g-1。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种丛枝菌根真菌的野外扩繁方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1）将基质土壤过筛后平铺于硬质地面，直接暴露于阳光下，将50%多茵灵可湿性粉剂喷洒于基质土壤，边喷洒边翻拌；
2）将暴晒后完全干透的基质土壤在通风透气环境下放置一周左右后，将其铺于试验田；
3）丛枝菌根真菌接种：利用丛枝菌根菌剂制丸衣剂，对扩繁宿主种子进行接种处理；
4）将经步骤3）接种处理后种子均匀播撒在基质土壤上，并覆土进行养护；
5）养护3-4个月后，收获的基质土壤及扩繁宿主植物根系即为野外扩繁所得菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）基质土壤为河沙：田间土按照质量比为1:1-1.5混合的沙壤土。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）所述扩繁宿主种子为：玉米或高粱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）丛枝菌根菌剂的菌种为摩西球囊霉和根内球囊霉。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）所述接种处理的方法为丸衣化接种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述丸衣化接种的丸衣剂成分包括丛枝菌根真菌菌剂、有机矿质材料、黏结剂、保水剂、农用稀土、分散剂、耦合剂和微量元素,所述丛枝菌根真菌菌剂裸种与丸衣剂的重量比为1:4-6。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述丸衣剂成分包括按照重量份计的以下组分：有机矿质材料100份，黏结剂10-30份，保水剂10-30份，农用稀土0-15份，分散剂1-10份，耦合剂1-10份，微量元素10-20份，丛枝菌根真菌菌剂50份。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述有机矿质材料为凹凸棒、高岭土或膨润土或其组合；
所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或聚丙烯酸钠；
所述保水剂为丙烯酰胺保水剂或丙烯酸/丙烯酰胺共聚保水剂中或其组合；
所述耦合剂为钛酸酯偶联剂；
所述微量元素液成分为碘化钾0.8-0.9mg·L-1、硼酸6-6.5mg·L-1、硫酸锰22-22.5mg·L-1、硫酸锌8.3-8.8mg·L-1、钼酸钠0.2-0.3mg·L-1、硫酸铜0.02-0.03mg·L-1、氯化钴0.02-0.035mg·L-1。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5）养护的方式遵循人为控水，保证干湿交替，辅助喷施霍格兰茨营养液。
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