CN109596832B - 孕酮免疫层析检测试纸条及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种孕酮免疫层析检测试纸条及其制作方法。通过将孕酮单克隆抗体与第一配合物复合构成偶联复合物，再将该偶联复合物与荧光胶乳微粒连接，形成荧光胶乳微粒标记的偶联复合物。当此荧光标记的偶联复合物与样本中的孕酮抗原结合后可形成孕酮抗原‑荧光偶联复合物，通过层析作用在检测膜的质控区与包被的第二配合物特异性结合而大量聚积，其余没有结合孕酮抗原的荧光胶乳微粒标记的偶联复合物在检测膜的检测区与包被的孕酮偶联抗原结合，这种检测区与质控区共用一个荧光胶乳微粒的模式能将反应体系的信号量放大的同时还将单克隆抗体与荧光胶乳微粒结合不均匀的问题有效解决，从而可以大大改善灵敏度和准确性、扩宽线性范围。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析检测领域，尤其是涉及一种孕酮免疫层析检测试纸条及其制作方法。
背景技术
孕酮(英文Progesterone，简称Prog，中文亦称为黄体酮、孕甾酮、黄体甾酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮)是一种涉及雌性月经周期、妊娠和对人类或动物的胚胎有影响的类固醇，是最重要的孕激素。孕酮检查主要用于了解黄体的功能及卵巢有无排卵。未怀孕的雌性，其孕酮只在每次月经周期的后半段才由卵巢黄体大量分泌。脑、肝与肾上腺也会分泌。怀孕时(第三个月开始)，胎盘可大量分泌。孕酮与生育有着密切的关系。如果在怀孕初期出现孕酮低的情况建议及时检查治疗，这样才能有效的改善情况。如果是由于黄体功能不全，而导致分泌的孕酮量不足，可以采取补充黄体酮来治疗；或者由于卵巢早衰而引发孕酮低的情况，需要根据具体情况治疗。
因此，孕酮检查对于孕期的女性或动物尤为重要。然而，孕酮为类固醇类小分子物质，有抗原性无免疫原性，因此要获得高特异性孕酮抗体难度很大。在血液样本中通常存在很多与孕酮结构类似的类固醇类小分子物质，这些物质对孕酮的检测会形成干扰，同时小分子物质在检测过程中容易受空间位阻和基质效应的影响。在小分子类物质免疫层析检测中普遍存在灵敏度不高、线性范围窄、准确度不足的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种线性范围宽、灵敏度和准确性高的孕酮免疫层析检测试纸条及其制作方法。
一种孕酮免疫层析检测试纸条，包括基底和设在所述基底上标记垫、检测膜和吸收垫，所述标记垫、所述检测膜及所述吸收垫从所述基底的一端至另一端依次连接；所述标记垫具有标记区，所述标记区包被有荧光胶乳微粒标记的孕酮单克隆抗体与第一配合物，且各所述荧光胶乳微粒上标记的所述孕酮单克隆抗体与所述第一配合物构成偶联复合物；所述检测膜上设有检测区和质控区，所述检测区包被有孕酮偶联抗原，所述质控区包被有第二配合物，所述第一配合物与所述第二配合物能够特异性结合。
在其中一个实施例中，所述荧光胶乳微粒的粒径是0.1μm～1μm；和/或
所述荧光胶乳微粒受激发后发光的波长是180nm～800nm。
在其中一个实施例中，所述荧光胶乳微粒是胶体金颗粒或磁珠微粒。
在其中一个实施例中，各所述荧光胶乳微粒上的所述孕酮单克隆抗体与所述第一配合物是以1:1的摩尔比共价偶联构成所述偶联复合物。
在其中一个实施例中，所述第一配合物与所述第二配合物中一个是抗体，另一个是与该抗体对应的二抗。
一种上述任一实施例所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，包括如下步骤：
使用荧光胶乳微粒标记孕酮单克隆抗体与第一配合物构成的偶联复合物，制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液，将所述标记溶液加到标记垫的标记区，干燥；
将孕酮偶联抗原溶液和第二配合物溶液分别加到检测膜的检测区和质控区，干燥；
将干燥后的所述标记垫、所述检测膜及吸收垫置于基底上，并使所述标记垫、所述检测膜及所述吸收垫从所述基底的一端至另一端依次连接，得到所述孕酮免疫层析检测试纸条。
在其中一个实施例中，所述使用荧光胶乳微粒标记孕酮单克隆抗体与第一配合物构成的偶联复合物，制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液包括如下步骤：
制备孕酮单克隆抗体与第一配合物的偶联复合物；
活化荧光胶乳微粒，制备活化荧光胶乳微粒溶液，并将所述偶联复合物加入至所述活化荧光胶乳微粒溶液中，混匀，离心后收集沉淀；
将收集的所述沉淀复溶，得到所述标记溶液。
在其中一个实施例中，所述活化荧光胶乳微粒溶液中活化荧光胶乳微粒的浓度是800μg/100μl～1200μg/100μl；和/或
所述偶联复合物是按照每100μl所述活化荧光胶乳微粒溶液中加入5μg～20μg的量加入至所述活化荧光胶乳微粒溶液中；和/或
所述混匀是于室温下混合1.5h～3h；和/或
复溶时加入的溶剂的量需满足：复溶后得到的标记溶液的体积与待加入所述偶联复合物的所述活化荧光胶乳微粒溶液的体积相等；和/或
所述复溶使用的溶剂是PBS-TBN缓冲液或Tris-Hcl缓冲液；和/或
所述标记溶液是使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没的方式加到所述标记区。
在其中一个实施例中，所述标记区上所述标记溶液的加入量是2μl/cm2～6μl/cm2。
在其中一个实施例中，所述孕酮偶联抗原溶液的浓度是0.5mg/ml～1.0mg/ml，在所述检测区的加入量是20μl/(27～35)cm2；和/或
所述第二配合物溶液的浓度是0.5mg/ml～1.0mg/ml，在所述质控区的加入量是20μl/(27～35)cm2；和/或
所述孕酮偶联抗原溶液和/或所述第二配合物溶液是使用喷涂的方式加到相应的区。
传统的孕酮检测试纸条在制作时，是将孕酮抗体与第一配合物分开分别与荧光标记颗粒连接形成荧光标记颗粒标记的孕酮抗体和荧光标记颗粒标记的第一配合物，再将该两种荧光标记颗粒的标记物包被标记垫的标记区。因孕酮分子的特殊性，如有抗原性而无免疫原性导致抗体特异性差以及分子小等，试纸条线性只由检测线信号波动来提供，这种偶联方法对于小分子类物质检测实现难度大(因为小分子类物质只能用竞争法进行检测，而竞争法相比双抗夹心法灵敏度和线性相差很大)，并且待测样本中多种小分子物质都会对孕酮的检测造成干扰，同时小分子物质在检测过程中容易受空间位阻和基质效应的影响，在小分子类物质免疫层析检测中普遍存在灵敏度不高、线性范围窄、准确度不足。
基于此，本发明在大量尝试和创造性实验设计的基础上，通过改变荧光标记颗粒分别标记孕酮抗体和第一配合物的传统方案，将孕酮单克隆抗体与第一配合物复合构成偶联复合物，再将该偶联复合物与荧光胶乳微粒连接，形成荧光胶乳微粒标记的偶联复合物。当此荧光胶乳微粒标记的偶联复合物与检测样本中的孕酮抗原结合后可形成孕酮抗原-荧光偶联复合物，该孕酮抗原-荧光偶联复合物通过层析作用在检测膜的质控区与包被的第二配合物特异性结合而大量聚积，其余没有结合孕酮抗原的荧光胶乳微粒标记的偶联复合物在检测膜的检测区与包被的孕酮偶联抗原结合，这种检测区与质控区共用一个荧光胶乳微粒的模式能将反应体系的信号量放大的同时还将单克隆抗体与荧光胶乳微粒结合不均匀的问题有效解决，从而可以大大改善灵敏度和准确性、扩宽线性范围。
上述孕酮免疫层析检测试纸条可广泛应用在人体或动物体(例如可以是但不限于犬猫类宠物等)的孕前或孕期的孕酮检测过程中，尤其是孕期检测。该孕酮免疫层析检测试纸条是一种定量的检测工具，配合相应的荧光检测仪可以对待测样本进行高精度和高灵敏度的检测，适用性强。
附图说明
图1为本发明一实施例的孕酮免疫层析检测试纸条的结构示意图；
图2为图1所示的孕酮免疫层析检测试纸条的检测原理示意图；
图3、图4和图5分别为偶联标记与分开标记在标准曲线灵敏度、高端线性及整体线性上的比较结果；
图6为偶联标记与分开标记的T峰信号线性比较结果；
图7为偶联标记与分开标记的C峰信号线性比较结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请结合图1和图2，本发明提供了一种孕酮免疫层析检测试纸条10，其包括基底100和设在基底100上标记垫200、检测膜300和吸收垫400。标记垫200、检测膜300及吸收垫400从基底100的一端至另一端依次连接。优选的，如在图示的具体示例中，标记垫200、检测膜300与吸收垫400依次搭接设置，这样可以提高不同结构之间的接触面积，提高物质渗透扩散的效率。
标记垫200具有标记区，标记区包被有荧光胶乳微粒210标记的孕酮单克隆抗体220与第一配合物230，且各荧光胶乳微粒上标记的孕酮单克隆抗体220与第一配合物230构成偶联复合物240。图1所示的标记垫200还可以作为样品垫，直接用于承接样本溶液。可理解，在其他具体示例中，该孕酮免疫层析检测试纸条还可以包括一样品垫，样品垫与标记垫200的远离检测膜300的一端连接，如可以搭接在该端上。
检测膜300上设有检测区310和质控区320。检测区310包被有孕酮偶联抗原312。质控区320包被有第二配合物322。第二配合物322能够与第一配合物230特异性结合。
荧光胶乳微粒210可以是胶体金颗粒，也可以磁珠微粒。在一个具体示例中，荧光胶乳微粒210的粒径是0.1μm～1μm，如可以是0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm。荧光胶乳微粒210受激发后发光的波长是180nm～800nm，该激发光的波长范围广，便于检测，可以防止因荧光信号难以检测而影响检测结果的精度。
在一个具体示例中，各荧光胶乳微粒210上的孕酮单克隆抗体220与第一配合物230是以1:1的摩尔比共价偶联构成偶联复合物240，如可以分别对孕酮单克隆抗体220与第一配合物230采用本领域的常规方法进行共价修饰，然后进行共价反应连接。
在一个具体示例中，第一配合物230与第二配合物322中的一个是抗体，另一个是与该抗体对应的二抗，如第一配合物230是一抗，第二配合物322是二抗，也可对换。更具体的，在一个示例中，第二配合物322是IgG抗体，第一配合物230是抗IgG抗体。例如，第二配合物322可以为兔IgG抗体、鼠IgG抗体或鸡IgG抗体等，对应地，第一配合物230为羊抗兔IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体或羊抗鸡IgG抗体等。
当此荧光胶乳微粒210标记的偶联复合物240与检测样本中的孕酮抗原20结合后可形成孕酮抗原-荧光偶联复合物，该孕酮抗原-荧光偶联复合物通过层析作用在检测膜300的质控区320与包被的第二配合物322特异性结合而大量聚积，其余没有结合孕酮抗原的荧光胶乳微粒210标记的偶联复合物240在检测膜300的检测区310与包被的孕酮偶联抗原312结合，这种检测区310与质控区320共用一个荧光胶乳微粒210的模式能将反应体系的信号量放大的同时还将孕酮单克隆抗体220与荧光胶乳微粒210结合不均匀的问题有效解决，从而可以大大改善灵敏度和准确性、扩宽线性范围。
上述孕酮免疫层析检测试纸条10可广泛应用在人体或动物体(例如可以是但不限于犬猫类宠物等)的孕前或孕期的孕酮检测过程中，尤其是孕期检测。该孕酮免疫层析检测试纸条10是一种定量的检测工具，配合相应的荧光检测仪可以对待测样本进行高精度和高灵敏度的检测，适用性强。
本发明还提供了一种孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其包括如下步骤：
使用荧光胶乳微粒标记孕酮单克隆抗体与第一配合物构成的偶联复合物，制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液，将标记溶液加到标记垫的标记区，干燥；
将孕酮偶联抗原溶液和第二配合物溶液分别加到检测膜的检测区和质控区，干燥；
将干燥后的标记垫、检测膜及吸收垫置于基底上，并使标记垫、检测膜及吸收垫从基底的一端至另一端依次连接，得到孕酮免疫层析检测试纸条。
在一个具体的示例中，所述的使用荧光胶乳微粒标记孕酮单克隆抗体与第一配合物构成的偶联复合物，制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液具体包括如下步骤：
制备孕酮单克隆抗体与第一配合物的偶联复合物；
活化荧光胶乳微粒，制备活化荧光胶乳微粒溶液，并将偶联复合物加入至活化荧光胶乳微粒溶液中，混匀，离心后收集沉淀；
将收集的沉淀复溶，得到标记溶液。
上述标记垫和检测膜的制备过程可不限先后，同理孕酮单克隆抗体与第一配合物的偶联复合物与活化荧光胶乳微粒溶液的制备步骤也不限先后，可根据需要具体制作，如可以同时制备。
在一个具体示例中，活化荧光胶乳微粒溶液中活化荧光胶乳微粒的浓度是800μg/100μl～1200μg/100μl，如可以是800μg/100μl、900μg/100μl、1000μg/100μl、1100μg/100μl或1200μg/100μl等。
在向活化荧光胶乳微粒溶液中加入偶联复合物时，是按照每100μl活化荧光胶乳微粒溶液中加入5μg～20μg的量加入至活化荧光胶乳微粒溶液中，如可以按照每100μl活化荧光胶乳微粒溶液中加入5μg、8μg、10μg、12μg、15μg、18μg或20μg的量加入。
所述混匀是于室温下混合1.5h～3h，如可以是于10℃～45℃之间，优选20℃～38℃之间混合1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h或3h等。
复溶时加入的溶剂的量需满足：复溶后得到的标记溶液的体积与待加入偶联复合物的活化荧光胶乳微粒溶液的体积相等。复溶使用的溶剂优选是PBS-TBN缓冲液或Tris-Hcl缓冲液。
标记溶液可以使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没等方式加到标记区。
更具体的，标记区上标记溶液的加入量是2μl/cm2～6μl/cm2，如可以是2μl/cm2、2.5μl/cm2、3μl/cm2、3.5μl/cm2、4μl/cm2、4.5μl/cm2、5μl/cm2、5.5μl/cm2或6μl/cm2等。
在一个具体示例中，孕酮偶联抗原溶液的浓度是0.5mg/ml～1.0mg/ml，在检测区的加入量是20μl/(27～35)cm2，如可以是20μl/27cm2、20μl/29cm2、20μl/30cm2、20μl/31cm2、20μl/32cm2、20μl/33cm2或20μl/34cm2。
第二配合物溶液的浓度是0.5mg/ml～1.0mg/ml，在质控区的加入量是20μl/(27～35)cm2，如可以是20μl/27cm2、20μl/29cm2、20μl/30cm2、20μl/31cm2、20μl/32cm2、20μl/33cm2或20μl/34cm2。
孕酮偶联抗原溶液和/或第二配合物溶液是使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没等方式加到相应的区。
上述孕酮免疫层析检测试纸条的制备方法原理简单，对设备要求低，可广泛推广使用。
以下结合具体检测实施例对本发明的孕酮免疫层析检测试纸条的检测效果进行进一步详细的说明。
分别使用传统的检测试纸条和上述孕酮免疫层析检测试纸条8对不同浓度的孕酮标准品进行检测。其中，传统的检测试纸条的标记区使用荧光胶乳微粒分别标记孕酮单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体包被(记为分开标记)，而上述孕酮免疫层析检测试纸条10的标记区使用荧光胶乳微粒标记的孕酮单克隆抗体与羊抗兔IgG抗体1:1摩尔比共价连接构成的偶联复合物包被(记为偶联标记)，其他结构相同。
对质控区进行荧光信号检测，结果如下表1、图3～图7。
表1
结果显示：
1.偶联标记在标准曲线灵敏度、高端线性及整体线性均明显优于分开标记；
2.偶联标记与分开标记T峰信号线性相当；
3.偶联标记C峰信号线性明显优于分开标记。
说明偶联标记用于孕酮免疫层析检测试纸条的制作，其性能明显优于分开标记。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种孕酮免疫层析检测试纸条，其特征在于，包括基底和设在所述基底上标记垫、检测膜和吸收垫，所述标记垫、所述检测膜及所述吸收垫从所述基底的一端至另一端依次连接；所述标记垫具有标记区，所述标记区包被有荧光胶乳微粒标记的孕酮单克隆抗体与第一配合物偶联复合物；所述检测膜上设有检测区和质控区，所述检测区包被有孕酮偶联抗原，所述质控区包被有第二配合物，所述第一配合物与所述第二配合物能够特异性结合；所述孕酮单克隆抗体与所述第一配合物是先以1:1的摩尔比共价偶联构成偶联复合物，再与所述荧光胶乳微粒标记连接。
2.如权利要求1所述的孕酮免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述荧光胶乳微粒的粒径是0.1μm ~1μm。
3.如权利要求1所述的孕酮免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述荧光胶乳微粒受激发后发光的波长是180nm~800nm。
4.如权利要求1~3任一项所述的孕酮免疫层析检测试纸条，其特征在于，所述第一配合物与所述第二配合物中一个是抗体，另一个是与该抗体对应的二抗。
5.一种如权利要求1~4中任一项所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用荧光胶乳微粒标记的孕酮单克隆抗体与第一配合物偶联复合物制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液，将所述标记溶液加到标记垫的标记区，干燥；
将孕酮偶联抗原溶液和第二配合物溶液分别加到检测膜的检测区和质控区，干燥；
将干燥后的所述标记垫、所述检测膜及吸收垫置于基底上，并使所述标记垫、所述检测膜及所述吸收垫从所述基底的一端至另一端依次连接，得到所述孕酮免疫层析检测试纸条。
6.如权利要求5所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其特征在于，所述使用荧光胶乳微粒标记的孕酮单克隆抗体与第一配合物偶联复合物制备含荧光胶乳微粒-偶联复合物的标记溶液包括如下步骤：
制备孕酮单克隆抗体与第一配合物的偶联复合物；
活化荧光胶乳微粒，制备活化荧光胶乳微粒溶液，并将所述偶联复合物加入至所述活化荧光胶乳微粒溶液中，混匀，离心后收集沉淀；
将收集的所述沉淀复溶，得到所述标记溶液。
7.如权利要求6所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其特征在于，所述活化荧光胶乳微粒溶液中活化荧光胶乳微粒的浓度是800μg/100μl~1200μg/100μl；
所述偶联复合物是按照每100μl所述活化荧光胶乳微粒溶液中加入5μg~20μg的量加入至所述活化荧光胶乳微粒溶液中；
所述混匀是于室温下混合1.5h~3h；
复溶时加入的溶剂的量需满足：复溶后得到的标记溶液的体积与待加入所述偶联复合物的所述活化荧光胶乳微粒溶液的体积相等；
所述复溶使用的溶剂是PBS-TBN缓冲液或Tris-Hcl缓冲液；
所述标记溶液是使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没的方式加到所述标记区。
8.如权利要求7所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其特征在于，所述标记区上所述标记溶液的加入量是2μl/cm2~6μl/cm2。
9.如权利要求5~8中任一项所述的孕酮免疫层析检测试纸条的制作方法，其特征在于，所述孕酮偶联抗原溶液的浓度是0.5mg/ml ~1.0mg/ml，在所述检测区的加入量是20μl/27cm2~20μl/35cm2；
所述第二配合物溶液的浓度是0.5mg/ml ~1.0mg/ml，在所述质控区的加入量是20μl/27cm2~20μl/35cm2；
所述孕酮偶联抗原溶液和/或所述第二配合物溶液是使用喷涂的方式加到相应的区。
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