CN109593678A - 长双歧杆菌yh295及其在制备降低腹型肥胖风险产品中的应用 - Google Patents
长双歧杆菌yh295及其在制备降低腹型肥胖风险产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)YH295及在降低腹型肥胖风险产品中的应用，涉及益生菌的应用技术领域。本发明所述长双歧杆菌YH295的生物保藏编号为CGMCC No.14093。在本发明实施例中，所述长双歧杆菌YH295可通过显著增加肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量、显著上调肠道再生基因表达量和肠道跨膜结合蛋白含量、降低血浆内毒素和肠道炎症因子等途径，从而降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险，可应用于制备防治代谢综合征的食品、补充剂或药物中。
Description
技术领域
本发明属于益生菌的应用技术领域，具体涉及长双歧杆菌YH295及其在制备降低腹型肥胖风险产品中的应用。
背景技术
腹型肥胖又种中心性肥胖或向心性肥胖，主要指体内脂肪在腹部堆积，使腹腔内脏脂肪增加，表现为苹果形身材。中国男性腰围≥90cm，女性≥80cm即为腹型肥胖。腹型肥胖与人体健康有很强的相关性，有研究发现腹型肥胖患者腹部脂肪组织一方面进行能量储备，另一方面可分泌大量肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL-1,IL-6)等炎症因子，直接或间接地参与机体炎症反应，是代谢综合征的首要条件，其与代谢性疾病，如糖尿病、痛风、高血压、动脉硬化、心脑血管疾病等密不可分。腹型肥胖者患糖尿病的风险为正常人的10.3倍，有研究发现，中老年人腹型肥胖是糖尿病发病的独立危险因素；在腹型肥胖的青少年中，过量的内脏脂肪含量使其发生非酒精性脂肪肝及胰岛素抵抗的风险显著增加。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损伤因素所致的，病变主体在肝小叶并以弥漫性肝细胞脂肪变性和脂肪贮积为病理特征的临床病理综合征。包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化三种主要类型。其常伴有肥胖、糖耐量异常以及血脂紊乱等易患因素，是一种代谢应激性肝脏损伤。2014年一项针对我国NAFLD流行病调查研究发现，我国NAFLD患病率为20.09％，其中肥胖人群NAFLD的患病率达到70％～80％。
近年来，随着现代生活方式的改变，全球腹型肥胖和非酒精性脂肪肝患病率呈上升趋势，而腹型肥胖和非酒精性脂肪肝又是多种代谢性和非代谢性疾病的危险因素，严重威胁着人体健康，因此防治腹型肥胖和非酒精性脂肪肝已引起全球医学界广泛关注，开发降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险的食品、补充剂或药物对全球人口健康具有巨大价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株长双歧杆菌YH295及在降低腹型肥胖产品中的应用，所述长双歧杆菌可显著增加肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量、显著上调肠道再生基因和跨膜结合蛋白含量、降低血清内毒素和炎症因子水平等，从而降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)YH295，所述长双歧杆菌YH295保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏编号为CGMCCNo.14093。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在增加肠道中乳杆菌和双歧杆菌数量中的应用。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在上调肠道再生基因表达量和跨膜结合蛋白含量中的应用。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在降低血浆内毒素和肠道炎症因子水平中的应用。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在制备防治腹型肥胖食品、补充剂或药物中的应用。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在制备防治非酒精性脂肪肝食品、补充剂或药物中的应用。
优选的，所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度独立的为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。
本发明提供了一株长双歧杆菌YH295，为双歧杆菌属，长双歧杆菌种，属人体原籍菌，在所有年龄段人群肠道中定植，也是益生菌大家庭的一份子。本发明所述长双歧杆菌YH295，其可通过显著增加肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量、显著上调肠道再生基因表达量和肠道跨膜结合蛋白含量、降低血浆内毒素和肠道炎症因子水平等，从而降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险，因此可用于制备预防和/或治疗腹型肥胖食品、补充剂或药物以及预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的食品、补充剂或药物。
保藏说明
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，菌株编号为YH295，保藏时间为2017年05月4日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.14093。
具体实施方式
本发明提供了一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)YH295，所述长双歧杆菌YH295保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏编号为CGMCCNo.14093。
在本发明中，所述长双歧杆菌YH295的来源并没有特殊限定，优选自健康婴儿粪便中分离获得，其形态为多形态杆状，革兰氏染色阳性，不形成芽孢，接触酶阴性，氧化酶阴性，专性厌氧。本发明所述长双歧杆菌YH295能利用L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-乳糖、D-蔗糖、D-麦芽糖、水杨甙、D-木糖、D-松三糖和D-棉子糖进行代谢活动，不能利用D-山梨糖醇、L-鼠李糖、D-海藻糖、明胶、七叶皂甙元、甘油、D-纤维二糖和D-甘露糖。
在本发明中，将所述长双歧杆菌YH295在MRS平板上纯化分离，具体包括：无菌条件下用接种环挑长双歧杆菌YH295，在MRS平板上划线，平板置于培养箱中37℃厌氧培养72h，单菌落呈凸圆、表面光滑、边缘完整、乳白色、有光泽，且具有柔软的质地。
在本发明中，所述长双歧杆菌YH295优选保存在斜面培养基上，所述斜面培养基优选为MRS斜面培养基。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在增加肠道中乳杆菌和双歧杆菌数量中的应用。
在本发明所述应用中，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度优选为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。本发明所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的状态优选为冻干活菌粉。本发明对所述冻干活菌粉的制备方法优选包括菌株发酵和菌粉制备；所述菌株发酵优选为用接种环将长双歧杆菌YH295从斜面上挑取二环至装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液，其中菌体呈弥散状，试管底部常伴有微小的颗粒状沉淀。发酵液中活菌数达10亿～50亿个/mL。本发明所述菌粉制备优选包括将所述发酵液离心分离获得菌泥；将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。本发明所述水的质量优选为菌泥质量的6～15倍，更优选为8～12倍，最优选为10～11倍。本发明所述冻干载体优选的包括麦芽糊精、蔗糖、奶粉、甘油、半胱氨酸盐酸盐。本发明所述冻干载体的用量为菌泥质量的0.5～3倍。本发明所述冻干活菌数中活菌数优选为1.0×1010～5.0×1010cfu/g以上。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在上调肠道再生基因表达量和跨膜结合蛋白含量中的应用。
在本发明所述应用中，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度优选为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。本发明所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的状态优选为冻干活菌粉。本发明对所述冻干活菌粉的制备方法优选包括菌株发酵和菌粉制备；所述菌株发酵优选为用接种环将长双歧杆菌YH295从斜面上挑取二环至装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液，其中菌体呈弥散状，试管底部常伴有微小的颗粒状沉淀。发酵液中活菌数达10亿～50亿个/mL。本发明所述菌粉制备优选包括将所述发酵液离心分离获得菌泥；将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。本发明所述水的质量优选为菌泥质量的6～15倍，更优选为8～12倍，最优选为10～11倍。本发明所述冻干载体优选的包括芽糊精、蔗糖、奶粉、甘油、半胱氨酸盐酸盐。本发明所述冻干载体的用量为0.5～3倍。本发明所述冻干活菌数中活菌数优选为1.0×1010～5.0×1010cfu/g以上。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在降低血浆内毒素和肠道炎症因子含量中的应用。
在本发明所述应用中，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度优选为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。本发明所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的状态优选为冻干活菌粉。本发明对所述冻干活菌粉的制备方法优选包括菌株发酵和菌粉制备；所述菌株发酵优选为用接种环将长双歧杆菌YH295从斜面上挑取二环至装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液，其中菌体呈弥散状，试管底部常伴有微小的颗粒状沉淀。发酵液中活菌数达10亿～50亿个/mL。本发明所述菌粉制备优选包括将所述发酵液离心分离获得菌泥；将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。本发明所述水的质量优选为菌泥质量的6～15倍，更优选为8～12倍，最优选为10～11倍。本发明所述冻干载体优选的包括芽糊精、蔗糖、奶粉、甘油、半胱氨酸盐酸盐。本发明所述冻干载体的用量为0.5～3倍。本发明所述冻干活菌数中活菌数优选为1.0×1010～5.0×1010cfu/g以上。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在制备防治腹型肥胖食品、补充剂或药物中的应用。
在本发明所述应用中，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度优选为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。本发明所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的状态优选为冻干活菌粉。本发明对所述冻干活菌粉的制备方法优选包括菌株发酵和菌粉制备；所述菌株发酵优选为用接种环将长双歧杆菌YH295从斜面上挑取二环至装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液，其中菌体呈弥散状，试管底部常伴有微小的颗粒状沉淀。发酵液中活菌数达10亿～50亿个/mL。本发明所述菌粉制备优选包括将所述发酵液离心分离获得菌泥；将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。本发明所述水的质量优选为菌泥质量的6～15倍，更优选为8～12倍，最优选为10～11倍。本发明所述冻干载体优选的包括芽糊精、蔗糖、奶粉、甘油、半胱氨酸盐酸盐。本发明所述冻干载体的用量为0.5～3倍。本发明所述冻干活菌数中活菌数优选为1.0×1010～5.0×1010cfu/g以上。
本发明还提供了上述长双歧杆菌YH295在制备防治非酒精性脂肪肝食品、补充剂和药物中的应用。
在本发明所述应用中，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度优选为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。本发明所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的状态优选为冻干活菌粉。本发明对所述冻干活菌粉的制备方法优选包括菌株发酵和菌粉制备；所述菌株发酵优选为用接种环将长双歧杆菌YH295从斜面上挑取二环至装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液，其中菌体呈弥散状，试管底部常伴有微小的颗粒状沉淀。发酵液中活菌数达10亿～50亿个/mL。本发明所述菌粉制备优选包括将所述发酵液离心分离获得菌泥；将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。本发明所述水的质量优选为菌泥质量的6～15倍，更优选为8～12倍，最优选为10～11倍。本发明所述冻干载体优选的包括芽糊精、蔗糖、奶粉、甘油、半胱氨酸盐酸盐。本发明所述冻干载体的用量为0.5～3倍。本发明所述冻干活菌数中活菌数优选为1.0×1010～5.0×1010cfu/g以上。
下面结合实施例对本发明提供的长双歧杆菌YH295及在降低代谢综合征风险或改善腹型肥胖中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将长双歧杆菌YH295接种于装有50mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，再以5％接种量接入50ml MRS液体培养基中，37℃厌氧培养72h，即得长双歧杆菌YH295发酵液。
菌粉制备
1)离心：将上述发酵液离心分离获得菌泥；
2)冷冻干燥：按水量为菌泥重量的10倍，将所述菌泥与水和冻干载体混合，冷冻干燥制成冻干活菌粉。冻干活菌数的活菌数至少为1.0×1010～5.0×1010cfu/g。
实施例2
长双歧杆菌YH295对肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量影响
将30只雄性Wistar大鼠，分成3组，一组为对照组(10只)，正常饮食；一组为模型组(10只)，高脂饮食；另一组为YH295组(10只)，高脂饮食的同时灌喂PBS溶液稀释的长双歧杆菌YH295冻干菌粉(每天108CFU)。12周后检测肠道乳杆菌和双歧杆菌数量，数据用x±s表示，如表1所示：
表1长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠肠道乳杆菌和双歧杆菌的影响(x±s,lg10n/mL)
*与模型组比较，YH295组p<0.05
表1结果表明，与模型组相比，灌喂YH295活菌粉可使高脂饮食大鼠肠道的乳杆菌和双歧杆菌明显增加，且有显著性差异(p<0.05)。这表明YH295可增加肠道有益菌数量。
实施例3
长双歧杆菌YH295对肠道再生基因表达量和跨膜结合蛋白含量的影响进行与实施例2相同的实验，实验结束后，取出小肠黏膜层，提取总RNA，采用实时定量PCR技术测定大鼠中的肠道Reg I mRNA和总的看家基因含量，同时采用免疫印迹方法检测Reg I表达蛋白和看家基因表达蛋白浓度，分别以Reg I含量与看家基因含量的比值(RVmRNA)及两者表达蛋白的比值(RV蛋白)作为指标以评估YH295对Reg I的影响；同时取末端回肠和结肠组织冰冻切片，采用间接免疫荧光法检测小肠和结肠粘膜跨膜结合蛋白occludin含量。结果见表2和表3：
表2长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠肠道再生基因表达量的影响
*与模型组和对照组比较，YH295组p<0.001
表3长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠肠道跨膜结合蛋白的影响
*与模型组和对照组比较，YH295组p<0.05
由表2可知，YH295组Reg I的mRNA水平和蛋白表达量最高，均是对照组的4倍多和模型组的3倍多(见表2)；同时，YH295组的小肠和结肠跨膜结合蛋白含量均较模型组和对照组显著上升(p<0.05)(见表3)。
可见，长双歧杆菌YH295显著上调Reg I的表达和跨膜结合蛋白含量，以诱导小肠细胞增殖，从而在小肠绒毛结构的修复再生过程中发挥重要作用，增加肠道跨膜结合蛋白含量，增强肠黏膜屏障功能。
实施例4
长双歧杆菌YH295对血浆内毒素和肠道炎症因子水平的影响
进行与实施例2相同的实验，实验结束后，取血测定血浆脂多糖，采用酶免法测定小肠组织中的白细胞介素IL-1β和髓过氧化酶MPO，结果如表4所示：
表4长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠血浆内毒素和肠道炎症因子水平的影响
*与对照组比较，模型组组p<0.001
**与模型组比较，YH295组p<0.05
***与模型组比较，YH295组p<0.001
由表4可知，血浆脂多糖又称代谢内毒素，高脂饮食组的血浆脂多糖与对照组相比显著增加，差异极显著(p<0.001)，表明高脂饮食诱导血浆内毒素增加；而YH295组与模型组相比，血浆脂多糖显著降低(p<0.05)，表明YH295显著降低高脂饮食诱导产生的内毒素。同样，高脂饮食组的肠道炎症因子白细胞介素IL-1β和髓过氧化酶MPO与对照组相比也显著增加，差异极显著(p<0.001)；而YH295组与模型组相比，两者均极显著降低(p<0.001)。可见，长双歧杆菌YH295显著降低高脂饮食产生的血浆内毒素和肠道炎症因子水平。
实施例5
长双歧杆菌YH295对高脂饮食引起的体重和腹部脂肪量的影响
进行与实施例2相同的实验，每天给大鼠称重直至实验结束，12周实验结束后，切下腹腔下脂肪并称重，结果如表5所示：
表5长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠体重和腹部脂肪量的影响
*与对照组比较，模型组组p<0.05
**与模型组比较，YH295组p<0.05
由表5可知，在体重和腹部脂肪方面，模型组较对照组显著增加(p<0.05)，YH295组较模型组显著降低(p<0.05)，表明高脂饮食引起体重和腹部脂肪的增加，腹部肥胖模型成立，灌胃YH295则可降低高脂饮食引起的体重和腹部脂肪量的增加。可见长双歧杆菌YH295可降低高脂饮食引起的体重和腹部脂肪增加风险。
实施例6
长双歧杆菌YH295对高脂饮食引起的高血糖和高血脂的影响
进行与实施例2相同的实验，12周实验结束后空腹采血，测定空腹血糖和血脂，结果如表6所示：
表6长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠血糖和血脂的影响
*与对照组比较，模型组组p<0.05
**与模型组比较，YH295组p<0.05
由表6可知，在空腹血糖、甘油三酯和胆固醇方面，模型组较对照组显著增加(p<0.05)，YH295组较模型组显著降低(p<0.05)，表明高脂饮食引起体重和腹部脂肪增加的同时还会引起空腹血糖、血脂的升高，而灌胃YH295则可降低高脂饮食引起的高血糖和高血脂。可见长双歧杆菌YH295可降低高脂饮食引起的高血糖和高血脂风险。
实施例7
长双歧杆菌YH295对非酒精性脂肪肝的影响
30只雄性SD大鼠，分成3组，一组为对照组(10只)，正常饮食；一组为模型组(10只)，高脂饮食；另一组为YH295组(10只)，高脂饮食的同时灌胃PBS溶液稀释的长双歧杆菌YH295冻干菌粉(每天108CFU)。12周后取肝脏检测肝脏和肝脏脂肪重量，结果如表7所示：
表7长双歧杆菌YH295对高脂饮食大鼠肝脏脂肪的影响
*与对照组比较，模型组组p<0.001
**与模型组比较，YH295组p<0.05
由表7可知，模型组较对照组肝脏脂肪显著增加(p<0.001)，YH295组较模型组显著降低(p<0.05)，表明高脂饮食引起非酒精性脂肪肝，而灌胃YH295则可降低由高脂饮食引起的高肝脏脂肪。可见长双歧杆菌YH295可降低非酒精性脂肪肝风险。
本发明提供了一株长双歧杆菌YH295，可通过显著增加肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量、显著上调肠道再生基因表达量和肠道跨膜结合蛋白含量、降低血浆内毒素和肠道炎症因子水平等途径，从而降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险，可应用于制备预防和/或治疗代谢综合征的食品、补充剂或药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)YH295，所述长双歧杆菌YH295保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物保藏编号为CGMCC No.14093。
2.权利要求1所述长双歧杆菌YH295在增加肠道中乳杆菌和/或双歧杆菌数量中的应用。
3.权利要求1所述长双歧杆菌YH295在上调肠道再生基因表达量和跨膜结合蛋白含量中的应用。
4.权利要求1所述长双歧杆菌YH295在降低血浆内毒素和/或肠道炎症因子含量中的应用。
5.权利要求1所述长双歧杆菌YH295在制备防治腹型肥胖食品、补充剂或药物中的应用。
6.权利要求1所述长双歧杆菌YH295在制备防治非酒精性脂肪肝食品、补充剂或药物中的应用。
7.根据权利要求2～6任一项所述应用，其特征在于，所述应用时，所述长双歧杆菌YH295的活菌浓度独立的为106～109CFU/mL或106～109CFU/g。
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